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CN111712712A - 场效应晶体管传感器检测测定以及制造和使用其的系统和方法 - Google Patents

场效应晶体管传感器检测测定以及制造和使用其的系统和方法 Download PDF

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CN111712712A
CN111712712A CN201880087839.XA CN201880087839A CN111712712A CN 111712712 A CN111712712 A CN 111712712A CN 201880087839 A CN201880087839 A CN 201880087839A CN 111712712 A CN111712712 A CN 111712712A
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CN
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sensor
enzyme
substrate
target analyte
reporter
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Application number
CN201880087839.XA
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巴拉什·塔库拉帕里
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Inaro Biological Co ltd
Original Assignee
Inaro Biological Co ltd
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Publication date
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Abstract

本公开涉及用于检测样品中的目标分析物分子或颗粒、并在某些情况下确定流体样品中的分子或颗粒的浓度的度量的装置、系统和方法。

Description

场效应晶体管传感器检测测定以及制造和使用其的系统和 方法
发明人：Bharath Takulapalli
相关申请
本申请要求2017年11月28日提交美国申请序列号62/591,209的权益，其名为“制造和使用酶联的场效应晶体管传感器来进行经扩增的生物标志物检测的测定方法”，其内容通过引用整体纳入本文。
技术领域
本公开一般涉及用于检测流体样品中的目标分析物分子或颗粒、并在某些情况下确定流体样品中的分子或颗粒的浓度的度量的系统和方法。
背景技术
能够快速且精确检测并在特定情况下定量样品中的目标分析物分子或颗粒的方法和系统对各种应用而言是理想的。这样的系统和/或方法可用于许多领域，如学术和工业研究、环境评估、食品安全、医疗诊断、化学、生物和/或放射战剂的检测。这种技术的期望特征可以包括特异性、速度和灵敏度。
用于定量样品中低水平的分析物分子的当前大多数技术使用扩增程序来增加报告分子的数量，以能够提供可测量的信号。例如，此类过程包括用于在基于抗体的测定中扩增信号的酶联免疫吸附测定(ELISA)、以及用于在基于DNA的测定中扩增靶DNA链的聚合酶链式反应(PCR)。称为免疫PCR的一种更灵敏但间接的蛋白质靶标扩增技术(参见Sano，T.；Smith，C.L.；Cantor，C.R.Science 1992，258，120-122)利用了寡核苷酸标记，其随后可使用PCR对其进行扩增，并使用DNA杂交法对其进行检测(参见Nam，J.M.；Thaxton，C.S.；Mirkin，C.A.Science 2003；301，1884-1886；Niemeyer，C.M.；Adler，M.；Pignataro，B.；Lenhert，S.；Gao，S.；Chi，L.F.；Fuchs,H.；Blohm，D.Nucleic Acids Research 1999，27，4553-4561；以及Zhou，H.；Fisher，R.J.；Papas，T.S.Nucleic Acids Research 1993，21，6038-6039)。免疫PCR方法可进行超低水平的蛋白质检测，但这是一个复杂的测定过程，并且容易产生假阳性信号(参见Niemeyer,C.M.；Adler,M.；Wacker,R.Trends inBiotechnology2005,23,208-216)。
用于精确检测和任选地定量低浓度溶液中特定分析物的典型已知方法和/或系统的一个缺点是它们基于许多分析物分子产生测量信号的整体响应。大多数检测方案要求在整体中同时存在大量分子，以使聚集物信号(aggregate signal)高于检测限。该缺点限制了大多数检测技术的灵敏度和/或动态范围(即，可检测的浓度范围)。许多已知的方法和技术还受到非特异性结合问题的困扰，非特异性结合的问题是待检测的分析物分子/颗粒或报道分子非特异性地与预期位点以外的位点结合。这可能导致背景信号增加，因此限制了可以精确或可重复检测的最低浓度。
因此，希望用于检测和任选地定量分析物分子或颗粒的改进方法，尤其在其中这样的分子或颗粒以非常低的浓度存在于样品中。
发明内容
提供本概述是为了以简化形式介绍一些概念。在以下的示例性实施方式的详细描述中进一步详细描述了这些概念。本概述并不旨在必然地标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。
