CN111849888A - 基于3d生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括如下步骤：(1)将生物墨水、MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印得到含MSC的3D打印基质；(2)将含有MSC的3D打印基质进行交联；(3)将交联后3D打印基质进行培养获得汗腺细胞；其中，生物墨水的杨氏模量为160‑380kPa，且孔隙率为0.5‑0.7；本发明所提供的3D生物打印基质在不改变微观结构的前提下改进了水凝胶生物墨水的硬度，该方法实现了对皮肤真皮基质硬度的模拟，实验结果表明，该方法构建的3D生物打印基质能够更高效的诱导MSC向功能性汗腺分化。

Description

基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的 方法

技术领域

本发明涉及干细胞分化技术领域，特别涉及基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法。

背景技术

覆盖在机体表面的皮肤是机体最大的器官，其强大的防御能力能够为机体抵御感染、损伤以及烧(创)伤等各种外界环境的侵害。维持机体的热平衡是机体能够正常运转的重要环节，热平衡的失调会导致一系列严重的并发症，如中暑、高热、热惊厥、热休克甚至是死亡。汗腺作为皮肤附属器之一，其正常的发汗功能是机体维持热平衡的最重要的途径。由此可见，汗腺的存在以及功能的完整对于机体来说是不可或缺的。在临床上，烧(创)伤引起的大面积真皮层皮肤缺失是导致汗腺缺失最主要的原因。因此，在烧(创)伤领域的研究中，针对含汗腺的皮肤再生的相关研究是该领域内不可回避的重要部分。

在既往研究中，针对汗腺细胞再生的研究多集中在二维结构，这不仅无法模拟细胞在机体中所处的三维立体环境，也无法有效地研究物理因素对干细胞分化的影响。仅有的少数关于三维环境下汗腺再生的研究，也因三维架构的硬度较低导致其研究成果难以实现临床转化。

现有关于汗腺修复的的研究较少，如申请号:CN201910895337.6的专利公开了一种诱导汗腺功能性修复的方法，该方法主要应用质粒转染技术诱导表皮干细胞向汗腺细胞分化，并未考虑三维环境以及物理因素对干细胞的影响，且该方法中汗腺细胞的分别必须依赖表皮干细胞，应用范围有限。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括如下步骤：

(1)将生物墨水、MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印得到含MSC的3D打印基质；

(2)将含有MSC的3D打印基质进行交联；

(3)将交联后3D打印基质进行培养获得汗腺细胞；

其中，生物墨水的杨氏模量为160-380kPa，且孔隙率为0.5-0.7。

表皮干细胞与汗腺细胞为同谱系分化，难度较小。而间充质细胞向汗腺细胞分化为跨谱系分化，难度更大。在临床转化应用中，间充质干细胞的易获取性以及汗腺的重要功能使得针对间充质干细胞向汗腺细胞分化的研究有着重要的意义，现有的关于生物墨水中的汗腺分化研究，所应用的水凝胶生物墨水强度低导致其可成型性较差，临床转化难度大，本发明针对该技术难题进行研究，发现当使用杨氏模量为160-380kPa，且孔隙率为0.5-0.7的生物墨水与SC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆打印得到的3D打印基质再进行交联、培养，得到的类汗腺细胞团更大，杨氏模量适中。

进一步地，步骤(1)的含MSC的3D打印基质的制备方法如下：取体积比为2:0.25-2:18的浓度为1.0×10⁷cell/ml的MSC悬浮液、小鼠足趾部真皮基质匀浆和生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃冷却15-30min后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用打印喷嘴构建含MSC的3D打印基质，即得载有MSC的3D打印基质。

进一步地，步骤(2)所述将含有MSC的3D打印基质进行交联的具体方法为：将载有MSC的3D打印基质用浓度为2％-3％的氯化钙溶液交联8-12min，氯化钙溶液浸没3D打印基质。

进一步地，步骤(3)进行培养获得汗腺细胞具体包括以下步骤：先将交联后的载有MSC的3D打印基质用DMEM培养基培养3天，3天后再用汗腺专用培养基培养，所述DMEM培养基和所述汗腺专用培养基均是每两天更换一次；培养基培养的条件为放置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养。

