CN111713403A - 一种玉米单倍体幼苗加倍方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玉米单倍体幼苗加倍方法。本发明提供了一种植物单倍体幼苗加倍方法，包括以下步骤：1)将生长至1‑4叶期植物单倍体幼苗的根部在鬼臼毒素溶液中浸泡，得到处理后的植物幼苗；2)将所述处理后的植物幼苗移栽到大田，实现植物单倍体幼苗加倍。本发明所提供的玉米单倍体幼苗加倍技术能显著地提高玉米单倍体的散粉率，散粉率高达70％以上，远远高于对照的散粉率(一般10％左右)。此方法使用的药剂鬼臼毒素挥发性弱，操作人员只需带一次性手套和口罩即可操作；同时采用拱棚或露地育苗移栽的办法进行单倍体加倍，不依赖于实验室操作，适宜规模化批量生产双单倍体。

Description

一种玉米单倍体幼苗加倍方法

技术领域

本发明涉及农业植物育种领域，更具体地，涉及一种玉米单倍体幼苗加倍方法。

背景技术

玉米已经是我国种植面积最大和总产最高的粮食作物，目前生产上应用的玉米品种几乎全部为自交系组配而成的杂交种，在长期的实践中,玉米育种工作者都有这样的共识：“难在选系,重在组配,中心是配合力问题”。传统系谱法选育自交系采用连续自交的办法，从组材到稳定至少需要8代以上，而通过诱导单倍体再加倍的办法，两代就高度纯合稳定，称之为双单倍体育种技术，因为它具有选系稳定快并且纯合度高、组配的组合用于测试结果准确、项目管理简单等优点，非常适合商业化育种。

因为单倍体只有一套染色体组，一般雌穗较正常、可抽丝，授粉后可结实，但大部分材料雄穗败育、无花药或花药干瘪，不能正常散粉，必须进行化学加倍处理才能满足育种需求。目前加倍方法主要有自然加倍、切芽尖、注射生长点、幼胚培养等，自然加倍效率偏低，而切芽尖、注射生长点和幼胚培养技术需要非常熟练，而且在加倍的过程中要用到秋水仙素，该药剂对人的毒性大，操作时需十分小心。

因此，探索一种操作方法简单、加倍效率高、适宜规模化操作的方法显得非常有意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物单倍体幼苗加倍方法。

本发明提供的方法，包括以下步骤：

1)将生长至1-4叶期植物单倍体幼苗的根部在鬼臼毒素溶液中浸泡，得到处理后的植物幼苗；

2)将所述处理后的植物幼苗移栽到大田，实现植物单倍体幼苗加倍。

本发明还有一个目的是提供一种提高植物散粉率的方法。

本发明提供的方法，包括以下步骤：

1)将生长至1-4叶期植物单倍体幼苗的根部在鬼臼毒素溶液中浸泡，得到处理后的植物幼苗；

2)将所述处理后的植物幼苗移栽到大田，实现提高植物散粉率。

上述方法中，所述鬼臼毒素溶液的浓度为0.001-1mg/ml；进一步优选所述鬼臼毒素溶液的浓度为0.05mg/ml。

上述鬼臼毒素溶液的溶质为鬼臼毒素，制备方法如下：将0.1g鬼臼毒素(百灵威科技有限公司，产品编号：131142)溶解于100ml 95％乙醇水溶液，得到鬼臼毒素母液；再取10ml母液用纯净水稀释至目的浓度如0.05mg/ml。

