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CN111812328A - 一种肝癌转移早期测诊断试剂盒 - Google Patents

一种肝癌转移早期测诊断试剂盒 Download PDF

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CN111812328A CN202010700571.1A CN202010700571A CN111812328A CN 111812328 A CN111812328 A CN 111812328A CN 202010700571 A CN202010700571 A CN 202010700571A CN 111812328 A CN111812328 A CN 111812328A
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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肝癌转移早期测诊断试剂盒，包括鼠抗人S100A11单克隆抗体、封闭液、工作液、抗体稀释液、羊抗人二抗、DAB显色液、浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液、苏木素染液、中性树脂、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯、PBS；本发明试剂盒通过检测肝异常者的肝部异常部位与正常部位的S100A11蛋白表达水平，可以判断肝异常者的S100A11蛋白表达水平差异，进而判断待检者患肝癌的风险。

Description

一种肝癌转移早期测诊断试剂盒
【技术领域】
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种肝癌转移早期测诊断试剂盒。
【背景技术】
肝癌可以大致分为2类，一类是原发性肝癌，还是一种是转移性肝癌。原生性肝癌是的是，本身生长在肝脏表面的癌症；而转移性的肝癌，则因为其他组织和器官的癌细胞，慢慢转移到肝脏处，从而慢慢生长成肝癌。一般来说，原发性的肝癌恶化到晚期的进程，要比转移性肝癌时间久很多，大概要经过15年左右的时间，才会慢慢恶化成肝癌。
对于肝癌晚期的患者来说，当被发现晚期时，那就意味着体内的癌细胞已经大量扩散了，时间越久，恶化程度就越高，有的人甚至只有短短几个月的时间可以活。所以，确诊时间起着决定性的因素。但是目前没有一种能快速且简便的肝癌转移早期测诊断试剂盒，使得肝癌的确诊时间延后，导致患者得不到及时治疗。
S100A11蛋白是钙结合蛋白S100家族的成员，该家族共二十多个成员，与大多数S100蛋白一样Ca2+结合会使其构象发生巨大的变化以便与其多种靶蛋白相互作用。在该家族中， Ca2+流是调节多种细胞进程的信号，包括凋亡、收缩、分化、基因表达和许多其他的生理过程。S100A1的靶蛋白包括Ca2+信号转导中的蛋白、神经递质释放相关蛋白(突触蛋白I、Ⅱ)、细胞骨架和细丝连接蛋白、转录因子及其调节因子、酶、以及其他Ca2+激活蛋白等。S100A11 在细胞中既有信号分子的作用又可以作为分泌蛋白起作用。
【发明内容】
鉴于以上问题，本发明提供了一种肝癌转移早期测诊断试剂盒。
本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案实现：
一种肝癌转移早期测诊断试剂盒,包括鼠抗人S100A11单克隆抗体、封闭液、工作液、抗体稀释液、羊抗人二抗、DAB显色液、浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液、苏木素染液、中性树脂、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯、PBS；
所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％牛血清蛋白溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％的H2O2溶液；所述的抗体稀释液包括0.1％ (V/V)Tween-20的磷酸盐、pH7.4的0.1MPBS溶液。
一种肝癌转移早期测诊断试剂盒使用方法，包括以下步骤：
1)取待检测者肝部组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中15min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；
2)将所述脱蜡后的切片置于二甲苯中10min，更换二甲苯再浸泡10min，而后无水乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，70％乙醇浸泡5min， PBS浸泡5min后更换PBS重复浸泡3次，得到初步处理后的切片；
3)将初步处理后的切片置于工作液室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，得到灭酶处理后的切片；
4)用蒸馏水冲洗灭酶处理后的切片，而后PBS浸泡5min并更换PBS重复浸泡3次，得到清洗后切片；
5)将清洗后切片放入浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液中，并置于微波炉内加热，温度为90-99℃，然后室温放置11-15min，重复上述步骤3次，得到抗原修复后的切片；
6)将所述抗原修复后的切片放置于封闭液中，室温孵育20～30min后，除去封闭液，向所述切片中滴加鼠抗人S100A11单克隆抗体，37℃孵育1～2小时，得到处理后的切片；
7)将处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
