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CN111848707A - 一种甾体类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种甾体类化合物、其制备方法及其应用 Download PDF

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CN111848707A
CN111848707A CN202010906073.2A CN202010906073A CN111848707A CN 111848707 A CN111848707 A CN 111848707A CN 202010906073 A CN202010906073 A CN 202010906073A CN 111848707 A CN111848707 A CN 111848707A
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Abstract

本发明公开了一种甾体类化合物、其制备方法及其应用，甾体类化合物，其结构式为：
Figure DDA0002661508530000011
本发明甾体类化合物，可用于果蔬等食品的防腐；且源于天然植物资源，安全可靠、易降解。

Description

一种甾体类化合物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种甾体类化合物、其制备方法及其应用，属于甾体类化合物领域。
背景技术
随着生活水平提高，越来越多人开始关注果蔬等食品中在贮藏过程中防腐剂安全问题。传统的防腐剂，有苯并咪唑类(如多菌灵、特克多、托布津等)、仲丁胺及其衍生物、鲜宝、百毒杀等，均为化学合成，超剂量用药现象在一些地区或作物上比较普遍，对农产品质量安全构成风险。
气调、冷藏等物理保鲜方法虽然能有效延缓果蔬采后生理生化过程，保持水果新鲜度，但其缺点在于：一旦离开原物理环境，特别是受机械损伤后易受微生物、特别是霉菌浸染，发生霉变腐烂。因此，化学防腐成为不可或缺的水果保鲜方法，而研究开发新型高效安全天然的植物防腐保鲜剂，对于果品防腐保鲜等领域具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种甾体类化合物、其制备方法及其应用，本发明甾体类化合物可用于果蔬等食品的防腐，且源于天然资源，环境友好、对人及动物等非靶标安全。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种甾体类化合物，其结构式为：
Figure BDA0002661508510000011
一种甾体类化合物的用途，用于制备抗霉菌剂，甾体类化合物的结构式为：
化合物1：
Figure BDA0002661508510000021
化合物2：
Figure BDA0002661508510000022
化合物3：
Figure BDA0002661508510000023
化合物4：
Figure BDA0002661508510000024
化合物5：
Figure BDA0002661508510000025
化合物6：
Figure BDA0002661508510000026
化合物7：
Figure BDA0002661508510000027
化合物8：
Figure BDA0002661508510000028
化合物9：
Figure BDA0002661508510000029
化合物10：
Figure BDA00026615085100000210
化合物11：
Figure BDA00026615085100000211
或化合物12：
Figure BDA00026615085100000212
制备抗霉菌剂时，上述甾体类化合物的用量为0.5-2.0g/L。
上述甾体类化合物的制备方法，包括如下步骤：
A、将开口箭根茎用95％乙醇热回流提取2～4次，每次热回流2～4h，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
B、将总浸膏用纯水混悬，用体积比为1:1～3:1的石油醚和乙酸乙酯的混合物萃取2～4次，除去脂溶性杂质，水层用乙酸乙酯等体积萃取4～6次，合并上层乙酸乙酯层，减压浓缩至浸膏，30-50℃真空干燥至干；
C、将步骤B所得物料采用硅胶柱色谱依次用体积比为0～100:1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为的0～20:1乙酸乙酯-乙醇进行梯度洗脱，经TLC检测(薄层色谱)后，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩，蒸干溶剂后，选取抑制霉菌最好、得率最高的样品作为目标样品；
D、将步骤C所得的目标样品用中低压柱色谱进行梯度洗脱，洗脱剂为体积比为(0～1)：(1～3)的石油醚-乙酸乙酯和体积比为(0～9)：(1～9)的乙酸乙酯-甲醇,通过TLC检测，合并成分相似的流分，减压浓缩后，经反相半制备高效液相色谱(HPLC)分离得到化合物1-11。
上述制备方法，无需大孔树脂柱分离，洗脱液易浓缩，且所用溶剂毒性小。
申请人经研究发现，上述化合物1-12对霉菌均有一定程度的抑制作用，且均源于生物资源，绿色环保，不仅明确了开口箭中抑制霉菌的有效成分，且为合成绿色环保的抑霉菌剂提供了依据。
为了进一步提高各化合物的得率，步骤C中，石油醚-乙酸乙酯分为十二个梯度进行洗脱，分别为100:1/50:1/20:1/10:1/8:1/4:1/2:1/1:1/1:2/1:5/1:10/0:1；乙酸乙酯-乙醇分为六个梯度进行洗脱，分别为20:1/10:1/5:1/2:1/1:1/0:1。
