CN111808800A - 一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备获取方法，属于细胞生物学及临床应用领域；本发明具体公开了一种免疫抑制性髓系抑制细胞(Myeloid‑derived suppressor cells，MDSCs)，来源于健康捐献个体，通过体外药物诱导刺激产生免疫抑制性，及其制备提纯方法；本发明发现体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞在体外能有效抑制CD4+T细胞增殖效应，减轻角膜移植后排斥反应，并且有效抑制病理性新生血管的生长，本发明的上述应用可以制备有效地治疗角膜移植后排斥及有效抑制病理性新生血管生成的生物制剂。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备获取方法，属于细胞生物学及临床应用领域。
背景技术
髓样抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cells，MDSC)是一种骨髓来源细胞形态幼稚的髓系祖细胞，在一定环境下可以向下游分化为成熟的粒细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在小鼠体内，MDSC特征性共表达表面分子髓系分化抗原(Myeloid-cell LineageDifferentiation Antigen-1，Gr-1)和CD11b(即αM-integrin)。根据MDSC中Gr-1的亚群Ly6C及Ly6G的表达可大致分为粒性MDSC(CD11b+Gr-1+Ly6GhighLy6C-，PMN-MDSC)和单核性MDSC(CD11b+Gr-1+Ly6G-Ly6Chigh，M-MDSC)两群(VegliaF,Perego M,GabrilovichD.Myeloid-derived suppressor cells coming of age.Nat Immunol.2018；19(2):108-119.)。
研究报道，在肿瘤和炎症状态下，MDSC可以诱导调节性T细胞(RegulatoryT cell，Treg)分化增殖，影响Treg/Th17平衡，促进M2巨噬细胞极化，增强Arg-1、Nos2和Nox2的表达，通过细胞直接接触和细胞分泌物间接作用，抑制效应性T细胞(CD11b+Gr-1+Ly6G-Ly6Chigh，M-MDSC)两群(VegliaF,Perego M,Gabrilovich D.Myeloid-derived suppressorcells coming of age.Nat Immunol.2018；19(2):108-119.)。生理状态下正常小鼠骨髓分离的CD11b+Gr-1+MDSC(
MDSC,nMDSC)没有免疫抑制功能，而在病理状态下体内诱导的MDSC，如脓毒血症小鼠及负荷肝癌小鼠骨髓内分选出的CD11b+Gr-1+MDSC，具有强大的免疫抑制性，可以有效抑制CD4+及CD8+T细胞增殖，且具有一定的剂量相关性(Yan He,BeibeiWang,Bei Jia,Jieying Guan,Hui Zeng*,Zhiqiang Pan*.Effects of adoptivetransferring different sources of Myeloid Derived Suppressor cells in micecorneal transplant survival.Transplantation 2015；99:2102–2108.)，但体内病理环境诱导具有抑制功能性MDSC有效但存在高风险。
MDSC在负荷肿瘤模型中被证明有助于新生血管和新生淋巴管生成，并可以协助肿瘤的逃逸和转移(Veglia F,Perego M,Gabrilovich D.Myeloid-derived suppressorcells coming ofage.Nat Immunol.2018；19(2):108-119.)，而在移植模型中MDSC对于病理性新生血管生成的作用未有报道。我们观察到在同种异体角膜移植小鼠体内用anti-Gr-1抗体清除MDSC后，植床与植片迅速新生血管化，术后早期即有大量新生血管及淋巴管长入植片；而角膜移植手术同时过继转移体内或体外诱导的MDSC在抑制排斥反应的同时也表现出对角膜植片新生血管化和新生淋巴管化的强烈抑制作用(Yan He,Beibei Wang,BeiJia,Jieying Guan,Hui Zeng*,Zhiqiang Pan*.Effects of adoptive transferringdifferent sources of Myeloid Derived Suppressor cells in mice cornealtransplant survival.Transplantation 2015；99:2102–2108.)(Yan He,Bei Jia,HuiZeng,Zhiqiang Pan*,The Roles of Sepsis-Induced Myeloid Derived SuppressorCells in Mice Corneal Skin and Combinedtransplantation,Transpl Immunol,2016,34,8-13.)。
