CN111727054A - 用于增加疗效的可与细胞结合的免疫佐剂 - Google Patents

Abstract

本案提供了能够调节免疫反应的治疗套组。该治疗套组还可用于增强从细胞碎片释放的抗原的免疫原性。并提供了使用该治疗套组的方法。

Description

用于增加疗效的可与细胞结合的免疫佐剂

相关申请的交叉引用

本申请案请求于2018年1月4日申请的美国临时申请案号62/613,574的权益。

技术领域

本案关于一种治疗套组及其使用方法。

背景技术

针对抗原目标的有效免疫增强取决于抗原及免疫刺激讯号的协调呈现。经由病原体识别受体的促效剂所活化的先天免疫讯号引发了特定细胞激素环境的分泌，这反过来形成针对该抗原目标的后天性免疫。这种机制经常被用于疫苗设计，因为疫苗抗原通常与免疫佐剂一起配制以增强免疫增强作用。一旦免疫系统被引发抵抗一外来抗原，后天性免疫细胞就能识别并消除类似的可疑细胞，同时保留相同抗原的记忆，从而可以更快、更有效地攻击感染复发[1]。

在对抗恶性细胞，亦即癌症，的战役中越来越了解到后天性免疫的作用，因为免疫细胞，例如细胞毒性T淋巴细胞，可以促进根除这些细胞目标。肿瘤细胞经常表达肿瘤相关抗原，这些抗原可作为疫苗开发的目标。最近的研究显示，通过以免疫佐剂配制肿瘤相关抗原，所得疫苗制剂可以增强肿瘤特异性免疫力，促进更好的癌症治疗效果[2]。这些癌症疫苗制剂需要肿瘤样品的基因组分析以鉴定特定的肽序列，然后可以合成这些序列以用于疫苗开发。

或者，也可通过萃取患者癌细胞样品或使用同种异体癌细胞来开发基于全细胞的肿瘤疫苗。在这些方法中，在施用前将肿瘤细胞衍生物与佐剂一起外源配制。该佐剂混合物便可以增加在所述肿瘤细胞衍生物中肿瘤相关抗原的免疫原性。于一范例中，死亡癌细胞于体外(ex vivo)以佐剂纳米粒子功能化以接种对抗皮下肿瘤[3]。该平台本身具有30％的效率，当与免疫检查点阻滞剂疗法结合使用时，可以增加至高达78％。于另一范例中，同种异体癌细胞于体外(ex vivo)以干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)促效剂配制为一疫苗制剂[4]。该制剂称为STING-VAX，在动物模型中给药后能够引发抗肿瘤免疫。

内源性免疫刺激分子的诱导也被认为是成功治疗癌症的重要因素。已经证明了几种癌症治疗方法，包括几种类型的化学疗法、放射线以及溶瘤病毒，在癌细胞中诱导细胞压力并引发免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death，ICD)。这种类型的细胞死亡与内源性释放的危险相关分子模式(danger associated molecular patterns，DAMPs)有关，这些模式由源自垂死细胞的肽、蛋白质或核酸的组合而组成[5]。这些内源性危险讯号与来自垂死细胞的抗原物质一起促进抗原特异性后天性免疫。越来越多的证据显示，这种共同展示抗原及免疫刺激分子的先天机制对于控制受过多种肿瘤影响的患者的疾病进程至关重要[6]。因此可以想到，借助于外源佐剂可以增强这种机制，该外源佐剂可以进一步放大癌症细胞死亡后对释放的肿瘤抗原的免疫反应。

发明内容

于本申请案中，我们开发了可与细胞结合的免疫佐剂，并证明其用于在治疗期间增强从细胞释放的抗原的免疫原性。如图1所示，通过将外源免疫佐剂与可与癌细胞结合的功能相关联-例如通过细胞的内化、膜结合，或表面配体结合–该佐剂可标记该细胞目标以增强免疫。无论治疗本身是否触发内源性危险讯号，诱导细胞碎片、囊泡，以及抗原释放的后续治疗将触发免疫反应。因此，本申请案涉及免疫佐剂的功能化及与功能化佐剂相关的治疗方式。本案请求保护的发明除了可应用于癌症，更可应用于任何致病细胞。具体而言，设计一种免疫佐剂，其可通过细胞内(细胞内化)或细胞外手段(膜结合或表面配体结合)与恶性细胞结合。然后将用功能化佐剂处理后的恶性细胞诱导、释放细胞碎片、囊泡，以及抗原。可以通过本领域已知的任何刺激来触发、诱导抗原释放。例如，刺激可以至少包含化学试剂、生物试剂、光，或机械刺激。

在本发明的范围内，提供了致病细胞的治疗方式，其中首先向患病细胞施用外源佐剂。该外源佐剂可以如下与细胞结合：(1)一种佐剂制剂，其允许向细胞内递送所需的佐剂，例如，纳米粒子、外泌体、经设计的细胞穿透肽等；(2)一种佐剂制剂，可以嵌入到细胞膜内，例如具有亲脂性连接符、两亲性连接符等的佐剂；以及(3)一种佐剂制剂，其对细胞表面分子部分体(moiety)具有结合亲和力且能够与细胞膜分子部分体物理结合，例如，与抗体偶联的佐剂、与适体偶联的佐剂、佐剂糖制剂等。

一旦佐剂与感染的细胞结合，接着以能引起囊泡化、抗原释放的刺激处理该细胞，该刺激包括，但不限于，化疗药物、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏等。该治疗方案有助于在体内(in vivo)产生共定位的外源佐剂及抗原。原则上，所述与细胞相关联的免疫原性佐剂可用于与根除病原细胞的任何现有或新出现的治疗方式互补。

于一态样，本文提供了一种治疗套组，包含：能与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及用于诱导抗原自细胞释放的手段。

于另一态样，本文提供了一种治疗疾病的方法，包含：给对有此需要的受试者施用能够与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及对所述有此需要的受试者施用用于诱导抗原自细胞释放的手段。

较佳地，免疫佐剂制剂包含包封佐剂的聚合物纳米粒子，且聚合物纳米粒子可进一步包含：不透水的聚合物外壳，以及由聚合物外壳包围的一或多个含水核心。

较佳地，聚合物外壳的厚度可小于25nm，且聚合物纳米粒子的外径为30-600nm。

较佳地，用于诱导抗原自细胞释放的手段包封在所述聚合物纳米粒子中。

较佳地，免疫佐剂制剂可包含MPLA、CpG，poly(I:C)，或环状二核苷酸的变体。

较佳地，免疫佐剂制剂可包含细胞质模式识别受体或干扰素基因刺激因子(STING)的促效剂。

较佳地，所述促效剂可为环状二-鸟苷单磷酸(di-GMP)或环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(GAMP)。

较佳地，该免疫佐剂制剂可包含佐剂，佐剂可与用于识别并结合于细胞表面上分子部分体的小分子、肽、抗体、适体、糖分子部分体、聚合物或其组合共轭结合。

较佳地，抗体可为免疫球蛋白分子、Fv、双硫键连接的Fv、单株抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含二个Fab片段并由双硫键于铰链区连接的二价片段、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由一抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(complementarity determining region，CDR)，或单链抗体。

较佳地，免疫佐剂制剂可包含能够与细胞膜结合的分子共轭结合的佐剂。

较佳地，分子可为亲脂性的或两亲性的。

较佳地，亲脂性分子可包含脂肪酸链、胆固醇，或磷脂。

较佳地，两亲分子可包含脂质-聚乙二醇(lipid-PEG)共轭结合物。

较佳地，免疫佐剂制剂可包含与纳米微粒或细胞穿透肽配制的佐剂，纳米微粒或细胞穿透肽可用于细胞内递送。

较佳地，细胞穿透肽可包含HIV-1TAT肽(GRKKRRQRRRPPQ)、渗透肽(RQIKIWFQNRRMKWKK)、聚精氨酸(Rn)，或输送蛋白(GWTLNSAGYLLGINLKALAALAKKIL)。

较佳地，用于诱导抗原释放的手段可包含化学试剂、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏，或其组合。

较佳地，化学试剂可包含细胞毒性剂。

较佳地，细胞毒性剂可包含单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F，MMAF)、米他汀(mertansine，DM1)、蒽环类药物(anthracycline)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、苯二氮平类药物(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟维司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、来曲唑(letrozole)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、PTK787/ZK 222584、奥沙利铂(oxaliplatin)、亚叶酸钙(leucovorin)、雷帕霉素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib，

SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷化剂(alkylating agent)、烷基磺酸盐(alkylsulfonate)、氮丙啶(aziridines)、乙烯亚胺(ethylenimine)、甲基蜜胺(methylamelamine)、内酯(acetogenins)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡拉汀(callystatin)、CC-1065、隐藻菌素(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾植塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲怜胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、剌抱霉素(calicheamicin)、葱环类抗生素(dynemicin)、氯膦酸盐(clodronate)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatinchromophore)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酌酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、二甲叶酸(denopterin)、噪罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)、氨麸精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醒内酯(aceglatone)、醒怜酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿喃啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、倍曲布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、地怜酸胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、伊尔福尼辛(elformithine)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、埃坡霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓(gallium nitrate)、羟基脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocins)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索葱醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-鬼臼酸乙肼(2-ethylhydrazide)、甲基苄肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根霉素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三亚胺醌(triaziquone)、2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)、单端抱霉烯(trichothecene)、氨基甲酸乙酯(urethan)、长春碱酰胺(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甘露莫司汀(mannomustine)、二漠甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、双溴丙基哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿糖胞苷(arabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、类紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(doxetaxel)、氯芥苯丁酸(chloranbucil)、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、铂(platinum)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、双羟蒽醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、伊达曲杀(edatrexate)、道诺霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、截瘤达锭(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)、视黄醇(retinoid)、卡培他滨(capecitabine)，或其组合。

