CN111830168B - 一种泊洛沙姆的lc-hr-ms/ms定量分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种泊洛沙姆的LC‑HR‑MS/MS定量分析方法，该方法具体包括：先分别制备待检测液和标准液；然后进行液相色谱‑质谱联用检测分析；其中，高效液相色谱法采用PLRP‑S Reversed‑Phase Column色谱柱，进行梯度洗脱；洗脱中以0.1％‑0.3％甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1％‑0.3％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相；质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5000～6000V，离子源温度：450～550℃，碰撞能量：40～50eV；再根据峰面积比值计算待检测液中泊洛沙姆的含量。本发明是一种选择性强、灵敏度高且分析时间短的泊洛沙姆的LC‑HR‑MS/MS定量分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物辅料的分析方法，具体涉及一种泊洛沙姆的LC-HR-MS/MS定量分析方法。
背景技术
泊洛沙姆具有独特的理化性质和良好的生物相容性，被FDA批准作为食品添加剂、药物赋形剂和药物输送载体。近年来，泊洛沙姆在药剂学和生物医学领域的得到了广泛的应用。尽管关于泊洛沙姆的各种应用研究报道较多，但对其及相关制剂的药代动力学研究却不多。口服给药和基于泊洛沙姆原位凝胶的局部给药后，泊洛沙姆能否吸收进入血循环尚无文献报道。不同分子量的泊洛沙姆在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程还不是十分清楚。
迄今为止，文献报道的泊洛沙姆体内外定量分析方法主要包括比色法、放射标记法、尺寸排阻色谱法等。(1)比色法：主要是以硫氰酸钴或碘-碘化钾为显色剂，该方法灵敏度低，重现性和选择性差，只可粗略估计样品中泊洛沙姆的含量。(2)放射性标记法：是将同位素(如14C)标记到泊洛沙姆的碳骨架上，通过检测样品中的放射性原子量来对泊洛沙姆定量。但放射性同位素对环境可造成污染，难以应用于人体试验中，标记泊洛沙姆必须在具有特殊防护设备实验室完成，没有建立明确的方法学来说明标记前后泊洛沙姆的药代参数是否发生改变。(3)尺寸排阻色谱法(SEC)：又称凝胶渗透色谱法，主要用于大分子物质的分离。该方法已报道的检测器有示差折射率检测器、蒸发光散射检测器和质谱检测器。示差折射率检测器可用于泊洛沙姆188的体内含量测定，定量下限为25μg/mL，灵敏度较低，基线不稳定，平衡时间较长。蒸发光检测器和电喷雾质谱(ESI-MS)测定伊曲康唑注射液中泊洛沙姆188含量，前者定量下限为25μg/mL，线性范围窄；后者采用选择离子监测模式，以最强峰m/z 976.4作为泊洛沙姆188定量的跟踪离子，由于泊洛沙姆的分子量不唯一且呈正态分布，在ESI电离模式下带多电荷，因此，仅仅选择某个特定的离子进行分析会丢失很多其他离子的信息，不能够获得全部信息采集。这些分析方法无法准确评价泊洛沙姆质量的优劣，无法避免相同质荷比的化学噪音干扰，无法精准评价体内药动学行为。因此，亟需开发一种灵敏度高、选择性好的能够满足体内泊洛沙姆含量测定的方法，为其药代动力学研究提供良好的方法学基础。
发明内容
本发明提供一种泊洛沙姆的LC-HR-MS/MS定量分析方法，尤其是针对泊洛沙姆188；其目的主要在于建立一种选择性强、灵敏度高且分析时间短的LC-HR-MS/MS定量分析方法，并且能为其他种类型的泊洛沙姆体内定量分析提供方法借鉴。本发明提供的所提供的定稿分析方法，为后续泊洛沙姆药代动力学研究提供良好的基础，并且为该聚合物的药理研究和安全性评价提供一定的参考。
所述LC-HR-MS/MS定量分析方法，包括如下步骤：
1)分别制备待测样品溶液和标准样品溶液；并在所述待测样品溶液和标准样品溶液中加入内标工作液；
2)将所述标准样品溶液和待测样品溶液进行液相色谱-质谱联用检测分析；
其中，高效液相色谱法采用PLRP-S Reversed-Phase Column色谱柱，以0.1％-0.3％甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1％-0.3％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3～4；按如下条件进行梯度洗脱：
0～1.4min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
1.4～1.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为由40％增加至65％；
1.5～3.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为65％；
3.0～3.1min：流动相B占流动相总体积的百分比为由65％增加至95％；
3.1～4.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为95％；
4.5～4.6min：流动相B占流动相总体积的百分比为90％减少至40％；
4.6～6.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
其中，质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5000～6000V，离子源温度：450～550℃，碰撞能量：40～50eV；
3)计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量。