随着MDSC在肿瘤、移植、自身免疫病的研究深入，稳定获取功能性MDSC的需求突出，但MDSC在不同的诱导环境下，免疫功能和产量均变化很大，如何在体外稳定且高效的诱导出功能性的MDSC供研究和未来应用，意义重大且暂时没有相关研究。
发明内容
为解决现有免疫抑制性髓系抑制细胞主要体内提取、效果不稳定，且体外诱导技术欠缺的技术问题，本发明第一目的在于，提供一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，旨在实现免疫抑制功能MDSC(ex vivo generated MDSC by cytokine-induceddifferentiation ofbone marrow cells，evMDSC)的高收率地体外定向诱导制备。
本发明第二目的在于，提供一种所述的体外诱导方法诱导得到的evMDSC。
本发明第三目的在于，提供一种所述的体外诱导方法诱导得到evMDSC的应用。
一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，由髓样抑制细胞在诱导剂诱导下体外培养得到；
所述的诱导剂包含细胞因子GM-CSF和IL-6。
本发明提供了一种evMDSC体外定向诱导制备方法。本发明研究发现，GM-CSF和IL-6存在协同性，在较低的浓度下即可获得高活性、高收率的evMDSC。不仅如此，本发明人研究还发现，GM-CSF和IL-6协同诱导制得的evMDSC，相较于体内提取以及其他方式获得的evMDSC，在抑制角膜移植的新生血管以及新生淋巴管，以及延长角膜移植植片生存周期方面具有更优的效果。
研究发现，在所述的GM-CSF和IL-6协同诱导的基础上，进一步配合比例以及浓度的控制，有助于进一步改善evMDSC的收率，进一步提升在角膜移植方面具有更优效果的evMDSC亚型(PMN-evMDSC)的选择性。
作为优选，所述的GM-CSF和IL-6的质量比例为0.5～1:0.5～1；进一步优选为1：1。
本发明中，诱导剂的浓度为1～20ng/mL；优选为8～12ng/mL。本发明所述的诱导剂，基于所述的GM-CSF和IL-6的协同，可以在较低的含量下，即可意外地获得优异的定向诱导效果，例如，可以获得更高含量的evMDSC，提高活性细胞亚型的选择性。
本发明中，所述的髓样抑制细胞为健康供体的骨髓细胞。例如，所述的髓样抑制细胞为健康老鼠的骨髓细胞。
本发明所述的方法，将髓样抑制细胞在包含所述的诱导剂的培养基中培养得到。
本发明中，所述的培养基可以由现有的适宜骨髓细胞生长的常规培养基基础上配伍所需含量的诱导剂得到。
作为优选，所述的培养基包含8～12％胎牛血清、85～95％1640培养基、0.5～1.5％青霉素-链霉素双抗、1～20ng/mL的诱导剂。
作为优选，培养条件为：在温度为37±0.2℃、5±0.1％CO2下培养，且培养的时间大于或等于5天；优选为7～9天。研究发现，培养所述的天数，能够意外地实现所述的因子之间的协同性，有助于意外地改善evMDSC含量，并且显著改善PMN-evMDSC的表达。
本发明中，体外培养后，可采用现有手段分离出目标evMDSC，并采用现有方法对其进行亚型鉴别以及测定。
作为优选，体外培养后，采用免疫磁珠分离法分选出evMDSC，通过细胞计数和流式细胞学检测evMDSC数量和表型，以及PMN/M-evMDSC表达比例的变化，Giemsa染色来识别evMDSC两个亚群的细胞形态，筛选出较为适宜的培养条件，初步建立体外诱导免疫抑制功能性MDSC体系。
本发明还包括采用所述的制备方法制得的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞。
优选地，所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞为PMN-MDSC亚型细胞和/或M-MDSC亚型细胞。
本发明还提供了一种所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞在用于制备免疫抑制生物制剂中的应用。