较佳地，光解剂可包含光卟啉(Photofrin)、拉泊芬钠(Laserphyrin)、氨基左旋糖酸(Aminolevulinic acid，ALA))、酞菁硅Pc 4(Silicon Phthalocyanine Pc 4)、间-四羟基苯基氯(m-tetrahydroxyphenylchlorin，mTHPC)、二氢卟酚e6(chlorin e6，Ce6)、奥美拉(Allumera)、氨基酮戊酸(Levulan)、替莫泊芬(Foscan)、美特维克(Metvix)、海克维克(Hexvix)、光克洛(Photochlor)、光敏(Photosens)、光瑞斯(Photrex)、亮美恩(Lumacan)、米索尼克(Visonac)、安菲尼克(Amphinex)、维替泊芬(Verteporfin)、罗他泊芬(Purlytin)、ATMPn、酞菁锌(Zinc phthalocyanine，ZnPc)、原卟啉IX(Protoporphyrin IX，PpIX)、焦脱镁叶绿酸A(Pyropheophorbide a，PPa)、脱镁叶绿酸A(Pheophorbide a，PhA)，或其组合。

较佳地，方法可以进一步包含：将佐剂包封于聚合物纳米粒子中。聚合物纳米粒子包含：不透水的聚合物外壳，以及由聚合物外壳包围的一或多个含水核心。

较佳地，用于诱导抗原释放的手段可于施用免疫佐剂制剂之前或之后施用于有此需要的受试者。

较佳地，用于诱导抗原释放的手段可与免疫佐剂制剂同时给予有此需要的受试者。

较佳地，方法可以进一步包含：将用于诱导抗原自细胞释放的手段包封于免疫佐剂制剂中。

较佳地，该方法可以进一步包含：将佐剂与识别并结合于细胞表面上分子部分体的小分子、肽、抗体、适体、糖分子部分体、聚合物或其组合共轭结合，以形成所述免疫佐剂制剂。

较佳地，方法可以进一步包含：将佐剂与能够与细胞膜结合的分子共轭结合。

较佳地，方法可以进一步包含：配制具有纳米粒子或细胞穿透肽的佐剂，用于细胞内递送。

较佳地，可以通过选自由下列所组成的群组的至少一种模式进行对受试者施用的步骤：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、关节囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑室内、脑室内、颅内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内，以及透皮。

较佳地，疾病可以是心血管疾病、癌症、自体免疫疾病或感染。

附图说明

图1说明与致病细胞关联免疫佐剂及其在增强后续治疗中的作用。免疫佐剂被功能化以通过各种方式与病原细胞结合，例如细胞内递送、膜固定，以及表面结合。然后对所得到的细胞进行处理，诱导产生佐剂关联细胞碎片，其可通过协调抗原及佐剂输送而促进后天性免疫。

图2描绘了聚合物纳米粒子对核酸及蛋白质的包封效率。A：通过超高速离心造粒，观察空纳米粒子(左)、装载有染料标记DNA的纳米粒子(中)，以及装载有染料标记牛血清白蛋白的纳米粒子(右)。独特的有色颗粒表示DNA与BSA蛋白的成功包封。B：以低温电子显微镜(cryoEM)观察空纳米粒子。C：以cryoEM观察DNA装载的纳米粒子。D：以cryoEM观察BSA蛋白质装载的纳米粒子。通过纳米粒子内部的高度粒状纹理可以观察到有效的DNA与蛋白质装载。

图3描绘了聚合物纳米粒子对用于免疫刺激的STING促效剂的包封及控制释放的影响。A：制备装载佐剂的薄壳中空纳米粒子。B：通过纳米粒子追踪分析测量的纳米粒子尺寸。C：通过梯度HPLC验证环状二-GMP的包封。D：以CryoEM观察薄壳中空纳米粒子。E：货物释放研究揭示所述纳米粒子的pH敏感触发释放曲线。

图4描绘了装载STING促效剂的纳米粒子在增强淋巴细胞激素的同时使循环细胞激素最小化。A：与cd-GMP纳米粒子及游离cd-GMP作用后，在小鼠树突细胞株中诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。B：在相同的小鼠树突细胞株中诱导介白素-6(IL-6)。C：在所述小鼠树突细胞株中诱导干扰素-β(IFN-β)。D：以等剂量的cd-GMP游离分子形式以及cd-GMP纳米粒子制剂一起作用时JAWSII的活化。E：足垫注射游离cd-GMP或纳米粒子cd-GMP 48小时后淋巴结IFN-β的定量。F：足垫注射游离cd-GMP与纳米粒子cd-GMP后全身TNF-α的含量。

图5描绘了基于肿瘤细胞相关免疫佐剂(装载cGAMP的纳米粒子)的治疗方式。在摄入纳米粒子后，处理含有外源佐剂的细胞以产生死细胞碎片。该含有外源佐剂的细胞碎片随后引发后天性免疫以改善治疗结果。

图6描绘了(a)以CryoEM观察荧光标记的装载cGAMP的纳米粒子。(b)共轭焦分析以及(c)流式细胞仪分析显示在以装载cGAMP的纳米粒子处理后cGAMP与死细胞及碎片的结合。

图7描绘了与以cGAMP纳米粒子作用的HeLa细胞产生的细胞碎片比以游离cGAMP作用的细胞更具免疫原性。该HeLa细胞关联的cGAMP纳米粒子导致DC的CD80(a)、CD86(b)表达增加，且DC的TNF-α(c)与IFN-β(d)分泌增加。

图8描绘了在以游离(游离佐剂)及纳米粒子形式(佐剂纳米粒子)的染料标记STING促效剂(红色)进行肿瘤内注射时，检验肿瘤及癌细胞的佐剂保留。在施用佐剂后24小时，通过(a)全身影像、(b)流式细胞仪分析，以及(c)荧光显微镜检查该肿瘤及萃取的癌细胞。检查显示施用纳米粒子后肿瘤内及癌细胞内显著的佐剂保留。

图9描绘了使用不同佐剂及化学药物组合的肿瘤治疗功效，包括安慰剂、仅顺铂(仅CTTP)、仅cGAMP装载的纳米粒子(仅纳米粒子)、游离的cGAMP然后加上顺铂(cGAMP+CTTP)，以及装载cGAMP的纳米粒子然后加上顺铂(NP+CTTP)。(a)B16-OVA鼠黑色素瘤皮下模型的肿瘤植入及治疗方案。(b)所有治疗组在60天内的肿瘤进程。(c)不同治疗组的生存分析曲线(n＝9-11)。(c)在来自NP+CTTP组(n＝4)的无肿瘤存活动物进行再发肿瘤实验中平均肿瘤体积的比较。与接种相同数量的肿瘤细胞(n＝1)的初始对照动物进行比较肿瘤生长。

图10描绘了抗体共轭结合的CpG-ODN的制备。

图11描绘了(A)以荧光显微镜观察游离CpG-FAM(中)与抗体共轭结合的CpG-FAM(αCD44-CpG-FAM；右)作用3小时后HeLa细胞单层。以较高数量的荧光点状物观察到通过抗体共轭结合的CpG-FAM而增强的CpG结合。(B)以流式细胞仪分析具有CpG-FAM的细胞。(C)定量与CpG-FAM关联的细胞。相较于游离CpG-FAM(游离)，抗CD44共轭结合物(αCD44)在HeLa细胞上产生更高的CpG-FAM结合。

图12描绘了以游离CpG(游离)或抗CD44共轭结合的CpG(αCD44)处理的HeLa细胞碎片作用后，JAWSII细胞中成熟标志物(A)CD80以及(B)CD86的表达。

图13描绘了(A)纳米粒子包封的CpG的示意图。(B)以CryoEM观察纳米粒子包封的CpG。

图14描绘了(A)以荧光显微镜观察经游离CpG-FAM(中)以及纳米粒子包封的CpG(CpG-FAM NP；右)作用24小时后的HeLa细胞单层。以大量荧光点状物观察到增强的CpG结合。(B)以流式细胞仪分析具有CpG-FAM的细胞。(C)定量与CpG-FAM关联的细胞。抗-CD44共轭结合物在HeLa细胞上产生比游离CpG-FAM更高的CpG-FAM结合。

图15描绘了与以游离CpG(游离)或纳米粒子包封的CpG(NP)处理的HeLa细胞碎片作用后，JAWSII细胞的成熟标志物(A)CD80以及(B)CD86的表达。

图16描绘了(A)与化学治疗药物(柔红霉素)与佐剂(cd-GMP)共包封的纳米粒子的示意图。(B)以CryoEM观察与柔红霉素及cd-GMP共包封的纳米粒子。

图17描绘了以与柔红霉素及cd-GMP共包封的纳米粒子((cdGMP+DR)NP)、游离cd-GMP与柔红霉素纳米粒子(cdGMP+DR NP)或仅柔红霉素纳米粒子(DR NP)处理的CT26细胞碎片作用后，JAWSII细胞的成熟标志物(A、B)CD86以及(C、D)CD80的表达。

