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CN111819293A - 来源于乳杆菌种细菌的纳米囊泡及其用途 - Google Patents

来源于乳杆菌种细菌的纳米囊泡及其用途 Download PDF

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CN111819293A CN201980017151.9A CN201980017151A CN111819293A CN 111819293 A CN111819293 A CN 111819293A CN 201980017151 A CN201980017151 A CN 201980017151A CN 111819293 A CN111819293 A CN 111819293A
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vesicles derived
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Abstract

本发明涉及来源于乳杆菌属的细菌的囊泡及其用途，并且本发明人已经通过实验证实了与正常个体相比，从患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者获得的样品中的囊泡显著减少，并且囊泡抑制由病原囊泡引起的炎性介质的分泌。因此，期望根据本发明的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡可有效地用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法以及开发用于预防、减轻或治疗包括所述疾病在内的伴随免疫功能障碍的炎性疾病的组合物。

Description

来源于乳杆菌种细菌的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及来源于乳杆菌属(genus Lactobacillus)的细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及使用来源于乳杆菌属的细菌的纳米囊泡来诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法，以及包含所述囊泡的用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物。
背景技术
自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物群落之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性炎性疾病已经改变疾病模式，成为决定生活质量和人类寿命的主要疾病。特别是由饮食习惯的西化引起的癌症和糖尿病等代谢疾病，心肌梗塞和中风等心血管疾病，帕金森氏病、痴呆和抑郁症等神经精神疾病正成为国民健康的主要问题。
这种疾病的特征在于慢性炎症，并且慢性炎症伴随着针对外部病因的免疫功能障碍。作为针对源自细菌的致病因子的免疫应答，分泌白介素(IL)-17细胞因子的Th17的免疫应答很重要，并且当暴露于细菌致病因子时，会发生由Th17免疫应答引起的嗜中性炎症。在炎症过程中，诸如肿瘤坏死因子-α(以下称为TNF-α)之类的炎症介质起着重要作用。另外，最近报道了由细菌致病因子分泌的IL-6在Th17细胞的分化中起重要作用，并且还参与心血管疾病或脑/神经精神疾病的发病机理。
生存在人体中的共生微生物总数达100万亿，是人类细胞的10倍，并且已知微生物中的基因数量是人类基因的100倍以上。微生物群或微生物组是指存在于给定栖息地中的包括细菌、古细菌和真核生物在内的微生物群落，众所周知，肠道微生物群在人类生理中起着重要作用，并且由于与人类细胞的相互作用而对人类健康和疾病产生巨大影响。
我们体内共存的细菌和古细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因、蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。最近发现，人体吸收的来源于病原性细菌的囊泡在诸如糖尿病和肥胖症之类的代谢疾病的发病机理中起着重要的作用。
乳杆菌属的细菌是分泌乳酸的革兰氏阳性细菌，并且属于乳杆菌属的各种细菌被用作益生菌产品。但是，尚无关于使用来源于乳杆菌属细菌的囊泡的用于诸如胃癌、肾衰竭、痴呆和中风之类的疾病的诊断和治疗技术的报道
发明内容
【技术问题】
通过进行认真研究以解决所述常规问题的结果，发明人证实，通过宏基因组分析，与正常个体相比，在来源于患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者的样品中，来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的含量显著降低，并且还通过在体外分离来源于乳杆菌属的细菌的囊泡并评价治疗效果证实，其表现出免疫调节作用。基于此，完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种提供用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的信息的方法。
此外，本发明还涉及提供用于预防、减轻或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的组合物，其包含作为活性成分的来源于乳杆菌的囊泡。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
为了实现上述本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析，将其中来源于所述乳杆菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为胃癌、肾衰竭、痴呆或中风。
另外，本发明提供了一种诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析，将其中来源于所述乳杆菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、肾衰竭、痴呆或中风。