为了进一步提高各化合物的得率，步骤D中，石油醚-乙酸乙酯分为三个梯度进行洗脱，分别为1:1/1:3/0:1；步骤D中，乙酸乙酯-甲醇分为七个梯度进行洗脱，分别为90:10/85:15/75:25/50:50/30:70/10:90/0:1。
本发明未提及的技术均参照现有技术。
本发明甾体类化合物，可用于果蔬等食品的防腐；且源于天然植物资源，对人及动物安全、环境友好。
附图说明
图1为本发明实施例1中所得化合物1的1H-NMR图谱；
图2为本发明实施例1中所得化合物1的13C-NMR图谱；
图3为本发明实施例1中所得化合物2和3的1H-NMR图谱；
图4为本发明实施例1中所得化合物2和3的13C-NMR图谱；
图5为本发明实施例1中所得化合物4的1H-NMR图谱；
图6为本发明实施例1中所得化合物4的13C-NMR图谱；
图7为本发明实施例1中所得化合物5的1H-NMR图谱；
图8为本发明实施例1中所得化合物5的13C-NMR图谱；
图9为本发明实施例1中所得化合物6的1H-NMR图谱；
图10为本发明实施例1中所得化合物6的13C-NMR图谱；
图11为本发明实施例1中所得化合物7的1H-NMR图谱；
图12为本发明实施例1中所得化合物7的13C-NMR图谱；
图13为本发明实施例1中所得化合物8的1H-NMR图谱；
图14为本发明实施例1中所得化合物8的13C-NMR图谱；
图15为本发明实施例1中所得化合物9的1H-NMR图谱；
图16为本发明实施例1中所得化合物9的13C-NMR图谱；
图17为本发明实施例1中所得化合物11和12的1H-NMR图谱；
图18为本发明实施例1中所得化合物11和12的13C-NMR图谱；
图19为本发明化合物对指状青霉的抑制效果图；
图20为本发明化合物对匍枝根霉的抑制效果图。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
甾体类化合物的提取：
取开口箭根茎7kg，用95％乙醇热回流提取3次，每次3h，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏，将总浸膏用纯水混悬，用石油醚:乙酸乙酯(v/v＝1:1～3:1)萃取3次，除去脂溶性杂质，水层用乙酸乙酯等体积萃取5次，合并上层乙酸乙酯层，减压浓缩至浸膏，35-45℃真空干燥至干。取乙酸乙酯萃取物70g，采用硅胶柱色谱依次用石油醚-乙酸乙酯体系(其中V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝100:1/50:1/20:1/10:1/8:1/4:1/2:1/1:1/1:2/1:5/1:10/0:1)和乙酸乙酯-乙醇体系(其中：V(乙酸乙酯):V(乙醇)＝20:1/10:1/5:1/2:1/1:1/0:1)进行梯度洗脱，每500mL～600mL收集一瓶，按收集顺序编号后，经薄层色谱(TLC)检测，根据薄层色谱显色情况分析后，确定成分大致相同的流分，合并后，减压浓缩，蒸干溶剂后，得到18个部位，编号：Fr.1～18。经初步抑制霉菌活性筛选(匍枝根霉和指状青霉)，发现Fr.14号抑菌效果最好、得率最高。取Fr.14样品10g，用中低压柱色谱进行梯度洗脱，洗脱剂依次为石油醚-乙酸乙酯体系(其中V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝1:1/1:3/0:1)和乙酸乙酯-甲醇体系(其中V(乙酸乙酯):V(甲醇)＝90:10/85:15/75:25/50:50/30:70/10:90/0:1),每15mL收集一管，按洗脱顺序编号后，经TLC分析，合并成分大致相同的流分，减压浓缩后得到Fr.14-1～15。其中：Fr.14-9经反相半制备高效液相色谱(PHPLC)分离得到化合物4和化合物5，Fr.14-12经PHPLC分离得到化合物6和7，Fr.14-14经PHPLC分离得到化合物1,2,3,11和12；Fr.14-15经PHPLC分离得到化合物8，9和10。
表1为化合物1-12的结构式
Figure BDA0002661508510000041
Figure BDA0002661508510000051
Figure BDA0002661508510000061
化合物1的鉴定
化合物1，白色无定形粉末，易溶于DMSO,氯仿，甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z675.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C35H56O11。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)谱中1.09(3H,s,H-19),0.93(3H,d,J＝6.6Hz,H-21),0.71(3H,s,H-18)分别为甾体类苷元的三个角甲基典型氢信号，1.01(3H,d,J＝7.1Hz)为螺甾27位甲基信号。δH 4.40,4.05分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号,δ4.29处为糖的端基氢信号,2.02(d,J＝5.2Hz,3H)显示了乙酰基上的甲基氢信号。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)谱中，δ16.60(C-18),14.92(C-21),13.28(C-19).为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，16.40为27位螺甾甲基碳信号。δ109.35是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有3个碳信号，分别是δ74.67(C-3),74.25(C-1),74.10(C-7)，δ101.67(C-1')是糖的端基碳信号，δ170.81,21.18的碳信号再次证实了乙酰基的存在。通过1D,2D NMR综合分析，对化合物1进行了全归属，详见表2。