其中，本发明所述高效液相色谱法中所提供的Agilent PLRP-S Reversed-Phase色谱柱的孔径为
吸附泊洛沙姆188效果显著，且不易被干扰。
本发明进一步提出的，所述待测样品溶液中的样品为血浆或脏器的待检测液；所述待检测液采用沉淀蛋白法处理，获得所述待测样品溶液。具体而言，以血浆为待检测液时，直接加入溶剂进行蛋白沉淀；若以脏器为待检测液时，先将脏器加生理盐水打碎，制备成匀浆液(即为下述的预处理)；然后再加入溶剂进行蛋白沉淀。
优选的，所述沉淀蛋白法处理具体为：以0.1％-0.3％甲酸的乙腈和异丙醇为沉淀试剂，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3～4；将沉淀试剂按体积比为3～5:1加入待检测液中进行沉淀蛋白；涡旋后高速离心，取上清液，即得所述待测样品溶液；
在实际操作中，待检测液和内标工作液可同时加入沉淀试剂；若待检测液和内标工作液的体积比为1:1时，经蛋白沉淀后，待测样品溶液与内标工作液的体积比约等为1:1。
更优选的，所述脏器还包括预处理，具体为：将离体脏器搅碎至匀浆液，高速离心取上清液，获得待检测液；
本发明进一步提出的，所述标准溶液采用如下方式制得：
配置2.5～250μg/mL至少6个梯度的泊洛沙姆标准液；所述泊洛沙姆标准液的溶剂为体积比2:2.5～3.5的乙腈和水。在实际操作中，可先配置高浓度的泊洛沙姆标准液；然后加入一定比例的空白血浆进行混合。
本发明进一步提出的，所述待测样品溶液和所述标准样品溶液中加入有内标工作液，其中，所述内标工作液为0.8～1.2μg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:2.5～3.5的乙腈和水。
最优选的，所述内标工作液为1μg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:3的乙腈和水。
其中，所述待测样品溶液与所述内标工作液的体积比为1:0.8～1.2，优选为1:1；所述标准样品溶液与所述内标工作液的体积比为1:0.8～1.2，优选为1:1。
本发明采用辛伐他汀为内标，能够提高定量分析的准确度和精密度，可保证定量分析方法更加稳定。通常，稳定同位素标记内标和结构类似物内标能够更好地提高分析的准确度与精密度，但泊洛沙姆188作为高分子聚合物，难以合成出其稳定同位素标记内标，因此本发明选择小分子的化合物辛伐他汀作为内标。该内标物与泊洛沙姆188具有相似的保留时间，产生的用于定量的离子碎片不同，不会对泊洛沙姆188产生交叉干扰，且灵敏度和重现性较好。
本发明进一步提出的，所述高效液相色谱法的条件至少还包括如下一项：
柱温35～45℃，
流速0.7～0.9mL/min；
自动进样器温度12～18℃；
优选的，所述高效液相色谱法的条件至少还包括如下一项：
以0.1％甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3；
柱温40℃，
流速0.8mL/min；
自动进样器温度15℃。
本发明所述高效液相色谱法中的流动相A为甲酸、乙腈和异丙醇的混合；在实验过程中发现，向其加入了洗脱能力更强的异丙醇后，分析物的残留有所减少，峰宽变窄；且不同比例的乙腈和异丙醇其效果有较为明显的差异；当比例为乙腈：异丙醇(2:3，v/v)的洗脱效果最好，峰型最佳。此外，本发明提供的流动相A中再加入0.1％甲酸，可显著改善离子化效率和色谱峰峰型。
本发明在采用上述流动相的基础上，进一步优化其梯度洗脱的方式。在实验过程中，发现泊洛沙姆188在40％的有机相中能够保留到色谱柱上，在泊洛沙姆188在65％的有机相中响应最高且峰型最好。但因65％的有机相不能够完全冲洗掉生物样品中的干扰组分，因此在梯度最后又采取了95％的有机相进行干扰组分的冲洗。
此外，流速、柱温及自动进样器温度对洗脱效率共同影响着。流速越大，色谱柱的柱压越高，对其峰型也有一定的影响，最终确定流速为0.8mL/min。柱温及自动进样器的温度也会影响柱效，合适的温度能够使分析物灵敏度更高。
本发明进一步提出的，所述质谱法的条件至少还包括如下一项：
气帘气：30～40psi；
GS1:35～55psi；优选35～45psi；
GS2:35～55psi；优选35～45psi；
解簇电压：90～110V；
碰撞能量：40～50eV；
MSALL扫描范围：50-1250Da；
提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01Da；
优选的，所述质谱法的条件为：离子喷雾电压：5500V、离子源温度：500℃、气帘气：35psi、GS1:40psi、GS2:40psi、解簇电压：100V、碰撞能量：45eV、MSALL扫描范围：50-1250Da、提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01Da。
本发明所提供的质谱法采用电喷雾离子化，其离子化效率高，更适用于分析泊洛沙姆188这类高分子聚合物和强极性化合物。
为了尽可能除去其他泊洛沙姆188的干扰离子，且保证定量下限信号强度的前提下，本发明提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度为±0.01Da，该提取窗口宽度信噪比高。
本发明在探索泊洛沙姆188的质谱裂解规律，进行了泊洛沙姆在不同质谱扫描方式下的比较研究与可行性分析，研究发现TOF MS扫描模式是定量泊洛沙姆188的有效方法。
在优化CE的过程中发现，当CE的能量较小时，泊洛沙姆188碎片离子的分布是由质荷比相对大的碎片离子组成，虽然选择性可能会更好，但是这些前体离子响应很低，可以造成定量结果的灵敏度低，而且并不是所有的泊洛沙姆188分子都能产生这些相同的碎片，不具有可替代性。随着CE能量的增大，不可计数的泊洛沙姆188前体离子逐渐被裂解为有限的几个单电荷离子，这些单电荷离子是泊洛沙姆188分子的共有结构，适合作为定量离子。