作为本发明的一个实施方案，步骤(a)中的样品可以是血液。
作为本发明的另一个实施方案，步骤(b)中的成对的引物可以是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的引物。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡。
另外，本发明提供了一种用于预防或减轻伴随免疫功能障碍的炎性疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡。
另外，本发明提供了一种用于预防或减轻炎性皮肤疾病的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡。
另外，本发明提供了来源于乳杆菌属的细菌的囊泡用于预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的用途。
此外，本发明提供了一种预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡的药物组合物。
在本发明的一实施方案中，囊泡的平均直径可以为10至200nm。
在本发明的另一个实施方案中，囊泡可以从乳杆菌属的细菌中天然或人工地分泌。
在本发明的另一个实施方案中，所述来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡可以是选自由来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的囊泡、来源于干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的囊泡、来源于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的囊泡和来源于沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)的囊泡组成的群组中的一种或多种囊泡。
在本发明的另一个实施方案中，所述炎性疾病可以是选自由胃癌、肾衰竭、痴呆和中风组成的群组中的一种或多种疾病。
【有益效果】
发明人证实肠道细菌不会通过上皮细胞吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡会被吸收，全身分布，然后通过肾脏、肝脏和肺部排泄出体内，以及通过对来源于在患者的血液中存在的细菌的囊泡进行宏基因组分析，也证实了与正常个体相比，来源于在患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者的样品中存在的乳杆菌属的细菌的囊泡明显减少。另外，当体外分离并培养属于乳杆菌属的细菌的短乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和沙克乳杆菌，然后将所述囊泡与所述菌株分离并施用于炎性细胞时，致病性囊泡对炎症介质(诸如IL-6和TNF-α)的分泌被显著抑制，从而证实了根据本发明的免疫调节功能，和来源于乳杆菌的囊泡预期可有效地用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法，以及用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物。
附图说明
图1A是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(EV)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(EV)的分布模式的一系列照片，并且图1B是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。
图2是在对胃癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图3是在对肾衰竭患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图4是在对痴呆患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图5是在对中风患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组分析之后，比较来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布的结果。
图6是在诸如大肠杆菌EV之类的病原性囊泡的处理之前通过来源于植物乳杆菌(L.plantarum)或短乳杆菌(L.brevis)的囊泡的预处理评估对由大肠杆菌EV引起的炎性介质IL-6和TNF-α分泌的影响，以评估来源于短乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用(PC：阳性对照；LP：植物乳杆菌EV；LB：短乳杆菌)的结果。
图7是在诸如大肠杆菌EV之类的病原性囊泡的处理之前通过来源于植物乳杆菌(L.plantarum)或干酪乳杆菌(L.casei)的囊泡的预处理评估对由大肠杆菌EV引起的炎性介质IL-6和TNF-α分泌的影响，以评估来源于干酪乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用(PC：阳性对照；LP：植物乳杆菌EV；LC：干酪乳杆菌)的结果。
图8是在诸如大肠杆菌EV之类的病原性囊泡的处理之前通过来源于植物乳杆菌(L.plantarum)或鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)的囊泡的预处理评估对由大肠杆菌EV引起的炎性介质IL-6和TNF-α分泌的影响，以评估来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用(PC：阳性对照；LP：植物乳杆菌EV；LR：鼠李糖乳杆菌)的结果。