进一步地，DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5-15％(v/v)的胎牛血清FBS，0.8-1.2％(v/v)双抗溶液，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

进一步地，汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入1-3ng/mL三碘甲状腺原氨、4-6％(v/v)胎牛血清FBS、8-12ng/mLEGF、0.3-0.5μg/mL半琥珀酰氢化考的松、0.8-1.2％(v/v)双抗溶液和0.8-1.2mL/100mLITS，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

进一步地，所述生物墨水通过以下方法制备而成：

称取3.5-4.5重量份的海藻酸钠和9-11重量份的明胶均匀混合，置入装有90-110重量份的超纯水中搅拌均匀制得海藻酸钠-明胶混悬液；待海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水时，制得生物墨水。

进一步地改进，海藻酸钠与所述明胶、超纯水的质量比为4:10:100。

进一步地改进，将海藻酸钠与明胶置入超纯水中搅拌均匀后，还包括以下步骤：将海藻酸钠-明胶混悬液于40-80℃条件下放置8-20小时，即可使海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水中。

进一步地改进，海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水后还包括以下步骤：将打印基质通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在60-80℃条件下灭菌10-60分钟；再在1-8℃条件下灭菌3-10分钟，循环交叉灭菌3次；

优选地，在70℃条件下灭菌30分钟；再在4℃条件下灭菌5分钟，循环交叉灭菌3次。

70℃下灭菌30min，再在5℃下灭菌5min，这是一个循环，一共进行3个循环；巴氏消毒法即完成。

本发明所提供的生物生物墨水在不改变微观结构的前提下改进了水凝胶生物墨水的硬度，该方法实现了对皮肤真皮基质硬度的模拟，实验结果表明，该方法构建的生物墨水能够更高效的诱导MSC向功能性汗腺分化。

附图说明

附图1.为空白组、实施例1-3和对照例1的生物墨水的杨氏模量对比柱状图和孔隙率对比柱状图；

附图2.为打印后7天时用扫描电子显微镜观察空白组、实施例1-3和对照例1的生物墨水的微观结构；

附图3.为各组生物墨水中间充质干细胞表达汗腺表面标记物蛋白相关基因的差异。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。

实施例1

本实施例提供了一种生物墨水，该生物墨水由以下方法制备而成：使用微量称量仪称取3.5g海藻酸钠粉剂和9g明胶粉剂，将海藻酸钠和明胶均匀混合后，置入装有110mL超纯水的容量瓶中，然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液，将海藻酸钠-明胶混悬液在40℃条件下放置20小时以使其完全溶解，然后通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在60℃条件下灭菌60分钟；再在1℃条件下灭菌3分钟，循环交叉灭菌3次，灭菌后，将生物墨水密封并保存在4℃待用。

实施例2

本实施例提供了一种生物墨水，该生物墨水由以下方法制备而成：使用微量称量仪称取4g海藻酸钠粉剂和10g明胶粉剂，将海藻酸钠和明胶均匀混合后，置入装有100mL超纯水的容量瓶中，然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液，将海藻酸钠-明胶混悬液在60℃条件下放置12小时以使其完全溶解，然后通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在70℃条件下灭菌30分钟；再在4℃条件下灭菌5分钟，循环交叉灭菌3次，灭菌后，将生物墨水密封并保存在4℃待用。

实施例3

本实施例提供了一种生物墨水，该生物墨水由以下方法制备而成：使用微量称量仪称取4.5g海藻酸钠粉剂和11g明胶粉剂，将海藻酸钠和明胶均匀混合后，置入装有90mL超纯水的容量瓶中，然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液，将海藻酸钠-明胶混悬液在80℃条件下放置8小时以使其完全溶解，然后通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在80℃条件下灭菌10分钟；再在8℃条件下灭菌10分钟，循环交叉灭菌3次，灭菌后，将生物墨水密封并保存在4℃待用。