TOF MS扫描模式与前体离子扫描模式相比，能够将无限的研究分析对象转化成有限的特征离子，使得多分散性的聚合物定量分析成为了可能。而且TOF MS模式的二级离子稳定性好，重现性佳，且抗干扰能力强。TOF MS扫描模式与源内裂解方式相比，其CE的能量大，使泊洛沙姆188聚合物的裂解很充分，特征碎片离子的响应就大大提高。且所有的泊洛沙姆188离子都可以被打碎，给定量的准确度也提供了保障。
本发明进一步提出的，所述步骤3)具体为：
将标准样品溶液进行LC-MS/MS定量分析，利用所述标准样品溶液与内标物的峰面积的比值，采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W＝1/X2；通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程；再根据待测样品溶液与内标物的峰面积比值进行比较，基于所述线性回归方程，计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量。
本发明提供一种优选方案，一种泊洛沙姆188的LC-MS/MS定量分析，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备待测样品溶液：将待检测液采用沉淀蛋白法处理；具体的：以0.1％-0.3％甲酸的乙腈和异丙醇为沉淀试剂，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3～4；将沉淀试剂按体积比为3～5:1的比例加入所述待检测液中，进行沉淀蛋白；涡旋后高速离心，取上清液，即得所述待测样品溶液；
其中，所述待检测液为待测血浆或经预处理后的待测脏器；所述预处理具体为：将离体脏器搅碎至匀浆液，高速离心取上清液，获得待检测液；
2)制备标准样品溶液：配置2.5～250μg/mL至少6个梯度的泊洛沙姆188标准液；所述泊洛沙姆标准液的溶剂为体积比2:2.5～3.5的乙腈和水。
其中，所述待测样品溶液和所述标准样品溶液中分别按1:0.8～1.2的体积比加入内标工作液；所述内标工作液为0.8～1.2μg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:2.5～3.5的乙腈和水；
3)将所述标准样品溶液和待测样品溶液进行液相色谱-质谱联用检测分析；
其中，高效液相色谱法采用PLRP-S Reversed-Phase Column色谱柱，以0.1％-0.3％甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1％-0.3％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3～4；按如下条件进行梯度洗脱：
0～1.4min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
1.4～1.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为由40％增加至65％；
1.5～3.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为65％；
3.0～3.1min：流动相B占流动相总体积的百分比为由65％增加至95％；
3.1～4.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为95％；
4.5～4.6min：流动相B占流动相总体积的百分比为90％减少至40％；
4.6～6.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
柱温为35～45℃，流速为0.7～0.9mL/min；自动进样器温度为12～18℃；
其中，质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5000～6000V，离子源温度：450～550℃，碰撞能量：40～50eV；气帘气：30～40psi；GS1:35～45psi；GS2:35～45psi；解簇电压：90～110V；碰撞能量：40～50eV；MSALL扫描范围：50-1250Da；提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01Da；
4)经LC-MS/MS定量分析，利用所述标准样品溶液与内标物的峰面积的比值，采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W＝1/X2；通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程；再基于所述待测样品溶液与内标物的峰面积比值进行比较，基于所述线性回归方程，计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量。
附图说明
图1为实施例提供的不同干扰组分的血浆色谱图；
图2为实施例提供的定量分析方法获得的标准曲线线性回归图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
如下实施例试剂和设备具体如下：
1、试剂
表1相关使用试剂
2、仪器
表2相关使用仪器
3、使用到的药品如下：
待测物：泊洛沙姆188，来源：北京MREDA公司，分子式：H(OCH2CH2)x(OCH2CHCH3)y(OCH2CH2)zOH，理论平均分子量：8400，纯度：99.9％，贮藏条件：室温，CAS号：9003-11-6；
内标：辛伐他汀，来源：美国Sigma公司，分子式：C25H38O5，理论分子量：418.57
