CN111793138A

CN111793138A - 一种靶向乳腺癌的融合肽及应用

Info

Publication number: CN111793138A
Application number: CN202010598626.2A
Authority: CN
Inventors: 张虎; 刘雪; 王雨婷; 陈昱锦; 时瑞; 李保路
Original assignee: Jiangsu Vocational College of Medicine
Current assignee: Jiangsu Vocational College of Medicine
Priority date: 2020-06-28
Filing date: 2020-06-28
Publication date: 2020-10-20
Anticipated expiration: 2040-06-28
Also published as: CN111793138B

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种靶向乳腺癌的融合肽及应用。该融合肽包括N端的穿膜肽和C段的前导肽，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明根据生物学中心法则，研究了转录因子PDEF核定位信号关键序列，依此设计合成了靶向抑制PDEF入核转运的前导肽，并进一步制得融合肽，实验证实该融合肽可以显著抑制乳腺癌细胞的生长。

Description

一种靶向乳腺癌的融合肽及应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种靶向乳腺癌的融合肽及应用。

背景技术

目前，世界范围内癌症新发病例逐年增加，乳腺癌(Breast cancer，BC) 仍然是女性发病率和死亡率最高的肿瘤，且发病呈年轻化趋势，在中国亦是如此。乳腺癌具有高度异质性，根据基因表达谱可将其分为basal-like、 luminal和HER2+三种亚型，分别占比约10～15％、60～70％和25～30％。basal-like型乳腺癌恶性程度高，临床上尚无理想靶向药物；luminal型乳腺癌占比约60～70％，雌激素受体(Estrogen receptor，ER)阳性，预后较好，临床上可采取内分泌治疗；HER2+型乳腺癌占比约25～30％，预后较差，临床上常采用抗HER2靶向药物进行治疗。然而，luminal型和HER2+型乳腺癌在临床治疗过程中会发生耐药现象。因此，现有治疗手段仍不能满足临床乳腺癌个体化治疗需求，开发新型治疗靶点和药物势在必行。

发明内容

本发明通过整合分析TCGA数据、CCLE数据、GTEx数据和肿瘤细胞生长依赖基因数据，发现前列腺来源Ets因子(Prostate-Derived Ets Factor, PDEF)特异性表达于乳腺癌和前列腺癌中，且特异性促进PDEF高表达的 luminal和HER2+型乳腺癌细胞的生长，提示PDEF是一个有潜力的乳腺癌靶向治疗的新靶点。

本发明第一方面提供一种靶向乳腺癌的融合肽，该融合肽包括N端的穿膜肽和C段的前导肽，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

RLWGIRKNRPAMNYDKLSRSIRQYYKKGIIRKPD(SEQ ID NO：1)。

本发明中的所述穿膜肽可以为本领域常规的各种穿膜肽，包括但不限于：TAT、Penetratin、Polyarginines、DPV₁₀₄₇、MPG、Pep-1、pVEC、ARF(1-22)、 BPrPr(1-28)、MAP、Transportan、p28、VT5、Bac 7(Bac 1-24)、C105Y、PFVYLI 或Pep-7。

本发明的融合肽可以通过本领域常规的方法合成，也可以商购获得。

本发明第二方面提供上述前导肽在制备乳腺癌细胞生长抑制剂中的应用。

具体地，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-453细胞和/或SK-BR-3细胞。

本发明根据生物学中心法则，研究了转录因子PDEF核定位信号关键序列，依此设计合成了靶向抑制PDEF入核转运的前导肽，并进一步制得融合肽，实验证实该融合肽可以显著抑制乳腺癌细胞，如MDA-MB-453和 SK-BR-3细胞的生长。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了PDEF对癌症细胞生长的影响。A：敲除PDEF靶向抑制 PDEF高表达乳腺癌细胞的生长；B：敲低PDEF靶向抑制PDEF高表达乳腺癌细胞的生长。

图2示出了PDEF核定位信号NLS对其入核转运的影响。A：在线工具预测显示PDEF核定位信号氨基酸序列为： RLWGIRKNRPAMNYDKLSRSIRQYYKKGIIRKPD；B：细胞免疫荧光实验证实核定位信号NLS缺失抑制PDEF入核转运。

图3示出了H15998空载质粒图谱。

图4A和图4B分别示出了本发明的融合肽对乳腺癌细胞生长的抑制作用。图4A：融合肽作用第三天和第四天，显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-453 的生长(P＜0.05，P＜0.05)；图4B：融合肽作用第三天和第四天，显著抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的生长(P＜0.05，P＜0.05)。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。

实施例1

本实施例用于说明干预PDEF特异性抑制PDEF高表达乳腺癌细胞的生长。

癌症细胞生长依赖基因分析

1、全基因组敲除文库筛选数据分析：

登录Depmap portal(https://depmap.org/portal/)门户网站，输入基因名“PDEF”，自动识别后，选择“PDEF”，左侧选择数据集“CRISPR(Avana)Public 20Q2”，下载结果，如图1A所示。

2、全基因组敲低文库筛选数据分析：

登录Depmap portal(https://depmap.org/portal/)门户网站，输入基因名“PDEF”，自动识别后，选择“PDEF”，左侧选择数据集“Combined RNAi (Broad,Novartis,Marcotte)”，下载结果，如图1B所示。

图1中每一个圆圈代表一个乳腺癌细胞系，圆圈大、小表示PDEF表达高、低；彩色表示突变；细胞生长依赖参数CERES或DEMETER2数值< 0表示PDEF促进细胞生长，>0表示PDEF抑制细胞生长。-1处红线为阈值，红线左侧表示PDEF显著影响细胞生长，右侧表示PDEF影响细胞生长不显著。由图1可以看出，敲除PDEF靶向抑制PDEF高表达乳腺癌细胞的生长，敲低PDEF靶向抑制PDEF高表达乳腺癌细胞的生长。

