CN111808950B - 一种甲状腺乳头状癌miRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与甲状腺乳头癌相关的miRNA标志物，所述标志物为miRNA‑503‑5p；同时，提供了所述miRNA标志物在制备预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的工具中的应用。本发明通过GEO和TCGA数据库中甲状腺乳头状癌miRNA数据进行分析，筛选出与甲状腺乳头状癌有关的miRNA，用荧光定量PCR验证其在临床样本中的表达，为甲状腺乳头状癌的诊断及治疗提供依据。经检验证明，miRNA‑503‑5p能有效的区分甲状腺乳头状癌标本和正常标本。本发明在分子水平上为临床诊断甲状腺乳头状癌提供了新的诊断方法。

Description

一种甲状腺乳头状癌miRNA标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种甲状腺乳头状癌miRNA标志物及其应用。

背景技术

甲状腺乳头状癌(Papillary thyroid cancer，PTC)是甲状腺癌最常见的组织学类型，约占甲状腺癌的90％，是近年来发病率增长最快的内分泌系统恶性肿瘤。近年来，随着超声检查、细针穿刺活检等甲状腺诊断手段的增加，甲状腺乳头状癌的发病率显著增加，已成为世界上第四大癌症。值得注意的是，甲状腺乳头状癌直径>4cm肿瘤以及局部和远期转移肿瘤的发生率也有所上升，致使PTC死亡率增加。甲状腺乳头状癌的手术切除存在较多并发症，例如喉返神经损伤和甲状旁腺功能低下，这对患者的生活质量有重大影响。因此，及早对甲状腺乳头状癌进行诊断及干预，对甲状腺乳头状癌患者预后及生活质量具有非常重要的意义。

PTC起病隐秘，患者常无特殊症状。临床上主要通过触诊、超声、核素显像等方法对PCT进行筛查，但这些方法的诊断水平仍十分有限。目前，超声引导下细针穿刺细胞学活检是术前诊断甲状腺结节最有效的检查方式，但仍有一部分甲状腺结节难以通过明确诊断，检测准确度和灵敏性低。因此，研究新的诊断方法以提高PTC的诊断效率已成为研究者探索的主要方向。

microRNAs(miRNAs)是参与基因表达的表观遗传调控的小型非编码RNA，其长度为19至25个核苷酸，与mRNA的3’UTR区域结合，下调蛋白编码基因表达，在翻译水平上，抑制蛋白质合成。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。miRNAs广泛参与疾病的病理生理过程(尤其在恶性肿瘤中)，在基因调控网络中充当“枢纽”，控制着许多靶标，已成为诊断和监测恶性肿瘤较有前途的生物标记及癌症治疗的新型潜在靶点。

检测miRNA的表达水平可以为甲状腺乳头状癌的临床诊断提供参考。目前，已有研究表明miRNA表达异常将导致癌症发生相关基因表达异常，从而诱发癌症的发生。因此，寻找新的miRNA标志物用于甲状腺乳头状癌的诊断及检测具有十分重要的意义。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种与甲状腺乳头癌相关的miRNA标志物，能够用于甲状腺乳头状癌组织样本的判断，为甲状腺乳头状癌临床上诊断和风险预判提供有效手段。

本发明还提出上述miRNA标志物在制备预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的工具中的应用。

本发明还提出上述miRNA标志物高通量测序平台中的应用。

本发明还提出一种预判甲状腺乳头状癌风险或诊断甲状腺乳头状癌的芯片。

本发明还提出一种预判甲状腺乳头状癌风险或诊断甲状腺乳头状癌的试剂盒。

本发明还提出一种用于甲状腺乳头状癌诊断和筛查的产品。

根据本发明的第一方面实施方式的miRNA标志物，所述miRNA标志物为miRNA-503-5p.

进一步地，所述miRNA-503-5p选自以下miRNA中的至少一种：初始miRNA-503-5p、前体miRNA-503-5p和成熟miRNA-503-5p；所述初始miRNA-503-5p在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-503-5p；所述前体miRNA-503-5p在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA-503-5p。

根据本发明具体实施方式的miRNA标志物，至少具有如下有益效果：miRNA-503-5p作为一种与甲状腺乳头癌相关的miRNA标志物，其在甲状腺乳头状癌组织中的表达量较癌旁组织中的表达量高，且其在于预后较差的甲状腺乳头状癌患者组织中表达量较预后较好的甲状腺乳头状癌患者组织中的表达量高，因此，miRNA-503-5p可以用于制备相关的用于预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的工具，通过检测组织中miRNA-503-5p的量即可诊断是否患有甲状腺乳头癌疾病及判断甲状腺乳头癌患者的预后状况。

本发明的一些具体的实施方式中，所述miRNA标志物还包括对miRNA-503-5p进行碱基修饰或者在5’端增加碱基获得的序列。

应当知道，本发明的miRNA-503-5p包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示完整miRNA-503-5p核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。

