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CN111818937A - 使用天冬酰胺酶的治疗方法 - Google Patents

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CN111818937A
CN111818937A CN201880084869.5A CN201880084869A CN111818937A CN 111818937 A CN111818937 A CN 111818937A CN 201880084869 A CN201880084869 A CN 201880084869A CN 111818937 A CN111818937 A CN 111818937A
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P·皮捏
H·瓜萨哈尼
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Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd
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Abstract

本发明涉及用L‑天冬酰胺酶治疗疾病的方法。

Description

使用天冬酰胺酶的治疗方法
技术领域
本发明涉及一种具有显著的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质和聚乙二醇的缀合物，特别地，其中聚乙二醇具有小于或等于约5000Da的分子量，特别地涉及其中蛋白质是来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的缀合物，以及其在疗法中的用途。
背景技术
具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质，通常称为L-天冬酰胺酶，多年来已成功用于治疗儿童的急性成淋巴细胞性白血病(ALL)。ALL是最常见的儿童恶性肿瘤(Avramis和Panosyan,(2005)44:367-393)。
L-天冬酰胺酶还已用于治疗霍奇金病、急性粒细胞性白血病、急性粒-单核细胞白血病(acute myclomonocytic Leukemia)、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和黑素肉瘤(Kotzia(2007)J.Biotechnol.127,657-669)。据信，L-天冬酰胺酶的抗肿瘤活性是由于某些恶性细胞不能合成L-天冬酰胺或合成能力降低(Kotzia(2007)J.Biotechnol.127,657-669)。这些恶性细胞依赖于L-天冬酰胺的细胞外供应。然而，L-天冬酰胺酶催化L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，从而耗尽L-天冬酰胺的循环池并杀死在没有L-天冬酰胺的情况下不可进行蛋白质合成的肿瘤细胞(Kotzia(2007)J.Biotechnol.127,657-669)。
来自大肠杆菌(E.coli)的L-天冬酰胺酶是ALL疗法中使用的第一酶药物，并且已经作为
Figure BDA0002562222360000011
在美国或作为
Figure BDA0002562222360000012
和L-天冬酰胺酶
Figure BDA0002562222360000021
在欧洲上市。还已经从其他微生物中分离出L-天冬酰胺酶，例如，来自菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)的L-天冬酰胺酶蛋白，被称为克立他酶(crisantaspase)，其已经作为
Figure BDA0002562222360000022
上市(Wriston(1985)Meth.Enzymol.113,608-618；Goward(1992)Bioseparation 2,335-341)。还鉴定了来自欧文氏菌的其他菌种的L-天冬酰胺酶，包括，例如，菊欧文氏菌3937(Genbank登录号AAS67028)、菊欧文氏菌NCPPB 1125(Genbank登录号CAA31239)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(Genbank登录号AAP92666)和胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫亚种(Erwinia carotovora subsp.astroseptica)(Genbank登录号AAS67027)。这些菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶彼此间具有约91-98％的氨基酸序列同一性，而胡萝卜软腐欧文氏菌L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有大约75-77％的氨基酸序列同一性(Kotzia(2007)J.Biotechnol.127 657-669)。
目前可得的L-天冬酰胺酶制剂不提供替代或互补疗法，特别是治疗ALL的疗法，其特征在于高的催化活性和显著改善的药理学和药代动力学特性，以及降低的免疫原性。
在一个方面，本发明要解决的问题是提供一种L-天冬酰胺酶制剂，其具有：高的体外生物活性；稳定的PEG-蛋白质连接；延长的体内半衰期；显著降低的免疫原性，如例如重复施用后针对L-天冬酰胺酶制剂的抗体应答的减少或消除所证明的；以及对于对使用例如大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶的一线疗法产生了敏感性的患者，作为二线疗法的可用性。
已知的L-天冬酰胺酶缀合物尚未解决这一问题，其具有与修饰的L-天冬酰胺酶制剂的显著交叉反应性(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588，以引用方式整体并入本文)，或具有明显降低的体外活性(Kuchumova(2007)Biochemistry(Moscow)增刊B:BiomedicalChemistry,1,230-232，以引用方式整体并入本文)。根据本发明，通过提供欧文氏菌L-天冬酰胺酶与亲水性聚合物(更具体地，具有5000Da或更少的分子量的聚乙二醇)的缀合物、用于制备这种缀合物的方法以及所述缀合物的用途而解决了这一问题。
发明内容
本发明涵盖了一种治疗患者的通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的方法，包括施用有效量的具有显著的L-天冬酰胺羟基水解酶活性的蛋白质和聚乙二醇(PEG)的缀合物，其中聚乙二醇具有小于或等于约5000Da的分子量，其中蛋白质是来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶。在一些实施方案中，L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，缀合物包含来自欧文氏菌的与SEQ ID NO:1的氨基酸具有100％序列同一性的L-天冬酰胺酶。在一些实施方案中，PEG具有约5000Da、4000Da、3000Da、2500Da或2000Da的分子量。在一些实施方案中，与未缀合于PEG时的L-天冬酰胺酶相比，缀合物具有至少60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的体外活性。在一些实施方案中，缀合物具有比未缀合于PEG时的L-天冬酰胺酶更有效至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍的L-天冬酰胺耗尽活性。在一些实施方案中，缀合物将血浆L-天冬酰胺水平耗尽至不可检测的水平，持续至少约12、24、48、96、108或120小时。在一些实施方案中，与未缀合于PEG时的L-天冬酰胺酶相比，缀合物具有更长的体内循环半衰期。在一些实施方案中，缀合物具有比以相等蛋白质剂量施用的培门冬酶(pegaspargase)更长的t1/2。在一些实施方案中，在小鼠中静脉内施用后，缀合物在以蛋白质含量计约50μg/kg的剂量下具有至少约58至约65小时的t1/2，并且在以蛋白质含量计约10μg/kg的剂量下具有至少约34至约40小时的t1/2。在一些实施方案中，缀合物在约10,000至约15,000IU/m2(约20-30mg蛋白质/m2)范围内的剂量下具有至少约100至约200小时的t1/2。在一些实施方案中，与未缀合于PEG时的L-天冬酰胺酶相比，缀合物具有更大的曲线下面积(AUC)。在一些实施方案中，在相等的蛋白质剂量下，缀合物具有比培门冬酶大至少约3倍的平均AUC。在一些实施方案中，PEG与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基共价连接。在一些实施方案中，PEG通过酰胺键与一个或多个氨基共价连接。在一些实施方案中，PEG共价连接于可用氨基的至少约40％至约100％或总氨基的至少约40％至约90％。
本发明的方法涵盖缀合物的用途，所述缀合物具有下式：
Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n
其中Asp是L-天冬酰胺酶，NH是Asp的赖氨酸残基和/或N末端的一个或多个NH基团，PEG是聚乙二醇部分，n是代表Asp中可用氨基的至少约40％至约100％的数目，并且x是在约1至约8、更具体地约2至约5范围内的整数。在一个具体实施方案中，PEG是单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)。
本发明的方法涵盖包含一个或多个肽的L-天冬酰胺酶的缀合物的用途，其中所述肽各自独立地为肽RN–(P/A)–RC，其中(P/A)是仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中RN是附接至所述氨基酸序列的N末端氨基的保护基，并且其中RC是通过其氨基结合至所述氨基酸序列的C末端羧基的氨基酸残基，其中每个肽通过由所述肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和L-天冬酰胺酶的游离氨基形成的酰胺键缀合至L-天冬酰胺酶，并且其中肽所缀合的游离氨基中的至少一个不是L-天冬酰胺酶的N末端α-氨基。
本发明的方法涵盖缀合物用于治疗癌症的用途。在一些实施方案中，癌症选自由以下组成的组：淋巴瘤、大细胞免疫母细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK淋巴瘤、霍奇金病、急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性T细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML)、双表型B细胞骨髓单核细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。
在一些实施方案中，疾病选自由以下组成的组：肾细胞癌、肾细胞腺癌、胶质母细胞瘤(包括多形性胶质母细胞瘤和星形胶质母细胞瘤)、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括大细胞肺癌和小细胞肺癌)、子宫内膜癌、卵巢腺癌、卵巢畸胎癌、宫颈腺癌、乳腺癌、乳腺腺癌、乳腺导管癌、胰腺癌、胰腺导管癌、结肠癌、结肠腺癌、结肠直肠腺癌、膀胱移行细胞癌、膀胱乳头状瘤、前列腺癌、骨肉瘤、骨上皮癌(epitheloid carcinoma)、前列腺癌和甲状腺癌。在一些实施方案中，以约5U/kg体重至约50U/kg体重的量施用缀合物。
在一些实施方案中，以在约100至约15,000IU/m2范围内的剂量施用缀合物。在一些实施方案中，施用是静脉内或肌内的，并且每周一次、每周两次或每周三次。在一些实施方案中，缀合物作为单一疗法施用。在一些实施方案中，缀合物作为组合疗法的一部分施用。在一些实施方案中，缀合物作为与
Figure BDA0002562222360000051
道诺霉素、阿糖胞苷、
Figure BDA0002562222360000052
ABT-737、维奈托克、达托里昔布(dactolisib)、硼替佐米、卡非佐米、长春新碱、泼尼松龙、依维莫司和/或CB-839的组合疗法的一部分施用。在一些实施方案中，接受治疗的患者对大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式或对欧文氏菌天冬酰胺酶具有既往超敏性。在一些实施方案中，接受治疗的患者具有疾病复发，特别是在用大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治疗后发生的复发。
附图说明
图1-2示出使用培克立他酶(pegcrisantaspase)与其他化合物的体内实验数据。
图3示出示例性单一药剂的剂量-反应曲线。
图4示出具有非活性剂的示例性混合物的剂量-反应曲线。
图5示出示例性单一药剂和混合物的比较数据。
图6示出表明药物组合是否具有协同作用的剂量导向图(dose-oriented plot)。
图7示出CNS细胞系数据。
图8-9示出培克立他酶的IC50效应。
图10示出培克立他酶在白血病和淋巴瘤细胞系中的体外敏感性。
具体实施方式
细菌来源的L-天冬酰胺酶具有高免疫原性和抗原性潜力并且经常引起不良反应，所述不良反应的范围从轻度过敏反应到致敏化患者中的过敏性休克(Wang(2003)Leukemia17,1583-1588)。大肠杆菌L-天冬酰胺酶是特别有免疫原性的，据报道在i.v.或i.m.施用之后，存在针对大肠杆菌L-天冬酰胺酶的抗天冬酰胺酶抗体，在成人中高达78％并且在儿童中高达70％(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588)。
来自大肠杆菌和菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶在其药代动力学特性方面不同并且分别具有不同的免疫原性特征谱(Klug Albertsen(2001)Brit.J.Haematol.115,983-990)。此外，已显示，在用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶处理后产生的抗体不与来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶交叉反应(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588)。因此，来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，即克立他酶，已经在对大肠杆菌L-天冬酰胺酶有反应的患者中被用作ALL的二线治疗(Duval(2002)Blood15,2734-2739；Avramis(2005)Clin.Pharmacokinet.44,367-393)。