如下面更详细地阐述的，本公开涉及用于检测流体样品中的(例如，目标)分析物分子或颗粒、并在某些情况下确定流体样品中的分子或颗粒的浓度的度量的系统和方法。可以通过例如定量传感器响应来确定流体样品中分子或颗粒的浓度的度量。
根据本公开的至少一个实施方式，用于检测目标分析物的装置包括：传感器装置，其包含暴露于环境的表面；捕获剂，其位于表面上或表面附近，捕获剂配置为选择性结合目标分析物；任选地，初级结合剂，其与目标分析物结合；报告酶偶联物，其与初级结合剂或目标分析物结合；以及酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物。如下面更详细地阐述的，所述传感器装置能够通过检测由于酶反应产物的产生导致的环境的电性质(例如，电荷和/或电位)或环境的磁性质或传感器表面的电性质或表面的机械性质的改变来产生信号。所述传感器装置可以是或可以包括例如场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。所述目标分析物可包括例如测试介质中的分子或生物标志物或离子物质或细胞或颗粒。根据示例性的方面，所述捕获剂被固定于表面上或表面附近。根据其他实施例，所述酶反应产物包括离子。所述酶反应产物可直接与表面结合。所述酶反应产物可直接与传感器表面结合或者与传感器参比电极结合或者与传感器对电极结合或与传感器附近的活性表面结合(结合可以改变传感器的响应)。所述传感器装置能够以阵列形式存在，其包括多个传感器装置和固定在每个传感器装置上或附近的独特的捕获剂。附加或替代性地，所述传感器装置能够以阵列形式存在，其包括多个传感器装置和固定在阵列中的多个传感器装置上或附近的独特的捕获剂。所述传感器装置能够以阵列形式存在，其包括多个传感器装置以检测多个目标分析物。根据示例性的方面，所述酶反应产物还能够使用荧光或发光或其他光学检测方法来检测。传感器装置由于酶反应产物而产生信号，此外还能够任选使用光学检测方法进行检测。
根据本公开的至少一个其他实施方式，用于检测目标分析物的装置包括：传感器基材，其包括传感器装置；互补基材，其包括与目标分析物选择性结合的捕获剂；任选地，初级结合剂，其与目标分析物结合；报告酶偶联物，其与初级结合剂或目标分析物结合；以及酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物。所述传感器装置可通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境的电性质或环境的磁性质或传感器表面的电性质或表面的机械性质的改变来产生信号。互补基材可包括捕获剂的阵列。所述传感器基材包括传感器装置的阵列。此外，包括传感器装置阵列的传感器基材可以与包括捕获剂的匹配阵列的互补基材对准/叠置、靠近或接触，以形成微流体通道，用以在传感器基材和互补基材之间形成流体流动。所述传感器基材和互补基材可具有柱或孔或图案或微流体通道或其他物理特征。该流动可以引发报告酶反应，从而产生酶反应产物。所述互补基材可包括多种捕获剂、和固定于多个点的每个点的独特的捕获剂。附加或替代性地，所述互补基材可包括使用抗表位结合剂固定在表面上的表位标签融合蛋白，其中融合蛋白可以以阵列形式原位表达。固定于互补基材上的蛋白质可以是野生型蛋白、蛋白质突变、翻译后修饰的蛋白质、异常蛋白质、肽、多肽、变性蛋白质、同种型。可以使用诸如NAPPA(核酸可编程蛋白质阵列)或分离的蛋白质捕获(IPC或对位捕获或NAPPA版本的覆盖捕获)之类的方法或其他原位或非原位蛋白质生产方法来生产和固定原位蛋白质阵列。
根据本公开的至少其他实施方式，一种用于检测目标分析物的方法包括：提供传感器装置，其包括表面；提供捕获剂，其位于表面或在表面附近；将表面暴露于包括目标分析物的环境；任选地提供初级结合剂，其与目标分析物结合；提供报告酶偶联物，其与初级结合剂或目标分析物结合；提供酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物；并使用传感器装置，通过检测由于酶反应产物的产生导致的环境的电性质或表面的机械性质的改变来产生信号。所述传感器装置可以是例如场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。
根据本公开的至少另一种实施方式，一种用于检测目标分析物的方法包括：提供传感器装置，其包括表面；提供捕获剂，其位于表面或在表面附近；将表面暴露于包括目标分析物的环境；任选地提供初级结合剂，其与目标分析物结合；提供酶底物偶联物，其与初级结合剂或目标分析物结合；提供报告酶，其在酶底物的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物；并使用传感器装置，通过检测由于酶反应产物的产生导致的环境的电性质或表面的机械性质的改变来产生信号。所述传感器装置可以是例如场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。此外，传感器信号通过检测酶反应产物在传感器表面上的结合来产生信号。
根据本公开的至少另一种实施方式，一种用于酶联传感器测定的方法包括：提供传感器装置，其包括表面；任选地提供捕获剂，其位于表面或在表面附近，捕获剂配置为与互补的酶底物偶联物或报告酶偶联物之一结合；将直接或使用捕获剂固定于传感器表面或其附近的酶底物偶联物或报告酶偶联物之一固定，将表面暴露于包含互补的报告酶或酶底物中的另一者的环境中，在固定偶联物和其他反应组分存在下进行生物化学反应，产生酶反应产物；并使用传感器装置，通过检测由于酶反应产物的产生导致的环境的电性质或表面的机械性质的改变来产生信号。所述传感器装置可以是例如场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。此外，传感器信号通过检测酶反应产物在传感器表面上的结合来产生信号。