图9是在诸如大肠杆菌EV之类的病原性囊泡的处理之前通过来源于植物乳杆菌(L.plantarum)或沙克乳杆菌(L.sakei)的囊泡的预处理评估对由大肠杆菌EV引起的炎性介质IL-6和TNF-α分泌的影响，以评估来源于沙克乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用(PC：阳性对照；LP：植物乳杆菌EV；LS：沙克乳杆菌)的结果。
具体实施方式
本发明涉及来源于乳杆菌属的细菌的囊泡及其用途。
发明人通过宏基因组分析证实了，与正常个体相比，在从患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者获得的样品中，来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少，从而诊断出疾病。另外，因为从属于乳杆菌属的细菌的短乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆和沙克乳杆菌分离出囊泡并识别了其特性，所以证实了该囊泡可用于预防、减轻或治疗该疾病。
因此，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析，将其中来源于所述乳杆菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、肾衰竭、痴呆或中风。
如本文所使用的，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定胃癌、肾衰竭、痴呆和中风是否发生，疾病的程度等。
如本文所使用的，术语“宏基因组”还指微生物组，并且是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是从形成完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是技术的目标，该技术通过使用快速序列分析方法，分析所有DNA和RNA(不考虑物种)来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢。
在本发明中，样品可以是血液，但不受限于此。
作为本发明的另一方面提供了用于预防、治疗或减轻包括胃癌、肾衰竭、痴呆、中风、炎性皮肤病等的炎性疾病的组合物，其包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡。该组合物包括食品组合物、化妆品组合物和药物组合物，并且在本发明中，食品组合物包括健康功能性食品组合物。本发明的组合物可以是口服喷雾剂或吸入剂。
本文所用的术语“囊泡”是指用由各种细菌分泌的纳米级膜形成的结构。来源于诸如乳杆菌之类的革兰氏阳性细菌的囊泡包括肽聚糖和脂磷壁酸(lipoteichoic acid)，它们是细菌细胞壁的成分、囊泡中的各种低分子化合物以及蛋白质和核酸。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由乳杆菌属的细菌天然分泌或人工产生的，并且平均直径为10至200nm。
可通过使用选自离心、超高速离心、高压处理、挤出、超声处理、细胞裂解、均质化、冷冻-解冻、电穿孔、机械分解、化学处理、通过过滤器的过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳的一种或多种方法，从包含乳杆菌属的细菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤和对所获得的囊泡的浓缩之类的过程。
如本文所使用的，术语“预防”是指抑制包括胃癌、肾衰竭、痴呆、中风、炎性皮肤病和/或类似疾病的炎性疾病的所有行为，或者通过施用根据本发明的组合物来延迟其发作的所有行为。
如本文所使用的，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来减轻或有益地改变包括胃癌、肾衰竭、痴呆、中风、炎性皮肤病和/或类似疾病的炎性疾病的症状的所有行为。
如本文所使用的，术语“减轻”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有行为。
本文使用的术语“炎性疾病”可以是由构成免疫系统的体液介质的直接反应引起的疾病，或由通过刺激局部或全身性效应系统产生的一系列生物反应引起的疾病，以及本发明的炎性疾病可以是胃癌、肾衰竭、痴呆、中风或炎性皮肤病以及伴随免疫功能障碍的疾病，但是本发明不限于此。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，并且包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不受限于此，并且如果需要，还可包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’s literature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。
本发明的药物组合物可以根据所期望的方法口服施用或可肠胃外施用(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内施用)，并且剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物制剂以及给药途径和持续时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。
根据本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及其他医学领域众所周知的因素确定。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
具体而言，根据本发明的药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别和体重而变化，并且通常是每1千克体重施用0.001至150mg该组合物，优选每1千克体重施用0.01至100mg该组合物，可以每天或隔天给药，或者每天给药一次至三次。然而，由于剂量可以根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄而增加或减少，因此上述剂量并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，基于原料计，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。但是，对于出于健康和卫生目的或出于健康控制目的而长期摄入时，所述量可能少于上述范围。