实施例2

本实施例用于说明PDEF核定位信号肽影响PDEF入核转运。

一、预测PDEF核定位信号多序列：

登录NCBI Protein数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)，输入“PDEF”，选择“Ets transcription factor PDEF[Homo sapiens]”，下载P DEF蛋白氨基酸序列；登录核定位信号预测工具NLS_Mapper(http://nls-m apper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi/)，输入PDEF氨基酸序列，点击“Predict NLS”下载结果，如图2的A图所示；在线工具预测显示P DEF核定位信号氨基酸序列为：RLWGIRKNRPAMNYDKLSRSIRQYYKK GIIRKPD。

二、克隆构建

1、获得插入片段：

PDEF CCDS区全长和PDEF核定位信号缺失DNA序列由元生物技术 (上海)股份有限公司合成；

2、载体酶切：

根据表1配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心，置于37℃反应3h。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。H15998质粒购自和元生物技术(上海)股份有限公司，空载质粒图谱如图3所示。

表1载体酶切体系

3.载体重组连接：

通过

plus One step PCR Cloning Kit(购自Novoprotein公司) 试剂盒，利用同源重组的方法将PDEF DNA片段定向克隆至载体。

根据表2配制20μl反应体系，50℃反应10min。

表2载体连接体系

4、转化

将10μL连接反应产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴孵育2min；加入500μL LB 培养基，置于37℃摇床振荡培养1h；取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

5、测序鉴定

将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养12-16h，取适量菌液进行测序、鉴定。

三、细胞免疫荧光实验检测核定位信号对PDEF入核转运的影响：

1、细胞转染：

待12孔板内的MDA-MB-453细胞汇合至60％，将1.6μl Lipo8000^TM(购自碧云天生物公司)、800ng质粒分别加入50μl无血清培养基中，混匀后，室温静置5min，添加到24孔板中，8h后更换新鲜培养基。

2、Hoechst染色并观察

取12孔板培养的细胞，弃掉培养基，加入500μl Hoechst 33258(购自碧云天公司)，充分覆盖细胞；继续培养细胞30min；弃染色液，用PBS 洗涤3次；抗荧光淬灭液封片(购自碧云天公司)；激光共聚焦显微镜观察 EGFP-PDEF融合蛋白核定位情况，并记录照片，如图2的B图所示。细胞免疫荧光实验证实核定位信号NLS缺失抑制PDEF入核转运。空载和NLS缺失组PDEF主要定位于细胞质，PDEF全长组显示PDEF主要定位于细胞核。

实施例3

本实施例用于验证本发明融合肽抑制乳腺癌细胞生长的作用。

一、融合肽的合成

融合肽TAT-AP34和对照多肽TAT-Ctrol34的序列如表3所示，委托金斯瑞生物科技公司合成。

表3

二、细胞增殖实验

利用200μl Opti-MEM分别重悬7.0×10⁵个乳腺癌MDA-MB-453-GFP 和SK-BR-3-GFP细胞，各加入10mg TAT-AP34或TAT-Ctrol34，37℃孵育 1h；培养基重悬后，3000cells/孔接种于96孔板，每天定时拍照，持续4 天，计算荧光强度，绘制生长曲线，SPSS 16.0进行统计分析。

图4A-4B示出了融合肽TAT-AP34对乳腺癌细胞生长的抑制作用。 TAT-AP34作用第三天和第四天，显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-453的生长(P＜0.05，P＜0.05，图4A)以及显著抑制乳腺癌细胞SK-BR-3的生长 (P＜0.05，P＜0.05，图4B)。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

序列表

<110> 江苏医药职业学院

<120> 一种靶向乳腺癌的融合肽及应用

<130> BJI2000893JSYY

<141> 2020-06-28

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Arg Leu Trp Gly Ile Arg Lys Asn Arg Pro Ala Met Asn Tyr Asp Lys

1 5 10 15

Leu Ser Arg Ser Ile Arg Gln Tyr Tyr Lys Lys Gly Ile Ile Arg Lys

20 25 30

Pro Asp

<210> 2

<211> 43

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ile Arg Lys

1 5 10 15

Asn Arg Pro Ala Met Asn Tyr Asp Lys Leu Ser Arg Ser Ile Arg Gln

20 25 30

Tyr Tyr Lys Lys Gly Ile Ile Arg Lys Pro Asp

35 40

<210> 3

<211> 43

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Leu Lys Glu Leu Leu Leu Lys

1 5 10 15

Pro His Ser Tyr Gly Arg Phe Ile Arg Trp Leu Asn Lys Glu Lys Gly

20 25 30

Ile Phe Lys Ile Glu Asp Ser Ala Gln Val Ala

35 40

Claims

1.一种靶向乳腺癌的融合肽，其特征在于，该融合肽包括N端的穿膜肽和C段的前导肽，所述前导肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的融合肽，其中，所述穿膜肽为TAT、Penetratin、Polyarginines、DPV₁₀₄₇、MPG、Pep-1、pVEC、ARF(1-22)、BPrPr(1-28)、MAP、Transportan、p28、VT5、Bac 7(Bac 1-24)、C105Y、PFVYLI或Pep-7。

3.权利要求1或2所述的前导肽在制备乳腺癌细胞生长抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，所述乳腺癌细胞为MDA-MB-453细胞和/或SK-BR-3细胞。