在某些情况下，本公开的主题可以包括相互关联的产品/针对特定问题的替代解决方案和/或一个或多个系统和/或物品的多种不同用途。
附图说明
当结合以下说明性附图考虑时，可以通过参考详细描述和权利要求来获得对本公开的示例性实施方式的更完整的理解。
图1示出了标准ELISA(酶联免疫吸附测定)形式。
图2示出了根据本公开的各种示例的适合使用的示例性传感器。
图3示出了根据本公开的示例的直接酶-传感器连接测定的实例。
图4示出了根据本公开的示例的间接酶-传感器连接测定的实例。
图5示出了根据本公开的示例的夹心酶-传感器连接测定的实例。
图6示出了根据本公开的示例的传感器、捕获探针、目标分析物、信号探针和报告酶的示例。
图7示出了根据本公开的示例的装置，其中报告酶偶联物被DNA或RNA链偶联物代替，然后DNA或RNA链偶联物直接或通过结合至初级结合剂而结合至目标分析物。
图8示出了根据本公开的示例的装置，其中捕获剂是固定在传感器装置表面上或表面附近的DNA探针。
图9-16示出了根据本公开的各种实施方式的形成和使用各种装置的方法。图16示出了根据本公开的示例的测定。
图17(A)和(B)示出了FDEC传感器检测由酶底物或辅因子的流动或添加引发的激酶酶活性。图17(C)示出了FDEC传感器检测在药物分子存在下激酶酶活性的抑制，例如药物发现筛选或抗药性检测应用的情况。图17(D)示出了FDEC传感器检测磷酸酶对Tau酶底物的去磷酸化作用。
图18示出了根据本公开的示例性实施方式的本发明的连接传感器测定(或ELTAA)，其检测测试培养基中细菌细胞的存在，从而导致传感器响应。
应当理解，图中的元件是为了简化和清楚而示出的，并且不一定按比例绘制。例如，附图中某些要素的尺寸可以相对其它要素放大，有助于更好地理解本公开的这些说明性实施方式。
具体实施方式
尽管下面公开了某些实施方式和示例，但是本领域技术人员将理解，本发明超出了本发明的具体公开的实施方式和/或用途及其明显的修改和等同形式。因此，所公开的本发明的范围不应受到以下描述的特定公开的实施方式的限制。本文中呈现的图示并不意味着必须是任何特定材料、结构或装置的实际视图，而是可以是用于描述本公开的实施方式的理想化表示。
除非说明书和权利要求中另有明确说明，术语“包括”、“包含”等应被认为是包括性含义，而不是排他性或穷举性含义，也就是说，其含义是“包括但不限于”；采用单数或复数的词汇也分别包括复数或单数。另外，当在本申请中使用时，术语“本文”、“上文”和“下文”以及类似含义的词语应整体上指本申请，而不是本申请的任何特定部分。如本文所用，除非文中另有明确说明，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代形式。除非另有明确说明，否则本文所用的“与”可与“或”互换使用。
以下提供的本公开的示例性实施方式的描述并非旨在穷举或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方式和示例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。
如本文所用，目标分析物(可与“目标分子”或“目标物质”或“生物标志物”互换使用)是在“测试样品”中检测到的物质，在示例性应用中代表以下一种或多种，但不限于此：生物分子、有机分子、无机分子、离子、微粒、纳米粒子、细胞、囊泡、外泌体、蛋白质、抗原、dna、rna、肽、酶、细胞因子、激素、生长因子、酶辅因子、抗体、膜蛋白、细胞表面受体、细菌、病原体、病毒、真菌、真核细胞、原核细胞、脂质、代谢产物、碳水化合物、糖、聚糖、PNA(肽核酸)、生物聚合物、药物分子、有机或无机物质、组织、器官、细胞器。
如本文所用，测试样品(与“测试介质”互换使用)是一种测试物质，其被测试一种或多种目标分析物的存在，并且代表但不限于以下一种或多种：血液、唾液、生物样品、尿液、粪便、痰、水溶液、有机溶液、流体、气体、液体、组织样品、组织裂解液、血清、血浆、病原体生长培养基、细菌培养基、化学液体、化学混合物、抽吸物、鼻吸出物、肺吸出物、器官吸出物、胎液、羊水。
如本文所用，捕获剂是结合/捕获测试分析物的试剂或部分或物质或表面。捕获剂的非限制性实例是：抗体、抗原、dna、rna、互补寡聚物、脂质、细胞表面受体、适体、聚糖、珠子、颗粒、磁性颗粒、有机或无机分子或表面、亲水或疏水表面、微米或纳米结构表面、纳米多孔或介孔表面。
在一个示例性情况下，捕获剂可以是抗体且相应的目标分析物可以是抗原；在另一个实例中，捕获剂可以是抗原且相应的目标分析物可以是抗体；在另一个实例中，捕获剂可以是DNA或RNA链且相应的目标分析物可以是互补的DNA或RNA链；在另一个实例中，捕获剂可以是适体且相应的目标分析物可以是蛋白质；在另一个实例中，捕获剂可以是蛋白质且相应的目标分析物可以是另一个与其结合的蛋白质。
捕获剂可提供一种或多种示例性配置，但不限于此：(1)捕获剂在传感器的附近或邻近被提供/固定/打印/包覆于与传感器相同的表面或物理基材；(2)捕获剂被直接提供/固定/打印/包覆于传感器表面，传感器表面的覆盖部分或传感器表面的整体；(3)捕获剂被提供/固定/打印/包覆在第二表面，该固定表面是与传感器表面不同的第二表面，其可以包括但不限于第二表面/物理基材或珠子或颗粒或磁性颗粒或纳米颗粒中的一个或多个，并且使第二表面(固定表面)接近或邻近或接触具有传感器的第一表面。“接近”和“邻近”和“附近”一词可以互换使用，并且具有相同的含义。在一些示例性的应用中，接近意味着小于几百微米。在另一些示例性的应用中，接近意味着小于几微米。在另一些示例性的应用中，接近意味着小于几百纳米。在另一些示例性的应用中，接近意味着小于几毫米。