在另一个为了降低与微生物L-天冬酰胺酶的施用相关的免疫原性的尝试中，产生了用甲氧基-聚乙二醇(mPEG)修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶。此方法通常被称为“聚乙二醇化”并已显示出改变蛋白质的免疫学特性(Abuchowski(1977)J.Biol.Chem.252,3578-3581)。作为
Figure BDA0002562222360000071
上市的这种所谓的mPEG-L-天冬酰胺酶或培门冬酶于1994年首先在美国被批准用于ALL的二线治疗，并从2006年起已被批准用于儿童和成人的ALL的一线疗法。
Figure BDA0002562222360000072
具有延长的体内半衰期和降低的免疫原性/抗原性。
Figure BDA0002562222360000073
是大肠杆菌L-天冬酰胺酶，已使用5kDa的mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(SS-PEG)对其在多个赖氨酸残基处进行了修饰(美国专利号4,179,337)。SS-PEG是第一代的PEG试剂，其含有对酶的水解敏感的或在微碱性pH值下不稳定的酯键(美国专利号4,670,417)。这些特性降低了体外和体内稳定性并且可能损害药物安全性。
此外，已证实，所产生的针对来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶的抗体将与
Figure BDA0002562222360000074
交叉反应(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588)。即使这些抗体不是中和性的，但是这一发现清楚地表明了体内交叉超敏性或交叉失活的高可能性。实际上，在一个报道中，30-41％的接受培门冬酶的儿童具有过敏反应(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588)。
除了外在的过敏反应之外，最近报道了“沉默超敏性”的问题，由此患者产生抗天冬酰胺酶抗体，但不显示出超敏性反应的任何临床证明(Wang(2003)Leukemia 17,1583-1588)。这种反应可以导致形成针对大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶的中和抗体；然而，这些患者不被转向欧文氏菌L-天冬酰胺酶，因为没有外在的超敏性迹象，因此，他们接受较短持续时间的有效治疗(Holcenberg(2004)Pediatr.Hematol.Oncol.26,273-274)。
菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶治疗通常被用于对大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶超敏的情况中。然而，已观察到多达30-50％的接受欧文氏菌L-天冬酰胺酶的患者是抗体阳性的(Avramis(2005)Clin.Pharmacokinet.44,367-393)。此外，由于菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶具有比大肠杆菌L-天冬酰胺酶显著更短的清除半衰期，其必须被更频繁地施用(Avramis(2005)Clin.Pharmacokinet.44,367-393)。在Avramis的研究中，欧文氏菌天冬酰胺酶与差的药代动力学特征谱相关(Avramis(2007)J.Pediatr.Hematol.Oncol.29,239-247)。因此，相对于欧文氏菌L-天冬酰胺酶，大肠杆菌L-天冬酰胺酶和培门冬酶是ALL的优选一线疗法。
许多生物制药品已成功地被聚乙二醇化并上市多年。为了将PEG与蛋白质偶联，PEG必须在其OH末端被活化。基于将被聚乙二醇化的蛋白质上的可用反应基团选择活化基团。在蛋白质的情况中，最重要的氨基酸是赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、C末端羧酸和N末端氨基。鉴于蛋白质中广泛的反应基团，几乎整个肽化学均已被应用于活化PEG部分。这种活化的PEG试剂的实例是活化的碳酸酯，例如，对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯；活性酯，例如，琥珀酰亚胺酯；并且对于位点特异性偶联开发了醛和马来酰亚胺(Harris(2002)Adv.Drug Del.Rev.54,459-476)。用于PEG修饰的各种化学方法的可用性显示出聚乙二醇化蛋白的每种新开发都将是个案研究。除了化学之外，附接于蛋白质的PEG的分子量对聚乙二醇化蛋白质的药学特性也具有强大的影响。在大多数情况中，预期PEG的分子量越高，药学特性的改善越好(Sherman(2008)Adv.Drug Del.Rev.60,59-68；Holtsberg(2002)Journal of Controlled Release 80,259-271)。例如，Holtsberg等人发现，当PEG与精氨酸脱氨酶(分离自微生物来源的另一氨基酸降解酶)缀合时，当PEG附接物的大小从分子量5000Da增加到20,000Da时，酶的药代动力学和药效动力学功能增加(Holtsberg(2002)Journal of Controlled Release 80,259-271)。
然而，在许多情况中，与未修饰的生物制药品相比，聚乙二醇化的生物制药品显示出显著减少的活性(Fishburn(2008)J.Pharm.Sci.,1-17)。在来自胡萝卜软腐欧文氏菌的L-天冬酰胺酶的情况中，已观察到聚乙二醇化使其体外活性降低至大约57％(Kuchumova(2007)Biochemistry(Moscow)增刊B:Biomedical Chemistry,1,230-232)。来自胡萝卜软腐欧文氏菌的L-天冬酰胺酶与菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶(克立他酶)仅具有约75％的同源性。对于
Figure BDA0002562222360000091
还已知，与未修饰的大肠杆菌L-天冬酰胺酶相比，其体外活性为大约50％。
本文描述了来自欧文氏菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，与未修饰的L-天冬酰胺酶蛋白相比以及与来自大肠杆菌的培门冬酶制剂相比，其具有改善的药理学特性。本文描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物(例如，用5000Da分子量的PEG聚乙二醇化的菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶)用作治疗剂，特别是用于对使用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶，或来自欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶进行的治疗显示出超敏性(例如，过敏反应或沉默超敏性)的患者。本文描述的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶缀合物也可用作治疗剂而用于具有疾病复发(例如，ALL的复发)且先前用另一形式的天冬酰胺酶(例如，用来自大肠杆菌的L-天冬酰胺酶或聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶)治疗的患者中。
如本文所详述的，与已知的L-天冬酰胺酶制剂(诸如培门冬酶)相比，本发明的缀合物显示出出人意料的优越特性。例如，与来自大肠杆菌的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，来自菊欧文氏菌的未修饰的L-天冬酰胺酶(克立他酶)具有显著更低的半衰期(Avramis(2005)Clin.Pharmacokinet.44,367-393，以引用方式整体并入本文)。在相等的蛋白质剂量下，本发明的聚乙二醇化的缀合物具有的半衰期大于来自大肠杆菌的聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶。
定义
除非另外明确地定义，否则本文使用的术语将根据它们在本领域中的通常含义来理解。
如本文所用，术语“包括”是指“包括但不限于”，并且以单数形式使用的术语应当包括复数，且反之亦然，除非上下文另有指示。
如本文所用，术语“通过耗尽天冬酰胺可治疗的疾病”是指这样的病状或病症，其中参与或促成所述病状或病症的细胞缺乏合成L-天冬酰胺的能力或该能力降低。L-天冬酰胺的耗尽或丧失可以是部分的或基本上完全的(例如，达到使用本领域已知的方法和设备不可检测的水平)。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指产生期望的治疗效果所需要的蛋白质(例如，天冬酰胺酶或其缀合物)的量。
如本文所用，术语“序列同一性”与“同源性”可互换使用，并且因此在适当的情况下可以具有相同的含义。
如本文所用，术语“共同施用(co-administration、co-administering)”、“与...组合施用(administered in combination with、administering in combinationwith)”、“同时(simultaneous和concurrent)”涵盖将两种或更多种活性药物成分施用给人受试者，使得两种活性药物成分和/或其代谢物同时存在于人受试者中。共同施用包括以分开的组合物同时施用、在不同时间以分开的组合物施用，或以其中存在两种或更多种活性药物成分的组合物施用。以分开的组合物同时施用和以其中存在两种药剂的组合物施用也涵盖在本发明的方法中。
L-天冬酰胺酶蛋白
根据本发明的蛋白质是具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的酶，即L-天冬酰胺酶。
在本领域中已鉴定了许多L-天冬酰胺酶蛋白，它们是通过已知的方法从微生物中分离的。(参见，例如，Savitri(2003)Indian J.Biotechnol 2,184-194，其以引用方式整体并入本文)。最广泛使用且可商购获得的L-天冬酰胺酶来源于大肠杆菌或菊欧文氏菌，二者共享50％或更少的结构同源性。在欧文氏菌种内，在菊欧文氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌来源的酶之间报道了通常75-77％的序列同一性，并且在菊欧文氏菌的不同亚种之间发现大约90％的序列同一性(Kotzia G A、Labrou E,Journal of Biotechnology(2007)127:657-669，以引用方式整体并入本文)。一些代表性的欧文氏菌L-天冬酰胺酶包括，例如，表1中提供的那些：
Figure BDA0002562222360000111
表1的欧文氏菌L-天冬酰胺酶的序列以及GenBank条目以引用方式并入本文。疗法中所用的优选L-天冬酰胺酶是分离自大肠杆菌和欧文氏菌(具体是菊欧文氏菌)的L-天冬酰胺酶。
L-天冬酰胺酶可以是从微生物中分离的天然酶。它们也可以通过重组酶技术在生产性微生物诸如大肠杆菌中产生。作为实例，本发明的缀合物中使用的蛋白质可以是在重组大肠杆菌生产性菌株中产生的来自大肠杆菌的蛋白质，或在重组大肠杆菌生产性菌株中产生的来自欧文氏菌种(特别是菊欧文氏菌)的蛋白质。
酶可以通过其特定活性鉴定。此定义因此包括也存在于其他生物体(更特别地，其他微生物)中的具有所定义的特定活性的所有多肽。通常可以通过它们在某些如PFAM或COG所定义的家族中的分组来鉴定具有相似活性的酶。PFAM(比对和隐马尔科夫模型的蛋白质家族数据库；pfam.sanfferac.ukl)代表蛋白质序列比对的大的集合。每个PFAM都有可能使得多个比对可视化，看到蛋白质结构域，评价在生物体间的分布，获得对其他数据库的访问，以及使已知的蛋白质结构可视化。COG(蛋白质的直系同源物组的群集；vv-ww.nebi.nlm.nih.gov/COG/)是通过比较来自43个完全测序的基因组的蛋白质序列而获得的，所述基因组代表30个主要的系统发育系。每个COG由至少三个系限定，这允许鉴定以前的保守结构域。
鉴定同源序列和它们的百分比同源性或序列同一性的手段是本领域技术人员熟知的，并且特别地包括BLAST程序，其可以由网站blast.ncbi.olo.nih.gov/Blast.cgi使用，并且使用所述网站上指示的默认参数。然后可以使用，例如，程序CLUSTALW(www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)或MULTALIN(bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html)，使用那些网站上指示的默认参数开发(例如，比对)所获得的序列。使用GenBank上针对已知基因给出的参考，本领域技术人员能够确定其他生物体、细菌菌株、酵母、真菌、哺乳动物、植物等中的等效基因。使用可以通过用来源于其他微生物的基因进行序列比对而确定的共有序列来有利地进行这一常规工作，并设计简并探针以克隆另一生物体中的相应基因。这些分子生物学的常规方法是本领域技术人员熟知的，并且描述于，例如Sambrook(2012)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版Cold SpringHarbor Lab Press)中。
实际上，本领域技术人员应理解如何选择和设计实质上保持其L-天冬酰胺酶活性的同源蛋白。通常，使用Nessler测定，根据Mashburn和Wriston描述的方法确定L-天冬酰胺酶活性(Mashburn(1963)Biochem.Biophys.Res.Comm.12,50，以引用方式整体并入本文)。
在本发明的缀合物的特定实施方案中，L-天冬酰胺酶蛋白与包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白质具有至少约80％的同源性或序列同一性，更具体地，与包含SEQ ID NO:1的序列的蛋白质具有至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、2095％、96％、97％、98％、99％或100％的同源性或同一性。SEQ ID NO:1如下：
Figure BDA0002562222360000131
术语“包含SEQ ID NO:1的序列”是指蛋白质的氨基酸序列可不严格地被限制为SEQ ID NO:1，但可含有另外的氨基酸。
在一个特定实施方案中，所述蛋白质是菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶，其具有SEQID NO:1的序列。在另一个实施方案中，L-天冬酰胺酶来自菊欧文氏菌NCPPB 1066(Genbank登录号CAA32884，以引用方式整体并入本文)，其具有或不具有信号肽和/或引导序列。