本领域人员熟知，为了保证miRNA的稳定性，可以在miRNA的一端增加保护性碱基，如TT，也可对miRNA碱基进行修饰，但是不影响miRNA的功能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miRNA-503-5p功能的条件下，对miRNA-503-5p进行碱基修饰或者在5’端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述miRNA-503-5p为成熟miRNA-503-5p，所述成熟miRNA-503-5p核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1序列为：UAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAG。

虽然在某些具体实施方式中所使用的是成熟miRNA-503-5p，但是本领域技术人员可以预期，使用初始miRNA(pi-miRNA-503-5p)、前体miRNA(pre-miRNA-503-5p)将可以获得与成熟miRNA-503-5p同样的技术效果，因为细胞具有进一步将初始miRNA(pi-miRNA-503-5p)或前体miRNA(pre-miRNA-503-5p)加工为成熟miRNA-503-5p的能力。所述前体miRNA-503-5p的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2序列为：UGCCCUAGCAGCGGGAACAGUUCUGCAGUGAGCGAUCGGUGCUCUGGGGUAUUGUUUCCGCUGCCAGGGUA。

本发明的miRNA-503-5p核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟的miRNA-503-5p主要呈单链形式，而miRNA-503-5p前体是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。

根据本发明第二方面，提供了miRNA-503-5p在制备预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的工具中的应用。

本发明的实验证明：已发生甲状腺乳头状癌的组织中miRNA-503-5p的水平显著高于未发生甲状腺乳头状癌的组织的水平；因此，与未发生甲状腺乳头状癌的组织中miRNA-503-5p的水平相比，如果受试者甲状腺乳头状癌组织中miRNA-503-5p显著升高，那么则可以判断该受试者已发生甲状腺乳头状癌，从而为临床治疗方案的制定提供诊断基础。

本发明还提供了miRNA-503-5p在判断甲状腺乳头状癌的工具中的应用。与不发生甲状腺乳头状癌的组织中的miRNA-503-5p的水平相比，如果受试者甲状腺乳头状癌的组织中的miRNA-503-5p的水平显著升高，则表明受试者发生甲状腺乳头状癌。

进一步地，上述预判甲状腺乳头状癌风险、判断甲状腺乳头状癌是否发生的工具包括但不限于试剂盒、芯片或试纸等。

进一步地，所述工具包括用于检测待测样本中miRNA-503-5p表达水平的试剂。所述试剂包括用于检测miRNA-503-5p的引物和/或探针。

进一步地，所述试剂包含qPCR实验中使用的反转录引物和/或扩增引物；所述反转录引物为Oligo(dT)特异性的RT引物；所述扩增引物的上游引物序列如；所述扩增引物的下游引物为通用反向引物。

进一步地，所述试剂盒中还包括PCR技术常用的试剂和酶。

根据本发明第三方面，提供了上述miRNA-503-5p在高通量测序平台中的应用。通过高通量测序能获知待检测样本甲状腺乳头状癌组织中miRNA-503-5p的表达水平，将待测样本的结果同未发生甲状腺乳头状癌的组织样本相比，容易判断待测样本是否存在甲状腺乳头状癌的风险或者容易判断待测样本是否已经发生了甲状腺乳头状癌。因此，经过高通量测序获得miRNA-503-5p与价值乳头状癌相关性的应用同样包含在本发明的保护范围之内。

根据本发明第四方面的芯片，所述芯片包括固相载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应于miRNA-503-5p的部分或全部序列。所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道的可用于判断甲状腺乳头状癌是否发生的miRNA的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种miRNA指标联合判断甲状腺乳头状癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

进一步地，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

本发明中，所述的miRNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，当固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi，V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control ofgene expression on a genomic scale.Science，1997；278：680和马立人，蒋中华主编.生物芯片.北京：化学工业出版社，2000，1-130。

根据本发明的第五方面的试剂盒，所述试剂盒包括用于检测受试者甲状腺乳头状癌组织中miRNA-503-5p的表达水平的试剂。与未发生甲状腺乳头状癌组织中的miRNA-503-5p的表达水平比较，若通过试剂盒检测甲状腺乳头状癌中miRNA-503-5p的表达水平显著升高，则判断该受试者的甲状腺乳头状癌风险很高或者已发生甲状腺乳头状癌。

进一步地，所述试剂包括用于检测miRNA-503-5p表达水平的引物和/或探针。所述试剂还包括其他针对现有技术中已经报道的可用于判断甲状腺乳头状癌风险，或者判断甲状腺乳头状癌是否发生的miRNA的引物和/或探针。将多种miRNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种miRNA指标联合判断甲状腺乳头状癌的情况也包含在本发明的保护范围之内。

本发明的miRNA-503-5p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miRNA-503-5p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。