化合物2的鉴定
化合物2，白色无定形粉末，易溶于氯仿，DMSO,甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z657.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C35H54O10，其不饱和度为Ω＝8，推测可能为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)谱中1.07(s,3H,H-19),0.90(d,J＝6.7Hz,3H,H-21),0.73(s,3H,H-18)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.87,2.93分别为4位和3位的连氧次甲基氢信号。δ4.17处为糖的端基氢信号,1.97(s,3H)显示了乙酰基上的甲基氢信号。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)谱中，δ16.42(C-18),15.07(C-21),14.16(C-19).为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，17.55为27位甲基碳信号，处于较高场，说明27位为R构型。δ109.37是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ137.48,125.09是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ77.39(C-4),73.80(C-3),，δ102.16(C-1')是糖的端基碳信号,δ169.95，21.92的碳信号再次证实了乙酰基的存在。综合分析，对化合物2进行了全归属，详见表3。
化合物3的鉴定
化合物3，白色无定形粉末，易溶于氯仿，DMSO,甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z657.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C35H54O10,其不饱和度为Ω＝8，推测可能为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)谱中1.07(s,3H,H-19),0.93(d,J＝6.9Hz,3H,H-21S),0.73(s,3H,H-18),为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.87,2.93分别为4位和3位的连氧次甲基氢信号,δ4.17处为糖的端基氢信号,δ169.95，21.92的碳信号再次证实了乙酰基的存在。13C NMR(151MHz,DMSO-d6)谱中，δ16.42(C-18),14.90(C-21),14.16(C-19).为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，16.53为27位甲基碳信号,处于较高场，说明27位为S构型。δ108.6是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ137.48,125.09是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ77.39(C-4),73.80(C-3)，δ102.16(C-1')是糖的端基碳信号。综合分析，对化合物3进行了全归属，详见表3。
表2本发明化合物1的1H-NMR和13C-NMR谱数据(600Mz,DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000071
表3本发明化合物2和3的1H-NMR和13C-NMR谱数据(600Mz,DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000081
化合物4的鉴定
化合物4，白色粉末，易溶于DMSO，微溶于氯仿，难溶于水、甲醇、乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z 573.3[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR和DEPT谱，推测该化合物的分子式为C29H42O10，其不饱和度为Ω＝9，推测为开口箭属植物中典型的甾体类化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)谱中δ0.75(3H,s,H-18),0.92(3H,s,H-19)和0.925(3H,d,J＝5.85Hz,H-21)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号，4.74(1H,s,H-27a)和4.77(1H,s,H-27b)为27位双键的两个氢信号。δ3.787(1H,d,J＝9.05Hz H-1),4.908(1H,s,H-2),4.025(1H,t,J1＝2.85Hz,J2＝2.70Hz,H-3),4.855(d,1H,J＝4.1Hz,H-4),3.879(1H,s,H-7)，分别为1，2，3，4和7位的连氧次甲基氢信号。δ3.83(1H,d,J＝12.0Hz,H-26a)和4.13(1H，d,J＝12.0,H-26b)为26位亚甲基两个氢信号。δ2.07(3H,s,H-29)为连羰基碳的甲基氢信号，结合碳谱δ170.17处羰基碳信号推测其含有乙酰基。