实施例4

本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用实施例1的方法制备得到生物墨水；

(2)取1ml 1.0×10⁷细胞/ml的MSC悬浮液、0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，使用3D生物打印平台(购自Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水，标记为3.5-9-110组，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃条件下冷却15分钟(3.5-9-110)后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用直径为260μm的打印喷嘴(购自捷诺飞生物科技股份有限公司)以层层叠加的形式构建直径为50mm、厚度为5mm、孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水；

(3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2％氯化钙溶液中交联12分钟，将交联后的基质置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养；在打印后的前三天内，使用含有DMEM培养基培养；三天后更换为汗腺专用培养基，每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水用培养基培养7天；

以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5％(v/v)的胎牛血清FBS，0.8％(v/v)双抗溶液(青霉素—链霉素混合液)，充分混匀后密封置于4℃保存。

以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入1ng/mL三碘甲状腺原氨、4％(v/v)胎牛血清FBS、8ng/mL EGF、0.3μg/mL半琥珀酰氢化考的松、0.8％(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、0.8mL/100mL ITS，充分混匀后密封置于4℃保存；

其中，MSC由以下方法制备：

S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后，浸泡在75％的酒精溶液中10分钟；

S2在无菌超净台内，将小鼠置于100mm细胞培养皿中，用眼科剪剪开小鼠两侧的后肢皮肤后，用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织，充分暴露手术视野，取出双侧的股骨和胫骨；

S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓冲液的100mm细胞培养皿中，置于冰上操作；

S4手术操作结束后，将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中，加入1mL的MSC提取专用胶原酶，用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂，用眼科剪将碎骨剪至1mm³的碎片，再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)，用无菌滴管充分吹打骨碎片团块至碎片分离后，移入50mL离心管中后密封；

S5将50mL离心管置于37℃下放置60min，每5分钟上下颠倒一次；

S6使用低速台式离心机在1400rpm下离心10分钟后，弃上清液，加入足量的MesenCult^TM MSC培养基，将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中孵育4天；

S7细胞贴壁生长至80％时以1:3传代，本次实验中使用第2代间充质干细胞；

小鼠足趾部真皮基质匀浆(PD)通过以下方法制备:

S1将5只出生后24小时内的C57BL/6小鼠处死后，浸泡在75％的酒精溶液中10分钟；

S2将小鼠置于100mm细胞培养皿中，用眼科剪剪取四肢的足趾部后置于无菌研磨器中；

S3在无菌条件下，加入4mL无菌PBS缓冲液后充分研磨成匀浆液；

S4将匀浆液分装至无菌的1.5mL的EP管中，使用低温高速离心机在4℃、13000rpm条件下离心5分钟；

S5上清液既为PD，转移至新的无菌1.5mL的EP管中，密封后置于-80℃保存待用。

实施例5

本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用实施例2的方法制备得到生物墨水；

(2)取1ml 1.0×10⁷细胞/ml的MSC悬浮液、0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，使用3D生物打印平台(购自Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水，标记为4A10G组，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃条件下冷却20分钟后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用直径为260μm的打印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、厚度为5mm、孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水；

(3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2.5％氯化钙溶液中交联10分钟，将交联后的基质置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养；在打印后的前三天内，使用含有DMEM培养基培养；三天后更换为汗腺专用培养基，每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水用培养基培养7天；

以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10％(v/v)的胎牛血清FBS，1％(v/v)双抗溶液(青霉素—链霉素混合液)，充分混匀后密封置于4℃保存。

以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL EGF、0.4μg/mL半琥珀酰氢化考的松、1％(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、1mL/100mL ITS，充分混匀后密封置于4℃保存；

其中，MSC由以下方法制备：

S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后，浸泡在75％的酒精溶液中10分钟；

S2在无菌超净台内，将小鼠置于100mm细胞培养皿中，用眼科剪剪开小鼠两侧的后肢皮肤后，用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织，充分暴露手术视野，取出双侧的股骨和胫骨；

S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓冲液的100mm细胞培养皿中，置于冰上操作；

S4手术操作结束后，将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中，加入1mL的MSC提取专用胶原酶，用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂，用眼科剪将碎骨剪至1mm³的碎片，再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)，用无菌滴管充分吹打骨碎片团块至碎片分离后，移入50mL离心管中后密封；