上述方法中，所述浸泡的时间为1-10小时；进一步优选为，所述浸泡的时间为5小时。

进一步地，在本发明的方法所述浸泡步骤中，根部白色部分全部浸泡在溶液中，叶片绿色部分全部露在溶液外面。

上述方法中，所述植物为单子叶植物，在本发明的实施例中采用玉米为例。

上述方法在提高植物单倍体幼苗加倍效率中的应用也是本发明保护的范围；

或上述方法在促进植物单倍体幼苗加倍中的应用也是本发明保护的范围；

或上述方法在提高植物散粉率中的应用也是本发明保护的范围。

上述方法中的鬼臼毒素溶液在提高植物单倍体幼苗加倍效率中的应用也是本发明保护的范围；

或上述方法中的鬼臼毒素溶液在促进植物单倍体幼苗加倍中的应用也是本发明保护的范围；

或，上述方法中的鬼臼毒素溶液提高植物散粉率率中的应用也是本发明保护的范围。

上述实现植物单倍体幼苗加倍或促进植物单倍体幼苗加倍体现在提高植物单倍体加倍效率，上述提高植物单倍体加倍效率具体体现在提高植物散粉率。

上述提高植物散粉率为采用上述方法得到的植物散粉率高于不加入鬼臼毒素溶液浸泡处理的方法得到的植物散粉率。

由于在该方法中，所有操作均在田间操作，不需要实验室设备，加倍效果好，具有较好的应用前景。

本发明所提供的玉米单倍体幼苗加倍技术能显著地提高玉米单倍体的散粉率，散粉率高达70％以上，远远高于对照的散粉率(一般10％左右)。此方法使用的药剂鬼臼毒素挥发性弱，操作人员只需带一次性手套和口罩即可操作；同时采用拱棚或露地育苗移栽的办法进行单倍体加倍，不依赖于实验室操作，适宜规模化批量生产双单倍体。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售、种子均可通过用诱导系授粉并挑选出来，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下面实施例中的玉米单倍体籽粒按照如下方法获得：

1、玉米单倍体籽粒的培育

以农大高诱1号(李国良,苏俊,李春霞,龚士琛,宋锡章,阎淑琴,扈光辉,王明泉.农大高诱1号对玉米不同种质和世代单倍体诱导频率的研究[J].玉米科学,2008(05):3-6)为父本，伟科702(河南金苑种业股份有限公司)做母本进行杂交，灌浆结束后收获果穗，挑选籽粒顶部紫顶胚无色的籽粒，作为似单倍体籽粒。

2、玉米单倍体籽粒的鉴定

将上述似单倍体籽粒用如下1)或2)的方法鉴定，得到农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒：

1)、遗传标记鉴定

将似单倍体籽粒精细播种，从2～3叶期至拔节期根据幼苗长势、植株高度、叶片长度、叶片颜色以及叶片着生角度等即可确认单倍体，具体方法记载在如下文献中:李国良,苏俊,李春霞,龚士琛,宋锡章,阎淑琴,扈光辉,王明泉.农大高诱1号对玉米不同种质和世代单倍体诱导频率的研究[J].玉米科学,2008(05):3-6。

2)、细胞学鉴定

在似单倍体籽粒播种生长至幼芽时切取根尖进行细胞学压片,观察染色体数目。切取玉米根尖2-3mm,放到饱和的对二氯苯水溶液中，浸泡3-4h,取出用卡诺固定液(95％乙醇：冰醋酸＝3：1)固定24h。转入70％的酒精,4℃冰箱中保存。用ddH2O清洗数次，加入纤维素酶(2％)和果胶酶(0.5％)的混合物，在28℃温箱中进行解离4～5h。压片，在显微镜下观察染色体数目，并拍照。

正常的玉米染色体数为2n＝20,单倍体的染色体数为n＝10。

实施例1、玉米单倍体加倍方法

本实施例所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1、播种育苗

冬季11月上旬，在海南省三亚市崖州区南滨农场育种基地，取960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒点播在用河沙为介质的市售96孔育苗盘中育苗，河沙需过筛，剔除石块，播种深度为2cm，960粒单倍体籽粒共播种10苗盘。每两排育苗盘铺设一条微喷带，播种后立即浇透水；以后每天早上喷水2分钟，保持河沙湿润，得到单倍体幼苗；

2、单倍体加倍

当3叶期时上午取含有单倍体幼苗的育苗盘用水冲洗河沙，小心取出单倍体幼苗，切忌弄断幼苗主根，用清水清洗干净控干，每50株幼苗用尼龙草捆成束，码放在50mm*25mm*60mm塑料盒中，放置在背阴处，有部分单倍体籽粒没有出苗，淘汰了部分苗龄太小的单倍体苗，共得到900棵单倍体幼苗，每个塑料盒可装900棵幼苗。

0.05mg/ml鬼臼毒素溶液配制：将0.1g鬼臼毒素(百灵威科技有限公司，产品编号：131142)溶解于100ml 95％乙醇水溶液，得到鬼臼毒素母液；再取10ml鬼臼毒素母液加入纯净水200ml稀释至浓度为0.05mg/ml。

上午9点将0.05mg/ml鬼臼毒素溶液从塑料盒一角倒入，使鬼臼毒素溶液浸没所有单倍体幼苗根部，液面在根的白色和叶片绿色交界处最为适宜，常温下浸泡5小时，得到处理后的幼苗。

3、移栽到大田

将药液控干，处理过的幼苗反复用流水冲洗30分钟，下午移栽到大田中，行距60cm，株距12cm，立即浇水。第一周每天上午十时下午二时各用微喷带浇水一次，一周后新叶长出，转入正常管理(确保足量的肥水供应和良好的栽培管理措施，分次追施化肥，适期、适量灌水，严防虫鼠危害，记载在如下文献中：李杰文,刘长虹,刘治先,杨菲,李文才,孙琦,于艳丽,丁照华.玉米单倍体高效加倍技术规范[J].山东农业科学,2013,45(10):121-124+130.)，最终有850棵正常成活。