本试验使用到的动物如下：
SPF级健康SD雄性大鼠，生长周龄7周左右，每只体重200±20g，许可证号为SCXK(辽)2015-0001。
大鼠空白血浆的制备：具体通过健康SD大鼠眼眶静脉丛采取全血，用高速离心机在13000r/min的转速下离心5min，取上清液。
实施例
本实施例提供一种泊洛沙姆的LC-MS/MS定量分析，包括如下步骤：
1)制备内标工作液：所述内标工作液为1μg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:3的乙腈和水。
具体而言，所述内标储备液(1mg/mL)的配制具体为：分析天平称取25.0mg辛伐他汀，置于25mL容量瓶中，加入少量乙腈-水(2:3，v/v)，震荡容量瓶，待辛伐他汀全部溶解后，加乙腈-水(2:3，v/v)定容至刻度线，得到终浓度为1.0mg/mL的辛伐他汀储备液；用乙腈-水(2:3，v/v)稀释至1μg/mL。
2)制备标准样品溶液：配置2.5～250μg/mL 7个梯度的泊洛沙姆188标准液，具体为250、125、75、25、12.5、7.5、2.5μg/mL；所述泊洛沙姆标准液的溶剂为体积比2:3的乙腈和水。
具体而言：分析天平称取25.0mg泊洛沙姆188，置于25mL容量瓶中，加入少量乙腈-水(2:3，v/v)，震荡容量瓶，待泊洛沙姆188全部溶解后，加乙腈-水(2:3，v/v)定容至刻度线，溶液呈澄清透明状，得到终浓度为1.0mg/mL的泊洛沙姆188储备液；然后用乙腈-水(2:3，v/v)溶液稀释至浓度为250、125、75、25、12.5、7.5、2.5μg/mL。在7个梯度的泊洛沙姆188标准液中按1:1的体积比加入内标工作液。
3)制备待测样品溶液：将待检测液采用沉淀蛋白法处理；具体的：以0.1％甲酸的乙腈和异丙醇为沉淀试剂，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3；将待检测液和内标工作液按体积比为1:1的比例加入所述溶剂中，进行沉淀蛋白；然后再进行高速离心，取上清液，即得所述待测样品溶液；其中，沉淀试剂与所述待检测液的体积为4:1。
其中，所述待检测液为待测血浆或经预处理后的待测脏器；所述预处理具体为：将离体脏器搅碎至匀浆液，高速离心取上清液，获得待检测液；
具体而言：待测血浆的待测样品溶液具体制备方法为：沉淀试剂为0.1％甲酸-乙腈：异丙醇(2:3，v/v)。在2mL抗吸附EP管中依次加入50μL内标工作液(1μg/mL)和50μL泊洛沙姆188未知样品，再加入200μL 0.1％甲酸-乙腈：异丙醇(2:3，v/v)进行沉淀蛋白。将混合体系涡流30s后，置于高速离心机中，以13000r/min的转速下离心5min，取上清液；
具体而言：采集小鼠心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉和脑共8个组织。取出组织后先用生理盐水简单冲洗表面血液及胃内残留物，用滤纸吸干表面水份，并将组织剪碎。取出1.0±0.1g组织向其加入取出组织重量4倍体积的生理盐水(1:4，g/mL)，用组织匀浆机进行搅碎制备出匀浆液。取出1mL左右匀浆液，以6000rpm转速将未搅碎组织沉入EP管底部。取匀浆上清液50μL置2mL抗吸附EP管中，随后加入50μL内标工作液(1μg/mL)，再加入200μL 0.1％甲酸-乙腈：异丙醇(2:3，v/v)进行样品处理。将混合体系涡流30s后，置于高速离心机中，以13000r/min的转速下离心5min，将上清液倒入2mL抗吸附EP管中，取上清液；
4)将所述标准样品溶液和待测样品溶液进行液相色谱-质谱联用检测分析；
其中，高效液相色谱法采用PLRP-S Reversed-Phase Column色谱柱，以0.1％甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3；按如下条件进行梯度洗脱：
0～1.4min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
1.4～1.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为由40％增加至65％；
1.5～3.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为65％；
3.0～3.1min：流动相B占流动相总体积的百分比为由65％增加至95％；
3.1～4.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为95％；
4.5～4.6min：流动相B占流动相总体积的百分比为90％减少至40％；
4.6～6.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为40％；
柱温为40℃，流速为0.8mL/min；自动进样器温度为15℃；
其中，流动相的配制具体为：用量筒量取200mL的乙腈和300mL的异丙醇，倒入流动相玻璃瓶后加入500μL甲酸，轻摇混匀，超声15min，配置成含0.1％甲酸-乙腈：异丙醇(2:3，v/v)溶液；流动相水相的配置过程为：用量筒准确量取500mL纯水倒入玻璃瓶中，加入500μL甲酸，轻摇混匀，超声15min，配置成0.1％甲酸-水溶液。
质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5500V、离子源温度：500℃、气帘气：35psi、GS1:40psi、GS2:40psi、解簇电压：100V、碰撞能量：45eV、MSALL扫描范围：50-1250Da、提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01Da。