S5将50mL离心管置于37℃下放置45min，每5分钟上下颠倒一次；

S6使用低速台式离心机在1300rpm下离心10分钟后，弃上清液，加入足量的MesenCult^TM MSC培养基，将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中孵育3天；

S7细胞贴壁生长至80％时以1:3传代，本次实验中使用第3代间充质干细胞；

本实施例的小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。

实施例6

本实施例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用实施例3的方法制备得到生物墨水；

(2)取1ml 1.0×10⁷细胞/ml的MSC悬浮液、0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，使用3D生物打印平台(购自Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水，标记为4.5-11-110组，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃条件下冷却30分钟后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用直径为260μm的打印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、厚度为5mm、孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水；

(3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的3％氯化钙溶液中交联8分钟，将交联后的基质置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养；在打印后的前三天内，使用含有DMEM培养基培养；三天后更换为汗腺专用培养基，每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水用培养基培养7天；

以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入15％(v/v)的胎牛血清FBS，1.2％(v/v)双抗溶液(青霉素—链霉素混合液)，充分混匀后密封置于4℃保存。

以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入3ng/mL三碘甲状腺原氨、6％(v/v)胎牛血清FBS、12ng/mL EGF、0.5μg/mL半琥珀酰氢化考的松、1.2％(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、1.2mL/100mLITS，充分混匀后密封置于4℃保存；

其中，MSC由以下方法制备：

S1将1周龄的C57BL/6小鼠处死后，浸泡在75％的酒精溶液中10分钟；

S2在无菌超净台内，将小鼠置于100mm细胞培养皿中，用眼科剪剪开小鼠两侧的后肢皮肤后，用眼科镊钝性分离肌肉和筋膜组织，充分暴露手术视野，取出双侧的股骨和胫骨；

S3将分离出的股骨和胫骨置于装有抗凝缓冲液的100mm细胞培养皿中，置于冰上操作；

S4手术操作结束后，将股骨和胫骨转移至新的100mm细胞培养皿中，加入1mL的MSC提取专用胶原酶，用止血钳轻柔钳夹股骨和胫骨直至碎裂，用眼科剪将碎骨剪至1mm³的碎片，再次加入MSC提取专用胶原酶(以每只老鼠使用2mL的MSC提取专用胶原酶为准)，用无菌滴管充分吹打骨碎片团块至碎片分离后，移入50mL离心管中后密封；

S5将50mL离心管置于37℃下放置45min，每5分钟上下颠倒一次；

S6使用低速台式离心机在1300rpm下离心10分钟后，弃上清液，加入足量的MesenCult^TM MSC培养基，将管底沉淀物充分重悬后转移到新的100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中孵育3天；

S7细胞贴壁生长至80％时以1:3传代，本次实验中使用第3代间充质干细胞；

本实施例的小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。

对照例1

本对照例提供了一种生物墨水，该生物墨水由以下方法制备而成：使用微量称量仪称取1g海藻酸钠粉剂和3g明胶粉剂，将海藻酸钠和明胶均匀混合后，置入装有100mL PBS的容量瓶中，然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液，将海藻酸钠-明胶混悬液在60℃条件下放置12小时以使其完全溶解，然后通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在70℃条件下灭菌30分钟；再在4℃条件下灭菌5分钟，循环交叉灭菌3次，灭菌后，将生物墨水密封并保存在4℃待用。

对照例2

本对照例提供了一种生物墨水，该生物墨水由以下方法制备而成：使用微量称量仪称取1g海藻酸钠粉剂和3g明胶粉剂，将海藻酸钠和明胶均匀混合后，置入装有100mL超纯水的容量瓶中，然后充分搅拌使粉剂均匀分散在溶剂中制得海藻酸钠-明胶混悬液，将海藻酸钠-明胶混悬液在60℃条件下放置12小时以使其完全溶解，然后通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在70℃条件下灭菌30分钟；再在4℃条件下灭菌5分钟，循环交叉灭菌3次，灭菌后，将生物墨水密封并保存在4℃待用。