传感器装置(与“生物传感器”或“化学传感器”或“离子传感器”互换使用)：一个非限制性实例是场效应晶体管传感器。另一个非限制性实例是FDEC(完全耗尽的指数耦合)FET传感器。可替代地，如本文所用，“传感器装置”代表以下中的一个或多个，但不限于此：FET(场效应晶体管)传感器、FDEC(完全耗尽的指数耦合)FET传感器、场效应传感器、电荷传感器、电势传感器、功函数传感器、GMR传感器、石墨烯传感器、二硫化钼传感器、ISFET传感器、BJT(双极结型晶体管)传感器、晶体管传感器、电容传感器、电阻传感器、导电传感器、电化学传感器、等离子传感器、SPR传感器、安培传感器、伏安传感器、碳纳米管传感器、纳米线传感器、纳米管传感器、基于III-V的传感器、GaS传感器、电子自旋传感器、GaN传感器、雪崩二极管传感器、电子或空穴隧穿传感器、柔性传感器、量子线传感器、GMR(巨磁电阻)传感器、离子传感器、石英晶体微天平传感器、MEM传感器、NEM传感器、音叉传感器、压电传感器、机械传感器。在2015年10月27日发布的美国专利第9,170,228号中描述了示例性传感器装置，其内容通过引用合并于此。
在一个示例性应用中，与FET传感器或FDEC FET传感器连接的本发明的传感器测定法称为酶联晶体管放大活性测定法(ELTAA)。
传感器装置通常可以是单个传感器，也可以是装置传感器阵列内的装置，也可以是嵌套的传感器阵列的阵列，可以是在表面或物理基材上，也可以是嵌入在孔、微孔、纳孔或皮孔或毫微微管中的传感器。
报告酶是一种催化测试介质中底物反应以产生产物的酶。报告酶可以是ALP或其他磷酸酶、SRC或其他激酶、HRP酶等。报告酶的非限制性实例是激酶、蛋白酶、DNA酶、泛素化酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶、聚合酶、水解酶、裂解酶、转移酶、异构酶、连接酶、氧化还原酶、葡糖苷酶、糖苷水解酶、糖酶、脱氢酶、烯醇化酶、分泌酶、合酶、内切核酸酶、外切核酸酶、脂肪酶、加氧酶、纤维素酶、环化酶、酯酶。
报告酶产物的非限制性实例包括：酶反应产物如离子、离子物质、分子、有机分子、蛋白质、翻译后修饰的底物、表观遗传标记的底物、非离子分子、蛋白质、肽、氨基酸、低聚物、核苷酸、聚糖、糖、脂质。在示例性应用中，酶反应产物是离子，例如但不限于H+、Pi(磷酸根离子)、PPi(焦磷酸根)等。报告酶的非限制性实例是碱性磷酸酶及其各自的底物，其释放离子作为催化产物。报告酶的另一个非限制性实例是具有释放离子产物的硫氨酸染料底物的HRP。
初级结合剂：是与目标分析物结合的分子或物质。在一个非限制性示例性应用中，它可以是抗体或DNA寡聚物或抗原或颗粒。在一个示例性应用中，捕获剂和互补的结合剂可以在目标分析物的不同位置或表位与目标分析物结合。在一个示例性应用中，初级结合剂可被称为初级标签。
报告酶偶联物：是与报告酶偶联的生物分子，其中生物分子与初级结合剂结合。在一个示例性应用中，报告酶偶联物可被称为次级标签。
在一个非限制性示例性应用中，报告酶可直接与结合目标分析物的互补结合剂结合(可称为直接测定)。在另一个非限制性示例性应用中，可使用标签偶联的报告酶，标签与互补结合剂结合，互补结合剂又与目标分析物结合(可称为间接测定)。
捕获剂能够以特异性或选择性从非常高到非常低的范围与测试分析物结合，结合强度或亲和力从非常高到非常低的范围。本公开的方法可以用于检测测试样品中是否存在目标分析物和/或定量存在的目标分析物的量。可以使用本发明的方法来检测目标分析物，其低至单分子检测或单分析物检测。
酶底物：酶底物是根据需要在辅因子存在下，酶所作用的生物分子或化学物质。报告酶在其他辅因子、缓冲液、反应组分的存在下催化涉及底物的生物化学反应。以酶底物为反应物的报告酶催化的生物化学反应产生酶反应产物。
在一个非限制性实例中，报告酶催化酶底物以释放催化反应产物，所述催化反应产物包括与传感器相互作用或结合至传感器以产生检测信号的离子。
在另一个非限制性实例中，报告酶催化底物以释放包括与传感器相互作用/结合以产生传感器检测信号的非离子物质的产物。在另一个非限制性实例中，报告酶底物反应的产物包含以下一种或多种：(a)可以被传感器检测到的反应产物；(b)可以被基于光的光谱学方法(如荧光、发光、量热法等)检测到的反应产物；两个检测顺序地或同时地或并行地或组合地进行。
固定的表面或固定表面：在一个非限制性实例中，固定表面是捕获剂和/或分析物和/或互补结合分子和/或偶联的报告酶被结合或固定的地方。在一非限制性实例中，固定表面可与传感器装置在同一表面或物理基材上。在另一个非限制性示例中，固定的表面是不同的表面/物理基材，并且固定的表面被带到接近或邻近传感器表面。如本文所用，术语传感器基材和互补基材是指固体材料基材或物体。如本文所用，酶底物是指与酶相对应的化学反应物和生物分子，其中酶将酶底物催化成可能是离子或其他分子的酶反应产物。
如此处所使用的，附近或接近或邻近代表但不限于与传感器表面的示例性距离中的一个或多个：与传感器表面的距离小于100微米，与传感器表面的距离小于50微米，与传感器表面的距离小于25微米，与传感器表面的距离小于10微米，与传感器表面的距离小于5微米，与传感器表面的距离小于1微米，与传感器表面的距离小于0.5微米，与传感器表面的距离小于1000微米，与传感器表面的距离小于500微米，或与传感器表面的距离小于250微米。距离可能大于零且小于这些值中的任何一个。
本发明中描述的化学和生物传感器可用于示例性应用中的一种或多种，但不限于：(i)检测样品中目标分析物的存在(ii)检测样品中目标分析物的产生或释放或消耗(iii)检测样品中目标分析物的添加或去除。