4、检测

散粉率为衡量玉米单倍体加倍效果的主要指标。

散粉期调查散粉株数，散粉株即为单倍体加倍后植株。整个群体散粉期持续5～25天，每日调查记载新散粉株数，散粉期结束后计算玉米单倍体植株散粉率，公式为散粉株数占总株数的百分率。

检测散粉株的方法为如下1)或2)：

1)表型观察：雄穗上部分小穗颖壳张开，花药饱满外露并裂开，用手敲动有花粉粒飘散，这些有花药散粉的植株记作散粉株，即为单倍体加倍后植株。

需要指出的是个别植株虽然花药外露但花药干瘪，用手敲动没有花粉飘散不能记作散粉株。

2)染色检测：散粉时，用手拍动雄穗，用纸袋收集飘落的花粉，置于载玻片上，加1～2滴0.2％的I-KI溶液，压片，于低倍显微镜下观察。正常花粉内含淀粉遇碘变蓝色，活力低的花粉遇碘呈黄褐色。蓝色花粉可育，视为加倍成功，为散粉株；黄褐色花粉不育，不为散粉株，即没有加倍成功。

结果如下：本发明的方法制备850棵正常成活玉米植株中，散粉株(即单倍体加倍后植株)为680株(经染色镜检验证，也是加倍成功)，散粉率为80％。

对照组：取960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒直播到大田中，种植密度相同，不用药剂加倍处理，正常管理，最后有860株单倍体成苗发育正常。

散粉期每日调查记载散粉株数，检测玉米单倍体植株散粉率，对照自然条件下散粉株(即单倍体加倍后植株)为86株，散粉率为10％。

因此，本发明方法制备的加倍后玉米的散粉率远远高于对照，表明本发明的方法解决了单倍体加倍过程中散粉率低这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体加倍效率。

实施例2、玉米单倍体加倍方法

本实施例所提供的玉米单倍体加倍方法由如下步骤组成：

1、播种育苗

春季4月下旬，在北京市顺义区金苑育种基地，用木桩支起简易塑料拱棚，取960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒点播在用河沙为介质的市售96孔育苗盘中育苗，河沙需过筛，剔除石块，播种深度为1.5-2cm，取960粒单倍体籽粒共播种10苗盘。每两排育苗盘铺设一条微喷带，播种后立即浇透水；以后每天早上喷水2分钟，保持河沙湿润，得到单倍体幼苗；

2、单倍体加倍

当3叶期时上午取含有单倍体幼苗的育苗盘用水冲洗河沙，小心取出单倍体幼苗，切忌弄断幼苗主根，用清水清洗干净控干，每50株幼苗用尼龙草捆成束，码放在50mm*25mm*60mm塑料盒中，放在背阴处，有部分单倍体籽粒没有出苗，淘汰了部分苗龄太小的单倍体苗，共得到890棵单倍体幼苗，每个塑料盒装有890棵。

0.05mg/ml鬼臼毒素溶液配制：将0.1g鬼臼毒素(百灵威科技有限公司，产品编号：131142)溶解于100ml 95％乙醇水溶液，得到鬼臼毒素母液；再取10ml鬼臼毒素母液用纯净水200ml稀释至浓度为0.05mg/ml。

3、移栽到大田

将药液控干，处理过的幼苗反复用流水冲洗30分钟，下午移栽到大田中，行距60cm，株距12cm，立即浇水。第一周每天上午十时下午二时各用微喷带浇水一次，一周后新叶长出，转入正常管理，最终有840棵植株正常生长。

4、检测

散粉期每日调查记载散粉株数，计算玉米单倍体植株散粉率，结果如下：本发明的方法840棵植株中散粉株(即单倍体加倍后植株)为630株(经染色镜检验证，也是加倍成功)，散粉率为75％。

对照组：取960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒直播到大田中，种植密度和药剂处理的密度相同，正常管理，最后有850株单倍体成苗发育正常。散粉期每日调查记载新散粉株数，计算玉米单倍体植株散粉率，对照自然条件下散粉株(即单倍体加倍后植株)为68株(经细胞系验证，也是加倍成功)，散粉率为8％。