SEQ ID NO:1的蛋白质的片段也包含在本发明的缀合物中所用的蛋白质的定义中。术语“SEQ ID NO:1的片段”是指多肽的序列可包括比SEQ ID NO:1更少的氨基酸，但仍包括足够的氨基酸以赋予L-氨基水解酶活性。
本领域熟知的是，可以通过取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰多肽，而同时保留其酶活性。例如，在给定位置通过化学上等效的氨基酸取代一个氨基酸而不影响蛋白质的功能特性是常见的。取代可被定义为以下组中的一个组之内的交换：
小的脂肪族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
极性、带负电的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
极性、带正电的残基：His、Arg、Lys；
大的脂肪族、非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys；
大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。
因此，可预期导致以一个带负电的残基取代另一个残基(诸如谷氨酸取代天冬氨酸)或以一个带正电的残基取代另一个残基(诸如赖氨酸取代精氨酸)的改变将产生功能上等效的产物。
氨基酸序列中氨基酸被修饰的位置以及经受修饰的氨基酸的数目没有特别的限制。技术人员能够识别可被引入而不影响蛋白质活性的修饰。例如，可预期蛋白质的N或C末端部分中的修饰在某些情况下不改变蛋白质的活性。关于天冬酰胺酶，特别地，已进行了许多表征，特别是关于形成活性催化位点的序列、结构和残基。这关于可被修饰而不影响酶活性的残基提供了指引。所有来自细菌来源的已知L-天冬酰胺酶都具有共同的结构特征。所有的都是在两个相邻单体的N和C末端结构域之间具有四个活性位点的同四聚体(Aghaipour(2001)Biochemistry 40,5655-5664，以引用方式整体并入本文)。所有的都在其三级和四级结构中具有高度相似性(Papageorgiou(2008)FEBS J.275,4306-4316，以引用方式整体并入本文)。L-天冬酰胺酶的催化位点的序列在菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌和大肠杆菌L-天冬酰胺酶II之间是高度保守的(Papageorgiou(2008)FEBS J.275,4306-4316)。活性位点柔性环含有氨基酸残基14-33，并且结构分析显示Thr15、Thr95、Ser62、Glu63、Asp96和Ala120接触配体(Papageorgiou(2008)FEBS J.275,4306-4316)。Aghaipour等人通过检查与其底物复合的酶的高分辨率晶体结构而对菊欧文氏菌L-天冬酰胺酶的四个活性位点进行了详细分析(Aghaipour(2001)Biochemistry 40,5655-5664)。Kotzia等人提供了来自欧文氏菌的几个种和亚种的L-天冬酰胺酶的序列，虽然菊欧文氏菌与胡萝卜软腐欧文氏菌的蛋白质之间仅具有约75-77％的同一性，但是它们各自都仍具有L-天冬酰胺酶活性(Kotzia(2007)J.Biotechnol.127,657-669，以引用方式整体并入本文)。Moola等人进行了菊欧文氏菌3937L-天冬酰胺酶的表位作图研究，并且在试图降低天冬酰胺酶的免疫原性时，甚至在各种抗原性序列突变后仍能保留酶活性(Moola(1994)Biochem.J.302,921-927，以引用方式整体并入本文)。上文引用的每篇文章都以引用方式整体并入本文。鉴于已经对L-天冬酰胺酶进行了广泛表征，本领域技术人员可确定如何进行片段和/或序列取代而仍保留酶活性。
用于缀合物的聚合物
聚合物选自由以下组成的组：非毒性水溶性聚合物，诸如多糖，例如羟乙基淀粉；聚氨基酸，例如聚赖氨酸；聚酯，例如聚乳酸；以及聚环氧烷，例如聚乙二醇(PEG)。
聚乙二醇(PEG)或单-甲氧基-聚乙二醇(mPEG)是本领域中熟知的并且包括线性和支化聚合物。一些聚合物(特别是PEG)的实例在以下各项中提供，其中的每一个都以引用方式整体并入本文：美国专利号5,672,662；美国专利号4,179,337；美国专利号5,252,714；美国专利申请公布号2003/0114647；美国专利号6,113,906；美国专利号7,419,600；美国专利号9,920,311以及PCT公布号WO2004/083258。
此类聚合物的质量通过多分散性指数(PDI)表征。PDI反映出给定聚合物样品中分子量的分布并且由重均分子量除以数均分子量计算得到。它指示了批次聚合物中个别分子量的分布。PDI具有通常大于1的值，但是当聚合物链接近理想高斯分布(＝单分散性)时，PDI接近1。
聚乙二醇有利地具有包括在约500Da至约9,000Da范围内的分子量。更具体地，聚乙二醇(例如，mPEG)具有选自由以下组成的组的分子量：2000Da、2500Da、3000Da、3500Da、4000Da、4500Da和5000Da的聚乙二醇。在一个特定实施方案中，聚乙二醇(例如，mPEG)具有5000Da的分子量。
用于制备缀合物的方法
为了随后将聚合物与具有L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质相偶联，聚合物部分含有活化的官能团，其优选与蛋白质中的氨基反应。在一个方面，本发明涉及一种制备缀合物的方法，所述方法包括使一定量的聚乙二醇(PEG)与一定量的L-天冬酰胺酶在缓冲液中配混足以使PEG与L-天冬酰胺酶共价连接的时间段。在一个特定实施方案中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ IDNO:1的序列。在一个实施方案中，PEG是单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)。
在一个实施方案中，在缓冲液中进行聚乙二醇与L-天冬酰胺酶之间的反应。在一些特定实施方案中，缓冲液的pH值在约7.0至约9.0的范围内。最优选的pH值范围在约7.5与约8.5之间，例如，pH值为约7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或15 8.5。在一个特定实施方案中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。
此外，L-天冬酰胺酶的聚乙二醇化在介于约0.5与约25mg/mL之间，更具体地介于约2与约20mg/mL之间，且最具体地介于约3与约15mg/mL之间的蛋白质浓度下进行。例如，蛋白质浓度为约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/mL。在一个特定实施方案中，在这些蛋白质浓度下聚乙二醇化的L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。
在大于2mg/mL的升高的蛋白质浓度下，聚乙二醇化反应在少于2小时之内快速进行。此外，应用少于约20:1的相对L-天冬酰胺酶中的氨基摩尔过量的聚合物。例如，摩尔过量少于约20:1、19:1、18:1、17:1、16:1、15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7.5:1、7:1、6.5:1、6:1、5.5:1、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.5:1或1:1。在一个具体实施方案中，摩尔过量少于约10:1，并且在一个更具体的实施方案中，摩尔过量少于约8:1。在一个特定实施方案中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。
可与蛋白质偶联的PEG部分的数目将取决于游离氨基的数目，并且甚至更取决于哪些氨基可用于聚乙二醇化反应。在一个特定实施方案中，聚乙二醇化的程度(即，与L-天冬酰胺酶上的氨基相偶联的PEG部分的数目)在游离和/或可用氨基的约10％至约100％的范围内(例如，约10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或蛋白质的N末端)的100％聚乙二醇化在本文也称为“最大程度聚乙二醇化的”。确定mPEG-r-克立他酶缀合物中的修饰氨基(聚乙二醇化的程度)的一种方法是Habeeb所述的方法(A.F.S.A.Habeeb,“Determination of free amino groupsin proteins by trinitrobenzensulfonic acid”,Anal.Biochem.14(1966),第328页，以引用方式整体并入本文)。在一个实施方案中，PEG部分与L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基相偶联(其中氨基包括赖氨酸残基和/或N末端)。在一个特定实施方案中，聚乙二醇化的程度在总的或可用的氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)的约10％至约100％的范围内，例如，约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一个具体实施方案中，约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与PEG部分偶联。在另一个具体实施方案中，约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、70％、71％、72％、7％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与PEG部分偶联。在一个具体实施方案中，40％-55％或100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与PEG部分偶联。在一些实施方案中，PEG部分通过共价连接与L-天冬酰胺酶偶联。在一个特定实施方案中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。
在一个实施方案中，本发明的缀合物可由式
Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n
表示，其中Asp是L-天冬酰胺酶蛋白，NH是蛋白链的赖氨酸残基和/或N末端的NH基团，PEG是聚乙二醇部分并且n是蛋白质中可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)的至少40％至约100％的数目，所有都在上文和下文的实施例中定义，x是在1至8范围内的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8)，优选2至5(例如，2、3、4、5)。在一个特定实施方案中，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。
可用于形成本发明的缀合物的其他聚乙二醇化方法提供于，例如，美国专利号4,179,337、美国专利号5,766,897、美国专利申请公布号2002/0065397A1和美国专利申请公布号2009/0054590A1中，其中的每一个以引用方式整体并入本文。
具体的实施方案包括具有实质上的L-天冬酰胺氨基水解酶活性的蛋白质和聚乙二醇，其选自缀合物的组，其中：
(A)所述蛋白质与SEQ ID NO:1中公开的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的结构同源性，聚乙二醇具有约5000Da的分子量，蛋白质和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白质共价连接，并且约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)或约80-90％，特别是约84％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与聚乙二醇部分相连。
(B)所述蛋白质与SEQ ID NO:1中公开的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的同源性，聚乙二醇具有约5000Da的分子量，蛋白质和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白质共价连接，并且约40％至约45％，特别是约43％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)或约36％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与聚乙二醇部分相连。
(C)所述蛋白质与SEQ ID NO:1中公开的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的同源性，聚乙二醇具有约2000Da的分子量，蛋白质和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白质共价连接，并且约100％的可用氨基(例如，一个或多个赖氨酸残基和/或N末端)或约80-90％，特别是约84％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与聚乙二醇部分相连。
(D)所述蛋白质与SEQ ID NO:1中公开的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶具有至少90％的同源性，聚乙二醇具有约2000Da的分子量，蛋白质和聚乙二醇部分通过酰胺键与蛋白质共价连接，并且[0092]约50％至约60％，特别是约55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)或约47％的总氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)与聚乙二醇部分相连。
L-天冬酰胺酶-PEG缀合物
与未修饰的L-天冬酰胺酶相比，特别是与未修饰的欧文氏菌L-天冬酰胺酶相比，更特别地与未修饰的来自菊欧文氏菌的L-天冬酰胺酶相比，并且更特别地与具有SEQ IDNO:1的序列的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，本发明的缀合物具有某些优点和出人意料的特性。