图18描绘了以与柔红霉素及cd-GMP共包封的纳米粒子((cdGMP+DR)NP)、游离cd-GMP与柔红霉素纳米粒子(cdGMP+DR NP)或仅柔红霉素纳米粒子(DR NP)处理的CT26细胞碎片作用后，JAWSII细胞分泌IFN-β。

具体实施方式

以下将以本文描述的其他具体实施例更详细地描述本案的前述与其他态样。应当理解的是，本发明可以不同的形式实施，并且不应该被解释为限于这里阐述的具体实施例。相反地，提供这些具体实施例是为了使本揭露内容彻底及完整，并且向本领域技术人员充分传达本发明的范围。

本文中对本发明的描述中使用的术语仅用于描述特定具体实施例的目的，而非意图限制本发明。如在本发明的描述以及所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一个”以及“该(所述)”意旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。

如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“特征在于(characterized by)”或其任何其他变型是指在明确指出的任何限制的情况下，涵盖非排他性的包含。例如，包含一系列特征的组合物、混合物、流程或方法不必仅限于那些特征，而是可以包括未明确列出的或这种组合物、混合物、流程或方法固有的其他特征。

连接词词组“由…组成(consisting of)”排除了未指定的任何特征、步骤，或成分。如果在权利要求中，除了通常与之相关的杂质之外，这样的权利要求将排除除了所述材料之外的材料。当“由…组成”一词出现在一项权利要求正文的一个子句中，而非紧接在前言之后时，它只限制该子句中规定的特征；其他特征不排除在该整个权利要求之外。

连接词词组“基本上由…组成(consisting essentially of)”用于在附加材料、步骤、特征、组分或组件不会对请求保护的发明的基本及新颖特征产生实质性影响的前提下，除了字面上揭露的那些之外，组合物、方法还包括该些材料、步骤、特征、组分或组件。术语“基本上由…组成”占据“包含”及“由...组成”之间的中间地带。

如果申请人已经将发明或其一部分定义为具有开放式术语，例如“包含”，则应该容易理解(除非另有说明)该描述应该被解释为也使用术语“基本上由…组成”或“由…组成”来描述这样的发明。

如本文所用，术语“约”用于表示一数值包括，例如，测量装置或用于确定该数值的方法误差的固有变异，或该研究对象之间存在的变异。取决于具体情况，通常该术语意指包括大约或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％变化。

除非明确指出仅指替代方案或替代方案为相互排斥的，权利要求中使用术语“或”是用于表示“及/或”，尽管本案揭露内容支持仅为替代方案与“及/或”的定义。

“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”在本文中意指对受试者施用治疗组合物，目的为治愈、减轻、缓解、治疗、预防，或改善一病症、该病症的症状，继发于该疾病的疾病状态，或对该疾病的易感性。

如本文所用的“受试者”是指被诊断患有、或怀疑患有或发展为下列疾病的哺乳动物受试者，例如心血管疾病、癌症、自体免疫疾病，或感染。示例性患者可为人类、猿、狗、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物以及患有可以从前述治疗中受益的疾病的其他哺乳动物。

“施用(Administering)”或“施用(Administration)”在本文中为对一受试者提供本案的治疗套组。作为实例而非限制，施用可以通过肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、关节囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑室内、脑室内、颅内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内，以及透皮执行。例如，注射可以通过静脉内(intravenous，i.v.)注射、皮下(sub-cutaneous，s.c.)注射、皮内(intradermal，i.d.)注射、腹膜内(intraperitoneal，i.p.)注射，或肌肉内(intramuscular，i.m.)注射进行。可以采用一种或多种这样的途径。肠胃外给药可以是，例如，通过推注或随时间推移逐渐灌注。可替代地，或同时，可以通过口服途径施用。

如本文所用，“免疫佐剂制剂”是指当施用于一受试者时能够在受试者中诱导免疫反应的一种制剂。当与抗原组合施用时，“免疫佐剂制剂”能够引发抗原特异性免疫反应。在由一受试者施用后，“免疫佐剂制剂”将通过细胞内化、膜结合，及/或表面配体结合而与细胞结合。

如本文所用，“细胞内化”是指允许向细胞内递送所需佐剂的佐剂制剂。例如，可以至少通过纳米粒子、胞外泌体、经设计的细胞穿透肽等实现所需佐剂的“细胞内化”。

如本文所用，“膜结合”是指可以嵌入到细胞膜中的佐剂制剂。例如，可以至少通过亲脂性连接符、两亲性佐剂等达到所需佐剂的“膜结合”。

如本文所用，“表面配体结合”s指对细胞表面分子部分体具有结合亲和力并且能够与细胞膜分子部分体物理性结合的佐剂制剂。例如，可以至少通过抗体、适体、糖制剂等实现所需佐剂的“表面配体结合”。

如本文所用，“用于诱导抗原自细胞释放的手段”是指使用一化学或物理方法诱导处理的细胞释放引发免疫反应的细胞碎片、囊泡，及/或抗原。例如，该手段可包含化学试剂、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏，或其组合。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术及科学术语具有本领域技术人员所通常理解的相同含义。本文引用的所有出版物、专利申请、专利，以及其他参考文献通过引用整体并入与呈现参考文献的这些句子及/或段落相关的教示。

于一具体实施例中，揭露了用于增强从细胞释放的抗原的免疫原性的治疗套组。该治疗套组包含能够与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及用于诱导抗原从一细胞释放的手段。

于一较佳的具体实施例中，所述免疫佐剂制剂为包封佐剂的聚合物纳米粒子，其包含：不透水的聚合物外壳，以及由该聚合物外壳包围的一或多个含水核心。

所述聚合物外壳可具有小于25nm的厚度，且所述聚合物纳米粒子具有30-600nm的外径。较佳地，所述厚度小于24nm、23nm、22nm、21nm、20nm、18nm、16nm、14nm、12nm，或10nm。所述外径较佳为30-550nm、30-500nm、30-450nm、30-400nm、30-350nm、30-300nm、30-250nm、30-200nm、30-150nm、30-100nm、35-550nm、35-500nm、35-450nm、35-400nm、35-350nm、35-300nm、35-250nm、35-200nm、35-150nm、35-100nm、40-550nm、40-500nm、40-450nm、40-400nm、40-350nm、40-300nm、40-250nm、40-200nm、40-150nm、40-100nm、45-550nm、45-500nm、45-450nm、45-400nm、45-350nm、45-300nm、45-250nm、45-200nm、45-150nm、45-100nm、50-550nm、50-500nm、50-450nm、50-400nm、50-350nm、50-300nm、50-250nm、50-200nm、50-150nm，或50-100nm的范围内。

于一具体实施例中，所述聚合物外壳由两亲聚合物形成，该两亲聚合物含有非极性链段与极性端基团。所述非极性链段的实例包括，但不限于，聚(乳酸)、聚(乳酸-共-羟基乙酸)(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)、聚己内酯，以及聚胺酯。所述聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的乳酸与羟基乙酸的摩尔比为1:99至99:1，从10:90至90:10，从15:85至85:15，从20:80至80:20，从25:75至75:25，从30:70至70:30。较佳地，所述聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)的乳酸与羟基乙酸的摩尔比为50:50或75:25。所述极性端基团可为带负电的基团、带正电的基团、两性离子基团，或中性基团。带负电基团的实例包括羧酸、琥珀酸，以及磺酸。带正电基团的实例包括胺及脒。两性离子基团的实例包括羧基甜菜碱以及磺基甜菜碱。中性基团的实例为糖(saccharide)。

示例性聚合物外壳由含有聚(乳酸-共-羟基乙酸)作为非极性链段与羧酸作为极性端基团的聚合物所形成。

本文所述的聚合物纳米粒子可为聚合物中空纳米粒子平台，其具有厚度为25nm或更小的无缺陷聚合物外壳。该中空聚合物纳米粒子通常具有30至600nm的外径。

通过最小化壳厚度，所述聚合物纳米粒子可以形成为具有能够最大化货物载荷的大的内部水性空间。针对外径大于100nm的颗粒，内部水性空间可具有该颗粒外径的至少80％的直径，或者可具有大总体积的多个隔室。在没有互补结合分子的情况下，利用薄壳中空纳米粒子证明了亲水性染料与核酸的高效包封。该薄壳纳米粒子被证明能够抵抗渗透压，此一特征可归因于完全无缺陷、不透水的聚合物外壳。本申请案的聚合物纳米粒子可用于在各种领域中递送生物活性剂，包括药物递送及疫苗开发。

聚合物纳米粒子，特别是由可生物降解及生物兼容的聚合物如聚(乳酸-共-羟基乙酸)(PLGA)组成的纳米粒子在纳米医学研究中受到相当大的关注，因为该聚合物具有许多特征，包括生物兼容性、生物降解性，以及合成柔韧性。然而，由于该聚合物固有的疏水性，基于PLGA的纳米粒子仅限于在临床中输送不溶于水的化合物。亲水性及大分子货物在聚合物纳米粒子中的包封仍然是个挑战，因为聚合物倾向于形成的固体纳米球具有很少或没有可以携带亲水性及大分子货物的水性核心空间，例如siRNA。