对照例3

本对照例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用对照例1的方法制备得到生物墨水；

(2)取1ml 1.0×10⁷细胞/ml的MSC悬浮液、0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，使用3D生物打印平台(购自Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水，标记为control组，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃条件下冷却15分钟后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用直径为260μm的打印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、厚度为5mm、孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水；

(3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2.5％氯化钙溶液中交联10分钟，将交联后的基质置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养；在打印后的前三天内，使用含有DMEM培养基培养；三天后更换为汗腺专用培养基，每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水用培养基培养7天；

以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10％(v/v)的胎牛血清FBS，1％(v/v)双抗溶液(青霉素—链霉素混合液)，充分混匀后密封置于4℃保存。

以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL EGF、0.4μg/mL半琥珀酰氢化考的松、1％(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、1mL/100mL ITS，充分混匀后密封置于4℃保存；

其中，MSC和小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。

对照例4

本对照例提供了一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，该方法包括以下步骤：

(1)用对照例2的方法制备得到生物墨水；

(2)取1ml 1.0×10⁷细胞/ml的MSC悬浮液、0.5ml小鼠足趾部真皮基质匀浆和9ml步骤(1)制得的生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，使用3D生物打印平台(购自Regenovo公司)构建载有MSC的生物墨水，标记为1A3G组，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃条件下冷却15分钟后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将60mm培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用直径为260μm的打印喷嘴以层层叠加的形式构建直径为50mm、厚度为5mm、孔径为2.5mm的含MSC的生物墨水；

(3)将载有MSC的生物墨水浸入无菌的2.5％氯化钙溶液中交联10分钟，将交联后的基质置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养；在打印后的前三天内，使用含有DMEM培养基培养；三天后更换为汗腺专用培养基，每两天更换培养基一次将交联后的载有MSC的生物墨水用培养基培养7天；

以上的DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入10％(v/v)的胎牛血清FBS，1％(v/v)双抗溶液(青霉素—链霉素混合液)，充分混匀后密封置于4℃保存。

以上的汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入2ng/mL三碘甲状腺原氨、5％(v/v)胎牛血清FBS、10ng/mL EGF、0.4μg/mL半琥珀酰氢化考的松、1％(v/v)双抗溶液(青霉素-链霉素混合液)、1mL/100mL ITS，充分混匀后密封置于4℃保存；

其中，MSC和小鼠足趾部真皮基质匀浆的制备方法与实施例4相同。

本发明用到的试剂的购买厂家见表1：

表1.各试剂的购买厂家.

试验例1杨氏模量和孔隙率的检测

1.杨氏模量的检测：使用压缩模量检测平台检测实施例1-3和对照例1-2的生物墨水的杨氏模量。将20ml实施例1-3和对照例1-2的生物墨水分别装入20mL注射器中，密封并置于4℃以冷凝成凝胶状后，将注射器头部切断，小心轻柔地将注射器内固态凝胶推出并立即浸没在装有2.5％氯化钙溶液的容器内，放置在4℃中24小时以充分交联，将交联完成的圆柱体水凝胶制成高度(h)为20mm，直径(d)为20mm的待测样品。将样品放置在压缩模量检测平台(型号为INSTRON,Model 5567(英斯特朗，5567))上，选择100N的负载传感器，以3mm/min的下降速度开始压缩，直至将样品压缩至70％为止。每组重复3次以取平均值。选择压缩曲线的前10％，并以应变(ε)为横坐标和应力(σ)为纵坐标绘制相关曲线。公式(1)用于计算杨氏模量；实施例1-3和对照例1-2的杨氏模量柱状图见图1；

杨氏模量＝σ/ε (1)

由图1可知，实施例1-3组的生物墨水的杨氏模量显著高于对照例1-2组，即实施例1-3组的生物墨水的硬度显著高于对照例1-2组，而皮肤真皮组织硬度为6-220kPa，由图1可知，本发明3.5-9-110组和4A10G组的杨氏模量符合要求，更加具有转化价值。