除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，如同典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
除了所述添加剂之外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或以其组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
除了来源于乳杆菌属的细菌的囊泡之外，本发明的化妆品组合物还可以包括化妆品组合物中常规使用的组分，并且这些组分可以包括例如常规添加剂，包括抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、颜料和香料以及载体。
另外，本发明的组合物除了与来源于乳杆菌属的细菌的囊泡组合之外，还可以与常规使用的有机防晒剂组合使用，该有机防晒剂不会通过与来源于乳杆菌属的细菌的囊泡反应而降低皮肤保护效果。作为有机防晒剂，可以使用选自由甘油基PABA、甲酚曲唑三硅氧烷(drometrizole trisiloxane)、甲酚曲唑(drometrizole)、三油基二没食子酸酯(digalloyl trioleate)、苯基二苯并咪唑四磺酸二钠(disodium phenyldibenzimidazole tetrasulfonate)、二乙基己基丁酰胺三嗪酮(diethylhexylbutamidotriazone)、二乙氨基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯(diethylaminohydroxylbenzoyl hexylbenzoate)、DEA-甲氧基肉桂酸酯(DEA-methoxycinnamate)、劳森/二羟基丙酮(Lawson/dihydroxyacetone)混合物、亚甲基双-苯并三唑基四甲基丁基苯酚(methylenebis-benzotriazolyltetramethylbutylphenol)、4-甲基亚苄基樟脑、邻氨基苯甲酸甲酯(methyl anthranilate)、二苯甲酮-3(氧苯甲酮)、二苯甲酮-4、二苯甲酮-8(二氧苯甲酮)(benzophenone-8(dioxyphebenzone))、丁基甲氧基二苯甲酰甲烷(butylmethoxydibenzoylmethane)、双乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪(bisethylhexyloxyphenol methoxyphenyl triazine)、肉桂酸酯(cinoxate)、乙基二羟丙基PABA(ethyl dihydroxypropyl PABA)、辛二烯(octocrylene)、乙基己基二甲基PABA(ethylhexyldimethyl PABA)、甲氧基肉桂酸乙基己酯(ethylhexyl methoxycinnamate)、水杨酸乙基己酯(ethylhexyl salicylate)、乙基己基三嗪酮(ethylhexyl triazone)、对甲氧基肉桂酸异戊酯(isoamyl-p-methoxycinnamate)、聚硅氧烷-15(亚苄基丙二酸盐聚硅氧烷)(polysilicon-15(dimethicodiethylbenzal malonate))、对苯二亚甲基二樟脑磺酸(terephthalylidene dicamphor sulfonic acid)及其盐、TEA-水杨酸酯和对氨基苯甲酸(PABA)(aminobenzoic acid(PABA))组成的群组中的一种或多种。
例如，产品(其可以包含本发明的化妆品组合物)包括化妆品，例如收敛剂，皮肤爽肤剂，滋养爽肤水，各种面霜，香精，面膜(packs)和粉底，清洁剂，洗面奶，肥皂，护理剂和护发液(tonics)等。本发明的化妆品组合物的具体制剂包括皮肤乳液、皮肤柔软剂、皮肤爽肤水、收敛剂、乳液、乳霜、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、香精、滋养香精、面膜、肥皂、洗发水、清洁泡沫、清洁乳液、清洁霜、润肤露、沐浴露、乳液、口红、隔离霜、粉底、粉饼、散粉、眼影膏等。
在本发明的一个实施方案中，作为对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的结果，证实了，尽管细菌不是通过肠粘膜吸收的，但是来源于细菌的囊泡在给药后5分钟内被吸收并全身分布，且通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。
在本发明的另一实施方案中，通过使用患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者与正常个体的血液进行细菌宏基因组分析。结果证实，与正常个体的血液相比，在患有胃癌、肾衰竭、痴呆和中风的患者的血液中，来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例3至6)。
在本发明的另一个实施方案中，评估了来源于短乳杆菌菌株的囊泡的免疫调节和抗炎作用，并且通过评价在先用来源于植物乳杆菌的囊泡或不同浓度的来源于短乳杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后使用作为致病性囊泡的来源于大肠杆菌的囊泡处理后的免疫介质的分泌，证实了与来源于植物乳杆菌的囊泡相比，来源于短乳杆菌的囊泡有效抑制了来源于大肠杆菌的囊泡引起的TNF-α分泌(参见实施例7和8)。
在本发明的另一个实施方案中，评估了来源于干酪乳杆菌菌株的囊泡的免疫调节和抗炎作用，并且通过评价在先用来源于植物乳杆菌的囊泡或不同浓度的来源于干酪乳杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后使用作为致病性囊泡的来源于大肠杆菌的囊泡处理后的免疫介质的分泌，证实了与来源于植物乳杆菌的囊泡相比，来源于干酪乳杆菌的囊泡有效抑制了来源于大肠杆菌的囊泡引起的TNF-α分泌(参见实施例7和9)。