有鉴于大分子包封在病毒形式的天然纳米粒子中是常见的，理想的纳米载体应该具有薄壳，且其包围大的水性空间可用于包装生物活性分子。该薄壳还较佳地为无缺陷且不透水的，以允许可靠的货物包封。

于一具体实施例中，提供一种治疗疾病的方法。该方法包含对有此需要的受试者施用能够与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及对该有此需要的受试者施用用于诱导抗原自细胞释放的手段。所述疾病的实例包括，但不限于，心血管疾病、癌症、自体免疫疾病，或感染。

本文进一步详细揭露了制备上述聚合物纳米粒子的方法。

通常，所述薄壳中空纳米粒子基于双乳化方法(double emulsion process)制备，其使用在其末端具有高对比度度极性的两亲聚合物。更具体而言，首先使用羧基端-PLGA在二氯甲烷(dichloromethane，DCM)中的溶液，在音波震荡(sonic dispersion)下中乳化含有货物的水相以形成乳液。随后使用流体震荡(fluidic dispersion)将由此形成的乳液在一外水相中乳化。

通过在双乳化方法中调节聚合物浓度及分散力，或使用具有预定长度及高对比度度极性(sharp polarity)的聚合物，上述制备方法可以提供中空聚合物纳米粒子，具有外径在30到600nm的间，例如，30-40nm与100-600nm。

基于水-油-水双重乳化方法制备所述纳米粒子，其中溶解在溶剂系统中的聚合物首先用于乳化水相。随后通过二级水相乳化该乳液。内水相及外水相可为任何极性溶液，例如水、乙酸，以及乙醇。该水相含有溶解的分子以调节该溶液的酸度与黏度，包括磷酸钠及碳酸氢钠。于一具体实施例中，水作为纳米粒子制备过程中的抗溶剂。

上述用于制备本申请案的聚合物纳米粒子的水-油-水双乳化方法具有两个关键特征；即，(i)通过具有固有高对比度度极性的聚合物(具有羧基末端基团的PLGA)进行不同相之间的乳化，而非使用接口活性剂，例如，维生素E-D-α-生育酚聚乙二醇琥珀酸酯以及聚(乙烯醇)，其可增强乳化能力并使聚合物壳厚度最小化，且在不使用接口活性剂材料的情况下具有更高的商业价值；(ii)第二乳化过程中使用微流化器或超声波处理进行受控流体分散，以平衡油相的均质化及在内水相中保持包封的货物。

通过上述方法制备的聚合物纳米粒子可作为药物递送、治疗诊断，以及疫苗开发应用的一种平台技术。它可以促进大量生物活性剂的递送，包括小分子、肽、核酸，以及蛋白质，以增强其治疗效力。该薄壳聚合物中空纳米粒子可用于包封生物活性剂，包括，但不限于，小分子、肽、蛋白质、核酸、成像剂、无机纳米粒子、有机纳米粒子，以及上述的任何组合。该平台的表面可任选地以功能分子部分体修饰，包括小分子、肽、蛋白质、核酸、成像剂、纳米粒子，用于不同的应用，例如长效药物递送、目标药物递送，以及抗原递送。

无需进一步详细说明，相信本领域技术人员基于以上描述可以最大程度地利用本发明。因此，以下具体实施例仅被解释为说明性的，并且不以任何方式限制本案的其余部分。本文引用的所有出版物皆通过引用方式并入。

实施例

聚合物纳米粒子的制备

根据包括以下步骤的实验流程生产薄壳聚合物纳米粒子：

1.在DCM中制备10mg/mL羧基端-PLGA聚合物。

2.在500μL的PLGA/DCM溶液中乳化50μL内水相，以形成第一乳液。探针在50％超声波振幅下持续超声波震荡30秒。

3.将第一乳液在5mL水溶液中乳化，并使用微流化器在受控流体剪切下分散该混合物以形成第二乳液。

4.于第二乳液中再加入30mL水溶液，并在35℃下蒸发该溶剂。

5.于通风橱中蒸发DCM 3小时，得到一溶液。

6.以超高速离心机以22k g离心35分钟，以从该溶液中分离颗粒。

7.将该颗粒再分散至所需溶液中。

聚合物纳米粒子的特征描述以及包封

通过采用上述步骤，制备平均直径为110.9nm的中空聚合物纳米粒子。基于通过纳米粒子追踪分析获得的参数导出该颗粒的壳厚度的统计平均值。基于总聚合物重量、PLGA密度，以及所得纳米粒子的数量，计算出纳米粒子的壳厚度具有16.5nm的统计平均值。出乎意料的是，某些聚合物纳米粒子的直径小于40nm。

发现该薄壳中空纳米粒子由于不透水的聚合物外壳而具有渗透阻力。在一测试中，将包封亲水性红色食用色素的100nm中空纳米粒子悬浮于从水至3X PBS的各种溶液中，渗透压的差异(在0到850Osmo/kg的间)不会导致中空纳米粒子释放它们的货物。在各自的溶液中作用10分钟后，于30,000g离心5分钟沉淀纳米粒子，得到的颗粒显示类似的微红色，表示亲水性染料保留在颗粒中。基于吸亮度方法检测上清液中释放的染料，结果显示没有可检测的讯号。该研究显示，尽管具有低于20nm的薄聚合物外壳，但该中空纳米粒子具有无缺陷壳，使得它们对渗透压具有抗性。

为了进一步证明薄壳中空纳米粒子的壳为固体而非流体，中空纳米粒子受到机械应力以破坏其壳。在低温EM观察中，观察到破碎的中空纳米粒子。破碎的中空纳米粒子的观察图像显示具有固体壳的中空球体，与在机械扰动下经历囊泡重组的聚合物囊泡形成对比。该固体聚合物外壳导致不透水性及渗透阻力，这些特征在已知的中空纳米结构中并未被观察到。

该薄壳聚合物纳米粒子平台的一个显著特征为其能够以大的内部水性空间封装大量亲水性货物。该薄壳中空纳米粒子可用于包封几种生物活性剂，包括siRNA以及免疫佐剂环二-GMP。出乎意料的是，对各种长度尺度的亲水性内容物达到了高包封效率，包括小分子(例如，磺基-cy5、环状二-GMP(cd-GMP)，以及环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(cGAMP))、肽(例如，卵白蛋白肽OTI(SIINFEKL)或OTII(AAHAEINEA))、核酸(例如，CpG-寡脱氧核苷酸、20聚体(20-mer)的单链DNA，以及20聚体(20-mer)的siRNA)，以及蛋白质(例如，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)以及CRISPR-Cas9核酸酶)，其成功地被封装，在该化合物的溶解度限度内具有超过30％的效率。例如，siRNA以50％的效率包封，最终装载产率为约1nmol/mg纳米粒子，以及环状二-GMP以37％的装载效率包封。使用装载siRNA的薄壳中空纳米粒子，可观察到表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的HeLa细胞中绿色荧光蛋白(GFP)基因的沉默。

聚合物纳米粒子与亲水性大分子的包封

进行测定以评估聚合物纳米粒子对两种亲水性大分子的包封效率，亦即核酸(染料标记的20聚体(20-mer)的单链DNA)以及蛋白质(染料标记的BSA)。

请参考图2。图2描绘了聚合物纳米粒子对核酸及蛋白质的包封效率。于本实施例中，使用染料标记的20聚体(20-mer)单链DNA(A；中)以及染料标记的BSA(A；右)证明了核酸与蛋白质的有效包封。在使纳米粒子造粒时，发现该粒子颗粒是黄色的(指示黄色FAM染剂标记)，而非空纳米粒子的白色颗粒(A；左)。荧光定量显示该纳米粒子意外地分别表现出核酸及蛋白质的包封效率为42％与35％。

使用cryoEM也能观察核酸及蛋白质的有效包封。虽然空颗粒在其水性核心中显示出平坦、均匀的纹理(图2B部分)，但是装载DNA的颗粒(图2C部分)以及装载BSA的颗粒(图2D部分)显示出高度颗粒状的纹理，这是在cryoEM观察下浓缩生物成分的特征。基于本具体实施例的8mM DNA以及50mg/mL BSA的装载浓度，装载DNA的纳米粒子含有约3500个DNA分子，装载BSA的纳米粒子含有约260个蛋白质。重要的是，从未有粒子实现这种核酸及蛋白质的高载量。实际上，已知的基于PLGA的纳米制剂始终显示非常差的核酸包封，并且必须使用聚阳离子聚合物来中和核酸上的负电荷以增强装载。例如，参见Shi等人，Angew Chem Int EdEngl,2011,50(31):7027-31；及Woodrow et al.,Nature Materials,2009,8(6):526-533。

上述这些结果显示，本申请案的薄壳聚合物纳米粒子出乎意料地表现出对于其天然可溶状态的亲水性大分子的高包封效率，亦即高装载效率，突显了薄壳中空纳米粒子的优点及独特性。