优选地，将其用于制备抑制CD4+T细胞的免疫抑制生物制剂中的应用。
进一步优选，将其用于制备抑制器官移植免疫排斥反应的免疫抑制生物制剂中的应用。
更进一步优选，将其用于制备抑制角膜移植免疫排斥反应的免疫抑制生物制剂中的应用。
更进一步优选，将其用于制备抑制角膜移植的病理性新生血管和/或新生淋巴管生长的免疫抑制生物制剂中的应用；或者，将其用于制备延长角膜移植的角膜植片生存期的免疫抑制生物制剂中的应用。
本发明还提供了一种免疫抑制生物制剂，包含所述制备方法制得的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞。
优选地，所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞为PMN-MDSC亚型细胞。
优选地，所述的免疫抑制生物制剂为角膜移植免疫抑制生物制剂。
本发明研究意外地发现，采用本发明方法获得的evMDSC、特别是PMN-MDSC亚型细胞在角膜移植方面，能够有效抑制新生血管、新生淋巴管的生长，可以有效延长移植片的生存周期。
本发明中，动物模型以及生物性能研究步骤为：首先，耗竭体内MDSC对穿透性角膜移植术后病理性新生血管生成的影响。以同种异体穿透性角膜移植小鼠为模型，均分成3组，即术后每周腹腔注射两次anti-Gr-1抗体组、术后每周腹腔注射两次同型对照IgG组以及未处理组，观察各组角膜病理性新生血管生成情况。用特异性识别CD31(内皮细胞标记物)和LYVE-1(淋巴内皮细胞标记物)的抗体对各组角膜进行免疫荧光染色，评估新生血管和淋巴管在各组生长的强度变化。最后，观察体外诱导的MDSC过继转移对小鼠穿透性角膜移植免疫耐受和病理性新生血管生长的影响。以同种异体穿透性角膜移植小鼠为模型，均分成5组，手术当天分别在非手术眼球后注射PBS、nMDSC、evMDSC、PMN-evMDSC、M-evMDSC，观察各组角膜植片中位生存期和病理性新生血管生长情况。
有益效果
1、本发明提供了一种全新的evMDSC体外定向诱导合成的思路；且发现，所述的GM-CSF和IL-6存在协同诱导作用，能够在降低诱导剂用量的前提下，还能够高收率地获得evMDSC，不仅如此，还能够改善在角膜移植领域具有更优性能的PMN-evMDSC细胞亚型的选择性。
2、采用本发明方法获得的evMDSC，在角膜移植方面，能够有效抑制新生血管、新生淋巴管的生长，且能够有效延长移植片的使用周期。
附图说明
图1为实施例1不同天数与不同细胞因子浓度体外培养下MDSC比例；
图2为实施例1不同天数与不同细胞因子浓度体外培养下PMN-MDSC比例；
图3为实施例1不同天数与不同细胞因子浓度体外培养下M-MDSC比例；
图4为实施例1磁珠分选后的PMN/M-MDSC细胞形态；
图5为实施例3各组MDSC与CD4+T细胞共培养增殖抑制流式图
图6为实施例3各组MDSC与CD4+T细胞共培养增殖抑制比例
图7为实施例4角膜移植术后小鼠腹腔注射抗体anti-Gr-1或control IgG时间
图8为实施例4角膜移植术后7天和15天显微镜下直观图
图9为实施例4角膜移植术后角膜免疫荧光
图10为实施例4角膜移植术后角膜新生血管灌注区比例
图11为实施例4角膜移植术后角膜新生淋巴管灌注区比例
图12为实施例5角膜移植术后过继转移MDSC角膜植片存活率
图13为实施例5角膜移植术后过继转移MDSC角膜病理切片
图14为实施例5角膜移植术后显微镜下直观图
图15为实施例5角膜移植术后角膜免疫荧光
图16为实施例5角膜移植术后角膜新生血管灌注区比例
图17为实施例5角膜移植术后角膜新生淋巴管灌注区比例
具体实施方式
实施例1
体外诱导免疫抑制功能性MDSC体系的建立
(1)获取小鼠骨髓细胞：无菌环境下，6-8周雄性BALB/c小鼠处死后取双侧胫腓骨，PBS冲洗髓腔，收集细胞于离心管中，得到nMDSC细胞。
(2)培养基的配制：按照10％胎牛血清、90％1640培养基、1％青霉素-链霉素双抗配制基础培养基，加入不同浓度的细胞因子GM-CSF和IL-6(0、5、10、20ng/ml；GM-CSF和IL-6的比例为1：1)。
(3)细胞接种及培养：将细胞按照5x105个/孔接种于24孔板中，加入含不同浓度细胞因子的培养基，在37℃、5％CO2和饱和湿度下分别培养不同天数(0、3、5、7、9、11天)，严格隔天半量换液。
(4)获取evMDSC：将体外培养的骨髓细胞收集至离心管，用磁珠标记并与生物素抗Gr1和抗CD11b单克隆抗体结合，经过磁柱分选得到evMDSC。分选后细胞以流式细胞分析仪检测分离纯度。