测试仪器的非限制性示例性实施方案，其中所述测试仪器和部件可以使用本发明的酶联传感器阵列或ELTAA，从而应用于生物标志物检测或疾病诊断或预后或监测。在一个非限制性示例性实施方式中，测试仪器包括FET离子传感器技术或FDEC FET传感器技术。该测试仪器可以具有较小的外形尺寸，可以是台式仪器，可以是手持仪器，可以是手持便携式仪器。在一个非限制性示例性实施方式中，测试仪器可以包括以下组件，这些组件包括但不限于：(i)传感器阵列芯片，其可以包括传感器装置的阵列或嵌套的传感器阵列装置的阵列。传感器芯片在使用后可以重新使用，或者在使用后可以一次性使用；(ii)在传感器装置表面上或附近提供报告酶或酶底物之一以及其他酶反应组分。作为非限制性示例，该仪器可以另外包括第二互补基材，该第二互补基材具有与传感器芯片上的传感器阵列匹配的捕获剂阵列，其中互补基材以阵列形式具有固定的报告酶或酶底物；(iii)微流体盒，其包括或集成有微流体通道、阀、泵、致动器；(iv)在孔或隔离区域中或在泡罩包装中包含溶液、缓冲液、反应成分、辅因子、互补的酶底物或报告酶的泡罩包装；(v)电子电路，例如但不限于模拟集成电路或专用集成电路，包括AD转换器、FPGA、处理器、存储器，以多路复用形式、实时地用于检测传感器信号响应；(vi)外箱，该外箱集成了仪器的所有这些组件，并且可以具有外部用户界面，并且可以具有用于与计算机或移动装置的外部仪器进行通信的数字或类似界面；(vii)用于将测试样品引入仪器的端口，该端口可能包含要检测的目标分析物；(viii)分析传感器数据并可能另外推断疾病阶段和未来疾病进展的计算算法和方法；(ix)用于提取传感器阵列芯片的插槽和/或可以另外具有用于微流体盒和/或其他组件的插槽；(x)用于显示数据的组件。
本公开的装置或酶传感器测定法(或ELTAA)以及基于本发明测定法的测试仪器可以发现在学术和工业研究、生命科学和生物技术研究、早期疾病检测、疾病诊断、预后和治疗后监测、药物发现、靶标识别、表型筛选、药物筛选、疾病途径发现、临床结果指标的检测、疾病生物标志物发现、生物标志物检测、个性化治疗发展、精密医学、先发性诊断、病原体检测、环境评估、食品安全、医学诊断、兽医诊断、农业以及化学、生物和/或放射战剂的检测。
参考文献“酶联免疫吸附测定(ELISA)，John Crowther，分子生物方法手册pp657-682”和“免疫PCR：一种用于生物分子检测的超灵敏免疫测定，Anal ChimActa.2016Mar 3，910：12-24”中所包括的方法在不与本公开冲突的范围内通过引用并入本文。
图1示出了ELISA的各种示例，即直接ELISA，间接ELISA，夹心ELISA和竞争性ELISA，其可以与本公开的各种实施方式结合使用。使用直接ELISA，目标分子102可以结合初级结合剂或生物分子偶联物104，其可以结合报告酶106。如以下更详细讨论的，酶底物可以在报告酶106存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物108。使用间接ELISA，可以将次级偶联分子110插入初级结合剂104和报告酶106之间。使用夹心ELISA，捕获剂112能够结合至目标分子102，例如，将目标分子102结合至底物。最后，在竞争性ELISA中，抑制剂抗原可以竞争与有限量的标记抗体或抗原的结合。
使用典型的ELISA，可以在存在酶底物的情况下测定与一抗或二抗偶联并与目标分析物结合/固定/复合的报告酶，并使用光或紫外线或荧光或发光光谱学来检测所得的荧光或发光或其他光学信号。
相反，根据本公开的示例性方法，可以选择“报告酶底物-催化反应产物”系统，从而一种或多种报告酶反应产物能够被位于接近或邻近固定酶的化学传感器和/或离子传感器和/或生物传感器选择性地检测。在图2中示出了适合根据本公开的各种实例使用的非限制性示例性化学传感器和/或离子传感器和/或生物传感器。
图3-8示出了根据本公开的各种实施方式的示例性装置。尽管在示例中示出了目标分析物或探针，但是装置可在最初不包括此类目标分析物、探针、探针或其他目标材料。可以在示例性装置的使用期间添加这种目标材料。
图3示出了根据本公开的示例的直接酶-传感器连接测定或装置300和350的实例。装置300、350包括传感器装置302，偶联物生物分子304，报告酶306和酶底物。报告酶306和酶底物之间的反应产生反应产物308和环境310的改变，其又可以被传感器装置302检测到。装置300和305类似，除了：目标分析物312直接结合到装置350中的传感器装置302表面316上，而相比之下，在装置300中，目标分析物312结合到与传感器装置表面316分离的表面314上。表面314和表面316可以形成固体基材的相同表面。传感器装置302和本文描述的其他传感器装置可以是或包括FDEC FET传感器或FET传感器，如美国专利第9,170,228号中公开的传感器，其内容在不与本公开冲突的范围内通过引用结合在此。
图4示出了根据本公开的示例的装置400、450。装置400、450包括传感器装置402，初级结合剂404、偶联物结合剂406、报告酶408和酶底物。报告酶408和酶底物之间的反应产生反应产物410和环境412的改变，其又可以被传感器装置402检测到。目标分析物418可以结合到传感器装置表面416、或与传感器装置表面分离的另一表面414(例如，在与传感器装置相同的基材上)。
图5示出了根据本公开的示例的具有夹心酶传感器连接测定的装置500、550。装置500、550与上述装置相似，装置500、550除了包括传感器装置502、初级结合剂504、偶联结合剂506、报告酶508和酶底物之外还包括捕获剂520。报告酶508和酶底物之间的反应产生反应产物510和环境512的改变，其又可以被传感器装置502检测到。目标分析物518可以结合到传感器装置表面516、或与传感器装置表面分离的另一表面514(例如，在与传感器装置相同的基材上)。