5)经LC-MS/MS定量分析，利用所述标准样品溶液与内标物的峰面积的比值，采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W＝1/X2；通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程；
按照上述制备方法制备7个浓度水平的泊洛沙姆188标准样品溶液，进行三次平时实验；一套标准曲线样品在一个分析批的开始时进样，一套在中间时进样，一套在结束时进样。
采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W＝1/X2，使各浓度点测量值的相对误差降至最低，保证低浓度样品的准确性为最好。利用待测物泊洛沙姆188与内标峰面积的比值，通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程。标准曲线回算的浓度一般应该在标示值的±15％以内，LLOQ(定量下限)处应该在±20％内，并含最少6个有效浓度。标准曲线的线性相关系数r2应不小于0.98，r2越接近1，说明线性关系越好。本次试验以r2不小于0.99作为标准，即可满足体内定量分析的需要；
再与待测样品溶液与内标工作液的峰面积比值进行比较，基于所述线性回归方程，计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量。
本试验利用Analyst 1.7.1数据处理软件(美国Sciex公司)，通过MSALL全扫描模式(TOF MS扫描模式)，扫描所有在设置范围内质荷比的离子，获得总离子流图(TIC)。输入需要的泊洛沙姆188离子的质荷比范围，可从TIC图中提取出来定量离子的信息，获得提取的定量色谱图(EIC)。还可利用Peakview 2.2软件来优化质量提取窗口。本试验的定量离子为两个聚氧丙烯(PPO)单元构成的碎片，其理论质荷比为117.0899，质量提取窗口为117.08～117.10。
实验例
上述实施例提供的LC-MS/MS定量分析方法，从以下几个方面对泊洛沙姆188进行定量分析方法可靠性的验证，包括选择性、标准曲线、定量下限、准确度与精密度、基质效应、提取回收率、残留考察和必要的稳定性考察。
1、选择性
选择性(Selectivity)是通过分析不含内标的泊洛沙姆188待测物的空白生物基质样品与定量下限比较来评估。随机选取6个来源不同的大鼠空白血浆，按照上述实施例相同的方式进行空白血浆样品的处理。根据要求，干扰组分的响应应低于分析物定量下限响应的20％，并低于内标响应的5％。如图1和表3所示，图1中A为大鼠空白血浆色谱图；B为大鼠空白血浆加入内标(1μg/mL)的色谱图；C为LLOQ(定量下限)色谱图(图中：I为泊洛沙姆188，RT(泊洛沙姆188)＝2.48min；II为内标，RT(内标)＝2.69min)，在待测物和内标出峰位置无明显色谱峰干扰，说明血浆中的干扰组分不会影响泊洛沙姆188的定量分析。
表3泊洛沙姆188选择性的考察
2、标准曲线
按照上述实施例制备7个浓度水平的泊洛沙姆188标准样品溶液，三个平行实验。进行LC-MS/MS定量分析，一套标准曲线样品在一个分析批的开始时进样，一套在中间时进样，一套在结束时进样。采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W＝1/X2，使各浓度点测量值的相对误差降至最低，保证低浓度样品的准确性为最好。利用待测物泊洛沙姆188与内标峰面积的比值，通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程。标准曲线回算的浓度一般应该在标示值的±15％以内，LLOQ处(定量下限)应该在±20％内，并含最少6个有效浓度。标准曲线的线性相关系数r2应不小于0.98，r2越接近1，说明线性关系越好。本次试验以r2不小于0.99作为标准，即可满足体内定量分析的需要。在本次方法验证的3个分析批当中，每条标准曲线样品由7个浓度水平组成(0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0μg/mL)，标准曲线线性回归图见图2，其线性回归方程及相关系数见表4，均符合要求。
表4 val01～val03标准曲线结果汇总
3、定量下限
定量下限(Lower limit of quantification，LLOQ)是指试样中的检测物质能被定量测定的最低量，也是标准曲线的最低浓度，可以体现分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。在色谱分析中，其信噪比(The ratio of signal and noise，S/N)必须大于10才可进行定量，并且应符合准确度和精密度的要求。本试验中LLOQ为0.1μg/mL，制备6个LLOQ样品，检测样品中泊洛沙姆188的实际浓度，结果如表5所示。
表5大鼠血浆中泊洛沙姆188的LLOQ结果(μg/mL)
4、准确度与精密度
准确度和精密度是通过重复检测泊洛沙姆188的质控样品来评估的。准确度是通过未知样品浓度的平均值(Mean)和理论浓度的偏差(DEV)来计算的，即准确度(％)＝(未知样品浓度平均值–理论浓度)/理论浓度×100；精密度通过未知样品浓度的变异系数(CV)来计算考察，即精密度(％)＝(测得值/真实值)×100。准确度均值一般应在质控样品标示浓度的±15％范围内，批内和批间精密度的变异系数一般不得超过15％。
按照制备标示浓度为0.3、1.5、8μg/mL的泊洛沙姆188质控样品，处理质控样品，每个质控浓度制备六平行。连续制备并测定三个分析批。结果如表6所示，均符合相关标准规定。
其中，质控样品的制备具体为：采用上述方法制备大鼠空白血浆，将已配制的泊洛沙姆188质控工作液依次稀释成浓度为8、1.5、0.3μg/mL的泊洛沙姆188质控样品(有机溶剂含量＜5％)。