聚合物纳米粒子对于淋巴结中刺激免疫的干扰素基因刺激因子(STING)促效剂的包封及控制释放的影响

进行测定以评估聚合物纳米粒子对在淋巴结中刺激免疫的STING促效剂的包封及控制释放的影响。

图3描绘了聚合物纳米粒子对用于免疫刺激的STING促效剂的包封及控制释放的影响。于本实施例中，本平台用于疫苗开发。制备纳米粒子疫苗的主要技术挑战在于将抗原及佐剂可靠地结合在纳米级基质上。例如，参见Brannon-Peppas等人，Adv Drug DelivRev,2004,56(11):1649-59；以及Lima-Tenorio等人，Int J Pharm,2015,493(1-2):313-27。为了克服此一技术挑战，使用由可生物降解的聚合物，亦即PLGA，制备的薄壳聚合物中空纳米粒子包装高密度的功能性货物。

更具体地，使用双乳化方法制备直径在100至200nm的间的中空颗粒(图3A部分及图3B部分)。它们以约40％的效率有效地包封STING促效剂佐剂、环状二-GMP(cd-GMP)(图3C部分)，这是值得注意的，因为核酸及亲水性货物众所周知地难以包封在纳米粒子平台中。高封装效率为每个纳米粒子产生约2,000个STING促效剂分子。基于聚合物纳米粒子的STING促效剂纳米制剂从未被报告过。通过cryoEM检查显示这些中空纳米粒子中具有大的内核心，其造成cd-GMP的高装载效率(图3D部分)。在细胞内递送时，该中空纳米粒子的薄聚合物外壳由酸性pH触发以快速释放内部内容物(图3E部分)。

这些结果显示，该薄壳聚合物纳米粒子能够有效制备合成疫苗。

评估装载STING促效剂的纳米粒子对增强淋巴细胞激素同时使循环中细胞激素最小化

进行测定以评估装载STING促效剂的纳米粒子在增强淋巴细胞激素的同时使循环中细胞激素最小化。

图4揭示装载STING促效剂的纳米粒子在增强淋巴细胞激素的同时最小化循环中细胞激素。首先使用小鼠树突细胞株JAWSII在体外检测装载cd-GMP的纳米粒子的免疫活化。在以游离cd-GMP或cd-GMP纳米粒子作用24小时后，收集培养物上清液用于ELISA分析以定量TNF-α、IL-6，以及IFN-β的含量。与游离cd-GMP制剂相比，所述纳米粒子制剂更有效地引发TNF-α、IL-6，以及IFN-β的产生(图4A部分、图4B部分，以及图4C部分)。与等效剂量的游离cd-GMP相比，当与纳米粒子制剂一起作用时，细胞上的CD80表达也增强(图4D部分)。观察到纳米粒子使STING促效剂的佐剂活性(adjuvanticity)增强约30倍，这归因于纳米载体的细胞内递送增加。可以推断，游离的环二核苷酸不易进行膜渗透，并且可能不容易进入其细胞质目标。经纳米粒子包封后，通过粒子内吞作用增强细胞摄入，随后的细胞内释放促进cd-GMP进入细胞质，从而增强其免疫增效作用。

进一步将cd-GMP纳米粒子的免疫增效与小鼠体内游离cd-GMP进行比较。在足垫注射后48小时，收集引流的腘淋巴结用于IFN-β定量。观察到该纳米粒子制剂在淋巴结中诱导显著更高含量的IFN-β(图4E部分)，这对于适当的T细胞成熟是重要的。此外，还在足垫施用游离cd-GMP及cd-GMP纳米粒子后监测循环中TNF-α的含量，这是一种反应原性(reactogenicity)的指标。观察到该纳米粒子导致血清中TNF-α的含量显著降低，这反映了纳米粒子在淋巴系统中的分布。另一方面，该游离的cd-GMP诱导血清中TNF-α含量升高，这些小分子可以自由地扩散到血流中(图4F部分)。

这些结果显示，装载STING促效剂的纳米粒子有效地增强了用于淋巴结目标免疫增效作用的淋巴细胞激素。

基于细胞关联免疫佐剂的治疗方式

于一具体实施例中，本文所述的治疗套组及方法可用于治疗疾病，例如心血管疾病、癌症、自体免疫疾病，或感染。于一具体实施例中，本文所述的治疗套组及方法可用于癌症，例如口腔癌及咽癌(唇、舌、唾液腺、口腔底部、牙龈，以及其他口腔、鼻咽、扁桃体、口咽、下咽部，其他口腔/咽部)；消化系统的癌症(食道、胃、小肠、结肠与直肠、肛门、肛管与肛门直肠、肝脏、肝内胆管、胆囊、其他胆管、胰腺、腹膜后、腹膜、网膜与肠系膜、其他消化系统)、呼吸系统癌(鼻腔、中耳及鼻窦、喉、肺及支气管、胸膜、气管、纵隔与其他呼吸道)、间皮瘤的癌症、骨骼和关节，以及软组织，包括心脏；皮肤癌，包括黑色素瘤与其他非上皮性皮肤癌、卡波西氏肉瘤及乳腺癌、女性生殖系统癌(子宫颈、子宫体、子宫，卵巢、阴道、外阴，以及其他女性生殖器)、男性生殖系统的癌症(前列腺、睾丸、阴茎，以及其他男性生殖器)、泌尿系统癌(膀胱、肾及肾盂、输尿管、和其他泌尿器官)、眼睛与眼眶癌症、大脑及神经系统的癌症(大脑，以及其他神经系统)、内分泌系统的癌症(甲状腺及其他内分泌，包括胸腺)、淋巴瘤(霍奇金病与非霍奇金淋巴瘤)、多发性骨髓瘤以及白血病(淋巴细胞白血病、骨髓白血病、单核细胞白血病，以及其他白血病)。

于一具体实施例中，该免疫佐剂制剂包含包封佐剂的聚合物纳米粒子，且该聚合物纳米粒子可进一步包含：不透水的聚合物外壳，以及由该聚合物外壳包围的一或多个含水核心。于一较佳的具体实施例中，该佐剂包含MPLA、CpG、poly(I:C)、环状二核苷酸的变体、细胞质模式识别受体(例如环状二-GMP或环状GAMP)或干扰素基因刺激因子(STING)的促效剂。

请参考图5，其描述了基于肿瘤细胞相关免疫佐剂(装载cGAMP的纳米粒子)的治疗方式。于本申请案的一具体实施例中，将2’3’-cGAMP包封在聚合物中空纳米粒子内，以通过胞吞作用增强细胞内化。cGAMP为一种细胞质模式识别受体或干扰素基因刺激因子(STING)的促效剂，其活化TBK1/干扰素调节因子3(IRF3)/第1型干扰素(IFN)讯号传递。通过促进cGAMP与细胞的结合，该佐剂制剂准备(prime)抗原用于后续免疫处理。在通过一种用于诱导抗原释放的手段诱导细胞死亡的处理后，然后将该细胞碎片与来自佐剂制剂的外源递送佐剂一起处理，进而增强细胞杀伤的后天性免疫(图5)。

于一具体实施例中，该用于诱导抗原释放的手段包含化学试剂、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏，或其组合。

于一较佳的具体实施例中，所述化学试剂包含本领域已知的任何细胞毒性剂。例如，该细胞毒性剂包含单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F，MMAF)、米他汀(mertansine，DM1)、蒽环类药物(anthracycline)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、苯二氮平类药物(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟维司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、来曲唑(letrozole)、甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)、PTK787/ZK 222584、奥沙利铂(oxaliplatin)、亚叶酸钙(leucovorin)、雷帕霉素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib，

SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷化剂(alkylating agent)、烷基磺酸盐(alkylsulfonate)、氮丙啶(aziridines)、乙烯亚胺(ethylenimine)、甲基蜜胺(methylamelamine)、内酯(acetogenins)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡拉汀(callystatin)、CC-1065、隐藻菌素(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾植塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲怜胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、剌抱霉素(calicheamicin)、葱环类抗生素(dynemicin)、氯膦酸盐(clodronate)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatin chromophore)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酌酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、二甲叶酸(denopterin)、噪罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolonepropionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)、氨麸精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醒内酯(aceglatone)、醒怜酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿喃啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、倍曲布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、地怜酸胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、伊尔福尼辛(elformithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃坡霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓(gallium nitrate)、羟基脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocins)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索葱醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-鬼臼酸乙肼(2-ethylhydrazide)、甲基苄肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根霉素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三亚胺醌(triaziquone)、2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)、单端抱霉烯(trichothecene)、氨基甲酸乙酯(urethan)、长春碱酰胺(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甘露莫司汀(mannomustine)、二漠甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、双溴丙基哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿糖胞苷(arabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、类紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(doxetaxel)、氯芥苯丁酸(chloranbucil)、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、铂(platinum)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、双羟蒽醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、伊达曲杀(edatrexate)、道诺霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、截瘤达锭(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)、视黄醇(retinoid)、卡培他滨(capecitabine)，或其组合。

于一较佳的具体实施例中，所述光解剂通常为光动力疗法中使用的光敏剂，包含光卟啉(Photofrin)、拉泊芬钠(Laserphyrin)、氨基左旋糖酸(Aminolevulinic acid，ALA))、酞菁硅Pc 4(Silicon Phthalocyanine Pc 4)、间-四羟基苯基氯(m-tetrahydroxyphenylchlorin，mTHPC)、二氢卟酚e6(chlorin e6，Ce6)、奥美拉(Allumera)、氨基酮戊酸(Levulan)、替莫泊芬(Foscan)、美特维克(Metvix)、海克维克(Hexvix)、光克洛(Photochlor)、光敏(Photosens)、光瑞斯(Photrex)、亮美恩(Lumacan)、米索尼克(Visonac)、安菲尼克(Amphinex)、维替泊芬(Verteporfin)、罗他泊芬(Purlytin)、ATMPn、酞菁锌(Zincphthalocyanine，ZnPc)、原卟啉IX(Protoporphyrin IX，PpIX)、焦脱镁叶绿酸A(Pyropheophorbide a，PPa)、脱镁叶绿酸A(Pheophorbide a，PhA)，或其组合。