13C NMR(75MHz,DMSO-d6)谱中，δ15.71(C-18),11.97(C-19)和14.44(C-21)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，δ108.77是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ209.01是C-6位羰基碳信号，δ143.28和δ108.60为C-25，C-27位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm有5个碳信号δ71.87,69.88,71.58,69.14,73.87，分别为C-1，C-2，C-3，C-4和C-7的连氧次甲基碳信号。结合H-H COSY，HMBC,HSQC等2D-NMR综合分析，鉴定了该化合物的结构，对化合物4进行了全归属，详见表4。
化合物5的鉴定
化合物5，白色粉末，易溶于DMSO，微溶于氯仿，难溶于水、甲醇、乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z 575.3[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR和DEPT谱，推测该化合物的分子式为C29H44O10，其不饱和度为Ω＝8，推测为开口箭属植物中典型的甾体类化合物。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)谱中δ0.73(3H,s,H-18),0.92(3H,s,H-19),0.97(3H,d,J＝5.85Hz,H-21)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号，1.05(1H,d,J＝6.7Hz)为27位甲基氢信号)。H 3.80(1H,d,J＝10.0Hz,H-1),4.91(1H,s,H-2),4.03(1H,t,J＝2Hz,H-3),4.83(d,1H,J＝4.1Hz,H-4),3.83(1H,t,J＝2.0Hz,H-7)，分别为1，2，3，4和7位的连氧次甲基氢信号。δ3.85(1H,dd,J1＝11.0Hz,J2＝2.0Hz,H-26a)和3.28(1H,d,J＝11.3Hz,H-26b)为26位亚甲基两个氢信号。δ2.02为连羰基碳的甲基氢信号，结合碳谱δ170.17处羰基碳信号推测其含有乙酰基。13CNMR(75MHz,DMSO-d6)谱中，δ15.71(C-18),11.97(C-19)和14.44(C-21)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，δ108.77是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ209.01是C-6位羰基碳信号。另外，在中低场区65-80ppm有5个碳信号δ71.8,69.8,71.5,69.1,73.8分别为C-1，C-2，C-3，C-4和C-7的连氧次甲基碳信号。结合H-H COSY，HMBC,HSQC等2D-NMR综合分析，鉴定了该化合物的结构，对化合物5进行了全归属，详见表5。
化合物6的鉴定
化合物6，白色无定形粉末，易溶于DMSO，微溶于氯仿，难溶于水、甲醇、乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z 531.3[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C27H40O9，其不饱和度为Ω＝8，推测为开口箭属植物中典型的甾体类化合物。化合物1的1HNMR(500MHz,DMSO-d6)谱中δ0.75(3H,s,H-18)，0.92(3H,s,H-19)和0.92(3H,s,H-21)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号，4.81(1H,s,H-27a)和4.78(1H,s,H-27b)为27位双键的两个氢信号。δH 3.74(1H,s,H-1),4.08(2H,s,H-2,H-4),3.59(1H,s,H-3)和4.337(1H,m,H-7)分别为H-1，H-2，H-4，H-3和H-7的连氧次甲基氢信号。4.16(1H,d,J＝12.0Hz,H-26a),4.31(1H,d,J＝12.0Hz,H-26b)为26位亚甲基两个氢信号。13C NMR(75MHz,DMSO-d6)谱中，δ15.78(C-18),12.21(C-19),14.60(C-21)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，δ108.77是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ209.35是C-6位羰基碳信号，δ143.40和108.89为C-25，C-27位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm有5个碳信号δ71.87,66.06,74.13,69.55,73.86，分别为C-1，C-2，C-3，C-4和C-7的连氧次甲基碳信号。在IR中显示出强的多羟基的吸收峰3355cm-1，及-C＝O伸缩振动的吸收峰1715cm-1。综合分析，NMR核磁图谱及红外光谱图，对化合物6进行了全归属，详见表6。
表4本发明化合物4的1H-NMR,13C-NMR，H-H COSY,HMBC数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000101
表5本发明化合物5的1H-NMR和13C-NMR数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000111