病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。

真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301等。

可以表达miRNA-503-5p的DNA片段可以通过如下方式获取：从miRNA数据库中(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)寻找miRNA-503-5p在基因组上的位置及具体序列信息，根据基因组序列确定miRNA-503-5p初始miRNA的位置，在miRNA-503-5p初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达miRNA-503-5p的DNA片段。

根据本发明的第六方面的产品，所述产品用于检测miRNA-503-5p的表达水平；所述产品为如下1)-4)中任意一种：

1)诊断或辅助诊断所述待测样本是否甲状腺乳头状癌样本的产品；

2)筛查或辅助筛查所述待测样本是否甲状腺乳头状癌样本的产品；

3)诊断或辅助诊断所述待测人是否甲状腺乳头状癌患者的产品；

4)筛查或辅助筛查所述待测人是否甲状腺乳头状癌患者的产品。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例1的TCGA数据库中miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织及癌旁组织中表达量图；

图2为本发明实施例1的GEO数据库的数据集GSE113629中miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织及癌旁组织中的表达量图；

图3为本发明实施例1的TCGA数据库中的临床数据和表达数据显示miRNA-503-5p与预后相关性示意图；

图4为本发明实施例2的实时荧光定量PCR检测miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织和癌旁组织中的表达量图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：甲状腺乳头状癌相关的miRNA的筛选

1、甲状腺乳头状癌数据检索

构建检索词("thyroid and cancer"[MeSH Terms]OR"papillary and thyroidand cancer"[All Fields])AND("gse"[Filter]AND"Homo sapiens"[Organism])，按照预先设定的样本筛选策略，在NCBI GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中进行检索，得到了1套甲状腺乳头状癌miNRA数据集。而TCGA(The Cancer Genome Atlas，癌症基因组图谱)数据的获得，是通过R语言环境下的GDCRNATools包，下载甲状腺乳头状癌(肿瘤代号为THCA)的全部数据。预先设定的样本筛选策略：限制研究类型为“non-coding RNAprofilingby array”，符合以下标准的数据集将纳入我们的研究中：①所选数据集必须同时包括全基因组miRNA表达数据；②这些数据来自于甲状腺乳头状病例组和对照组的活检组织；③本研究均考虑经标准化或者原始数据集。

2、甲状腺乳头状癌miRNA表达数据整合分析

通过转录组数据分析软件对1套甲状腺癌miNRAGEO数据和TCGA甲状腺癌数据进行背景校正和标准化后进行t-test得到P值，计算效应量，然后利用Fisher检验合并P值，采用随机效应模型合并效应量，筛选差异表达miRNA，寻找交集，共筛选出29个差异表达的miRNA，其中表达水平上调的基因19个，表达水平下调的基因10个。基于万方、知网、pubmed，science等数据库的搜索，从19个上调的miRNA中筛除文献中已验证的miRNA，确定了3个上调的miRNA进行RT-qPCR验证，最后选择表达最好的miRNA-503-5p作为目标分子。

3、结果

图1为本实施例的TCGA数据库中miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织及癌旁组织中表达量图。如图1中TCGA数据结果显示，与甲状腺乳头状癌癌旁组织相比，甲状腺乳头状癌组织中的miRNA-503-5p表达水平显著增高(*p<0.0001)。通过GraphPad Prism8软件，利用两样本的T检验计算，结果显示P值<＝0.05，则认为其升高具有统计学意义，而miRNA-503-5p的P值<＝0.0001,所以认为癌组织相对与癌旁组织显著升高。

图2为本实施例的GEO数据库的数据集GSE113629中miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织及癌旁组织中的表达量图；如图2中GEO数据结果显示，与甲状腺乳头状癌癌旁组织相比，甲状腺乳头状癌组织中的miRNA-503-5p表达水平显著增高(*p<0.0001)。

由图1和图2的结果可以证明，筛选得到的miRNA-503-5p能够应用于甲状腺乳头癌组织的检测，由于miRNA-503-5p的表达在甲状腺乳头癌组织中和癌旁组织中具有显著的差异，因此可以通过对miRNA-503-5p表达水平的判断检测组织是否为甲状腺乳头癌组织，进而诊断是否患有甲状腺乳头状癌。

4、miRNA-503-5p与预后的相关性分析

利用TCGA表达数据和临床信息，评估了miRNA-503-5p的表达与患者OS(OverallSurvival，总生存期)之间的关联。在每个样本的中位生存时间处切断患者的生存时间，将患者分为高表达和低表达组，用R语言中的survtype包对生存差异进行评估。

图3为本明实施例的TCGA数据库中的临床数据和表达数据显示miRNA-503-5p与预后相关性示意图；如图3所示，miRNA-503-5p高表达，患者生存率低；miNRA-503-5p低表达，患者生存率高。miRNA-503-5p与患者预后呈负相关，具有统计学差异(*p＝0.031)。因此，从图3结果可知，通过检测患者组织中miRNA-503-5p的表达量能够预测甲状腺乳头癌患者的预后情况。