表6大鼠血浆中泊洛沙姆188的准确度和精密度
5、基质效应
基质效应(Matrix effect)是由生物样品中的非挥发性共流出组分与待测物在电喷雾接口共同离子化，与待测物竞争质子，影响待测物的离子化效率，造成离子抑制或增强效应，表现为离子增强或抑制作用[32,33]。本验证通过对低、中、高三个浓度水平的泊洛沙姆188质控样品进行分析评价。
具体方法为：随机选取6个来源不同的大鼠空白血浆，在空白血浆样品中加入泊洛沙姆188和内标工作液，配置成对应浓度水平的质控样品(0.3、1.5、8μg/mL)，每个浓度水平6平行，进行LC-MS/MS定量分析，获得含有生物基质的色谱峰面积，命名为spiked matrix。再配置不含生物基质的对应浓度水平的纯溶液质控样品(0.3、1.5、8μg/mL)，每个浓度水平6平行，进行LC-MS/MS定量分析，获得不含生物基质的色谱峰面积，命名为neat solution。基质因子经内标归一化后的变异系数不得大于15％。
基质效应＝(spiked matrix样品峰面积/neat solution样品峰面积)×100％
基质效应考察结果见表7，泊洛沙姆188在三个浓度水平质控样品的基质效应在82.64％～91.93％，变异系数在5.32％～6.71％。符合基质效应的考察标准。
表7泊洛沙姆188在大鼠血浆中基质效应(n＝6)
6、提取回收率
提取回收率(Extraction recovery)是生物样品经过一定的前处理后测得的量与理论加入量的比值，提取回收率的高低可以说明该前处理方法是否适合于此生物样品。本验证也是通过对低、中、高三个浓度水平的泊洛沙姆188质控样品进行分析评价。
制备三个浓度水平的质控样品(0.3、1.5、8μg/mL)，每个浓度水平6平行，进行质控样品的处理，进行LC-MS/MS定量分析，获得质控样品的色谱峰面积。按照制备不含生物基质的色谱峰面积neat solution。基质因子经内标归一化后的变异系数不得大于15％。
提取回收率＝(质控样品峰面积/neat solution样品峰面积)×100％
提取回收率考察结果见表8，泊洛沙姆188在三个浓度水平质控样品的提取回收率在72.88％～90.57％，变异系数在5.52％～9.11％。符合提取回收率的考察标准。
表8泊洛沙姆188在大鼠血浆中提取回收率(n＝6)
7、残留考察
在检测高浓度样品后，容易在色谱柱或系统中有一定的样品残留，因此应该考察检测过程中是否有残留存在。根据规定，在检测高浓度样品之后，空白样品中的残留应不超过LLOQ的20％，并且不超过内标的5％。此验证需要制备空白样品(carry over)和标准曲线最高浓度样品即ULOQ样品，每种样品六平行，制备ULOQ样品，两种样品均依据大鼠血浆样品处理方法处理。在一个分析批中，检测ULOQ样品后即刻检测一个carry over样品，通过carry over样品中待测物泊洛沙姆188和内标的响应值来判断是否有残留效应。结果如表9所示。
表9泊洛沙姆188样品的残留考察
8、稳定性考察
在实际检测分析的过程中，为了保证待测物在检测条件下，不会受到由温度、处理过程时间以及储存材料的改变而发生变化，需要对待测物进行一定的稳定性考察试验，以确保分析过程中的各个环节对待测物无影响。
(1)血浆样品处理前室温放置4h稳定性
按照泊洛沙姆188质控样品制备LQC(0.3μg/mL)和HQC(8μg/mL)样品，并在检测中命名为LRT和HRT，每种浓度水平的样品各三平行，在室温放置4h。按照大鼠血浆样品处理方法进行样品处理。根据相关规定，LRT和HRT样品实际浓度的平均值应与LQC、HQC的偏差在±15％以内，变异系数需小于15％。如表10所示，结果表明血浆样品处理前室温放置4h稳定。
表10泊洛沙姆188血浆样品处理前室温放置4h稳定性
(2)血浆样品处理后室温放置4h稳定性
按照泊洛沙姆188质控样品制备LQC(0.3μg/mL)和HQC(8μg/mL)样品，并在检测中命名为LST和HST，每种浓度水平的样品各三平行。按照大鼠血浆样品处理方法进行样品处理，处理后样品在室温放置4h。根据相关规定，LST和HST样品实际浓度的平均值应与LQC、HQC的偏差在±15％以内，变异系数需小于15％。如表11所示，结果表明血浆样品处理后室温放置4h稳定。
表11泊洛沙姆188血浆样品处理后室温放置4h稳定性
(3)血浆样品处理后在15℃自动进样室温度下放置8h的稳定性
本试验自动进样室的温度设置为15℃。按照泊洛沙姆188质控样品制备LQC(0.3μg/mL)和HQC(8μg/mL)样品，并在检测中命名为LASST和HASST，每种浓度水平的样品各三平行。按照大鼠血浆样品处理方法进行样品处理，处理后随即放入15℃自动进样室中并放置8h。根据相关规定，LASST和HASST样品实际浓度的平均值应与LQC、HQC的偏差在±15％以内，变异系数需小于15％。
如表12所示，结果表明血浆样品处理后在15℃自动进样室温度下放置8h稳定。
表12泊洛沙姆188血浆样品处理后在15℃自动进样室温度下放置8h的稳定性
(4)血浆样品-20℃反复冻融稳定性
本试验样品保存在-20℃冰箱中，部分样品在实测过程中可能会涉及到多次分析。按照表泊洛沙姆188质控样品制备LQC(0.3μg/mL)和HQC(8μg/mL)样品，并在检测中命名为LFT和HFT，每种浓度水平的样品各三平行。按照大鼠血浆样品处理方法进行样品处理，处理后随即放入-20℃冰箱中贮存至少24h，并在室温下融化。样品完全融化后，将已融化的血浆样品再次放入-20℃冰箱进行每次至少12h的三次冻融过程。根据相关规定，LFT和HFT样品实际浓度的平均值应与LQC、HQC的偏差在±15％以内，变异系数需小于15％。如表13所示，结果表明血浆样品-20℃反复冻融三次稳定。
表13泊洛沙姆188血浆样品-20℃反复冻融稳定性