在本发明的另一个实施方案中，评估了来源于鼠李糖乳杆菌菌株的囊泡的免疫调节和抗炎作用，并且通过评价在先用来源于植物乳杆菌的囊泡或不同浓度的来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后使用作为致病性囊泡的来源于大肠杆菌的囊泡处理后的免疫介质的分泌，证实了与来源于植物乳杆菌的囊泡相比，来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡有效抑制了来源于大肠杆菌的囊泡引起的TNF-α分泌(参见实施例7和10)。
在本发明的另一个实施方案中，评估了来源于沙克乳杆菌菌株的囊泡的免疫调节和抗炎作用，并且通过评价在先用来源于植物乳杆菌的囊泡或不同浓度的来源于沙克乳杆菌的囊泡处理巨噬细胞，然后使用作为致病性囊泡的来源于大肠杆菌的囊泡处理后的免疫介质的分泌，证实了与来源于植物乳杆菌的囊泡相比，来源于沙克乳杆菌的囊泡有效抑制了来源于大肠杆菌的囊泡引起的TNF-α分泌(参见实施例7和11)。
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例
实施例1.肠道细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠道细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行实验。首先，将50μg剂量的带有荧光标记的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡中的每种通过胃肠道施用至小鼠的胃，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1A所示，细菌不被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡是排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时。
此外，为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药12小时后收集血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为在收集的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在血液、心脏、肺、肝、脾、脂肪、肌肉和肾中，但是细菌没有被吸收。
实施例2.临床样品中来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在首先将血液放入10ml试管中，并且通过离心(3,500×g，10分钟，4℃)使悬浮物沉降后，仅将上清液转移至新的10ml试管。使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到Centriprep管(离心过滤器50kD)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kD的物质，将残余物浓缩至10ml。通过使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，通过使用90Ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(PBS)中。
将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将DNA在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用Nanodrop定量DNA的量。此后，为了确认提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，并确认提取的基因中存在来源于细菌的基因。
[表1]
Figure BDA0002666224430000131
使用16S rDNA引物对通过上述方法提取的DNA进行扩增，然后进行测序(IlluminaMiSeq测序仪)，结果以标准流程图格式(SFF)文件输出，使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后确认用于阅读的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(Phred分数<20)已删除。对于OTU(操作分类单元)分析，通过使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个OUT的门、纲、目、科和属级上进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes(QIIME)的16S RNA序列数据库(108,453个序列)对在该属级上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析。
实施例3.胃癌患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
从66例胃癌患者和198例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自胃癌患者的血液中的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表2和图2)。
[表2]
Figure BDA0002666224430000141
实施例4.肾衰竭患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
从21例肾衰竭患者和19例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自肾衰竭患者的血液中的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表3和图3)。
[表3]
Figure BDA0002666224430000142
实施例5.痴呆患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