化合物7的鉴定
化合物7：白色粉末，易溶于DMSO，微溶于氯仿，难溶于水、甲醇、乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z 533.3[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C27H42O9，其不饱和度为Ω＝7，化合物不含苯环，推测可能为开口箭属植物中典型的多元环状的甾体类化合物。化合物2的1H NMR(500MHz,DMSO-d6)谱中δ0.97(d,J＝6.9Hz,3H,H-21),0.91(s,3H,H-19)和0.73(s,3H,H-18)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号，1.04(d,J＝6.9Hz,3H,H-27)为27位甲基氢信号。δ3.84(s,1H,H-1),4.57(s,1H,H-2),4.08(s,1H,H-3),4.80(d,J＝9.1Hz,1H,H-4)和3.90(s,1H,H-7)，分别为H-1，H-2，H-3，H-4和H-7的连氧次甲基氢信号。δ3.82(d,J＝16.4Hz,1H)和3.25(d,J＝11.2Hz,1H)为26位亚甲基两个氢信号。13C NMR(75MHz,DMSO-d6)谱中，δ15.77(C-18),14.37(C-21),12.09(C-19)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，δ15.93为27位甲基碳信号,δ108.92是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ209.24是C-6位羰基碳信号。另外，在中低场区65-80ppm有5个碳信号δ74.03,69.43,73.75,65.95和74.76，分别为C-1，C-2，C-3，C-4和C-7的连氧次甲基碳信号。在IR中显示出强的多羟基的吸收峰3362cm-1，及-C＝O伸缩振动的吸收峰1716cm-1。.综合分析，NMR核磁图谱及红外光谱图，对化合物7进行了全归属，详见表6。
表6本发明化合物6和7的1H-NMR和13C-NMR谱数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000121
化合物8的鉴定
化合物8，白色无定形粉末，易溶于氯仿，易溶于甲醇、乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z 613.4[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C33H50O9，其不饱和度为Ω＝9，且无苯环结构，推测为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。化合物3的1HNMR(600MHz,Chloroform-d)谱中1.05(s,3H,H-19),0.99(d,J＝6.4Hz,3H,H-21),0.83(s,3H,H-18).为甾体类苷元的三个角甲基氢信号，4.80(1H,s,H-27a)和4.77(1H,s,H-27b)为27位双键的两个氢信号。δH 4.47，4.04分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号。4.32(d,J＝12.0Hz,1H,H-26b),3.86(d,H,J1＝12.6)为26位亚甲基两个氢信号。δ5.12处给出糖的端基氢信号。13C NMR(151MHz,Chloroform-d)谱中，δ16.40(C-18),14.65(C-21),12.67(C-19)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，δ109.43是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ138.56,125.05是C-5，C-6位双键碳信号，δ143.66和108.65为C-25，C-27位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ75.68(C-3)和73.14(C-1)，δ100.98(C-1')是糖的端基碳信号。综合分析，对化合物8进行了全归属，详见表7。
表7本发明化合物8的1H-NMR和13C-NMR谱数据(DMSO-d6)
Figure BDA0002661508510000131
化合物9的鉴定
化合物9，白色无定形粉末，易溶于氯仿，甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z615.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C33H52O9，其不饱和度为Ω＝8，推测为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。化合物3的1H NMR(600MHz,Chloroform-d)谱中1.04(s,3H,H-19),0.98(d,J＝6.3Hz,3H,H-21),0.79(d,6H,J＝6.0,H-18,H-27).为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.40，4.03分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号。δ5.32处为糖的端基氢信号。13C NMR(151MHz,Chloroform-d)谱中，δ16.41(C-18),14.63(C-21R),12.69(C-19).为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，17.17为27位甲基碳信号。δ109.79是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ138.51,125.12是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ74.71(C-3)和73.11(C-1)，δ100.91(C-1')是糖的端基碳信号。综合分析，对化合物9进行了全归属，详见表8。