图6示出了适合于DNA分析的装置600的一部分。装置600可以是或包括固定在传感器表面上或附近的DNA探针。在这种情况下，目标试剂是测试介质中与DNA探针结合的DNA寡聚物。报告酶偶联物是与报告酶偶联并与目标DNA结合的DNA链。DNA-DNA结合可以通过配对链中的互补序列部分/区域进行，而互补序列部分/区域可以通过杂交进行结合。引入流动或酶底物或辅因子将启动报告酶反应，从而产生酶反应产物，从而产生传感器信号。
在示出的实例中，根据本公开的实例，装置600包括表面(例如，传感器装置)602、捕获探针或试剂604、目标分析物606、偶联物探针或生物标志物608、以及报告酶610。报告酶610可以是例如免疫PCR方法中使用的任何ELISA报告酶或PCR聚合酶。在报告酶是PCR聚合酶的情况下，传感器对反应产物的检测可通过释放的离子、产生的扩增DNA、或其他催化PCR反应产物。在另一个实例中，PCR聚合酶可以被由RNA产生cDNA的RT-PCR酶代替。装置600可以包括本文所述的任何传感器。装置600也可以包括酶底物。
图7示出了根据本公开的实例的适用于PCR的装置700。在这种情况下，将报告酶偶联物替换为DNA或RNA链偶联物，然后将其直接结合或通过结合初级结合剂与目标分析物结合。将诸如聚合酶、转录酶或逆转录酶之类的酶与引物一起与其他成分一起引入反应混合物中，以引发链合成反应。酶将作用于DNA/RNA链，导致释放离子作为反应产物，并由FET传感器检测到该离子，表明存在DNA/RNA偶联物结合的目标分析物。
装置700包括传感器装置702和PCR产物，其可以使用各种PCT技术形成，包括图7所示的那些。
图8示出了根据本公开的又一实施方式的适于检测RNA的装置800。装置800包括传感器802、固定在表面814和/或816上或附近的捕获剂804(例如，DNA探针)。示例性目标试剂406是结合至DNA探针404的测试介质中的RNA寡聚物。报告酶偶联物408是与报告酶410偶联并与目标RNA结合的DNA链。DNA-RNA结合可以通过配对链中的互补序列部分/区域进行，而互补序列部分/区域可以通过杂交进行结合。引入流动或酶底物或辅因子将启动报告酶反应，从而产生酶反应产物，从而产生传感器信号。
固态传感器、如传感器装置302、402、502、702、802以及本文所述的其他传感器装置，可以用于多种应用中。例如，化学固态传感器可用于连续和离散采样模式下的化学混合物的实时分析。类似地，生物传感器/传感器装置可用于检测生物制剂和危害，而辐射传感器可用于检测辐射的类型和量。
使用基于阵列的传感器的模式识别方法，传感器/传感器装置可用于检测复杂混合物中的单个成分、例如环境大气中的有毒分子，分析组合物中的多个组分，或对复杂混合物进行表征和质量评估(例如，用于表征异味，味道，气味等)。
典型的固态传感器通常包括检测或接收元件以及信号转导装置。接收器层例如通过物理吸收或物理吸附、化学吸附、微囊化等与目标物质、捕获剂等相互作用。换能器将接收器表面(例如，在如上所述的环境中)的变化转换成可测量的电信号。信号转导或接收器与换能器之间的信号耦合可以是线性的、非线性的、对数的或指数的。两个元件之间的耦合关系通常决定装置的灵敏度。
已经开发了各种信号换能器元件，例如电位传感器、安培传感器、电导传感器、基于场效应晶体管(FET)的传感器、光学传感器、热传感器、重力或压电传感器等。FET装置可能是特别期望的，因为FET装置表现出相对快速和灵敏的信号转导，相对易于使用，并且相对易于与其他传感器组件集成。
在FET装置的情况下，场效应晶体管装置的金属栅极可以替换或涂上敏感的薄膜、绝缘体或膜，用作信号检测元件。FET装置的工作原理是检测由于装置表面的相互作用而导致的局部电位变化。FET装置通过导致漏极电流变化的通道区域的电导率的变化将检测事件转换为电信号。可以通过用恒定的栅极电压偏置该装置并测量电流的变化，或者通过检测保持恒定电流所需的栅极电压的变化，将FET装置用作传感器。
金属氧化物半导体FET(MOSFET)型传感器通常以反向模式工作，其中通过偏置MOSFET的金属栅极在半导体通道中建立反向电流。在这些装置中，目标分子(直接或间接)在敏感薄膜上结合、或辐射水平的变化调节了反向通道中的少数载流子密度。因此，在向装置表面添加负电荷后，体p型MOSFET的反向电流减小。
尽管已经示出了这样的装置和换能器元件可用于某些感测应用，但是非FET装置相对庞大且昂贵，并且传统的基于FET的装置可能相对不稳定并且表现出相对较低的灵敏度。
本发明提供了一种改进的固态传感器，该固态传感器用作本文所述的传感器装置，用于检测生物和化学物质以及用于辐射检测。更具体地，本公开的示例性实施方式提供了一种包括量子线或纳米线的场效应晶体管(FET)，其用作完全耗尽的指数耦合(FDEC)传感器。如下面更详细地讨论的，当检测到所感测的离子或生物、化学或放射性物质时，操纵传感器的阈值电压或通道电导，从而引起通道电流的指数变化。
与传统的FET传感器相比，本发明的传感器的通道电流的指数变化在相反的方向上，并且在n通道型装置中，在检测到具有过量电子电荷或负电荷的物质时增大。这样的指数响应使得本发明的传感器对于定性和定量分析更加敏感。