从45例痴呆患者和49例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自痴呆患者的血液中的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表4和图4)。
[表4]
Figure BDA0002666224430000143
Figure BDA0002666224430000151
实施例6.中风患者和正常个体的血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组分析
从115例中风患者和109例正常个体(两组的年龄和性别均匹配)的血液中存在的囊泡中提取基因，使用实施例2的方法对所述血液进行宏基因组分析后，对来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的分布进行评估。结果，证实与来源于正常个体的血液相比，在来自中风患者的血液中的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见表5和图5)。
[表5]
Figure BDA0002666224430000152
实施例7.从乳杆菌属的细菌的培养物中分离囊泡
从环境样品中分离并培养短乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和沙克乳杆菌菌株，然后从中分离囊泡，接着分析它们的特性。将每种乳杆菌菌株在有氧条件下于37℃下在de Man,Rogosa and Sharpe(MRS)培养基中温育直至吸光度(OD600)达到1.0至1.5，然后在Luria-Bertani(LB)培养基中继代培养。随后，回收包含菌株的培养基，然后在10,000g和4℃下离心20分钟以除去菌株，然后通过0.22μm过滤器过滤。使用MasterFlex泵系统(Cole-Parmer，美国)，通过微滤，通过100kDa的Pellicon 2盒式滤膜(Merck Millipore，美国)，将过滤的上清液浓缩至50mL的体积。再次使用0.22μm过滤器过滤浓缩的上清液。之后，通过BCA分析定量蛋白质，并且对获得的囊泡进行以下实验。
实施例8.来源于短乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用
为了评估来源于短乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用，将巨噬细胞系用各种浓度(0.1、1和10μg/mL)的来源于短乳杆菌的囊泡预处理12小时，然后用1μg/mL的来源于大肠杆菌的囊泡(其是病原性囊泡)处理。12小时后，通过ELISA测量炎性细胞因子的分泌。为了进行ELISA，将捕获抗体在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稀释，然后根据工作浓度将50μL得到的稀释液分配到96孔聚苯乙烯板上，然后在4℃下过夜反应。
随后，将所得物用100μL含0.05％Tween-20的PBS(PBST)溶液洗涤3次，分配100μL含1％BSA的PBS(RD)溶液，在室温下封闭1小时，然后根据浓度分配样品和标准品各50μL，然后在室温下反应2小时。用100μL的PBST洗涤3次后，将检测抗体在RD中稀释，然后根据工作浓度以50μL分配，以在室温下进行2小时反应。将所得物用100μL的PBST洗涤3次，并将链霉亲和素-HRP(R&D Systems，USA)在RD中以1/40稀释并以50μL分配，然后在室温下反应20分钟。最后，将所得物用100μL的PBST洗涤3次，分配50μL的TMB底物(SurModics，美国)，并且在进行彩色显影5至20分钟时，将50μL的1M硫酸溶液分配以终止反应，然后使用SpectraMaxM3酶标仪(Molecular Devices，美国)在450nm处测量吸光度。
结果，如图6所示，通过来源于短乳杆菌的囊泡的预处理，证实了由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制。特别是，通过对来源于短乳杆菌的囊泡进行预处理，证实了与作为有效微生物对照的植物乳杆菌相比，抑制TNF-α分泌的效果显著提高。
实施例9.来源于干酪乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用
为了评估来源于干酪乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用，将巨噬细胞系用各种浓度(0.1、1和10μg/mL)的来源于干酪乳杆菌的囊泡预处理12小时，然后用1μg/mL的来源于大肠杆菌的囊泡(其是病原性囊泡)处理。12小时后，通过ELISA测量炎性细胞因子的分泌。结果，通过来源于干酪乳杆菌的囊泡的预处理，证实了由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制(参见图7)。特别是，通过对来源于干酪乳杆菌的囊泡进行预处理，证实了与作为有效微生物对照的植物乳杆菌相比，抑制TNF-α分泌的效果显著提高(参见图7)。
实施例10.来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用
为了评估来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用，将巨噬细胞系用各种浓度(0.1、1和10μg/mL)的来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡预处理12小时，然后用1μg/mL的来源于大肠杆菌的囊泡(其是病原性囊泡)处理。12小时后，通过ELISA测量炎性细胞因子的分泌。结果，如图8所示，通过来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡的预处理，证实了由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制。特别是，通过对来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡进行预处理，证实了与作为有效微生物对照的植物乳杆菌相比，抑制TNF-α分泌的效果显著提高。