在一些实施方案中，本发明的方法涵盖这样的缀合物：当以5U/kg体重(bw)或10μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量施用时，其使血浆L-天冬酰胺和谷氨酰胺水平降低至少约12、24、48、72、96或120小时的时间段。在其他实施方案中，当以25U/kg bw或50μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至不可检测的水平，持续至少约12、24、48、72、96、120或144小时的时间段。在其他实施方案中，当以50U/kgbw或100μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至少约12、24、48、72、96、120、144、168、192、216或240小时的时间段。在另一个实施方案中，当以约100至约15,000IU/m2(约1-30mg蛋白质/m2)范围内的剂量施用时，本发明的缀合物使血浆L-天冬酰胺水平降低至不可检测的水平，持续至少约12、24、48、72、96、120、144、168、192、216或240小时的时间段。在一个特定实施方案中，所述缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQID NO:1的序列。在一个特定实施方案中，所述缀合物包含分子量小于或等于约5000Da的PEG(例如，mPEG)。在一个更特定的实施方案中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)是聚乙二醇化的。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约4.5至约8.5，特别是约6.5的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约501U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约75％至约85％，特别是约81％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以5000Da的mPEG聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约12.0至约18.0，特别是约15.1的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约483U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约75％至约85％，特别是约78％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以5000Da的mPEG聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约5.0至约9.0，特别是约7.0的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约501U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约80％至约90％，特别是约87％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以10,000Da的mPEG聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约11.0至约17.0，特别是约14.1的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约541U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约80％至约90％，特别是约87％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以10,000Da的mPEG聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约6.5至约10.5，特别是约8.5的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约524U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约80％至约90％，特别是约84％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约40％-55％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以2,000Da的mPEG聚乙二醇化。
在一个实施方案中，所述缀合物包含约12.5至约18.5，特别是约15.5的mol PEG/mol单体比；约450至约550U/mg，特别是约515U/mg的比活性；以及与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，约80％至约90％，特别是约83％的相对活性。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列，其中大约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)以2,000Da的mPEG聚乙二醇化。
在其他实施方案中，单次注射后，与相应的未修饰的L-天冬酰胺酶相比，本发明的缀合物具有至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的增加的效力。在一个具体实施方案中，具有这些特性的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。在一个特定实施方案中，所述缀合物包含分子量小于或等于约5000Da的PEG(例如，mPEG)。在一个更特定的实施方案中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)是聚乙二醇化的。
在一个实施方案中，本发明的缀合物具有根据以下的如PCT公布号WO2011003886中所述确定的单剂量药代动力学特征谱，具体地，其中所述缀合物包含分子量小于或等于2000Da的mPEG和来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列：
Amax：约150U/L至约250U/L；
TAmax：约4h至约8h，具体地约6h；
dAmax：约220h至约250h，具体地约238.5h(零以上，从约90min至约240h)；
AUC：约12000至30000；以及
t1/2：约50h至约90h。
在一个实施方案中，本发明的缀合物具有根据以下的单剂量药代动力学特征谱，具体地，其中所述缀合物包含分子量小于或等于5000Da的mPEG和来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列：
Amax：约18U/L至约250U/L；
TAmax：约1h至约50h；
dAmax：约90h至约250h，具体地约238.5h(零以上，从约90min至约240h)；
AUC：约500至35000；以及
t1/2：约30h至约120h。
在一个实施方案中，在单剂量之后，与同等蛋白量的培门冬酶相比，本发明的缀合物在一段时间内(例如，24、48或72小时)产生相似水平的L-天冬酰胺耗尽。在一个具体实施方案中，所述缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。在一个特定实施方案中，所述缀合物包含分子量小于或等于约5000Da的PEG(例如，mPEG)。在一个更特定的实施方案中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)是聚乙二醇化的，更特别地约40-55％或100％。
在一个实施方案中，本发明的缀合物具有比以相等蛋白质剂量施用的培门冬酶更长的t。在一个具体实施方案中，在约50μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量下，所述缀合物具有至少约50、52、54、56、58、59、60、61、62、63、64或65小时的t1/2。在另一个具体实施方案中，在约10μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量下，所述缀合物具有至少约30、32、34、36、37、38、39或40小时的t1/2。在另一个具体实施方案中，缀合物在约100至约15,000IU/m2(约1-30mg蛋白质/m2)范围内的剂量下具有至少约100至约200小时的t1/2。
在一个实施方案中，在相等的蛋白质剂量下，本发明的缀合物具有比培门冬酶大至少约2、3、4或5倍的平均AUC。
在一个实施方案中，在施用单剂量后持续特定的时间段，本发明的缀合物不产生任何显著的抗体应答，所述时间段为，例如，大于约1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周等。在一个特定实施方案中，本发明的缀合物持续至少8周不产生任何显著的抗体应答。在一个实例中，“不产生任何显著的抗体应答”是指接受缀合物的受试者在本领域认可的参数内被鉴定为抗体阴性的。可通过本领域已知的方法确定抗体水平，例如ELISA或表面等离子体共振(SPR-Biacore)测定(Zalewska-Szewczyk(2009)Clin.Exp.Med.9,113-116；Avramis(2009)Anticancer Research 29,299-302，其中的每一个以引用方式整体并入本文)。本发明的缀合物可具有这些特性的任何组合。
PAS化的L-天冬酰胺酶
在一些实施方案中，本发明的方法涵盖包含一个或多个肽的L-天冬酰胺酶的缀合物，其中所述肽各自独立地为肽RN–(P/A)–RC，其中(P/A)是仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中RN是附接至所述氨基酸序列的N末端氨基的保护基，并且其中RC是通过其氨基结合至所述氨基酸序列的C末端羧基的氨基酸残基，其中每个肽通过由所述肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和L-天冬酰胺酶的游离氨基形成的酰胺键缀合至L-天冬酰胺酶，并且其中肽所缀合的游离氨基中的至少一个不是L-天冬酰胺酶的N末端α-氨基。这些分子也称为L-天冬酰胺酶的PAS化型式，并且在本文也称为缀合物。
修饰的L天冬酰胺酶蛋白的单体在修饰后具有约350、400、450、500个氨基酸至约550、600、650、700或750个氨基酸。在另外的方面，修饰的L-天冬酰胺酶蛋白具有约350至约750个氨基酸，或约500至约750个氨基酸。
如本文所述的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中包含的每个肽独立地是肽RN–(P/A)–RC。因此，对于本文所述的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中包含的每个肽，N末端保护基RN、氨基酸序列(P/A)和C末端氨基酸残基RC各自独立地选自其相应的含义。因此，修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中包含的两个或更多个肽可以是相同的，或它们可彼此不同。在一个方面，修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中包含的所有肽都是相同的。
化学缀合的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中包含在肽RN–(P/A)–RC中的部分(P/A)是氨基酸序列，其可以由总共介于10至100或更多个之间的脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基，总共15至60个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基，总共15至45个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成，例如总共20至约40个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基。在一个优选方面，所述氨基酸序列由约20个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。在另一个优选方面，所述氨基酸序列由约40个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。在肽RN–(P/A)–RC中，部分(P/A)中包含的脯氨酸残基的数目与(P/A)中包含的氨基酸残基的总数目的比率优选地≥10％且≤70％，更优选地≥20％且≤50％，并且甚至更优选地≥25％且≤40％。因此，优选的是，(P/A)中的氨基酸残基的总数目的10％至70％是脯氨酸残基，更优选地，(P/A)中包含的氨基酸残基的总数目的20％至50％是脯氨酸残基；并且甚至更优选地，(P/A)中包含的氨基酸残基的总数目的25％至40％(例如，25％、30％、35％或40％)是脯氨酸残基。此外，优选的是，(P/A)不含任何连续的脯氨酸残基(即，不含任何部分序列PP)。在一个优选方面，(P/A)是氨基酸序列AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(SEQ ID NO:2)。在另一个优选方面，(P/A)是氨基酸序列AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAAPAAPAPAAPAAPAPAAPA(SEQ ID NO:3)。
肽RN–(P/A)–RC中的基团RN可以是附接至氨基酸序列(P/A)的N末端氨基，特别是N末端α-氨基的保护基。优选的是，RN是焦谷酰基(pyroglutamoyl)或乙酰基。
肽RN–(P/A)–RC中的基团RC是氨基酸残基，其通过其氨基结合至(P/A)的C末端羧基，并且在其氨基与其羧基之间包括至少两个碳原子。应当理解，RC的氨基与羧基之间的至少两个碳原子可提供RC的氨基与羧基之间的至少两个碳原子的距离(例如，RC是ω-氨基-C3-15链烷酸，诸如ε-氨基己酸的情况)。优选的是，RC是ε-氨基己酸。
在一个实施方案中，所述肽是Pga-AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA-Ahx-COOH(SEQ ID NO:4)或Pga-AAPAAPAPAAPAAPAPAAPAAAPAAPAPAAPAAPAPAAPA-Ahx-COOH(SEQ ID NO:5)。术语“Pga”是“焦谷酰基”或“焦谷氨酸”的缩写。术语“Ahx”是“ε-氨基己酸”的缩写。