8)向上述处理后的切片中滴加HRP标记的羊抗人二抗，为KPL公司产品，37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；
9)将所述二抗处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
10)向上述处理后的切片中滴加适量工作液，37℃孵育60min；
11)将上述处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
12)将上述处理后的切片置于DAB显色液中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5～10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；
13)向所述显色后切片上滴加苏木素染液，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30s，蒸馏水冲洗所述切片10min，得到复染后的切片；
14)将所述复染后的切片，依次75％乙醇浸泡5min80％乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min 并重复3次，100％乙醇浸泡5min并重复3次，二甲苯浸泡20min并重复3次，使用中性树胶进行封片；
15)显微镜对封片进行拍照，使用DPController图像采集系统采图；采图后，根据细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。
阳性染色的细胞的细胞核和细胞浆中出现棕黄色或是黄褐色颗粒为阳性染色。
优选的，步骤6)中的鼠抗人S100A11单克隆抗体为使用抗体稀释液将鼠抗人S100A11 单克隆抗体稀释，鼠抗人S100A11单克隆抗体与抗体稀释液比例为1∶100。
由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：本发明试剂盒通过检测肝异常者的肝部异常部位与正常部位的S100A11蛋白表达水平，可以判断肝异常者的S100A11蛋白表达水平差异，进而判断待检者患肝癌转移的风险：若S100A11蛋白的表达水平高，则肝癌转移的风险高，需对患者肝癌细胞的转移加以监测和预防。若S100A11蛋白的表达水平低，则肝癌转移的风险低。
【附图说明】
图1是人S100A11蛋白细胞的光学显微镜图。
【具体实施方式】
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……) 仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B为例”，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
实施例
一种肝癌转移早期测诊断试剂盒,包括鼠抗人S100A11单克隆抗体、封闭液、工作液、抗体稀释液、羊抗人二抗、DAB显色液、浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液、苏木素染液、中性树脂、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯、PBS；
所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％牛血清蛋白溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％的H2O2溶液；所述的抗体稀释液包括0.1％ (V/V)Tween-20的磷酸盐、pH7.4的0.1MPBS溶液。
S100A11蛋白表达水平与肝癌的关系
实验方法
选取肝癌患者石蜡切片50例，远端对照50例(指肝癌患者的远端正常肝组织石蜡
切片，距离癌组织2-6cm)，基本信息见表1。
切片信息 肝癌组织组 远端对照组
人数 20 20
年龄 58±10.5 59±11.5
男性比例 25(50％) 25(50％)
按照如下方法使用肝癌转移早期测诊断试剂盒检测S100A11蛋白的表达水平：
1)取肝癌患者的病理组织及远端正常肝组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中 15min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；
2)将所述脱蜡后的切片置于二甲苯中10min，更换二甲苯再浸泡10min，而后无水乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，70％乙醇浸泡5min， PBS浸泡5min后更换PBS重复浸泡3次，得到初步处理后的切片；
3)将初步处理后的切片置于3％H2O2室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，得到灭酶处理后的切片；
4)用蒸馏水冲洗灭酶处理后的切片，而后PBS浸泡5min并更换PBS重复浸泡3次，得到清洗后切片；
5)将清洗后切片放入浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液中，并置于微波炉内加热，温度为90-99℃，然后室温放置11-15min，重复上述步骤3次，得到抗原修复后的切片；
6)将所述抗原修复后的切片放置于PBS作为溶剂配制的5％牛血清蛋白溶液中，室温孵育20～30min后，除去PBS作为溶剂配制的5％牛血清蛋白溶液，向所述切片中滴加鼠抗人 S100A11单克隆抗体，37℃孵育1～2小时，得到处理后的切片；
7)将处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
8)向上述处理后的切片中滴加HRP标记的羊抗人二抗，为KPL公司产品，37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；