所述用于诱导抗原释放的手段可以在施用该免疫佐剂制剂之前或之后给予有需要的受试者。在该治疗过程中，用于诱导抗原释放的手段及免疫佐剂制剂可配制为二个独立的剂型，用于在不同时间施用。

或者，所述用于诱导抗原释放的手段可以与免疫佐剂制剂同时给予有需要的受试者。在该治疗过程中，用于诱导抗原从细胞释放的手段可以配制或包封在该免疫佐剂制剂中，作为一单剂型或二个独立剂型同时施用。例如，佐剂以及细胞毒性剂可以配制于纳米粒子中或与种抗体共轭结合。

为了证明治疗方式，将HeLa细胞与荧光标记的cGAMP纳米粒子一起作用(图6(a)部分)。在作用24小时后细胞摄入纳米粒子后，使该细胞在化疗药物顺铂的处理下起囊泡并产生细胞碎片，如图5所示。为了证明佐剂纳米粒子与癌细胞囊泡的关联，以共轭焦显微镜分析收集的细胞碎片，并以荧光活化细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，FACS)定量。结果显示细胞碎片含有大量装载佐剂的纳米粒子(图6(b)部分、图6(c)部分)。

然后收集癌细胞碎片并与JAWSII小鼠树突细胞(DC)株一起作用以检查它们的免疫原性。将与游离cGAMP或cGAMP纳米粒子作用24小时的HeLa细胞以顺铂处理，并收集所得的细胞碎片以刺激树突细胞(DC)。作用24小时后收集树突细胞(DC)并研究树突细胞(DC)活化标记CD86与CD80。通过FACS分析证明免疫原性细胞碎片对DC的体外活化。通过ELISA分析TNF-α与IFN-β来评估活化的树突细胞(DC)的细胞激素图谱。结果显示，相较于游离cGAMP，与cGAMP纳米粒子一起作用显著增加了CD80与CD86的含量，并提高了树突细胞(DC)分泌的TNF-α及IFN-β，而游离cGAMP几乎没有与细胞结合的能力(图7)。特别是，一种被认为是塑造后天性细胞免疫关键因子的第I型IFN[7]，IFN-β通过佐剂制剂被提高了100多倍。

为了验证所述纳米粒子佐剂制剂的细胞关联效应，将B6小鼠以皮下接种B16-OVA肿瘤。使用全身成像、流式细胞仪分析，以及荧光显微镜验证B16细胞中纳米粒子介导的佐剂保留。染料标记的STING促效剂(2'-[DY-547]-AHC-c-diGMP)以其游离形式或纳米粒子形式施用在肿瘤内，并于24小时后检查。观察到干扰素基因刺激因子(STING)促效剂的纳米粒子制剂良好地保留在该肿瘤内(图8(a)部分)。在从解剖的肿瘤中萃取癌细胞后，并从流式细胞仪及共轭焦显微镜确认了干扰素基因刺激因子(STING)促效剂显著地与该癌细胞结合(图8(b)部分、图8(c)部分)。相较之下，在游离佐剂施用时观察到肿瘤内或癌细胞内几乎没有佐剂保留。

为了研究治疗方式的体内效率，将B6小鼠以皮下接种B16-OVA肿瘤。当肿瘤为可触知时，于顺铂化疗(CTTP)化疗之前，先以游离cGAMP或cGAMP纳米粒子预处理这些肿瘤。在肿瘤内施用佐剂后24小时，对小鼠肿瘤内进行顺铂注射给药以诱导细胞死亡(图9(a)部分)。这两组分别命名为cGAMP+顺铂(cGAMP+CTTP)以及纳米粒子+顺铂(NP+CTTP)，以区分游离cGAMP及cGAMP纳米粒子的使用。针对对照组，还制备了不接受治疗的荷瘤小鼠(安慰剂)、仅施用顺铂(仅CTTP)，以及仅施用cGAMP纳米粒子(仅纳米粒子)。针对cGAMP的施用，在50μL溶液中施用2.5μg佐剂。针对顺铂的施用，在100μL溶液中施用235μg的该化学药物。在不同的治疗之后，随时间监测肿瘤体积。在NP+CTTP组中，50％的动物(10个中的5个)显示出完全的肿瘤消退。相较之下，没有其他组别具有任何完全消退的肿瘤(图9(b)部分、图9(c)部分)。值得注意的是，仅CTTP组及仅NP组治疗皆未诱导肿瘤消退，表示该组合诱导了协同效应。此外，cGAMP+CTTP动物皆未显示肿瘤完全消退，表示NP+CTTP组中的协同效应可归因于癌细胞内增强的佐剂保留。使用来自NP+CTTP组的无肿瘤存活小鼠，其中4只在第60天以B16-OVA细胞再次攻击，并与之前没有肿瘤攻击及治疗的动物进行比较。观察到来自NP+CTTP组的存活动物中肿瘤生长显著降低，这表示这些动物已获得后天性抗癌免疫力(图9(d)部分)。这些结果证实，通过应用癌细胞关联免疫佐剂，由于促进后天性免疫，可以显著增强随后的抗癌治疗的功效。

于本申请案的一具体实施例中，该免疫佐剂制剂包含与小分子、肽、抗体、适体、糖分子部分体、聚合物或其组合共轭结合的佐剂，用于识别并结合于细胞表面上的分子部分体。较佳地，抗体包含免疫球蛋白分子、Fv、双硫键连接的Fv、单株抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含二个Fab片段并由一双硫键于铰链区连接的二价片段、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由一抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)，或单链抗体。

于一较佳的具体实施例中，CpG-FAM与抗体共轭结合，用于致病细胞结合。针对HeLa细胞上高表达的CD44的抗CD44抗体被用于与佐剂共轭结合。首先将1mg抗体与磺基-SMCC以1：20的摩尔比在1X PBS中混合24小时。作用后，使用截留分子量(molecular weightcut off，MWCO)为30kDa的离心过滤器纯化功能化抗体，然后将抗体与含有末端半胱氨酸基团的CpG-ODN混合。将FAM染剂附着于CpG-ODN以利观察(图10)。作用24小时后，使用截留分子量(MWCO)为30kDa的离心过滤器收集CpG-共轭结合的抗体。

接着，通过将游离CpG-FAM以及与抗CD44抗体共轭结合的CpG-FAM与HeLa细胞一起作用3小时，以评估CpG与HeLa细胞的关联。作用后，洗涤细胞并基于FAM荧光评估CpG结合。在荧光显微镜下观察到抗CD44抗体-CpG共轭结合物在HeLa细胞单层产生更高的荧光保留(图11A部分)。在分离细胞并于流式细胞仪分析后，抗CD44抗体共轭结合物组别观察到增强的CpG/癌细胞结合，证明佐剂成功的标定致病细胞(图11B部分、图11C部分)。

于佐剂结合后，然后以细胞毒性剂多柔比星处理HeLa细胞，以诱导细胞死亡并产生细胞碎片。在多柔比星处理20小时后，收集细胞碎片并喂食给JAWSII小鼠树突细胞。然后在与细胞碎片作用20小时后评估JAWSII细胞的活化标记物，如CD80及CD86。观察到以抗CD44抗体共轭结合的CpG处理的HeLa细胞的碎片触发了最高含量的成熟标记物(图12)。

于本申请案的另一具体实施例中，将CpG-FAM包封入聚合物纳米粒子中以增强肿瘤细胞摄取。采用双乳化方法制备装载CpG-FAM的纳米粒子。首先将20mg/mL的CpG溶于50μL的100mM磷酸盐缓冲液中，然后在含有50mg/mL PLGA(10,000Da，羧基端，50:50聚乳酸：乙交酯)的500μL乙酸乙酯中乳化。然后将所得到的油包水乳液在5mL的10mM磷酸盐缓冲液中乳化。作用后，将该水包油包水乳液倒入10mL的10mM磷酸盐缓冲液中，在氮气吹扫下蒸发乙酸乙酯。在溶剂蒸发1小时后，使用截留分子量(MWCO)为30kDa的离心过滤器收集纳米粒子包封的CpG。使用CryoEM验证了成功制备小于100nm的含有CpG的纳米粒子(图13)。

接着，通过将游离CpG-FAM与纳米粒子包封的CpG-FAM及HeLa细胞一起作用24小时，以评估CpG与HeLa细胞的关联。作用后，洗涤细胞并基于FAM荧光评估CpG结合。在荧光显微镜下观察到纳米粒子包封的CpG在HeLa细胞单层产生更高的荧光保留(图14A部分)。在分离细胞并于流式细胞仪分析后，纳米粒子包封的CpG组别观察到增强的CpG/癌细胞结合，证明该佐剂成功的标定细胞(图14B部分、图14C部分)。