在如本文所述的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白中，每个肽RN–(P/A)–RC可以通过由所述肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和L-天冬酰胺酶的游离氨基形成的酰胺键与L-天冬酰胺酶缀合。L-天冬酰胺酶的游离氨基可以是，例如，L-天冬酰胺酶的N末端α-氨基或侧链氨基(例如，L-天冬酰胺酶中包含的赖氨酸残基的ε-氨基)。如果L-天冬酰胺酶由多个亚基组成，例如，如果L-天冬酰胺酶是四聚体，那么可存在多个N末端α-氨基(即，每个亚基上一个)。在一个方面，如本文定义的9至13个肽(例如，9、11、12或13个肽)可化学缀合至L-天冬酰胺酶(例如缀合至L-天冬酰胺酶的每个亚基/单体)。
根据上文，在一个方面，肽所化学缀合的游离氨基中的至少一个不是(即，不同于)L-天冬酰胺酶的N末端α-氨基。因此，优选的是，肽所缀合的游离氨基中的至少一个是L-天冬酰胺酶的侧链氨基，并且特别优选的是，肽所缀合的游离氨基中的至少一个是L-天冬酰胺酶的赖氨酸残基的ε-氨基。
此外，优选的是，肽所缀合的游离氨基选自L-天冬酰胺酶的任何一个或多个赖氨酸残基的一个或多个ε-氨基、L-天冬酰胺酶的一个或多个N末端α-氨基或L-天冬酰胺酶的任何一个或多个亚基的一个或多个N末端α-氨基，以及其任何组合。特别优选的是，肽所缀合的游离氨基中的一个是N末端α-氨基，而肽所缀合的游离氨基中的其他一个或多个各自为L-天冬酰胺酶的赖氨酸残基的ε-氨基。可替代地，优选的是，肽所缀合的游离氨基中的每一个是L-天冬酰胺酶的赖氨酸残基的ε-氨基。
如本文所述的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白由L-天冬酰胺酶和如本文所定义的一个或多个肽组成。相应的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白可以例如由一个L-天冬酰胺酶和1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55个(或更多个)各自与L-天冬酰胺酶缀合的肽组成。L-天冬酰胺酶可以是，例如，单体蛋白或由多个亚基组成的蛋白，例如四聚体。如果L-天冬酰胺酶是单体蛋白，那么相应的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白可以例如由一个单体L-天冬酰胺酶和9至13个(或更多个)(例如，8、9、10、11、12或13个)各自与单体L-天冬酰胺酶缀合的肽组成。单体L-天冬酰胺酶的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出。如果L-天冬酰胺酶是由多个亚基组成的蛋白质，例如由四个亚基组成(即，如果所述L-天冬酰胺酶是四聚体)，那么相应的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白可以例如由四个L-天冬酰胺酶亚基和九至十三个(或更多个)(例如，9、10、11、12或13个)如本文所定义的各自缀合至L-天冬酰胺酶的每个亚基的肽组成。L-天冬酰胺酶的亚基的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:1中示出。类似地，如果L-天冬酰胺酶是由多个亚基组成的蛋白质，例如由四个亚基组成(即，如果所述L-天冬酰胺酶是四聚体)，那么相应的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白可以例如由四个L-天冬酰胺酶亚基和30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55个(或更多个)各自缀合至L-天冬酰胺酶四聚体的肽组成。在一个方面，本发明涉及具有L-天冬酰胺酶和多个化学附接的肽序列的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白。在另一方面，肽序列的长度为约10至约100、约15至约60或约20至约40。
仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的肽可共价连接至所述L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基酸，诸如赖氨酸残基和/或N末端残基，并且/或者仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的肽可共价连接至L-天冬酰胺酶表面的至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％至约60％、70％、80％、90％或100％的可用氨基，包括赖氨酸残基和/或N末端残基的氨基。例如，每个L-天冬酰胺酶可存在约11至12个可用赖氨酸残基，并且约8至12个赖氨酸将缀合至仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的肽。在另外的方面，仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的肽共价连接至所述L-天冬酰胺酶的总赖氨酸残基的约20％、30％、40％、50％或60％至约30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在另外的实施方案中，仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的肽通过接头与L-天冬酰胺酶共价连接。示例性接头包括美国专利申请号2015/0037359中公开的接头，其以引用方式整体并入本文。
在一个方面，缀合物是包含L-天冬酰胺酶以及仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成的长度为约200至约400个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的多肽的融合蛋白。换句话说，多肽可由约200至约400个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成。在一个方面，所述多肽由总共约200(例如201)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成(即，具有约200(例如201)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的长度)，或所述多肽由总共约400(例如401)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成(即，具有约400(例如401)个脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基的长度)。在一些优选实施方案中，所述多肽包含如SEQ ID NO:6或7所示的氨基酸序列或由其组成。在一些方面，融合蛋白每个单体具有约350、400、450、500个氨基酸至约550、600、650、700、750或1,000个氨基酸，包括单体和P/A氨基酸序列。在另外的方面，修饰蛋白具有约350至约800个氨基酸，或约500至约750个氨基酸。例如，所述多肽包括在美国专利号9,221,882中制备的肽。在一些方面，L-天冬酰胺酶来自欧文氏菌种，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，L-天冬酰胺酶包含如本文所述的SEQ ID NO:1的序列。
在另外的方面，本文公开的L-天冬酰胺酶可以使用(重组)载体产生，所述载体包含编码包含L-天冬酰胺酶和多肽的修饰的L-天冬酰胺酶蛋白的核苷酸序列，其中所述多肽仅由脯氨酸和丙氨酸氨基酸残基组成，优选地其中修饰蛋白是融合蛋白，如本文所述，其中载体可以表达修饰蛋白(例如融合蛋白)。在另外的方面，本发明还涉及包含本文所述的(重组)载体的宿主。宿主可以是酵母，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia Pistoris)、细菌、放线菌、真菌、藻类和其他微生物，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、芽孢杆菌(Bacillus)种、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和以下种属的细菌宿主：沙雷氏菌属(Serratia)、变形杆菌属(Proteus)、不动杆菌属(Acinetobacter)和产碱杆菌属(Alcaligenes)。其他宿主是本领域技术人员已知的，包括表达缺乏谷氨酰胺酶活性的天冬酰胺酶的变体的白色拟诺卡氏菌(Nocardiopsis alba)，以及在Savitri等人.(2003)Indian Journal ofBiotechnology,2,184-194(其以引用方式整体并入本文)中公开的那些。
治疗方法和用途
本发明的缀合物可以用于治疗通过耗尽天冬酰胺和/或谷氨酰胺可治疗的疾病。例如，所述缀合物可用于治疗成人和儿童中的急性成淋巴细胞性白血病(ALL)，以及预期天冬酰胺和/或谷氨酰胺的耗尽将具有有用效果的其他病状，或用于制造用于治疗所述疾病的药物。此类病状包括但不限于以下：恶性肿瘤或癌症，包括但不限于血液系统恶性肿瘤、淋巴瘤、大细胞免疫母细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK淋巴瘤、霍奇金病、急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性T细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML)、双表型B细胞骨髓单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤和黑素肉瘤。在一些实施方案中，所述疾病可以是急性骨髓性白血病或弥漫性大B细胞淋巴瘤。恶性肿瘤或癌症包括但不限于肾细胞癌、肾细胞腺癌、胶质母细胞瘤(包括多形性胶质母细胞瘤和星形胶质母细胞瘤)、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、肺癌(包括大细胞肺癌和小细胞肺癌)、子宫内膜癌、卵巢腺癌、卵巢畸胎癌、宫颈腺癌、乳腺癌、乳腺腺癌、乳腺导管癌、胰腺癌、胰腺导管癌、结肠癌、结肠腺癌、结肠直肠腺癌、膀胱移行细胞癌、膀胱乳头状瘤、前列腺癌、骨肉瘤、骨上皮癌、前列腺癌和甲状腺癌。
响应于天冬酰胺和/或谷氨酰胺耗尽的代表性的非恶性血液系统疾病包括免疫系统介导的血液疾病，例如感染性疾病，诸如由HIV感染引起的那些(即AIDS)。与天冬酰胺和/或谷氨酰胺依赖性相关的非血液系统疾病包括自身免疫疾病，例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、胶原血管病等。其他自身免疫疾病包括骨关节炎、艾萨克综合征(Issac’s syndrome)、银屑病、胰岛素依赖性糖尿病、多发性硬化症、硬化性全脑炎、风湿热、炎性肠病(例如，溃疡性结肠炎和克罗恩病)、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、肾小球性肾炎、重症肌无力、寻常天疱疮和格雷夫斯病。可在任何合适的体外或体内测定(例如，其中生长培养基缺乏天冬酰胺和/或谷氨酰胺的体外测定)中针对天冬酰胺和/或谷氨酰胺依赖性对疑似引起疾病的细胞进行测试。因此，在一个方面，本发明涉及一种治疗患者的可治疗的疾病的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本发明的缀合物。在另一方面，本发明的缀合物与另一活性药物成分共同施用。在一些实施方案中，本发明的缀合物与
Figure BDA0002562222360000311
道诺霉素、阿糖胞苷、
Figure BDA0002562222360000312
ABT-737、维奈托克(Venetoclax)、达托里昔布、硼替佐米、卡非佐米、长春新碱、泼尼松龙、依维莫司和/或CB-839共同施用。在一个具体实施方案中，疾病是ALL。在一个特定实施方案中，用于治疗通过天冬酰胺和/或谷氨酰胺耗尽可治疗的疾病的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含如本文所述的SEQ ID NO:1的序列。
在一个实施方案中，使用本发明的缀合物进行的治疗将作为一线疗法施用。在另一个实施方案中，使用本发明的缀合物进行的治疗将作为二线疗法在患者(特别是患有ALL的患者)中施用，其中所述患者对于其他天冬酰胺酶制剂，特别是天然大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶或其聚乙二醇化的变体(培门冬酶)产生了过敏或超敏性(包括“沉默超敏性”)的客观迹象。过敏或超敏性的客观迹象的非限制性实例包括针对天冬酰胺酶测试“抗体阳性”。在一个具体的实施方案中，在用培门冬酶治疗之后，将本发明的缀合物用于二线疗法中。在一个更具体的实施方案中，二线疗法中所用的缀合物包含来自欧文氏菌种的L-天冬酰胺酶，更具体地来自菊欧文氏菌，并且更具体地，所述L-天冬酰胺酶包含SEQ ID NO:1的序列。在一个更具体的实施方案中，所述缀合物还包含分子量小于或等于约5000Da，更具体地约5000Da的PEG(例如，mPEG)。在一个甚至更具体的实施方案中，至少约40％至约100％的可用氨基(例如，赖氨酸残基和/或N末端)是聚乙二醇化的，更特别地约40-55％或100％。
在另一方面，本发明涉及一种用于治疗急性成淋巴细胞性白血病的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的本发明的缀合物。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗急性骨髓性白血病的方法，所述方法包括向需要治疗的患者共同施用治疗有效量的与道诺霉素、阿糖胞苷、
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ABT-737、维奈托克、达托里昔布、硼替佐米和/或卡非佐米组合的本发明的缀合物。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗急性骨髓性白血病的方法，所述方法包括向需要治疗的患者共同施用治疗有效量的与维奈托克组合的本发明的缀合物。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向需要治疗的患者共同施用治疗有效量的与ABT-737、维奈托克、卡非佐米、长春新碱和/或泼尼松龙组合的本发明的缀合物。在另一方面，本发明涉及一种用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤的方法，所述方法包括向需要治疗的患者共同施用治疗有效量的与长春新碱组合的本发明的缀合物。