表8本发明化合物9和10的1H-NMR和13C-NMR谱数据(Chloroform-d)
Figure BDA0002661508510000141
化合物10的鉴定
化合物10，白色无定形粉末，易溶于氯仿，甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z615.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C33H52O9，其不饱和度为Ω＝8，推测可能为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。1H NMR(600MHz,Chloroform-d)谱中1.09(d,J＝6.7Hz,3H,H-27S),1.04(s,3H,H-19),0.98(d,J＝6.3Hz,3H,H-21)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.40，4.03分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号。δ5.32处为糖的端基氢信号。13C NMR(151MHz,Chloroform-d)谱中，δ16.41(C-18),14.44(C-21S),12.69(C-19).为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，16.08为27位甲基碳信号。δ109.31是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ138.51,125.12是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ74.71(C-3)和73.11(C-1)，δ100.91(C-1')是糖的端基碳信号。综合分析，对化合物10进行了全归属，详见表8。
表9本发明化合物11和12的1H-NMR和13C-NMR谱数据(Chloroform-d)
Figure BDA0002661508510000151
化合物11的鉴定
化合物11，白色无定形粉末，易溶于氯仿，甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z657.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C35H54O10，其不饱和度为Ω＝8，推测可能为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)谱中1.07(s,3H,H-19),1.01(d,J＝6.7Hz,3H,H-21),0.83(d,J＝6.0Hz,3H,H-18)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.40,4.03分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号。δ4.37处为糖的端基氢信号,2.14(d,J＝5.7Hz,3H)显示了乙酰基上的甲基氢信号。13CNMR(151MHz,Chloroform-d)谱中，δ16.38(C-18),14.56(C-21),12.60(C-19)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，17.14为27位甲基碳信号。δ109.87是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ138.16,125.23是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ74.57(C-3)和73.89(C-1)，δ101.26(C-1')是糖的端基碳信号，δ171.6，20.97的碳信号再次证实了乙酰基的存在。综合分析，对化合物11进行了全归属，详见表9。
化合物12的鉴定
化合物12，白色无定形粉末，易溶于氯仿，甲醇，乙醇。阳离子ESI-MS显示：m/z657.5[M+Na]+，结合1H NMR和13C NMR，推测该化合物的分子式为C35H54O10，其不饱和度为Ω＝8，推测可能为开口箭属植物中典型的含多元环的甾体类化合物。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)谱中1.07(s,3H,H-19),1.01(d,J＝6.7Hz,3H,H-21),0.83(d,J＝6.0Hz,3H,H-18)为甾体类苷元的三个角甲基氢信号。δH 4.40,4.03分别为1位和3位的连氧次甲基氢信号,δ4.37处为糖的端基氢信号,2.14(d,J＝5.7Hz,3H)显示了乙酰基上的甲基氢信号。13CNMR(151MHz,Chloroform-d)谱中，δ16.38(C-18),14.56(C-21),12.60(C-19)为甾体皂苷元上三个角甲基的特征碳信号，16.11为27位甲基碳信号。δ109.36是螺甾类化合物C-22位半缩醛碳的特征信号，δ138.16,125.23是C-5，C-6位双键碳信号。另外，在中低场区65-80ppm除了葡萄糖基的碳信号外，还有2个碳信号，分别是δ74.57(C-3)和73.89(C-1)，δ101.26(C-1')是糖的端基碳信号，δ171.6，20.97的碳信号再次证实了乙酰基的存在。综合分析，对化合物12进行了全归属，详见表9。