对比实验
1、将流动相A“采用成比例的乙腈与异丙醇混合，并向其加入少量的甲酸(以0.1％甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3)”，替换为“选用了纯乙腈中加入0.1％甲酸的有机相”；
实验发现，乙腈的洗脱强度并不能够使泊洛沙姆188完全洗脱，有很强的残留效应，且峰型较差。
2、将“Agilent PLRP-S Reversed-Phase色谱柱”替换为“Venusil ASB C8”，“SB-C18”，“Extend-C18”型号的色谱柱；
实验发现，这些反相色谱柱不能很好的实现分析物与其他干扰组分的分离，并有残留严重、基线过高和峰型较差等问题。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (13)
1.一种泊洛沙姆的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别制备待测样品溶液和标准样品溶液；并在所述待测样品溶液和标准样品溶液中加入内标工作液；
2）将所述标准样品溶液和待测样品溶液进行液相色谱-质谱联用检测分析；
其中，高效液相色谱法采用PLRP-S Reversed-Phase Column色谱柱，以0.1%-0.3%甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1%-0.3%甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3~4；按如下条件进行梯度洗脱：
0～1.4min：流动相B占流动相总体积的百分比为40%；
1.4～1.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为由40%增加至65%；
1.5～3.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为65%；
3.0～3.1min：流动相B占流动相总体积的百分比为由65%增加至95%；
3.1～4.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为95%；
4.5～4.6min：流动相B占流动相总体积的百分比为90%减少至40%；
4.6～6.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为40%；
其中，质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5000~6000 V，离子源温度：450~550 ℃，碰撞能量：40~50 eV；
3）计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量；将标准样品溶液进行LC-MS/MS定量分析，利用所述标准样品溶液与内标物的峰面积的比值，采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W=1/X2；通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程；再与待测样品溶液的峰面积进行比较，基于所述线性回归方程，计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量；
其中，所述定量分析软件Analyst 1.7.1通过TOF MS扫描模式扫描所有在设置范围内质荷比的离子，获得总离子流图；
其中，所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188。
2.根据权利要求1所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述待测样品溶液中的样品为血浆或脏器的待检测液；所述待检测液采用沉淀蛋白法处理，获得所述待测样品溶液。
3.根据权利要求2所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述沉淀蛋白法处理具体为：以0.1%-0.3%甲酸的乙腈和异丙醇为沉淀试剂，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3~4；将沉淀试剂加入待检测液中进行沉淀蛋白，沉淀试剂与待检测液的体积比为3~5:1；涡旋后高速离心，取上清液，即得所述待测样品溶液。
4.根据权利要求3所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述脏器还包括预处理，具体为：将离体脏器搅碎至匀浆液，高速离心取上清液，获得待检测液。
5.根据权利要求1~4任一项所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述内标工作液为0.8~1.2 µg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:2.5~3.5的乙腈和水。
6.根据权利要求5所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述待测样品溶液与所述内标工作液的体积比为1: 0.8~1.2；所述标准样品溶液与所述内标工作液的体积比为1:0.8~1.2。
7.根据权利要求1~4任一项所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述标准样品溶液采用如下方式制得：
配置2.5~250µg/mL至少6个梯度的泊洛沙姆标准液；所述泊洛沙姆标准液的溶剂为体积比2:2.5~3.5的乙腈和水。