在佐剂结合后，然后以细胞毒性剂多柔比星处理HeLa细胞，以诱导细胞死亡并产生细胞碎片。在多柔比星处理20小时后，收集细胞碎片并喂食给JAWSII小鼠树突细胞。然后在与细胞碎片作用20小时后评估JAWSII细胞的活化标记物，如CD80以及CD86。观察到以纳米粒子包封的CpG处理的HeLa细胞的碎片触发了最高含量的成熟标记物(图15)。

于本申请案的另一具体实施例中，该用于诱导抗原释放的手段可以与该免疫佐剂制剂同时施用于该有需要的受试者。或者，可以在施用该免疫佐剂制剂之前或之后将该用于诱导抗原释放的手段施用于该有需要的受试者。

于一具体实施例中，将柔红霉素与cd-GMP STING促效剂一起包封至纳米粒子中，以同时实现细胞内佐剂递送，同时引发细胞死亡。采用双乳化方法制备纳米粒子共包封柔红霉素及cd-GMP。首先以100mM磷酸盐缓冲液制备含有10mg/mL柔红霉素与10mg/mL cd-GMP的溶液，并将50μL溶液在500μL的含有50mg/mL PLGA(10,000Da，羧基端，50:50聚乳酸：乙交酯)的乙酸乙酯中乳化。然后将所得到的油包水乳液在5mL的10mM磷酸盐缓冲液中乳化。作用后，将水包油包水乳液倒入10mL的10mM磷酸盐缓冲液中，在氮气吹扫下蒸发乙酸乙酯。在溶剂蒸发1小时后，使用截留分子量(MWCO)为30kDa的离心过滤器收集柔红霉素/cd-GMP纳米粒子。作为对照组，在不存在cd-GMP的情况下以20mg/mL柔红霉素作为内水相制备包封柔红霉素的纳米粒子。通过cryoEM验证了成功制备小于100nm的含有柔红霉素与cd-GMP的纳米粒子(图16)。

然后，以三种不同的制剂治疗CT26结肠癌细胞：1)仅柔红霉素纳米粒子(DR NP)；2)游离cd-GMP与柔红霉素纳米粒子(cd-GMP+DR NP)；3)共包封柔红霉素以及cd-GMP的纳米粒子((cd-GMP+DR)NP。于2mL的CT26培养物中加入10μg柔红霉素与10μg cd-GMP。处理3小时后，收集细胞碎片并喂给JAWSII小鼠树突细胞。然后在与细胞碎片作用24小时后评估JAWSII细胞的活化标记物，如CD80与CD86。观察到以共包封柔红霉素及cd-GMP的纳米粒子处理的CT26细胞的碎片触发了最高含量的成熟标志物，如CD80以及CD86(图17)。

还评估来自JAWSII细胞上清液的IFN-β，其为T细胞活化及扩增的主要淋巴细胞活化讯号。观察到以共包封柔红霉素及cd-GMP的纳米粒子处理的CT26细胞的碎片诱导了JAWSII细胞中最高含量的IFN-β产生(图18)。这些结果显示，对细胞共同递送细胞毒性剂以及免疫佐剂的佐剂制剂可以诱导具有显著免疫原性的细胞碎片。

综上所述，以上描述证明包含免疫佐剂制剂的治疗套组能够促进针对特定细胞的免疫反应。基于细胞关联免疫佐剂也显示了一种新的治疗方式，其能够增强对患病细胞的后天性免疫。该方法及治疗套组适用于诱导细胞碎片及抗原释放的任何现有治疗，包括，但不限于，化学疗法、放射疗法、光热疗法、免疫疗法，以及外科手术干预。还考虑了将免疫佐剂与致病细胞相关联的其他方法，包括，但不限于，促进免疫佐剂进入细胞内、膜嵌入，以及表面结合的方法。该免疫佐剂还可包括，但不限于，MPLA、CpG、聚(I:C)、环状二核苷酸的变体，以及其他免疫刺激分子。还考虑了包含免疫佐剂制剂以及用于诱导抗原释放的手段的与细胞相关联的治疗套组，例如，含有cGAMP与化学药物的纳米粒子。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以对所揭露的具体实施例进行各种修改及变化。说明书与示例目的在于仅被视为示例性的，本揭露内容的真实范围由所附的申请专利范围及其均等范围指示。

参考文献

除非本说明书另有明确说明，否则以下列出并在此引用的参考文献通过引用结合至本说明书中。

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2.Ott,P.A.,et al.,An immunogenic personal neoantigen vaccine forpatients with melanoma.Nature,2017.547(7662):p.217-+.

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4.Fu,J.,et al.,STING agonist formulated cancer vaccines can cureestablished tumors resistant to PD-1blockade.Sci Transl Med,2015.7(283):p.283ra52.

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7.Hertzog,P.J.,Overview.Type I interferons as primers,activators andinhibitors of innate and adaptive immune responses.Immunology and CellBiology,2012.90(5):p.471-473.

Claims (42)

1.一种治疗套组，包含：

能与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及

用于诱导抗原自细胞释放的手段。

2.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂包含包封佐剂的聚合物纳米粒子，其中该聚合物纳米粒子包含：

不透水的聚合物外壳，以及

由所述聚合物外壳包围的一或多个含水核心。

3.如权利要求2的治疗套组，其中所述聚合物外壳的厚度小于25nm，且所述聚合物纳米粒子的外径为30-600nm。

4.如权利要求2的治疗套组，其中用于诱导抗原自细胞释放的所述手段被包封在所述聚合物纳米粒子中。

5.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂包含MPLA、CpG，poly(I:C)，或环状二核苷酸的变体。

6.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂包含细胞质模式识别受体或干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)的促效剂。

7.如权利要求6的治疗套组，其中所述促效剂为环状二-鸟苷单磷酸(di-GMP)或环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(GAMP)。

8.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂包含佐剂，所述佐剂与用于识别并结合于细胞表面上一分子部分体的小分子、肽、抗体、适体、糖分子部分体、聚合物或其组合共轭结合。

9.如权利要求8的治疗套组，其中所述抗体为免疫球蛋白分子、Fv、双硫键连接的Fv、单株抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含二个Fab片段并由双硫键于铰链区连接的二价片段、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由一抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(complementarity determining region，CDR)，或单链抗体。

10.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂与能够与细胞膜结合的一分子共轭结合。

11.如权利要求10的治疗套组，其中所述分子为亲脂性的或两亲性的。

12.如权利要求11的治疗套组，其中亲脂性分子包含脂肪酸链、胆固醇，或磷脂。

13.如权利要求11的治疗套组，其中两亲分子包含脂质-聚乙二醇(lipid-PEG)共轭结合物。

14.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂包含与纳米微粒或细胞穿透肽共轭结合的佐剂，所述纳米微粒或细胞穿透肽用于细胞内递送。

15.如权利要求14的治疗套组，其中所述细胞穿透肽包含HIV-1TAT肽(GRKKRRQRRRPPQ)、渗透肽(RQIKIWFQNRRMKWKK)、聚精氨酸(Rn)，或输送蛋白(GWTLNSAGYLLGINLKALAALAKKIL)。

16.如权利要求1的治疗套组，其中用于诱导抗原释放的手段包含化学试剂、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏，或其组合。

17.如权利要求16的治疗套组，其中所述化学试剂包含细胞毒性剂。

18.如权利要求17的治疗套组，其中所述细胞毒性剂包含单甲基澳瑞他汀E(Monomethyl auristatin E，MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F，MMAF)、米他汀(mertansine，DM1)、蒽环类药物(anthracycline)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、苯二氮平类药物(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟维司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、来曲唑(letrozole)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)、PTK787/ZK 222584、奥沙利铂(oxaliplatin)、亚叶酸钙(leucovorin)、雷帕霉素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib，

SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷化剂(alkylatingagent)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonate)、氮丙啶(aziridines)、乙烯亚胺(ethylenimine)、甲基蜜胺(methylamelamine)、内酯(acetogenins)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡拉汀(callystatin)、CC-1065、隐藻菌素(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾植塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲怜胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、剌抱霉素(calicheamicin)、葱环类抗生素(dynemicin)、氯膦酸盐(clodronate)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatin chromophore)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酌酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、二甲叶酸(denopterin)、噪罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)、氨麸精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醒内酯(aceglatone)、醒怜酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿喃啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、倍曲布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、地怜酸胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、伊尔福尼辛(elformithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃坡霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓(gallium nitrate)、羟基脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocins)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索葱醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-鬼臼酸乙肼(2-ethylhydrazide)、甲基苄肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根霉素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三亚胺醌(triaziquone)、2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)、单端抱霉烯(trichothecene)、氨基甲酸乙酯(urethan)、长春碱酰胺(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甘露莫司汀(mannomustine)、二漠甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、双溴丙基哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿糖胞苷(arabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、类紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(doxetaxel)、氯芥苯丁酸(chloranbucil)、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、铂(platinum)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、双羟蒽醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、伊达曲杀(edatrexate)、道诺霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、截瘤达锭(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)、视黄醇(retinoid)、卡培他滨(capecitabine)，或其组合。