2.孔隙率测量：实施例1-3和对照例1-2的生物墨水的孔隙率采用无水乙醇置换法进行测量，分别取20mL实施例1-3和对照例1-2的生物墨水装入20mL注射器中，密封并置于4℃以冷凝成凝胶状，然后挤入装有40mL 2.5％氯化钙溶液的50mL离心管中静置10分钟以交联，10分钟后弃去2.5％氯化钙溶液后，将样品冷冻干燥48小时。然后在离心管中加入45mL的无水乙醇(V1)，并在4℃下放置48小时，计算各组生物墨水的孔隙率，结果见图1。公式(2)用于计算孔隙率；

孔隙率＝(V1–V3)/(V2–V3)×100％ (2)

公式(2)中的V1是无水乙醇的体积，V2是添加无水乙醇后的总体积，V3是浸没样品48小时后剩余的无水乙醇的体积。每组重复3次以取平均值。

由图1可知，实施例1-3提供的生物生物墨水的孔隙率与对照例1-2组相当，无显著差异。

试验例2各组生物墨水的微观结构观察

分别将培养7天的实施例4-6和对照例3-4的生物墨水冷冻干燥48小时后浸入液氮中，于-196℃下快速超低温冷冻，用眼科镊轻轻掰断样品，小心轻柔地取出未经器械碰触或切割的横断面，将其粘在扫面电子显微镜样品台上，保持干燥并立即喷金后，扫描电子显微镜用于观察生物墨水的微观结构，放大倍数为220倍，结果见图2。

由图2可知，打印后7天时，实施例4-6组的类汗腺细胞团较对照例3-4组更大。

试验例3 RT-qPCR检测不同硬度下MSC表达汗腺表面标记物蛋白相关基因的差异

(1)提取RNA：

a：在实施例4-6和对照例3-4打印后1天和7天时，将各组含MSC的3D打印基质分别转移至50mL离心管中；

b：加入裂解液，置于水平摇床上震荡20分钟至3D打印基质充分裂解，将8.09g二水合柠檬酸钠(0.06M)、2.92g EDT(0.02M)A和4.39g氯化钠(0.15M)加入500mL去离子水中，混合均匀后置于室温待用；用量为45ml。

c：将各组完全裂解后的溶液在低速台式离心机上以1500rpm速度离心15分钟，弃上清，加入Trizol试剂(购自美国，Invitrogen公司)，每3ml的3D打印基质使用1ml Trizo试剂，吹打均匀后移入1.5mL无酶EP管中；

d：每1mL的Trizol试剂对应加200μl氯仿，充分剧烈震荡后，置于室温静置3分钟；

e：使用低温高速离心机在4℃、12000rpm条件下离心15分钟；

f：离心后EP管中液体分三相，上层透明、中层发白、下层粉红，小心轻柔的取600μL上层透明液体至新的无酶1.5mL EP管中，加入等体积的异丙醇，轻柔地上下颠倒15次，混匀，室温静置30min；

g：使用低温高速离心机在4℃、12000rpm条件下离心15分钟；

h：弃上清，加入1mL 75％的酒精，75％酒精用DEPC水(购自中国索莱宝公司)配置，轻柔地上下颠倒数次，至EP管管底的白色沉淀物漂浮即可；

i：使用低温高速离心机在4℃、12000rpm条件下离心5分钟；

j：弃上清，室温干燥2分钟，每管加入20μL DEPC水；

k：使用全自动多功能酶标仪检测各组的RNA浓度。

(2)反转录：

PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(购自日本的TAKARA公司)用于反转录步骤。

a：去除基因组DNA反应

按照表2在冰上配置反应体系1：

表2.反应体系1

试剂	使用量
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		Total RNA	1.0μg
RNase Free dH<sub>2</sub>O	定容至10μL