在另一方面，将以下列范围内的剂量施用本文所述的缀合物：约1500IU/m2至约15,000IU/m2，通常为约10,000至约15,000IU/m2(约20-30mg蛋白质/m2)，方案为约一周两次至约一月一次，通常为一周一次或隔周一次，作为单一药剂(例如，单一疗法)或作为化疗药物的组合的一部分，所述药物包括但不限于糖皮质激素、皮质类固醇、抗癌化合物或其他药剂，包括但不限于甲氨蝶呤、地塞米松、强的松、泼尼松龙、长春新碱、环磷酰胺和蒽环类药物。例如，在化疗期(包括诱导、巩固或强化，以及维持)中将作为多药剂化疗的组分向患有ALL的患者施用本发明的缀合物。在一个具体实例中，缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂(例如，诸如美国专利号9,920,311中所阐述，其以引用方式整体并入本文)一起施用。在另一个具体实例中，缀合物不与天冬酰胺合成酶抑制剂一起施用，但是与其他化疗药物一起施用。所述缀合物可以作为多药剂化疗方案的一部分在其他化合物之前、之后或与其同时施用。
在一个具体的实施方案中，所述方法包括以约1U/kg至约25U/kg(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25U/kg)的量或其等效量20(例如，以蛋白质含量计)施用本发明的缀合物。在一个更具体的实施方案中，以选自由约5、约10和约25U/kg组成的组的量施用缀合物。在另一个具体的实施方案中，以在约1,000IU/m2至约20,000IU/m2范围内的剂量(例如，1,000IU/m2、2,000IU/m2、3,000IU/m2、4,000IU/m2、5,000IU/m2、6,000IU/m2、7,000IU/m2、8,000IU/m2、9,000IU/m2、10,000IU/m2、11,000IU/m2、12,000IU/m2、13,000IU/m2、14,000IU/m2、15,000IU/m2、16,000IU/m2、17,000IU/m2、18,000IU/m2,、19,000IU/m2或20,000IU/m2)施用缀合物。在另一个具体实施方案中，以下列剂量施用缀合物：对于单剂量，其将L-天冬酰胺和/或谷氨酰胺耗尽至持续约3天至约10天(例如，3、4、5、6、7、8、9或10天)的时间段使用本领域已知的方法和设备不可检测的水平。
在另一个实施方案中，所述方法包括施用本发明的缀合物，与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在患者中引起更低的免疫原性应答。在另一个实施方案中，所述方法包括施用本发明的缀合物，与未缀合的L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物在单剂量之后具有更长的体内循环半衰期。在一个实施方案中，所述方法包括施用这样的缀合物：以相等的蛋白质剂量施用时，其具有比培门冬酶更长的t1/2。在一个具体实施方案中，所述方法包括施用这样的缀合物：在约50μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量下，其具有至少约50、52、54、56、58、59、60、61、62、63、64或65小时的t1/2。在另一个具体实施方案中，所述方法包括施用这样的缀合物：在约10μg/kg(以蛋白质含量计)的剂量下，其具有至少约30、32、34、36、37、37、39或40小时的t1/2。在另一个具体实施方案中，所述方法包括施用这样的缀合物：在约10,000至约15,000IU/IU/m2(约20-30mg蛋白质/IU/m2)范围内的剂量下，其具有至少约100至约200小时的t1/2。在一个实施方案中，所述方法包括施用这样的缀合物：在相等的蛋白质剂量下，其具有比培门冬酶大至少约2、3、4或5倍的平均AUC。
使用L-天冬酰胺酶治疗后，ALL患者中的复发率仍然是高的，其中大约10％-25％的儿科ALL患者具有早期复发(例如，一些在诱导后30-36个月的维持期中)(Avramis(2005)Clin.Pharmacokinet.44,367-393)。如果用大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶治疗的患者有复发，随后用大肠杆菌制剂进行的治疗可导致“疫苗接种”效果，由此大肠杆菌制剂在随后的施用过程中具有增加的免疫原性。在一个实施方案中，可将本发明的缀合物用于治疗具有复发的ALL的患者的方法中，所述患者先前用其他天冬酰胺酶制剂治疗过，特别是那些先前用大肠杆菌来源的天冬酰胺酶治疗过的患者。
在一些实施方案中，本发明的用途和治疗方法包括施用具有上文(例如，在标题为L-天冬酰胺酶PEG缀合物或PAS化的L-天冬酰胺酶的部分中)或下文所述的特性或特性组合的L-天冬酰胺酶缀合物。
组合物、制剂和施用途径
本发明还包括包含本发明的缀合物的药物组合物。在一个具体实施方案中，所述药物组合物作为待用溶剂重构的冻干粉末包含在小瓶中，诸如目前可得的天然L-天冬酰胺酶，无论用于其生产的细菌来源为何
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在另一个实施方案中，药物组合物还可包括“随时使用的”溶液，诸如培门冬酶
Figure BDA0002562222360000342
其使得能够在适当的处理后通过例如肌内、静脉内(输注和/或推注)、脑-心室内(icv)、皮下途径施用。在另外实施方案中，药物组合物可包含与
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道诺霉素、阿糖胞苷、ABT-737、维奈托克、达托里昔布、硼替佐米、卡非佐米、长春新碱、泼尼松龙、依维莫司和/或CB-839组合的本发明的缀合物。
可以使用标准技术向患者施用本发明的缀合物，包括包含本发明的缀合物的组合物(例如，药物组合物)。技术和制剂通常可在以引用方式并入本文的Remington’sPharmaceutical Sciences(2013)第22版,Mack Publishing中找到。
合适的剂型部分取决于用途或进入途径，例如口服、经皮、经粘膜或通过注射(肠胃外)。此类剂型应允许治疗剂到达靶细胞，或以其他方式具有期望的治疗效果。例如，注射到血流中的药物组合物优选是可溶的。
根据本发明的缀合物和/或药物组合物可被配制为药学上可接受的盐及其复合物。药学上可接受的盐在其被施用的量和浓度下存在时是非毒性的盐。此类盐的制备可以通过改变化合物的物理特征而不阻止其发挥其生理学作用来促进药物使用。在物理特性方面有用的改变包括降低熔点以促进经粘膜施用，以及增加溶解性以有利于施用更高浓度的药物。如本领域技术人员将会知道的，天冬酰胺酶的药学上可接受的盐可作为复合物存在。
药学上可接受的盐包括酸加成盐，诸如含有硫酸盐、盐酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、环己基氨基磺酸盐和奎尼酸盐的那些。药学上可接受的盐可获自酸，包括盐酸、马来酸、硫酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、丙二酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己基氨基磺酸、延胡索酸和奎尼酸。
药学上可接受的盐还包括碱加成盐，诸如当酸性官能团(诸如羧酸或酚)存在时，含有苄星青霉素、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺、普鲁卡因、铝、钙、锂、镁、钾、钠、铵、烷基胺和锌的那些。例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences,同上。可以使用适当的相应碱制备此类盐。
药学上可接受的载体和/或赋形剂也可被掺入根据本发明的药物组合物中以有利于特定天冬酰胺酶的施用。适用于实践本发明的载体的实例包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖(诸如乳糖、葡萄糖或蔗糖)，或各种淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油、聚乙二醇和生理学上相容的溶剂。生理学上相容的溶剂的实例包括用于注射的无菌水溶液(WFI)、盐溶液和右旋糖。
可通过不同的途径施用根据本发明的药物组合物，包括静脉内、腹膜内、皮下、肌内、口服、局部(经皮)或经粘膜施用。对于全身性施用，优选口服施用。对于口服施用，例如，可将化合物配制成常规的口服剂型，诸如胶囊、片剂和液体制剂诸如糖浆、酏剂和浓缩滴剂。
可替代地，可使用注射(肠胃外施用)，例如肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。对于注射，将药物组合物配制于液体溶液中，优选生理学相容的缓冲液或溶液，诸如盐水溶液、汉克氏溶液(Hank’s solution)或林格氏溶液(Ringer’s solution)。此外，可将化合物配制为固体形式并在即将使用前重新溶解或悬浮。例如，可产生冻干形式的所述缀合物。在一个具体实施方案中，肌内施用所述缀合物。在另一个具体实施方案中，静脉内施用所述缀合物。
也可通过经粘膜或经皮手段实现全身性施用。对于经粘膜或经皮施用，在制剂中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂是本领域熟知的，并且对于经粘膜施用而言，包括例如胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，可使用去污剂促进渗透。经粘膜施用，例如，可以是通过鼻用喷雾、吸入器(用于肺部递送)、直肠栓剂或阴道栓剂。对于局部施用，化合物可被配制成软膏、药膏、凝胶或乳霜，如本领域所熟知的。
待递送的缀合物的量将取决于许多因素，例如化合物的IC50、EC50、生物学半衰期、患者的年龄、体型、重量和身体状况，以及待治疗的疾病或病症。这些因素和要考虑的其他因素的重要性是本领域普通技术人员所熟知的。通常，待施用的缀合物的量将在约10个国际单位/平方米患者身体表面积(IU/m2)至50,000IU/m2的范围内，优选的是约1,000IU/m2至约15,000IU/m2的剂量范围，并且更优选的是约6,000IU/m2至约15,000IU/m2的范围，并且对于治疗恶性血液系统疾病(例如白血病)而言特别优选的是约10,000至约15,000IU/m2(约20-30mg蛋白质/m2)的范围。通常，在治疗过程中，这些剂量以约每周3次至约每月一次，通常每周一次或隔周一次的间隔，通过肌内或静脉内注射施用。当然，可采用其他剂量和/或治疗方案，如由主治医师所确定的。
本发明通过以下另外的实施例进行进一步说明，所述实施例不应理解为限制性的。根据本公开，本领域技术人员应当理解的是，可以在不背离本发明的精神和范围的情况下对所公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相似或类似的结果。
实施例
美国专利号9,920,311的主题以引用方式并入本文，包括公开了产生和测试聚乙二醇化的天冬酰胺酶的方法的实施例。如美国专利号9,920,311中所阐述，制备以下实施例中使用的mPEG-r-克立他酶缀合物。
实施例1
如下文所示，在两个阶段中针对各种细胞系测试mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶)。
细胞制备。所有细胞系均已获得弗吉尼亚州马纳萨斯市(美国)的美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许可。通过在ATCC推荐的培养基中进行传代培养并根据ATCC推荐的规程(www.atcc.org)进行冷冻来制备主细胞库和工作细胞库(MCB和WCB)。
化合物制备。将测试化合物适当地制备为在DMSO或水性缓冲液中的原液，并进行连续稀释以获得稀释系列。
细胞增殖测定。使用ATP作为端值，用可商购获得的发光测定评估细胞增殖。
对照。t＝0信号。在平行板上，分配45μl细胞，并在5％CO2的潮湿气氛中在37℃下孵育。24小时后，将5μl含DMSO的Hepes缓冲液和25μl ATPlite 1StepTM溶液混合，并且在孵育10分钟后测量发光(＝发光t＝0)。
参考化合物。参考化合物多柔比星的IC50在单独的板上测量。连续记录IC50。如果IC50超限(偏离历史平均值0.32-3.16倍)，则该测定无效。
细胞生长控制。所有细胞系的细胞倍增时间由未处理细胞的t＝0小时和t＝结束的生长信号计算。如果倍增时间超限(偏离历史平均值0.5-2.0倍)，则该测定无效。
最大信号。对于每个细胞系，在存在0.4％DMSO、不含化合物的情况下孵育直到t＝结束后记录最大发光(＝发光未处理,t＝结束)。
药物敏感性。以三种方式分析细胞系的“修饰型”和“野生型”组之间的10log IC50差异。首先，对于十八个最常见的遗传变化，在瀑布图中使各个细胞系的药物敏感性可视化。其次，在统计程序R中，使用II型Anova分析对最常见且最知名的癌基因的较大子集(总共38个)进行分析。结果展示在火山图中。第三，在R中通过双侧同方差t检验对114个癌基因的完整集合进行分析。对来自Anova和t检验的p值进行Benjamini-Hochberg多重检验校正，并且只有错误发现率低于20％的遗传相关性被认为是显著的。38个癌基因的II型Anova分析是与114个癌基因的同方差t检验不同的测试，这意味着相关性的显著性可能有所不同。有关OncolinesTM方法的更多信息，请参见www.ntrc.nl/services/oncolinestm。
使用IDBS XLfit，通过非线性回归计算IC50。孵育直到t＝结束后的生长百分比(％生长)计算如下：100％x(发光t＝结束/发光未处理,t＝结束)。通过4参数对数曲线将其拟合至10log化合物浓度(conc)：％生长＝底部+(顶部–底部)/(1+10(logIC50–conc)*hill))，其中hill是希尔系数，并且底部和顶部是在该测定中该化合物允许的渐进最小和最大细胞生长。
OncolinesTM中的培克立他酶
Figure BDA0002562222360000391
NCI60参数。50％细胞死亡时的浓度LD50是其中发光t＝结束＝1/2x发光t＝0h时的浓度。50％生长抑制的浓度GI50是其中细胞生长为半最大值时的浓度。这是与信号相关的浓度：((发光未处理，t＝结束-发光t＝0)/2)+发光t＝0。
曲线拟合。根据以下方案手动调整软件自动计算的曲线：当计算得到的曲线具有低于零的底部时，将曲线底部固定为0％。当软件计算较低值时，hill固定为-6。当用于拟合质量的F检验值>1.5时，或当化合物没有活性(<20％的最大效应)时，曲线无效，在这种情况下，将曲线从图中移除。当曲线具有双相特征时，将其拟合于效力最大的IC50。偶然地，当可能发生技术故障时，浓度点被淘汰。这总是显示在剂量-反应图中。当剂量-反应曲线被完全确定超过85％时，将最大效应(Max效应)计算为100％(未处理细胞的信号)减去曲线底部。当最高浓度下的数据点到达曲线底部时，剂量-反应曲线被认为100％完成。如果完整性小于85％，那么将最大效应计算为100％减去最低信号的平均值。在曲线底部被锁定为0％的情况下，最大效应始终计算为100％减去最高浓度下的生长抑制。