与本发明相反，现有技术教导了用于化学感测的基于反向的FET装置，其中装置结构的变化方式是向n通道FET的表面添加负电荷会导致反向通道电导降低(或漏极电流减小)，而正电荷的添加会导致反向通道电导增加；在p通道FET中，向装置表面添加负电荷会导致通道电导增加(或漏极电流增加)，而正电荷的添加会导致通道电导降低。在本申请中，装置结构的这种响应与本发明的装置的方向相反。如上所述，根据本发明的各种实施方式，在根据本发明的基于n通道反向的FET装置的表面上添加负电荷会增加反向通道电导，向表面添加正电荷会降低反向通道电导，而向基于p通道反向的装置表面添加负电荷会降低反向通道电导，而向表面添加正电荷会增加反向通道电导。
FET传感器装置或FDEC FET传感器装置的通道区域可以在整个区域厚度上包括结构或孔，或者该结构和/或孔可以形成在顶表面上。根据本发明的各种示例，FET传感器的顶表面包括微孔、介孔、纳米孔或大孔，即，孔径尺寸可以在约
Figure BDA0002603463480000181
至100微米或约
Figure BDA0002603463480000182
至约10mm的范围内。根据本发明的另外的实施方式，FET传感器通道区域包括尺寸范围从大约
Figure BDA0002603463480000183
到大约100微米的结构，例如纳米结构或微结构。每个结构的宽度可以从大约10埃到大约10毫米。该结构可以包括例如正方形、圆形、三角形、六边形、任何合适的横截面的纳米或微米级柱。所述结构还可以包括微孔或介孔或纳米多孔结构，所述微孔或介孔或纳米多孔结构叠加在浮雕或凹陷中的纳米或微图案上。
现在转到图9-16和18，示出了非限制性示例性装置、传感装置以及使用该装置和传感器装置的方法。图9-13示出了示例性装置的形成和使用中的示例和步骤。如下面更详细地阐述的，图14-16和18示出了适合于检测细胞活性的装置和测定。
1.提供传感器
图9示出了根据本公开的示例性实施方式的示例性传感器装置900。在所示实例中，传感器装置900是FDEC(完全耗尽的指数耦合)FET(场效应晶体管)。所示的传感器可以用任何其他非光学传感器替换，例如但不限于：FET(场效应晶体管)传感器、场效应传感器、电荷传感器、电势传感器、功函数传感器、GMR传感器、石墨烯传感器、二硫化钼传感器、ISFET传感器、BJT(双极结型晶体管)传感器、晶体管传感器、电容传感器、电阻传感器、导电传感器、电化学传感器、等离子体传感器、SPR传感器、安培传感器、伏安传感器、碳纳米管传感器、纳米线传感器、纳米管传感器、基于III-V的传感器、GaS传感器、GaN传感器、PN结传感器、二极管传感器、雪崩二极管传感器、电子或空穴隧穿传感器、柔性传感器、量子线传感器、GMR(巨磁电阻)传感器、或离子传感器。
传感器装置900包括通道902、源极区904、漏极区906和背栅908。传感器装置900还可包括金属触点910、912(在打开传感器表面上的窗口的绝缘膜内部)。如上所述，通道902可以被图案化和/或包括特征。
如图10(A)所示，捕获剂914、916可以附着到传感器装置900的表面920、922。附加地或替代地，如图10(B)所示，捕获剂可以附着到珠子上，该珠子位于装置900上或附近。图10(C)示出了传感器装置可以形成形成在基材922上的阵列920的一部分。基材922可与包括捕获剂926和/或本文所述的其他分子的互补基材924配对。互补基材924和基材922可以对准/叠置并且彼此靠近，使得固定的捕获剂和目标分析物以及报告酶在传感器装置900附近。
2.暴露捕获剂以测试样品。如果存在，则测试样品中的目标分子/分析物会与捕获剂结合
图11(A)-11(C)示出了与各种捕获剂结合的目标分析物1102。在一个非限制性实例中，捕获剂与目标分析物的结合是特异性和选择性的。可以将捕获剂提供在与传感器相同的表面上，或者提供在不同的表面或珠子918表面或其他(例如固定的)表面上。
3.引入与“报告酶”偶联的“互补结合剂”。或者引入互补结合剂，然后引入“与标签结合的报告酶”，其中“报告标签”与“互补结合剂”结合。
图12(A)-(C)示出了根据本公开的进一步的示例性实施方式的具有报告酶偶联物的装置1200、120和1275，所述报告酶偶联物直接结合至目标分析物，或经由初级结合剂间接结合至目标分析物。装置1200和1250包括传感器装置900、捕获剂1202、与目标分析物1206结合的初级结合剂1204、偶联生物分子1206和报告酶1208。捕获剂、目标分析物、初级结合剂、偶联物分子和/或报告酶可以与本文其他地方所述的相同。装置1250另外包括珠子1212，图12(C)示出了基材1222，捕获剂1224、目标分析物1226、初级结合剂1228、任选地偶联物生物分子和报告酶1230附接到该基材1222。如上所述，互补基材1222和基材1232可以对准/叠置并且彼此靠近。
·非限制性实例有：引入抗体偶联的报告酶或互补的DNA/RNA/寡聚物/结合分子偶联的报告酶或与和目标分子选择性结合或相互作用的分子/物质偶联的报告酶，其中抗体或互补分子或DNA/RNA包含与目标分析物结合的互补结合剂。
·偶联的报告酶通过“互补结合剂”和“标签”中的一种或两种固定/结合到目标分析物上。目标分析物具有多个结合表位，用于与捕获剂结合以及与“互补结合剂”或直接与“标签”结合。
·根据需要按顺序进行洗涤以除去未固定的测试样品/物质，并洗涤以除去未固定的偶联报告酶。引入酶底物，其中报告酶催化酶底物周转，从而导致催化反应产物的释放
图13(A)-(C)示出了装置1300、1350和1375，其包括添加在报告酶存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物的酶底物1302，
·在引入酶底物之前，可以将传感器表面和组件洗掉溶液中任何未结合/未固定/游离的报告酶。
·引入后，报告酶在特定反应中与酶底物1302相互作用，释放特定反应产物。释放的酶反应产物可以是离子物质或非离子物质或其他物质。
·在一种示例性情况下，报告酶可以自催化其自身。其非限制性实例是在ATP、Mg或Mn离子和其他激酶反应组分存在下的自磷酸化激酶。