因此，本发明方法制备的加倍后玉米的散粉率远远高于对照，表明本发明的方法解决了单倍体加倍过程中散粉率低这一关键技术难题，从而大大提高了单倍体加倍效率。

实施例3、玉米单倍体加倍方法的优化摸索

一、不同浓度鬼臼毒素溶液摸索

1、播种育苗

960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒按照实施例1步骤1进行播种育苗；

2、单倍体加倍

不同浓度鬼臼毒素溶液配制：将0.1g鬼臼毒素溶解于100ml 95％乙醇水溶液，得到鬼臼毒素母液；再取鬼臼毒素母液10ml用纯净水20L、10L、200ml、10ml分别稀释至浓度为0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.05mg/ml、1mg/ml。

与实施例1步骤2基本相同，不同的是将0.05mg/ml鬼臼毒素溶液替换为不同浓度鬼臼毒素溶液。

3、移栽到大田：与实施例1或2步骤3相同。

4、检测：与实施例1或2步骤4相同，结果0.0005mg/ml、0.001mg/ml、0.05mg/ml、1mg/ml鬼臼毒素溶液处理后制备的玉米植株散粉率为20％、70％、80％、75％。

可以看出，鬼臼毒素溶液浓度为0.001-1mg/ml散粉率好，其中最优的为0.05mg/ml。

二、鬼臼毒素溶液浸泡时间摸索

1、播种育苗

960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒按照实施例1步骤1进行播种育苗；

2、单倍体加倍

与实施例1步骤2基本相同，不用的是单倍体幼苗根部在0.05mg/ml鬼臼毒素溶液浸泡时间分别为0.5、1、5、10小时。

3、移栽到大田：与实施例1或2步骤3相同。

4、检测：与实施例1或2步骤4相同，结果幼苗根部鬼臼毒素溶液浸泡时间0.5、1、5、10小时制备的玉米植株散粉率为15％、60％、70％、65％。

可以看出，浸泡时间1-10小时散粉率好，其中最优的为5小时。

三、幼苗和幼苗根部

1、播种育苗

960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒按照实施例1步骤1进行播种育苗；

2、单倍体加倍

与实施例1步骤2基本相同，不用的是将单倍体幼苗根部和单倍体整个幼苗在0.05mg/ml鬼臼毒素溶液浸泡时间。

3、移栽到大田：与实施例1或2步骤3相同。

4、检测：与实施例1或2步骤4相同，结果单倍体幼苗根部在鬼臼毒素溶液浸泡制备的加倍后玉米植株散粉率为70％；单倍体幼苗整个在鬼臼毒素溶液浸泡制备的加倍后玉米植株散粉率为50％。

可以看出，根部浸泡效果好。

四、不同时期幼苗

1、播种育苗

960粒农大高诱1号与伟科702杂交得到的紫顶白胚玉米单倍体籽粒按照实施例1步骤1进行播种育苗；

2、单倍体加倍

与实施例1步骤2基本相同，不用的是分别取1、2、3、4叶期单倍体幼苗和5叶期幼苗在0.05mg/ml鬼臼毒素溶液浸泡。

3、移栽到大田：与实施例1或2步骤3相同。

4、检测：与实施例1或2步骤4相同，结果1、2、3、4叶期单倍体幼苗制备的加倍后玉米植株散粉率分别为70％、75％、80％、75％；5叶期幼苗制备的加倍后玉米植株散粉率为30％。

可以看出，1、2、3、4叶期单倍体幼苗效果好，尤其为3叶期最好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种植物单倍体幼苗加倍方法，包括以下步骤：

1)将生长至1-4叶期植物单倍体幼苗的根部在鬼臼毒素溶液中浸泡，得到处理后的植物幼苗；

2)将所述处理后的植物幼苗移栽到大田，实现植物单倍体幼苗加倍。

2.一种提高植物散粉率的方法，包括以下步骤：

1)将生长至1-4叶期植物单倍体幼苗的根部在鬼臼毒素溶液中浸泡，得到处理后的植物幼苗；

2)将所述处理后的植物幼苗移栽到大田，实现提高植物散粉率。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述鬼臼毒素溶液的浓度为0.001-1mg/ml。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述鬼臼毒素溶液的浓度为0.05mg/ml。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述鬼臼毒素溶液的溶质为鬼臼毒素。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述浸泡的时间为1-10小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述浸泡的时间为5小时。

8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物。

9.权利要求1-8任一所述方法在提高植物单倍体幼苗加倍效率中的应用；

或权利要求1-8任一所述方法在促进植物单倍体幼苗加倍中的应用；

或权利要求1-8任一所述方法在提高植物散粉率中的应用。

10.权利要求1-8任一所述方法中的鬼臼毒素溶液在提高植物单倍体幼苗加倍效率中的应用；

或权利要求1-8任一所述方法鬼臼毒素溶液在促进植物单倍体幼苗加倍中的应用；

或，权利要求1-8任一所述方法中的鬼臼毒素溶液提高植物散粉率率中的应用。