19.如权利要求16的治疗套组，其中所述光解剂包含光卟啉(Photofrin)、拉泊芬钠(Laserphyrin)、氨基左旋糖酸(Aminolevulinic acid，ALA)、酞菁硅Pc 4(SiliconPhthalocyanine Pc 4)、间-四羟基苯基氯(m-tetrahydroxyphenylchlorin，mTHPC)、二氢卟酚e6(chlorin e6，Ce6)、奥美拉(Allumera)、氨基酮戊酸(Levulan)、替莫泊芬(Foscan)、美特维克(Metvix)、海克维克(Hexvix)、光克洛(Photochlor)、光敏(Photosens)、光瑞斯(Photrex)、亮美恩(Lumacan)、米索尼克(Visonac)、安菲尼克(Amphinex)、维替泊芬(Verteporfin)、罗他泊芬(Purlytin)、ATMPn、酞菁锌(Zinc phthalocyanine，ZnPc)、原卟啉IX(Protoporphyrin IX，PpIX)、焦脱镁叶绿酸A(Pyropheophorbide a，PPa)、脱镁叶绿酸A(Pheophorbide a，PhA)，或其组合。

20.如权利要求1的治疗套组，其中所述免疫佐剂制剂与用于诱导抗原自细胞释放的手段是以单剂量配制。

21.一种治疗疾病的方法，包含：

对有此需要的受试者施用能够与细胞物理结合的免疫佐剂制剂；以及

对所述有此需要的受试者施用用于诱导抗原自细胞释放的手段。

22.如权利要求21的方法，进一步包含：

将佐剂包封于聚合物纳米粒子中，其中该聚合物纳米粒子包含：

不透水的聚合物外壳，以及

由该聚合物外壳包围的一或多个含水核心。

23.如权利要求21的方法，其中用于诱导抗原释放的所述手段是于施用所述免疫佐剂制剂之前或之后施用于所述有此需要的受试者。

24.如权利要求21的方法，其中用于诱导抗原释放的所述手段是与所述免疫佐剂制剂同时给予所述有此需要的受试者。

25.如权利要求24的方法，进一步包含：

将用于诱导抗原自细胞释放的所述手段包封于所述免疫佐剂制剂中。

26.如权利要求21的方法，其中所述免疫佐剂制剂包含MPLA、CpG，poly(I:C)，或环状二核苷酸的变体。

27.如权利要求21的方法，其中所述佐剂包含细胞质模式识别受体或干扰素基因刺激因子(STING)的促效剂。

28.如权利要求21的方法，其中所述促效剂为环状二-鸟苷单磷酸(di-GMP)或环状鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸(GAMP)。

29.如权利要求21的方法，进一步包含：

将佐剂与识别并结合于细胞表面上一分子部分体的小分子、肽、抗体、适体、糖分子部分体、聚合物或其组合共轭结合，以形成所述免疫佐剂制剂。

30.如权利要求29的方法，其中所述抗体为免疫球蛋白分子、Fv、双硫键连接的Fv、单株抗体、scFv、嵌合抗体、单结构域抗体、CDR移植抗体、双抗体、人源化抗体、多特异性抗体、Fab、双重特异性抗体、Fab’片段、双特异性抗体、F(ab’)2片段、包含二个Fab片段并由双硫键于铰链区连接的二价片段、由VH及CH1结构域组成的Fd片段、由一抗体的单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段、dAb片段、分离的互补决定区(CDR)，或单链抗体。

31.如权利要求21的方法，进一步包含：

将佐剂与能够与细胞膜结合的一分子共轭结合。

32.如权利要求31的方法，其中所述分子为亲脂性的或两亲性的。

33.如权利要求32的方法，其中亲脂性分子包含脂肪酸链、胆固醇，或磷脂。

34.如权利要求32的方法，其中两亲分子包含脂质-聚乙二醇(lipid-PEG)共轭结合物。

35.如权利要求21的方法，进一步包含：

配制具有纳米粒子或细胞穿透肽的佐剂，所述纳米粒子或细胞穿透肽用于细胞内递送。

36.如权利要求35的方法，其中所述细胞穿透肽包含HIV-1TAT肽(GRKKRRQRRRPPQ)、渗透肽(RQIKIWFQNRRMKWKK)、聚精氨酸(Rn)，或输送蛋白(GWTLNSAGYLLGINLKALAALAKKIL)。

37.如权利要求21的方法，其中用于诱导抗原释放的手段包含化学试剂、生物制剂、光照射、光解剂、机械破坏，或其组合。

38.如权利要求37的方法，其中所述化学试剂包含细胞毒性剂。

39.如权利要求38的方法，其中所述细胞毒性剂包含单甲基澳瑞他汀E(Monomethylauristatin E，MMAE)、单甲基澳瑞他汀F(Monomethyl auristatin F，MMAF)、米他汀(mertansine，DM1)、蒽环类药物(anthracycline)、吡咯并苯并二氮杂(pyrrolobenzodiazepine)、α-鹅膏蕈碱(α-amanitin)、微管蛋白裂解素(tubulysin)、苯二氮平类药物(benzodiazepine)、厄洛替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)、氟维司群(fulvestrant)、舒尼替尼(sunitinib)、来曲唑(letrozole)、甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)、PTK787/ZK 222584、奥沙利铂(oxaliplatin)、亚叶酸钙(leucovorin)、雷帕霉素(rapamycin)、拉帕替尼(lapatinib)、洛那法尼(lonafarnib，

SCH 66336)、索拉非尼(sorafenib)、吉非替尼(gefitinib)、AG1478、AG1571、烷化剂(alkylatingagent)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonate)、氮丙啶(aziridines)、乙烯亚胺(ethylenimine)、甲基蜜胺(methylamelamine)、内酯(acetogenins)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、卡拉汀(callystatin)、CC-1065、隐藻菌素(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾植塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑制素(spongistatin)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯怜酸胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆留醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲怜胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)、卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、剌抱霉素(calicheamicin)、葱环类抗生素(dynemicin)、氯膦酸盐(clodronate)、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新抑癌蛋白生色团(neocarzinostatin chromophore)、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、方文线菌素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正白氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酌酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)、二甲叶酸(denopterin)、噪罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫代鸟嘌呤(thioguanine)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、二脱氧尿苷(dideoxyuridine)、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、伊诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈膜斯酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)、氨麸精(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醒内酯(aceglatone)、醒怜酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)、恩尿喃啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、倍曲布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、地怜酸胺(defofamine)、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、伊尔福尼辛(elformithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃坡霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓(gallium nitrate)、羟基脲(hydroxyurea)、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocins)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、喷司他丁(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索葱醌(losoxantrone)、鬼臼酸(podophyllinic acid)、2-鬼臼酸乙肼(2-ethylhydrazide)、甲基苄肼(procarbazine)、雷佐生(razoxane)、根霉素(rhizoxin)、西佐喃(sizofiran)、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)、三亚胺醌(triaziquone)、2,2’,2”-三氯三乙胺(2,2’,2”-trichlorotriethylamine)、单端抱霉烯(trichothecene)、氨基甲酸乙酯(urethan)、长春碱酰胺(vindesine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、甘露莫司汀(mannomustine)、二漠甘露醇(mitobronitol)、二溴卫矛醇(mitolactol)、双溴丙基哌嗪(pipobroman)、甲托辛(gacytosine)、阿糖胞苷(arabinoside)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、塞替派(thiotepa)、类紫杉醇(taxoid)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(doxetaxel)、氯芥苯丁酸(chloranbucil)、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、巯嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、长春碱(vinblastine)、铂(platinum)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、米托蒽醌(mitoxantrone)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、双羟蒽醌(novantrone)、替尼泊苷(teniposide)、伊达曲杀(edatrexate)、道诺霉素(daunomycin)、氨喋呤(aminopterin)、截瘤达锭(xeloda)、伊班膦酸(ibandronate)、拓扑异构酶抑制剂(topoisomerase inhibitor)、二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylornithine，DMFO)、视黄醇(retinoid)、卡培他滨(capecitabine)，或其组合。

40.如权利要求37的方法，其中所述光解剂包含光卟啉(Photofrin)、拉泊芬钠(Laserphyrin)、氨基左旋糖酸(Aminolevulinic acid，ALA))、酞菁硅Pc 4(SiliconPhthalocyanine Pc 4)、间-四羟基苯基氯(m-tetrahydroxyphenylchlorin，mTHPC)、二氢卟酚e6(chlorin e6，Ce6)、奥美拉(Allumera)、氨基酮戊酸(Levulan)、替莫泊芬(Foscan)、美特维克(Metvix)、海克维克(Hexvix)、光克洛(Photochlor)、光敏(Photosens)、光瑞斯(Photrex)、亮美恩(Lumacan)、米索尼克(Visonac)、安菲尼克(Amphinex)、维替泊芬(Verteporfin)、罗他泊芬(Purlytin)、ATMPn、酞菁锌(Zinc phthalocyanine，ZnPc)、原卟啉IX(Protoporphyrin IX，PpIX)、焦脱镁叶绿酸A(Pyropheophorbide a，PPa)、脱镁叶绿酸A(Pheophorbide a，PhA)，或其组合。

41.如权利要求21的方法，其中是通过选自由下列所组成的群组的至少一种模式对所述受试者施用：肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹腔内、关节囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑室内、脑室内、颅内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸腔内、子宫内、膀胱内、推注、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内，以及透皮。

42.如权利要求21的方法，其中所述疾病为心血管疾病、癌症、自体免疫疾病，或感染。

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