实施例2
抑制指状青霉试验
上述化合物对指状青霉的体外抑制活性实验，菌株为指状青霉Penicilliumdigitatum(ACCC 30389)，广谱性杀菌剂—多菌灵作为阳性对照。
抑制真菌实验方法：微量二倍稀释法：
将活化好的指状青霉菌制成孢子悬液，接种于96孔板中，设置阳性对照，阴性对照和空白对照，每隔24h用酶标仪在600nm下测吸光值，培养72h后，计算细胞增殖抑制率，并用Graphpad prism软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％。实验结果见表11和图19。
表10本发明化合物对指状青霉的抑制作用
Figure BDA0002661508510000161
从表10和图19的实验数据可知，本发明化合物1～12具有不同程度的体外抑制真菌活性。
实施例3
抑制匍枝根霉试验：
本发明化合物对匍枝根霉的体外抑制活性实验，菌株匍枝根霉(Rhizopusstolonifera ACCC36973)，阳性对照为广谱杀菌剂—多菌灵、常用防腐剂苯甲酸钠和山梨酸钾。
抑制真菌实验方法：微量二倍稀释法：
将活化好的匍枝根霉制成孢子悬液，接种于96孔板中，设置阳性对照，阴性对照和空白对照，每24h用酶标仪在600nm下检测吸光值，培养72h后，计算细胞增殖抑制率，并用Graphpad prism软件计算被测试样品的半数抑制浓度(IC50)。
细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值平均值-样品组OD值平均值)÷(阴性对照组OD值平均值-空白对照组OD值平均值)×100％。实验结果见表11和图20。
表11本发明化合物对匍枝根霉的抑制作用
Figure BDA0002661508510000171
从表12和图20的实验数据可知，本发明化合物1～12具有不同程度的体外抑制真菌活性。

Claims (8)

1.一种甾体类化合物，其特征在于：其结构式为：
Figure FDA0002661508500000011
2.一种甾体类化合物的用途，其特征在于：用于制备抗霉菌剂，甾体类化合物的结构式为：
化合物1：
Figure FDA0002661508500000012
化合物2：
Figure FDA0002661508500000013
化合物3：
Figure FDA0002661508500000014
化合物4：
Figure FDA0002661508500000015
化合物5：
Figure FDA0002661508500000016
化合物6：
Figure FDA0002661508500000017
化合物7
Figure FDA0002661508500000021
化合物8：
Figure FDA0002661508500000022
化合物9：
Figure FDA0002661508500000023
化合物10：
Figure FDA0002661508500000024
化合物11：
Figure FDA0002661508500000025
或化合物12：
Figure FDA0002661508500000026
3.如权利要求2所述的甾体类化合物的用途，其特征在于：甾体类化合物的用量为0.5-2.0g/L。
4.一种权利要求2或3所述的甾体类化合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
A、将开口箭根茎用95％乙醇热回流提取2～4次，每次热回流2～4h，合并提取液减压回收溶剂，得总浸膏；
B、将总浸膏用纯水混悬，用体积比为1:1～3:1的石油醚和乙酸乙酯的混合物萃取2～4次，除去脂溶性杂质，水层用乙酸乙酯等体积萃取4～6次，合并上层乙酸乙酯层，减压浓缩至浸膏，30-50℃真空干燥至干；
C、将步骤B所得物料采用硅胶柱色谱依次用体积比为0～100:1的石油醚-乙酸乙酯和体积比为的0～20:1乙酸乙酯-乙醇进行梯度洗脱，经TLC检测后，合并成分相似的洗脱液，减压浓缩，蒸干溶剂后，选取抑制霉菌最好、得率最高的样品作为目标样品；
D、将步骤C所得的目标样品用中低压柱色谱进行梯度洗脱，洗脱剂为体积比为(0～1):(1～3)的石油醚-乙酸乙酯和体积比为(0～9):(1～9)的乙酸乙酯-甲醇,通过TLC检测，合并成分相似的流分，减压浓缩后，经反相半制备高效液相色谱分离得到化合物1～12。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤C中，石油醚-乙酸乙酯分为十二个梯度进行洗脱，分别为100:1/50:1/20:1/10:1/8:1/4:1/2:1/1:1/1:2/1:5/1:10/0:1。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤C中，乙酸乙酯-乙醇分为六个梯度进行洗脱，分别为20:1/10:1/5:1/2:1/1:1/0:1。
7.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤D中，石油醚-乙酸乙酯分为三个梯度进行洗脱，分别为1:1/1:3/0:1。
8.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于：步骤D中，乙酸乙酯-甲醇分为七个梯度进行洗脱，分别为90:10/85:15/75:25/50:50/30:70/10:90/0:1。
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