实施例2：实时荧光定量PCR验证差异表达的miRNA-503-5p

1、miRNA提取

使用Tiangen的miRNA提取试剂盒，每200μl血清中加入等体积裂解液，振荡器振荡混匀30秒。室温放置5min后，12,000rpm离心10min，取上清，加入200μl氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置5min后，12,000rpm离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，缓慢加入转移液体积1/3体积的无水乙醇混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min，12,000rpm离心30秒，保留流出液。缓慢加入流出液体积2/3体积的无水乙醇，混匀，一起转入吸附柱，室温放置2min后12,000rpm离心30秒，离心后保留吸附柱。向吸附柱中加入500μl去蛋白液，室温12,000rpm离心30sec，弃废液。500μl漂洗液，室温12,000rpm离心30秒。将吸附柱放入2ml收集管中，室温12,000rpm离心1min，去除残余液体。再将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加15-30μl无RNA酶的水，室温12,000rpm离心2min。

2、逆转录

将10pg-1μg的RNA模板与2μl的10倍缓冲液、2μl dATP(10mM)、0.5μl引物(核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.3所示；序列为：TAGCAGCGGGAACAGTTCTGCAG；)、0.5μl核糖核酸酶抑制剂和无核糖核酸酶水混合，体积最后为20μl，37℃孵育1h。然后反应管中加入1μl0.5μg/μl特异性RT引物，70℃孵育5min后立刻冰上孵育至少2min，打断RNA和引物的二级结构。最后，将上述20μl反应混合物与4μl 5倍缓冲液、1μl dNTP(10mM)，0.5μl M-MLV逆转录酶，0.5μl核糖核酸酶抑制剂，10μl polyA反应混合液和4μl无核糖核酸酶水混合，42℃孵育1h。

3、实时荧光定量PCR检测

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/l)1μl，反向引物(5μM/l)1μl(本发明使用加尾法引物设计，正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，序列为：TAGCAGCGGGAACAGTTCTGCAG；反向引物为通用序列引物)，模板cDNA2μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃20s，60℃55s)40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

如表1所示，可以看出，与癌旁组织相比，11例甲状腺乳头状癌组织中的miRNA-305-5p表达量上调，且与阳性对照miRNA-31-5p，miRNA-3065-5p)相比，具有显著差异。其中，miRNA-31-5p和miRNA-3065-5p是已知的甲状腺乳头状癌标志物，与已知的甲状腺乳头状癌标志物相比，本发明提供的标志物miRNA-305-5p具有更显著的差异性，因此，本发明的标志物miRNA-305-5p用于甲状腺乳头状癌的检测将具有更高的准确度和灵敏度。

表1为各样本中目的基因的表达量(相对于RNU6B的相对表达量)

图4为实时荧光定量PCR检测miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌癌组织和癌旁组织中的表达量图，纵坐标表示miRNA-503-5p的相对表达量。如图4所示，在甲状腺乳头状癌癌组织中的miRNA-503-5p含量显著高于癌旁组织(*p<0.001)，因此，证明miRNA-503-5p能够作为检测甲状腺乳头状癌的标记物。用Gram Pad Prism8软件表1的数据进行统计学处理。

综上所述，本发明通过GEO和TCGA数据库中甲状腺乳头状癌miRNA数据进行分析，筛选出与甲状腺乳头状癌有关的miRNA，用荧光定量PCR(RT-qPCR)验证其在临床样本中的表达，为甲状腺乳头状癌的诊断及治疗提供依据。通过实验验证，证明本发明的miRNA-503-5p在甲状腺乳头状癌组织中有较高的表达水平，在正常组织中的表达水平低，因此，能够通过测定样本中的miRNA-503-5p表达水平判断与甲状腺乳头状癌的相关性。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

序列表

<110> 中南大学湘雅医院

<120> 一种甲状腺乳头状癌miRNA标志物及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uagcagcggg aacaguucug cag 23

<210> 2

<211> 71

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ugcccuagca gcgggaacag uucugcagug agcgaucggu gcucuggggu auuguuuccg 60

cugccagggu a 71

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagcagcggg aacagttctg cag 23

Claims (4)

1. 一种与甲状腺乳头癌相关的miRNA标志物在制备预判甲状腺癌风险或诊断甲状腺乳头癌的产品中的应用，所述miRNA标志物为miRNA-503-5p，所述miRNA-503-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。

3. 一种预判甲状腺乳头状癌风险或诊断甲状腺乳头状癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测样本中miRNA-503-5p的表达水平的试剂，所述miRNA-503-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测所述miRNA-503-5p表达水平的引物和/或探针。