火山图。图8中的火山图示出38个重要基因的遗传转化如何与化合物敏感性(通过10logIC50测得)的偏移在统计学上相关。p值(火山图中的y轴)表示特定基因的突变与IC50偏移的遗传相关性的置信水平。IC50偏移的因子在x轴上示出。圆圈的面积与细胞组中突变体的数量成比例(每个突变存在至少3次)。为了计算显著性，对p值进行Benjamin-Hochberg多重检验校正，并且只有错误发现率<20％的遗传相关性为灰色。相关的截断p值(0.059)由一条水平线表示。如果不存在显著的相关性，那么不绘制灰色圆圈和水平线。
T检验的结果。对于98个经过验证的癌症驱动基因(其突变也发生在患者中)，测试了该基因的‘野生型’和‘突变型’变体在细胞系中的存在与否是否与所研究化合物的显著IC50偏移相关。‘IC50偏移’列表示10logIC50差。负的IC50偏移表明该化合物在携带“突变”基因的细胞系中更有效。‘p值’列表示双侧t检验的结果。为了计算显著性，对p值进行Benjamin-Hochberg多重检验校正，并且只有错误发现率<20％的遗传相关性突出显示(‘调整p值(adj.p-value)’列)。如果不存在显著相关性，那么下表中没有灰色单元格。
Figure BDA0002562222360000411
图9的特殊火山图将化合物敏感性(通过10logIC50测得)与癌症热点突变的存在相关联。与先前的分析相比，这对临床相关癌症驱动基因突变提供了更多关注。热点突变是通过单独研究对患者中的突变复发模式和拷贝数变化进行统计分析得出的。轴和统计分析与图8的火山图相同。显著性的截断p水平为0.32。
实施例3：培克立他酶和
Figure BDA0002562222360000412
的协同活性。效应20为了在SynergyScreenTM实验中确定化合物对其他抗癌剂活性的影响，使用了低的固定浓度，所述浓度对应于细胞生长被抑制20％时的浓度。该浓度使用单一化合物的剂量-反应曲线确定。该浓度是x轴上与y轴上未处理细胞的80％活力相对应的值。
Figure BDA0002562222360000413
Figure BDA0002562222360000421
Figure BDA0002562222360000422
使用AML或DLBCL的护理标准(SOC)中常用的其他药剂对mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶；参见以下第一个表格)或
Figure BDA0002562222360000423
(参见以下第二个表格)进行测试。当与道诺霉素、阿糖胞苷、ABT-737、维奈托克、达托里昔布、硼替佐米和卡非佐米一起使用时，在AML中的效果增加。此外，当与长春新碱、泼尼松龙、ABT-737、维奈托克、依维莫司、达托里昔布、硼替佐米、卡非佐米和CB-839一起使用时，在DLBCL中的效果增加。请参见下表。灰色阴影表示协同活性。浅灰色阴影表示一个实验，并且深灰色表示两个实验。
Figure BDA0002562222360000431
Figure BDA0002562222360000432
实施例3：用阿糖胞苷和道诺霉素在体内测试mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶)。向各5只小鼠的组给予作为单一药剂(5&50IU/kg)的mPEG-r-克立他酶(PegC)并且给予与SOC药剂阿糖胞苷(50mg/kg，每天一次，持续5天，然后休息2天，持续2个周期)和道诺霉素(1mg/kg，每周施用，持续2周)的组合。这些剂量均耐受良好。参见图1。组1是PBS对照，组3是PegC，组11是道诺霉素外加PegC，并且组13是道诺霉素。平均相对体重下降大约10％是由道诺霉素引起的。
实施例4：本实施例以与实施例1类似的方式进行，但是测试了与其他化合物组合的mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶)。图2示出培克立他酶增强阿糖胞苷、维奈托克和ABT-737的效果，表明协同作用。
实施例5：针对HL-60细胞系测试了与ABT-737组合的mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶)。
板制备。将混合物和单一药剂的原液在DMSO或0.9％氯化钠中稀释，以产生7点剂量-反应系列。在20mM无菌Hepes缓冲液pH 7.4(参考化合物)或培养基(培克立他酶)中进一步稀释31.6倍后，在384孔测定板中，将5μl培克立他酶溶液和5μl参考化合物添加到40μl预涂板的细胞中，一式两份。孵育期间所有孔中的最终DMSO浓度均为0.4％。对于单一药剂，最终测定浓度范围在其IC50的10倍与0.01倍(10与0.01IC50当量)之间。
细胞增殖测定。将细胞测定原液解冻，在适当的培养基中稀释并分配在384孔板中，根据所用的细胞系，在45μl培养基中浓度为每孔800-3200个细胞：即，DB：每孔800个细胞；RL：每孔1000个细胞；MV-4-11：每孔1600个细胞；KG-1、HL-60和HT每孔3200个细胞。对于每个所用的细胞系，细胞密度预先进行了优化。板的边缘用磷酸盐缓冲盐水填充。将涂板的细胞在5％CO2的潮湿气氛中在37℃下孵育。24小时后，添加5μl的培克立他酶溶液和5μl的参考化合物，并将板再进一步孵育72小时。72小时后，将板在30分钟内冷却至室温，并向每个孔中添加25μl的ATPlite 1StepTM(PerkinElmer)溶液，随后振荡2分钟。在室温下于黑暗中孵育5分钟后，在Envision多模式读取器(PerkinElmer)上记录发光。
对照：t＝0信号。在平行板上，一式四份地分配40μl细胞，并在5％CO2的潮湿气氛中在37℃下孵育。24小时后，将板在30分钟内冷却至室温。添加5μl含DMSO的Hepes缓冲液、5μl含0.9％氯化钠的培养基和25μl的ATPlite 1StepTM溶液，随后混合2分钟。孵育10分钟后在黑暗中测量发光(＝发光t＝0)。
细胞生长控制。所有细胞系的细胞倍增时间由未处理细胞的t＝0小时和t＝结束的生长信号计算。如果倍增时间超限(偏离历史平均值0.5-2.0倍)，则该测定无效。
最大信号。在每个384孔板上，在存在0.4％DMSO、不含化合物的情况下孵育72小时后记录最大发光。对所有等效孔(通常为14个)取平均值。该平均值定义为：发光未处理,t＝72h。
剂量反应曲线。组合分析需要准确的单一药剂IC50。对于各单一药剂，其剂量-反应信号使用XL-fit 5(IDBS软件)通过4参数对数曲线拟合：
发光＝底部+(顶部–底部)/(1+10(log IC50–log[cpd])·hill))
[cpd]是所测试的化合物浓度。hill是希尔系数。底部和顶部是曲线的渐近最小值和最大值。
组合指数(CI)确定。CI是协同作用最广泛使用的定量指示之一。CI评估达到固定效果所需的浓度。低于1的CI表示协同作用。小于0.3的CI表示强协同作用。例如，0.1的CI表示为达到相同的效果水平，该组合需要的浓度比由单一药剂数据所预期的浓度低十倍。例如，当将CI为0.1的有效和效力较小的化合物组合时，效力较小的化合物将有效化合物的有效浓度提高十倍。
CI是针对一定的细胞活力百分比(V)定义的，其为与未暴露的对照相关的信号：V＝100％x发光未处理,t＝72h/发光未处理,t＝72h。然后，将达到一定的细胞活力百分比V所需的组合的两种化合物cpd1和cpd2的浓度与单一药剂所需的浓度进行比较：
CI(100-V)＝[cpd1]V/IC(100-V),cpd1+[cpd2]V/IC(100-V),cpd2
例如，[cpd1]50表示赋予50％活力的混合物中的cpd1浓度。IC50,cpd1将表示单独cpd1的IC50。按照惯例，通过％效果标记CI，因此CI75表示25％活力下的CI
曲线偏移分析。这种分析提供了协同作用1的视觉确认。化合物1和2(cpd1和cpd2)的混合物和单一药剂的浓度以IC50当量表示(以IC50为‘单位’)：
[mix]＝[cpd1]/IC50,cpd1+[cpd2]/IC50,cpd2
剂量-反应信号使用XL-fit 5(IDBS软件)通过4参数对数曲线拟合
发光＝底部+(顶部–底部)/(1+10(log X–log[mix])·hill))
此处hill是希尔系数并且X是曲线的拐点。底部和顶部是曲线的渐近最小值和最大值。因为[mix]以IC50当量表示，单一药剂的曲线将重叠，并且其拐点将位于值1处。计算中所用的IC50值是针对单一药剂平行确定的那些。
在不存在协同作用的混合物中，曲线将与单一药剂的那些重叠。在存在协同作用的混合物中，曲线将朝向较低的IC50当量向左偏移：混合物似乎比基于各成分所预期的更有效。这是协同作用的良好指标。
等效线图。等效线图是揭示药物组合是否具有协同作用的剂量导向图。其限定为通常75％的一定效果水平。如果单一药剂曲线未达到此功效水平，那么等效线图水平设置为50％、30％、25％或20％。如果单一药剂未达到20％的效果，那么不绘制等效线图。在轴上，绘制出给出预设生长效果的单一化合物的计算剂量。两点都用一条直线(相加性线(additivity line))连接。对于药物组合，计算出哪些稀释度给出预设生长效果，并且在等效线图中绘制出此时各组分的浓度。在相加的药物效果的情况下，药物组合将接近相加性线。在协同或拮抗作用的情况下，所述点将分别位于该线的下方或上方。
使用非活性剂的实验。在某些约定的情况下，在‘非活性’剂的存在下进行协同实验，所述非活性剂是在测试浓度下作为单一药剂不得到剂量-反应曲线的化合物。除了将‘非活性’剂以固定浓度添加到实验的每个孔之外，如上所述进行实验。由于单一‘非活性’剂不显示出效果，因此其对CI的贡献微不足道。CI值则基于活性剂的反应。确定与其他活性剂相比混合物的曲线偏移。未计算得到等效线图。单一药剂的剂量-反应曲线在图3中示出。ABT-737具有835nM的IC50和67％的最大效应，而培克立他酶具有0.15的IC50和88％的最大效应。
曲线偏移分析：将单一药剂曲线(灰色和深灰色)和混合物曲线(红色、橙色和粉色)的x轴基于单一药剂的IC50转化为IC50当量，并且与混合物的剂量-反应曲线进行比较，如图4所示。
对于基于IC50的混合物的剂量-反应曲线，将所有曲线叠加并记录偏移。与单一药剂曲线(灰色和深灰色)相比，混合物曲线的向左偏移表示协同作用，向右偏移表示拮抗作用(参见图5和下表)。
与单一药剂相比，混合物的IC50偏移
Figure BDA0002562222360000471
Figure BDA0002562222360000472
Figure BDA0002562222360000473
Figure BDA0002562222360000481
使用培克立他酶和ABT-737的组合的结果在下文示出。由混合物数据计算得到的CI值ED75对应于25％活力。代表值是三种混合物在50％活力下的平均CI值，所述值在汇总中指出。
Figure BDA0002562222360000482
Figure BDA0002562222360000483
Figure BDA0002562222360000484
组合数据用于产生等效线图，如图6所示。等效线图是揭示药物组合是否具有协同作用的剂量导向图。在协同作用的情况下，组合点位于相加性直线的下方。培克立他酶的浓度以IU/mL示出。相加性线(深灰色)指示将给出理论相加性的浓度组合。药物组合以红色、粉色和橙色点绘制。概括地说，发现HL-60细胞系中培克立他酶与ABT-737之间的强协同作用，如下所示。
Figure BDA0002562222360000491
*在ED50下混合物的平均组合指数；CI＝1.0：无协同作用；CI<1.0：协同作用；CI<0.3：强协同作用；CI>1.5：拮抗
ND：未确定，测试化合物具有<20％的功效
NA：不适用
实施例6：本实施例以与实施例5类似的方式进行，但是如下所示测试了在不同细胞类型中与另外抗癌剂的协同作用。
Figure BDA0002562222360000492
Figure BDA0002562222360000501
实施例7：本实施例以与实施例1类似的方式进行，但是针对CNS细胞系测试了mPEG-r-克立他酶缀合物的活性，所述CNS细胞系包括例如胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤和星形胶质母细胞瘤。结果展示在图7中。进行了使用不同细胞系的另外实验，并且结果展示在图10中。
实施例8：根据实施例1所述的方法，针对AML(急性骨髓性白血病)和DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)细胞系，测试了与另外化合物组合的mPEG-r-克立他酶缀合物(培克立他酶)。结果在下文示出。KG-1、HL-60和MV4-11是AML细胞系，并且DB、HT和RL是DLBCL细胞系。培克立他酶和维奈托克的组合数据显示出在AML细胞系中的强协同作用。
AML和DLBCL细胞系中与参考化合物组合的培克立他酶CI50
Figure BDA0002562222360000511
实施例9
根据实施例1所述的方法，在多个细胞系中针对克立他酶的聚乙二醇化(PEG-克立他酶)和非聚乙二醇化(Erwinase)型式以及大肠杆菌L-天冬酰胺酶(Oncaspar)测试克立他酶的PAS化缀合物。PA-20和PA-40是在棒状杆菌或假单胞菌表达系统中产生的PAS化的克立他酶缀合物，并且PA-200是在假单胞菌表达系统中产生的PAS化的融合蛋白。PA-20、PA-40、PA-200和PA-400构建体是SEQ ID NO:2、3、6和7。结果在下文示出。CCRF-CEM、MOLT-4和RS4:11都是AML细胞系，Jurkat E6-1是急性T细胞白血病细胞系，HL-60是急性早幼粒细胞性白血病细胞系，MV4-11是双表型B细胞骨髓单核细胞性白血病细胞系，THP-1是AML细胞系，RL是非霍奇金淋巴瘤细胞系，并且H9是淋巴瘤细胞系。
OncolinesTM中的Erwinase
Figure BDA0002562222360000521
OncolinesTM中的Oncaspar
Figure BDA0002562222360000522
Figure BDA0002562222360000531
OncolinesTM中的PEG-克立他酶
Figure BDA0002562222360000532
OncolinesTM中的PA-20棒状杆菌
Figure BDA0002562222360000541
OncolinesTM中的PA-40棒状杆菌
Figure BDA0002562222360000542
OncolinesTM中的PA-20假单胞菌
Figure BDA0002562222360000543
OncolinesTM中的PA-40假单胞菌
Figure BDA0002562222360000551
OncolinesTM中的PA-200假单胞菌
Figure BDA0002562222360000552
本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验确定本文所述发明的具体实施方案的许多等效方案。此类等效方案旨在由以下权利要求所涵盖。
序列表
<110> Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd.