(5)表型分析：将各组evMDSC用CD11b、Gr-1、Ly-6g、Ly-6c标记后进行流式细胞学分析，结果显示evMDSC及其亚群PMN/M-evMDSC的比例在细胞因子诱导的第7天达到峰值，并以剂量依赖的方式增加(在0-10ng/mL之间)，延长培养时间(9-11天)和加倍细胞因子浓度(20ng/mL)均不能显著提高evMDSC的产量，如图1-3所示。Giemsa染色来识别evMDSC两个亚群的细胞形态，结果显示，通过磁珠分离的CD11b+Ly6G+Ly6Clo和CD11b+Ly6G-ly6Chi两个细胞群体分别具有多态性核形态和单核形态，即对应的是MDSC的两个亚群PMN-MDSC和M-MDSC，如图4所示。
根据实验结果分析，骨髓细胞与浓度为10ng/mL的细胞因子GM-CSF和IL-6体外共培养7天是产生体外诱导免疫抑制功能性MDSC的最佳条件，由此获取的细胞表型和形态特征都符合预期。
实施例2
CD4+T细胞增殖抑制实验
(1)获取小鼠CD4+T细胞：无菌环境下解剖并游离出6-8周雄性Balb/c小鼠脾脏，研磨后收集液体经200目尼龙网过滤收集于离心管中，加入3倍于细胞体积的红细胞裂解液，用磁珠标记并与CD4单克隆抗体结合，经过磁柱分选得到CD4+T。分选后细胞以流式细胞分析仪检测分离纯度。
(2)CD4+T细胞CFSE染色：将CD4+T细胞悬液用室温的PBS洗涤两次，重悬至5-10x106个/mL，加入1uM CFSE至最终浓度，混合室温避光孵育10min，加入4-5倍体积的完全培养基中止孵育，冰上孵育5min，使用完全培养液洗涤3次，加入0.4μg/mL anti-mouse CD28单抗。
(3)CD4+T细胞与evMDSC共培养：加入1x105个(100uL)的上述小鼠脾脏CD4+T细胞至10μg/mL anti-mouse CD3e单抗预包被的96孔板中，加入等量上述(实施例1制得)evMDSC及其亚型或nMDSC，以1:1的比例共培养3天，同时设置阳性对照组及阴性对照组。
(4)流式细胞学分析：增殖抑制结果显示，与阳性对照组相比，总evMDSC或PMN-evMDSC抑制了约51％CD4+T细胞增殖，M-evMDSC抑制了约42％，nMDSC几乎没有抑制功能,如图5-6所示。
体外细胞因子诱导培养的总evMDSC、PMN-evMDSC以及M-evMDSC对CD4+T细胞增殖均具有抑制作用，总evMDSC、PMN-evMDSC抑制作用相当，均稍高于M-evMDSC。通过以上方法诱导产生的MDSC可以作为体外产生具有的免疫抑制功能evMDSC的有效来源。
实施例3
耗竭体内MDSC对穿透性角膜移植术后病理性新生血管生成的影响
(1)构建穿透性角膜移植小鼠模型：将纯系的6-8周雄性Balb/c小鼠作为受体，C57BL/6小鼠作为供体进行角膜移植，称为同种异体角膜移植(Allograft，简称Allo)。供体受体均为BALB/c则称为同种同体角膜移植(Isograft，简称Iso)。受体角膜提前采用缝线法诱导植床新生血管状态，一周后行角膜移植手术：取植片2.25mm直径，植床2.0mm直径，11/0丝线连续缝合将植片水密缝合于植床上，8/0丝线缝合眼睑。术后第三天拆除眼睑缝线，第七天拆除角膜缝线。
(2)耗竭体内MDSC：将造模小鼠均分成3组，即术后每周腹腔注射两次0.1ml 1mg/ml anti-Gr-1抗体组、术后每周腹腔注射两次等量同型对照IgG组以及未处理组，具体打药时间如图7所示。
(3)评估病理性新生血管：显微镜下活体观察显示与同型对照IgG组和未处理组相比，anti-Gr-1抗体处理组植片和植床在术后第7天就能观察到有大量新生血管形成，如图8所示。取术后15天角膜用CD31和LYVE-1进行免疫荧光染色，显示同种同体组几乎无新生血管和淋巴管生长，同种异体组有大量新生淋巴管和部分血管生成，如图9所示，而在anti-Gr-1抗体处理组新生血管灌注区和淋巴管灌注区均大量增加如图10-11所示。
MDSC在穿透性角膜移植后抑制新生血管生成和免疫耐受维持方面起着重要作用，用anti-Gr-1抗体耗竭体内的MDSC将促进植片和植床病理性新生血管及淋巴管生成。
实施例4
过继转移evMDSC对小鼠穿透性角膜移植病理性新生血管生长和生存期的影响
(1)构建穿透性角膜移植小鼠模型(同实施例3)。
(2)过继转移：将体外获得的evMDSC及其亚型及nMDSC细胞，采用5×106个/ml的细胞浓度，分别于手术当天注射至小鼠非手术眼球后，每只注射0.1ml，即5×105个细胞，对照组即球后注射等量PBS。