实施例11.来源于沙克乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用
为了评估来源于沙克乳杆菌的囊泡的免疫调节和抗炎作用，将巨噬细胞系用各种浓度(0.1、1和10μg/mL)的来源于沙克乳杆菌的囊泡预处理12小时，然后用1μg/mL的来源于大肠杆菌的囊泡(其是病原性囊泡)处理。12小时后，通过ELISA测量炎性细胞因子的分泌。结果，如图9所示，通过来源于沙克乳杆菌的囊泡的预处理，证实了由来源于大肠杆菌的囊泡引起的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制。特别是，通过对来源于沙克乳杆菌的囊泡进行预处理，证实了与作为有效微生物对照的植物乳杆菌相比，抑制TNF-α分泌的效果显著提高。
提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅进行了说明，而不是限制性的。
【工业适用性】
由于根据本发明的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡可用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法以及用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物，预期它们将有效地用于相关的医学领域、化妆品领域和食品工业领域中。
<110> MD保健株式会社
<120> 来源于乳杆菌种细菌的纳米囊泡及其用途
<130> MPO20-052CN
<150> KR 10-2018-0026039
<151> 2018-03-05
<150> KR 10-2019-0024891
<151> 2019-03-04
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (17)

1.一种提供用于诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析，将其中来源于乳杆菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况分类为胃癌、肾衰竭、痴呆或中风。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中的所述样品是血液。
3.一种用于预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述囊泡的平均直径为10至200nm。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述囊泡是从所述乳杆菌属的细菌天然或人工分泌的。
6.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡是选自由来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)的囊泡、来源于干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的囊泡、来源于鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)的囊泡和来源于沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)的囊泡组成的群组中的一种或多种囊泡。
7.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述伴随免疫功能障碍的炎性疾病是选自由胃癌、肾衰竭、痴呆和中风组成的群组中的一种或多种疾病。
8.一种用于预防或减轻伴随免疫功能障碍的炎性疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于乳杆菌属细菌的囊泡。
9.根据权利要求8所述的食品组合物，其中，所述来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡是选自由来源于短乳杆菌的囊泡、来源于干酪乳杆菌的囊泡、来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡和来源于沙克乳杆菌的囊泡组成的群组中的一种或多种囊泡。
10.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述伴随免疫功能障碍的炎性疾病是选自由胃癌、肾衰竭、痴呆和中风组成的群组中的一种或多种疾病。
11.一种用于预防或减轻炎性皮肤病的化妆品组合物，其包含作为活性成分的来源于乳杆菌属细菌的囊泡。
12.根据权利要求11所述的化妆品组合物，其中，所述来源于所述乳杆菌属的细菌的囊泡是选自由来源于短乳杆菌的囊泡、来源于干酪乳杆菌的囊泡、来源于鼠李糖乳杆菌的囊泡和来源于沙克乳杆菌的囊泡组成的群组中的一种或多种囊泡。
13.一种诊断胃癌、肾衰竭、痴呆或中风的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用基于在16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)以获得每种PCR产物；以及
(c)通过对所述PCR产物的定量分析，将其中来源于乳杆菌属的细菌的细胞外囊泡的含量低于所述正常个体样品的情况确定为胃癌、肾衰竭、痴呆或中风。
14.一种预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用包含作为活性成分的来源于乳杆菌属的细菌的囊泡的药物组合物。
15.根据权利要求14所述的方法，所述炎性疾病是选自由胃癌、肾衰竭、痴呆和中风组成的群组中的一种或者多种疾病。
16.来源于乳杆菌属的细菌的囊泡用于预防或治疗伴随免疫功能障碍的炎性疾病的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，所述炎性疾病是选自由胃癌、肾衰竭、痴呆和中风组成的群组中的一种或者多种疾病。
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