Pine, Polly
Gursahani, Hemamalini
<120> 使用天冬酰胺酶的治疗方法
<130> 061834-5065
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 327
<212> PRT
<213> 菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)
<400> 1
Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile
1 5 10 15
Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly
20 25 30
Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys
35 40 45
Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn
50 55 60
Met Thr Gly Asp Val Val Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp
85 90 95
Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp
100 105 110
Lys Pro Val Val Phe Val Ala Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp
130 135 140
Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile
145 150 155 160
Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr
165 170 175
Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg
180 185 190
Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val
195 200 205
Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr
210 215 220
Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His
225 230 235 240
Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser
245 250 255
Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val
260 265 270
Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu
275 280 285
Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg
290 295 300
Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
325
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(20)肽
<400> 2
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(40)肽
<400> 3
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(20)肽
<400> 4
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 5
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(40)-多肽
<400> 5
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40
<210> 6
<211> 528
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(200)-融合蛋白
<400> 6
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile
195 200 205
Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly
210 215 220
Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu
225 230 235 240
Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys Lys Leu Ala Asn Val Lys Gly Glu
245 250 255
Gln Phe Ser Asn Met Ala Ser Glu Asn Met Thr Gly Asp Val Val Leu
260 265 270
Lys Leu Ser Gln Arg Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp
275 280 285
Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr
290 295 300
Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser Asp Lys Pro Val Val Phe Val Ala
305 310 315 320
Ala Met Arg Pro Ala Thr Ala Ile Ser Ala Asp Gly Pro Met Asn Leu
325 330 335
Leu Glu Ala Val Arg Val Ala Gly Asp Lys Gln Ser Arg Gly Arg Gly
340 345 350
Val Met Val Val Leu Asn Asp Arg Ile Gly Ser Ala Arg Tyr Ile Thr
355 360 365
Lys Thr Asn Ala Ser Thr Leu Asp Thr Phe Lys Ala Asn Glu Glu Gly
370 375 380
Tyr Leu Gly Val Ile Ile Gly Asn Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile
385 390 395 400
Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr
405 410 415
Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu
420 425 430
Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln His Gly Val Lys Gly Ile Val Tyr
435 440 445
Ala Gly Met Gly Ala Gly Ser Val Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met
450 455 460
Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val Val Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr
465 470 475 480
Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser
485 490 495
Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu
500 505 510
Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
515 520 525
<210> 7
<211> 728
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成的PA(400)肽
<400> 7
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
385 390 395 400
Ala Ala Asp Lys Leu Pro Asn Ile Val Ile Leu Ala Thr Gly Gly Thr
405 410 415
Ile Ala Gly Ser Ala Ala Thr Gly Thr Gln Thr Thr Gly Tyr Lys Ala
420 425 430
Gly Ala Leu Gly Val Asp Thr Leu Ile Asn Ala Val Pro Glu Val Lys
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Leu Leu Ala Arg Asp Asp Val Asp Gly Val Val Ile Thr His Gly Thr
485 490 495
Asp Thr Val Glu Glu Ser Ala Tyr Phe Leu His Leu Thr Val Lys Ser
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Arg Ile Tyr Tyr Gln Asn Arg Ile Asp Lys Leu His Thr Thr Arg Ser
595 600 605
Val Phe Asp Val Arg Gly Leu Thr Ser Leu Pro Lys Val Asp Ile Leu
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Tyr Gly Tyr Gln Asp Asp Pro Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Ala Ile Gln
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Ser Val Arg Gly Ile Ala Gly Met Arg Lys Ala Met Glu Lys Gly Val
660 665 670
Val Val Ile Arg Ser Thr Arg Thr Gly Asn Gly Ile Val Pro Pro Asp
675 680 685
Glu Glu Leu Pro Gly Leu Val Ser Asp Ser Leu Asn Pro Ala His Ala
690 695 700
Arg Ile Leu Leu Met Leu Ala Leu Thr Arg Thr Ser Asp Pro Lys Val
705 710 715 720
Ile Gln Glu Tyr Phe His Thr Tyr
725

Claims (29)

1.一种治疗患者的通过L-天冬酰胺耗尽可治疗的疾病的方法，包括施用有效量的具有显著的L-天冬酰胺羟基水解酶活性的蛋白质和聚乙二醇(PEG)的缀合物，其中所述聚乙二醇具有小于或等于约5000Da的分子量，其中所述蛋白质是来自欧文氏菌的L-天冬酰胺酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述L-天冬酰胺酶与SEQ ID NO:1的氨基酸具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述缀合物包含来自欧文氏菌的与SEQ ID NO:1的氨基酸具有100％序列同一性的L-天冬酰胺酶。
4.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述PEG具有约5000Da、4000Da、3000Da、2500Da或2000Da的分子量。
5.如任何前述权利要求所述的方法，其中与未缀合于PEG时的所述L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有至少60％、65％、70％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的体外活性。
6.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物具有比未缀合于PEG时的所述L-天冬酰胺酶更有效至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍的L-天冬酰胺耗尽活性。
7.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物将血浆L-天冬酰胺水平耗尽至不可检测的水平，持续至少约12、24、48、96、108或120小时。
8.如任何前述权利要求所述的方法，其中与未缀合于PEG时的所述L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更长的体内循环半衰期。
9.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物具有比以相等蛋白质剂量施用的培门冬酶更长的t1/2。
10.如任何前述权利要求所述的方法，其中在小鼠中静脉内施用后，所述缀合物在以蛋白质含量计约50μg/kg的剂量下具有至少约58至约65小时的t1/2，并且在以蛋白质含量计约10μg/kg的剂量下具有至少约34至约40小时的t1/2。
11.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物在约10,000至约15,000IU/m2(约20-30mg蛋白质/m2)范围内的剂量下具有至少约100至约200小时的t1/2。
12.如任何前述权利要求所述的方法，其中与未缀合于PEG时的所述L-天冬酰胺酶相比，所述缀合物具有更大的曲线下面积(AUC)。
13.如任何前述权利要求所述的方法，其中在相等的蛋白质剂量下，所述缀合物具有比培门冬酶大至少约3倍的平均AUC。
14.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述PEG与所述L-天冬酰胺酶的一个或多个氨基共价连接。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述PEG通过酰胺键与所述一个或多个氨基共价连接。
16.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述PEG共价连接于可用氨基的至少约40％至约100％或总氨基的至少约40％至约90％。
17.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物具有下式：
Asp-[NH-CO-(CH2)x-CO-NH-PEG]n
其中Asp是所述L-天冬酰胺酶，NH是所述Asp的赖氨酸残基和/或N末端的一个或多个NH基团，PEG是聚乙二醇部分，n是代表所述Asp中所述可用氨基的至少约40％至约100％的数目，并且x是在约1至约8范围内的整数。
18.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述PEG是单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)。
19.如任何前述权利要求所述的方法，其中疾病是癌症。
20.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：淋巴瘤、大细胞免疫母细胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、NK淋巴瘤、霍奇金病、急性粒细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性T细胞白血病、急性骨髓性白血病(AML)、双表型B细胞骨髓单核细胞性白血病和慢性淋巴细胞性白血病。
21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中疾病选自由以下组成的组：肾细胞癌、肾细胞腺癌、胶质母细胞瘤，包括多形性胶质母细胞瘤和星形胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤、恶性黑素瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、肺癌，包括大细胞肺癌和小细胞肺癌、子宫内膜癌、卵巢腺癌、卵巢畸胎癌、宫颈腺癌、乳腺癌、乳腺腺癌、乳腺导管癌、胰腺癌、胰腺导管癌、结肠癌、结肠腺癌、结肠直肠腺癌、膀胱移行细胞癌、膀胱乳头状瘤、前列腺癌、骨肉瘤、骨上皮癌、前列腺癌和甲状腺癌。
22.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物以约5U/kg体重至约50U/kg体重的量施用。
23.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物以在约10,000至约15,000IU/m2范围内的剂量施用。
24.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述施用是静脉内或肌内的，并且每周一次、每周两次或每周三次。
25.如任何前述权利要求所述的方法，其中所述缀合物作为单一疗法施用。
26.如权利要求123所述的方法，其中所述缀合物作为组合疗法的一部分施用。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述缀合物作为与
Figure FDA0002562222350000041
道诺霉素、阿糖胞苷、
Figure FDA0002562222350000042
ABT-737、维奈托克、达托里昔布、硼替佐米、卡非佐米、长春新碱、泼尼松龙、依维莫司和/或CB-839的组合疗法的一部分施用。
28.如任何前述权利要求所述的方法，其中接受治疗的所述患者对大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式或对欧文氏菌天冬酰胺酶具有既往超敏性。
29.如任何前述权利要求所述的方法，其中接受治疗的所述患者具有疾病复发，特别是在用大肠杆菌天冬酰胺酶或其聚乙二醇化形式治疗后发生的复发。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11400065B2 (en) 2019-03-01 2022-08-02 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US11504347B1 (en) 2016-07-22 2022-11-22 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11583510B1 (en) 2022-02-07 2023-02-21 Flamel Ireland Limited Methods of administering gamma hydroxybutyrate formulations after a high-fat meal
US11602512B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11602513B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11779557B1 (en) 2022-02-07 2023-10-10 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11839597B2 (en) 2016-07-22 2023-12-12 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11986451B1 (en) 2016-07-22 2024-05-21 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12186296B1 (en) 2016-07-22 2025-01-07 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12478604B1 (en) 2016-07-22 2025-11-25 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201912020D0 (en) * 2019-08-21 2019-10-02 Porton Biopharma Ltd Therapeutic Conjugate
TWI878368B (zh) * 2019-10-25 2025-04-01 愛爾蘭商爵士製藥愛爾蘭公司 重組ｌ—天冬醯胺酸酶
US20220313798A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Dosing of recombinant l-asparaginase
US20260007728A1 (en) 2022-07-14 2026-01-08 Jazz Pharmaceuticals Ireland Ltd. Combination therapies involving l-asparaginase

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1360049A (zh) * 2000-12-20 2002-07-24 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人l－天冬酰胺酶24.53和编码这种多肽的多核苷酸
CN1518595A (zh) * 2000-11-28 2004-08-04 凤凰药理学公司 修饰的精氨酸脱亚胺酶
US20120100121A1 (en) * 2009-07-06 2012-04-26 Thierry Abribat Pegylated L-Asparaginase
CN105802948A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用
CN105802946A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007103290A2 (en) * 2006-03-03 2007-09-13 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Materials and methods directed to asparagine synthetase and asparaginase therapies
ITMI20060612A1 (it) * 2006-03-30 2007-09-30 Keryos Spa New activaded poly-ethylene glycols-and related polymers and their applications
HK1204578A1 (zh) * 2012-03-21 2015-11-27 Erytech Pharma 用於治疗急性髓细胞白血病(aml)的药剂
WO2018085493A1 (en) * 2016-11-04 2018-05-11 Georgia State University Research Foundation, Inc. Endotoxin free asparaginase
GB201919219D0 (en) * 2019-12-23 2020-02-05 Otsuka Pharma Co Ltd Cancer biomarkers

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1518595A (zh) * 2000-11-28 2004-08-04 凤凰药理学公司 修饰的精氨酸脱亚胺酶
CN1360049A (zh) * 2000-12-20 2002-07-24 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人l－天冬酰胺酶24.53和编码这种多肽的多核苷酸
US20120100121A1 (en) * 2009-07-06 2012-04-26 Thierry Abribat Pegylated L-Asparaginase
CN102573917A (zh) * 2009-07-06 2012-07-11 阿利兹第二药物公司 聚乙二醇化的l-天冬酰胺酶
CN105802948A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇定点修饰的门冬酰胺酶及其制备方法与应用
CN105802946A (zh) * 2014-12-29 2016-07-27 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 聚乙二醇化的门冬酰胺酶及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EL-NAGGAR NE等: "Purification, characterization, cytotoxicity and anticancer activities of L-asparaginase, anti-colon cancer protein, from the newly isolated alkaliphilic Streptomyces fradiae NEAE-82", 《SCI REP》, vol. 6, no. 32926, pages 1 - 16, XP055482246, DOI: 10.1038/srep32926 *
李晓媛等: "PEG-L-天冬酰胺酶的临床研究近况", 《药学进展》, vol. 33, no. 11, pages 503 - 510 *
高解春，王耀平: "《现代小儿肿瘤学》", vol. 2003, 31 October 2003, 上海：复旦大学出版社, pages: 74 *

Cited By (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12115142B2 (en) 2016-07-22 2024-10-15 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12115143B2 (en) 2016-07-22 2024-10-15 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12478604B1 (en) 2016-07-22 2025-11-25 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11602512B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11602513B1 (en) 2016-07-22 2023-03-14 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11766418B2 (en) 2016-07-22 2023-09-26 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12263151B2 (en) 2016-07-22 2025-04-01 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11826335B2 (en) 2016-07-22 2023-11-28 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11839597B2 (en) 2016-07-22 2023-12-12 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11896572B2 (en) 2016-07-22 2024-02-13 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11986451B1 (en) 2016-07-22 2024-05-21 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12097176B2 (en) 2016-07-22 2024-09-24 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12097175B2 (en) 2016-07-22 2024-09-24 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12109186B2 (en) 2016-07-22 2024-10-08 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12115145B2 (en) 2016-07-22 2024-10-15 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12115144B2 (en) 2016-07-22 2024-10-15 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11504347B1 (en) 2016-07-22 2022-11-22 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12263150B2 (en) 2016-07-22 2025-04-01 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12128021B1 (en) 2016-07-22 2024-10-29 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12138239B2 (en) 2016-07-22 2024-11-12 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12144793B2 (en) 2016-07-22 2024-11-19 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12257223B2 (en) 2016-07-22 2025-03-25 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12239625B2 (en) 2016-07-22 2025-03-04 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12186296B1 (en) 2016-07-22 2025-01-07 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12186298B2 (en) 2016-07-22 2025-01-07 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12226389B2 (en) 2016-07-22 2025-02-18 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12226388B2 (en) 2016-07-22 2025-02-18 Flamel Ireland Limited Modified release gamma- hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12226377B2 (en) 2019-03-01 2025-02-18 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US12167992B2 (en) 2019-03-01 2024-12-17 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US12167991B2 (en) 2019-03-01 2024-12-17 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US11400065B2 (en) 2019-03-01 2022-08-02 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US12303478B2 (en) 2019-03-01 2025-05-20 Flamel Ireland Limited Gamma-hydroxybutyrate compositions having improved pharmacokinetics in the fed state
US11779557B1 (en) 2022-02-07 2023-10-10 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US12295926B1 (en) 2022-02-07 2025-05-13 Flamel Ireland Limited Modified release gamma-hydroxybutyrate formulations having improved pharmacokinetics
US11583510B1 (en) 2022-02-07 2023-02-21 Flamel Ireland Limited Methods of administering gamma hydroxybutyrate formulations after a high-fat meal

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