(3)生存期观察：与PBS对照组相比，nMDSC过继转移不能延长植片的存活时间，而evMDSC或PMN-evMDSC过继转移可使植片的中位生存期延长近两倍。等量M-evMDSC的过继可使植片的中位生存期稍增加(约为1.5倍)，如图12所示。同时H&E染色显示改善了植片的免疫细胞浸润、上皮角化、胶原纤维紊乱和基质水肿，如图13所示。
(4)评估病理性新生血管：显微镜下活体观察角膜新生血管，结果显示evMDSC、PMN-evMDSC和M-evMDSC过继转移显著降低了植片和植床病理性新生血管的形成，如图14所示。取术后15天角膜用CD31和LYVE-1进行免疫荧光染色，显示与PBS对照组相比，过继转移nMDSC不会减少新生血管的生成，如图15-17所示，而evMDSC和PMN-evMDSC过继转移可使病理性新生血管灌注区和淋巴管灌注区减少约60％。
本发明采取的是用细胞因子GM-CSF和IL-6对小鼠骨髓细胞进行体外培养，获取具有免疫抑制功能性的MDSC，该培养方案操作简便、成本低廉，相比荷瘤、脓毒血症模型的高死亡率，能高效稳定获取具有免疫抑制功能的MDSC；将evMDSC过继转移至角膜移植小鼠后能延长角膜植片的生存期，减缓角膜移植术后免疫排斥反应的发生，有效抑制病理性新生血管的形成，对于角膜移植术后的排斥反应具有治疗作用。本发明独到之处在于，经过体外细胞因子培养后，将原本不具有免疫抑制功能的MDSC诱导成具有强免疫抑制功能性MDSC，可以用于制备有效地治疗角膜移植后排斥及有效地抑制病理性新生血管生成的生物制剂。
Claims (10)
1.一种体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，由髓样抑制细胞在诱导剂诱导下体外培养得到；
所述的诱导剂包含细胞因子GM-CSF和IL-6。
2.如权利要求1所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，所述的髓样抑制细胞为健康供体的骨髓细胞。
3.如权利要求2所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，所述的髓样抑制细胞为健康老鼠的骨髓细胞。
4.如权利要求1所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，所述的GM-CSF和IL-6的质量比例为0.5～1:0.5～1。
5.如权利要求1～4任一项所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，将髓样抑制细胞在包含所述的诱导剂的培养基中培养得到。
6.如权利要求5所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，所述的培养基包含8～12％胎牛血清、85～95％1640培养基、0.5～1.5％青霉素-链霉素双抗；浓度为1～20ng/mL的诱导剂。
7.如权利要求1～6任一项所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞的制备方法，其特征在于，培养条件为：在温度为37±0.2℃、5±0.1％CO2下培养，且培养的时间大于或等于5天；优选为7～9天。
8.一种权利要求1～7任一项所述的制备方法制得的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞；
优选地，所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞为PMN-MDSC亚型细胞和/或M-MDSC亚型细胞。
9.一种权利要求8所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞在用于制备免疫抑制生物制剂中的应用；
优选地，将其用于制备抑制CD4+T细胞的免疫抑制生物制剂中的应用；
进一步优选，将其用于制备抑制器官移植免疫排斥反应的免疫抑制生物制剂中的应用；
更进一步优选，将其用于制备抑制角膜移植免疫排斥反应的免疫抑制生物制剂中的应用；
更进一步优选，将其用于制备抑制角膜移植的病理性新生血管和/或新生淋巴管生长的免疫抑制生物制剂中的应用；或者，将其用于制备延长角膜移植的角膜植片生存期的免疫抑制生物制剂中的应用。
10.一种免疫抑制生物制剂，其特征在于，包含权利要求1～7任一项所述制备方法制得的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞；
优选地，所述的体外诱导免疫抑制性髓系抑制细胞为PMN-MDSC亚型细胞；
优选地，所述的免疫抑制生物制剂为角膜移植免疫抑制生物制剂。
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