轻柔混合均匀后，42℃，2分钟，然后置于4℃待用。

b：反转录反应

按照表3在冰上配置反应体系2：

表3.反应体系2

轻柔混合均匀后，置于37℃持续15分钟、85℃持续5秒，然后置于4℃待用或置于-20℃保存。

(3)PCR反应：

按照表4在冰上配置PCR体系：

表4.PCR体系

实验中所用引物见表5：

表5.引物序列

按照如下步骤在7500Real-Time PCR system上进行扩增：

两步法PCR扩增程序：

阶段1：预变性，95℃持续30秒，循环1次；

阶段2：PCR反应，95℃持续5秒、60℃持续34秒，循环60次。

5、统计学分析

实验数据采用SPSS 24.0统计软件进行分析，数据描述为均值±标准差(mean±SD)，采用双尾t检验、单因素方差分析等方法进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义，实验结果见图3。

由图3可知，在打印后1天到7天时，实施例4-6组的Krt5、Krt14、Krt8和Krt18的基因表达水平持续显著升高，且在打印后1天和7天时均显著高于对照例3-4组。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将生物墨水、MSC悬浮液和小鼠足趾部真皮基质匀浆通过3D打印技术进行打印得到含MSC的3D打印基质；

(2)将含有MSC的3D打印基质进行交联；

(3)将交联后3D打印基质进行培养获得汗腺细胞；

其中，生物墨水的杨氏模量为160-380kPa，且孔隙率为0.5-0.7。

2.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(1)的含MSC的3D打印基质的制备方法如下：取体积比为2:0.25-2:18的浓度为1.0×10⁷cell/ml的MSC悬浮液、小鼠足趾部真皮基质匀浆和生物墨水混合均匀后密封在无菌打印注射器中，将密封后的无菌打印注射器放置在4℃冷却15-30min后，将无菌打印注射器安装在生物打印平台的打印臂上，设置温度为15℃，同时将培养皿放在3D生物打印平台，设置温度为4℃，使用打印喷嘴构建含MSC的3D打印基质，即得载有MSC的3D打印基质。

3.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(2)所述将含有MSC的3D打印基质进行交联的具体方法为：将载有MSC的3D打印基质用浓度为2％-3％的氯化钙溶液交联8-12min，氯化钙溶液浸没3D打印基质。

4.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，步骤(3)进行培养获得汗腺细胞具体包括以下步骤：先将交联后的载有MSC的3D打印基质用DMEM培养基培养3天，3天后再用汗腺专用培养基培养，所述DMEM培养基和所述汗腺专用培养基均是每两天更换一次；培养基培养的条件为放置于37℃，5％CO₂的无菌培养箱中培养。

5.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述DMEM培养基是在DMEM培养基原液中加入5-15％(v/v)的胎牛血清FBS，0.8-1.2％(v/v)双抗溶液，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

6.如权利要求4所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述汗腺专用培养基是将DMEM培养基原液和DMEM/F12培养基原液按1:1的比例混合，充分混匀后加入1-3ng/mL三碘甲状腺原氨、4-6％(v/v)胎牛血清FBS、8-12ng/mLEGF、0.3-0.5μg/mL半琥珀酰氢化考的松、0.8-1.2％(v/v)双抗溶液和0.8-1.2mL/100mLITS，所述双抗溶液为青霉素-链霉素混合液。

7.如权利要求1所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述生物墨水通过以下方法制备而成：

称取3.5-4.5重量份的海藻酸钠和9-11重量份的明胶均匀混合，置入装有90-110重量份的超纯水中搅拌均匀制得海藻酸钠-明胶混悬液；待海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水时，制得生物墨水。

8.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，所述海藻酸钠与所述明胶、超纯水的质量比为4:10:100。

9.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，将海藻酸钠与明胶置入超纯水中搅拌均匀后，还包括以下步骤：将海藻酸钠-明胶混悬液于40-80℃条件下放置8-20小时，即可使海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水中。

10.如权利要求7所述的基于3D生物打印技术高效诱导间充质干细胞向汗腺分化的方法，其特征在于，海藻酸钠-明胶混悬液中的海藻酸钠和明胶完全溶解于超纯水后还包括以下步骤：将打印基质通过巴氏消毒法灭菌，灭菌条件为：在60-80℃条件下灭菌10-60分钟；再在1-8℃条件下灭菌3-10分钟，循环交叉灭菌3次。

Images