8.根据权利要求1~4任一项所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的条件至少还包括如下一项：
柱温35~45℃，
流速0.7~0.9 mL/min；
自动进样器温度12~18 ℃。
9.根据权利要求8所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的条件至少还包括如下一项：
以0.1%甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1%甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3；
柱温40℃，
流速0.8 mL/min；
自动进样器温度15 ℃。
10.根据权利要求1~4任一项所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述质谱法的条件至少还包括如下一项：
气帘气：30~40 psi；
GS1 : 35~55 psi；
GS2 : 35~55 psi；
解簇电压：90~110 V；
碰撞能量：40~50 eV；
MSALL扫描范围：50-1250 Da；
提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01 Da。
11.根据权利要求8所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述质谱法的条件至少还包括如下一项：
气帘气：30~40 psi；
GS1 : 35~55 psi；
GS2 : 35~55 psi；
解簇电压：90~110 V；
碰撞能量：40~50 eV；
MSALL扫描范围：50-1250 Da；
提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01 Da。
12.根据权利要求10所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，所述质谱法的条件为：离子喷雾电压：5500 V、离子源温度：500 ℃、气帘气：35 psi、GS1 : 40 psi、GS2 :40 psi、解簇电压：100 V、碰撞能量：45 eV、MSALL扫描范围：50-1250 Da、提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01 Da。
13.根据权利要求1所述的LC-HR-MS/MS定量分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备待测样品溶液：将待检测液采用沉淀蛋白法处理；具体的：以0.1%-0.3%甲酸的乙腈和异丙醇为沉淀试剂，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3~4；将沉淀试剂加入所述待检测液中进行沉淀蛋白，沉淀试剂与待检测液的体积比为3~5:1；涡旋后高速离心，取上清液，即得所述待测样品溶液；
其中，所述待检测液为待测血浆或经预处理后的待测脏器；所述预处理具体为：将离体脏器搅碎至匀浆液，高速离心取上清液，获得待检测液；
制备标准样品溶液：配置2.5~250µg/mL至少6个梯度的泊洛沙姆188标准液；所述泊洛沙姆188标准液的溶剂为体积比2:2.5~3.5的乙腈和水；
其中，所述待测样品溶液和所述标准样品溶液中分别加入内标工作液；所述内标工作液为0.8~1.2 µg/mL的辛伐他汀溶液，所述辛伐他汀溶液的溶剂为体积比2:2.5~3.5的乙腈和水；所述待测样品溶液与所述内标工作液的体积比为1: 0.8~1.2；所述标准样品溶液与所述内标工作液的体积比为1:0.8~1.2；
2）将所述标准样品溶液和待测样品溶液进行液相色谱-质谱联用检测分析；
其中，高效液相色谱法采用PLRP-S Reversed-Phase Column色谱柱，以0.1%-0.3%甲酸的水溶液为流动相A相，以0.1%-0.3%甲酸的乙腈和异丙醇为流动相B相，所述乙腈和异丙醇的体积比为2:3~4；按如下条件进行梯度洗脱：
0～1.4min：流动相B占流动相总体积的百分比为40%；
1.4～1.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为由40%增加至65%；
1.5～3.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为65%；
3.0～3.1min：流动相B占流动相总体积的百分比为由65%增加至95%；
3.1～4.5min：流动相B占流动相总体积的百分比为95%；
4.5～4.6min：流动相B占流动相总体积的百分比为90%减少至40%；
4.6～6.0min：流动相B占流动相总体积的百分比为40%；
柱温为35~45℃，流速为0.7~0.9 mL/min；自动进样器温度为12~18 ℃；
其中，质谱法的条件参数为：离子喷雾电压：5000~6000 V，离子源温度：450~550 ℃，碰撞能量：40~50 eV；气帘气：30~40 psi；GS1 : 35~45 psi；GS2 : 35~45 psi；解簇电压：90~110 V；碰撞能量：40~50 eV；MSALL扫描范围：50-1250 Da；提取泊洛沙姆188特征碎片离子的离子提取窗口宽度：±0.01 Da；
3）经LC-MS/MS定量分析，利用所述标准样品溶液与内标物的峰面积的比值，采用加权最小二乘法进行线性回归运算，权重因子W=1/X2；通过定量分析软件Analyst 1.7.1的计算获得标准曲线样品的回算浓度及线性回归方程；再与待测样品溶液的峰面积进行比较，基于所述线性回归方程，计算待测样品溶液中泊洛沙姆的含量。
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