9)将所述二抗处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
10)向上述处理后的切片中滴加适量工作液，37℃孵育60min；
11)将上述处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
12)DAB显色：将上述处理后的切片置于DAB中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5～10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；
13)向所述显色后切片上滴加苏木素染液，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30s，蒸馏水冲洗所述切片10min，得到复染后的切片；
14)将所述复染后的切片，依次75％乙醇浸泡5min80％乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min 并重复3次，100％乙醇浸泡5min并重复3次，二甲苯浸泡20min并重复3次，使用中性树胶进行封片；
15)显微镜对封片进行拍照，使用DPController图像采集系统采图；采图后，根据肝癌患者和远端组织的肿瘤细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。
免疫组化评分标准
肿瘤细胞染色强度*肿瘤细胞阳性面积＝0-9分，
结果统计：阴性：0分；低度阳性：1-3分；高度阳性>3分。
其中，肿瘤细胞染色强度、阳性面积的评分如下：
Figure BDA0002592884460000051
由两名经验丰富的病理医生独立对免疫组化染色结果进行评分
4、结果分析
肝癌组织组和远端组织对照组进行统计学分析。
二、实验结果
肝癌组织组与远端组织对照中S100A11蛋白的表达水平检测结果见表2。
样品 阴性 低度阳性 高度阳性
肝癌组织组 1例 23例 26例
远端组织对照组 49例 1例 0例
表2 S100A11蛋白的表达水平
由表2可见，远端组织对照组中S100A11蛋白的阳性表达率为2％，高度阳性表达率为0；肝癌组织中的S100A11蛋白阳性表达率为98％，高度阳性表达率为52％；S100A11蛋白在肝癌组织中显著升高，与远端正常组织相比，S100A11蛋白表达水平差异具有统计学意义。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.一种肝癌转移早期测诊断试剂盒，其特征在于，包括鼠抗人S100A11单克隆抗体、封闭液、工作液、抗体稀释液、羊抗人二抗、DAB显色液、浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液、苏木素染液、中性树脂、70％乙醇、75％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇、二甲苯、PBS；
所述的封闭液是用磷酸盐缓冲液PBS作为溶剂配制的5％牛血清蛋白溶液；所述的工作液是用PBS溶液作为稀释液将30％H2O2溶液稀释为3％的H2O2溶液；所述的抗体稀释液包括0.1％(V/V)Tween-20的磷酸盐、pH7.4的0.1MPBS溶液。
2.如权利要求1所述的一种肝癌转移早期测诊断试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取待检测者肝部组织进行石蜡包埋切片，放置于60℃烘箱中15min，将所述石蜡切片脱蜡至水，得到所述脱蜡后的切片；
2)将所述脱蜡后的切片置于二甲苯中10min，更换二甲苯再浸泡10min，而后无水乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min，80％乙醇浸泡5min，75％乙醇浸泡5min，70％乙醇浸泡5min，PBS浸泡5min后更换PBS重复浸泡3次，得到初步处理后的切片；
3)将初步处理后的切片置于工作液室温孵育20min，以消除内源性过氧化物酶的活性，得到灭酶处理后的切片；
4)用蒸馏水冲洗灭酶处理后的切片，而后PBS浸泡5min并更换PBS重复浸泡3次，得到清洗后切片；
5)将清洗后切片放入浓度为0.01mol/L的柠檬酸钠缓冲液中，并置于微波炉内加热，温度为90-99℃，然后室温放置11-15min，重复上述步骤3次，得到抗原修复后的切片；
6)将所述抗原修复后的切片放置于封闭液中，室温孵育20～30min后，除去封闭液，向所述切片中滴加鼠抗人S100A11单克隆抗体，37℃孵育1～2小时，得到处理后的切片；
7)将处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
8)向上述处理后的切片中滴加HRP标记的羊抗人二抗37℃孵育60min，得到二抗处理后的切片；
9)将所述二抗处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
10)向上述处理后的切片中滴加适量工作液，37℃孵育60min；
11)将上述处理后的切片置于PBS浸泡5min，并更换PBS重复浸泡3次；
12)将上述处理后的切片置于DAB显色液中室温显色，在显微镜下观察切片的显色过程，反应时间控制在5～10min，用蒸馏水冲洗切片，得到显色后切片；
13)向所述显色后切片上滴加苏木素染液，轻度复染所述切片，而后用盐酸酒精分化所述切片30s，蒸馏水冲洗所述切片10min，得到复染后的切片；
14)将所述复染后的切片，依次75％乙醇浸泡5min80％乙醇浸泡5min，95％乙醇浸泡5min并重复3次，100％乙醇浸泡5min并重复3次，二甲苯浸泡20min并重复3次，使用中性树胶进行封片；
15)显微镜对封片进行拍照，使用DPController图像采集系统采图；采图后，根据细胞染色强度及阳性面积给予免疫组化评分。
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