·在一个非限制性实例中，酶底物反应产物位于传感器表面附近。
·在一种非限制性示例性情况下，释放的反应产物是由FDEC FET传感器或FET传感器检测到的离子。
·在另一个非限制性实例中，释放了酶催化反应的非离子反应产物，其与传感器表面相互作用或结合，从而导致传感器响应。
·在另一个非限制性实例中，释放了酶反应产物，该酶反应产物与涂在传感器表面的分子或有机或无机单层或多层膜相互作用或结合。
·酶反应产物与传感器的相互作用产生传感器信号。
·来自酶反应产物的传感器信号指示分析物分子的存在，因此可以高灵敏度检测分析物分子。
·每种酶都可以周转大量的底物分子，从而释放出大量的反应产物，这些产物与传感器相互作用以产生高信噪比的检测信号。
·在一种非限制性的示例性情况下，固定在单个分析物分子上的单个报告酶可以周转大量酶底物，从而导致高信噪比检测信号。
·在非限制性示例性情况下，在每个结合/标记步骤之后，测定法包括一个或多个用于防止非特异性粘附的封闭步骤。
·报告酶的非限制性例子包括磷酸酶，在催化作用下释放离子；激酶，在催化作用下释放H+离子；HRP，与底物相互作用，释放反应产物。
·在一个非限制性实例中，当HRP用作报告酶时，选择HRP底物以使其释放与传感器相互作用的离子，以产生检测信号。
在非限制性的示例性应用中，报告酶释放一种或多种产物，该产物可以通过基于光的光谱学方法(荧光，发光，量热检测等)和附近的传感器装置检测，随后在同一测定中依次或同时或并行地检测。
上述步骤的顺序可以互换。并且，在一些示例性情况下，可能不需要所有步骤或每个步骤，并且可以将其省略。例如，提供传感器的第一步可以在最后完成，其中将捕获剂结合在第二表面或珠子上，然后带领其接近或邻近传感器表面。
根据本公开的其他实施方式，可以使用装置和方法、使用酶联传感器检测细胞活性。
酶联晶体管放大活性(ELTAA)分析：ELTAA分析技术是一种非光学实时电子检测技术，其为单分子水平的灵敏度提供了潜力-灵敏度比ELISA高出几个数量级。ELTAA分析法结合了酶-底物相互作用(酶联的)固有的指数扩增与高灵敏度的FDEC场效应晶体管(FET)纳米线传感器(超灵敏性)，用于电子信号读出。
如上所述，FDEC(完全耗尽的指数耦合)FET传感器可以包括纳米级硅晶体管器件，由于独特的指数电荷耦合机制，可以超高灵敏度检测离子，其中与FDEC纳米线传感器表面结合的离子或分子可以打开/关闭传感器装置―――晶体管通道电流的数量级变化会通过电子方式被检测到。FDEC传感器的独特之处在于它们可以直接检测传感器表面的电荷变化。FDEC传感器中传感器响应的方向与通用ISFET或其他FET传感器的方向相反。添加H+离子会导致传统的ISFET传感器的阈值电压降低，而在FDEC传感器中，添加H+离子会导致晶体管的阈值电压升高。这是由于独特的装置物理原理导致FDEC传感器中的指数电容电荷耦合，从而有效地使其成为超灵敏电荷传感器或化学反应传感器。FDEC传感器也可以配置为检测传感器表面上的电位或功函数变化。
在FDEC传感器附近/邻近(例如，在100微米范围内)发生的酶-底物相互作用释放出可能与传感器表面相互作用的离子或分子反应产物，从而导致传感器响应。ELTAA测定法使用集成的FDEC指数耦合电荷传感器(超高灵敏度)以电子方式实时(动态读取)检测酶-底物功能活性(高特异性)，以指示目标分析物或酶生物标志物在测试分析物中的存在。
用于细胞周期检测的酶联传感器测定的非限制性示例性实施方式
细胞死亡测定：凋亡(或程序性细胞死亡)和坏死是已经定义和充分理解的两种细胞死亡形式。凋亡是细胞死亡的一种生理形式，它在多细胞生物的发育和维持中起着至关重要的作用，而坏死则完全是病理性的，不会给细胞带来任何已知的益处。两种细胞死亡机制中的共同因素是细胞内含物的释放。同样，细胞增殖生物标志物通常在细胞膜表面发现或散出到生长培养基中。这些细胞成分已被开发用于诊断和药物发现目的的细胞死亡测定。例如，经历凋亡或坏死的细胞表现出核小体间DNA切割成寡核小体长度的片段，其可以释放到细胞外。DNA片段化是细胞死亡的标志之一，已被用于原位测量细胞死亡。此外，半胱天冬酶(caspases)和非半胱天冬蛋白酶如组织蛋白酶、钙蛋白酶和颗粒酶也被认为是凋亡的效应物，并且在凋亡细胞附近的分泌物中发现。细菌溶解和细胞壁形成的抑制通常与抗生素治疗、癌症和神经变性相关。具体而言，大多数用于癌症治疗的化学治疗剂能使癌细胞分解，而几种抗菌剂会导致细菌细胞坏死。因此，使用体外测定法监测细胞死亡对于抗生素和抗癌药物的开发至关重要。
目前的细胞增殖测定：细胞增殖测定包括DNA合成、代谢活性、与细胞增殖相关的抗原和ATP浓度的测量。代谢细胞增殖测定法依赖于氧化还原染料，例如四唑鎓盐和阿尔玛蓝，它们在代谢活性细胞的环境中被还原。如前所述，这些测定还提供细胞死亡的间接测量。用分光光度计监测染料的颜色变化。ATP检测是另一种测量细胞增殖的方法，因为垂死或死细胞几乎不含或不含ATP。在细胞裂解物中测得的ATP浓度与细胞增殖之间存在线性关系。可以通过量化关键增殖标记(例如Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、拓扑异构酶IIB、磷酸化组蛋白H3和微型染色体维持2(MCM 2))的蛋白质水平来测量细胞增殖。
细菌细胞壁生物合成检测方法：多种酶存在于细菌的细胞膜中、周质空间内和细胞表面上，这些酶在细胞生长或凋亡过程中被特异地释放到培养基中。例如，通过使铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌活跃地生长，碱性磷酸酶(ALP)被释放到培养基中。
本发明的酶传感器测定法可通过在固定在传感器装置表面上或附近的酶底物存在下检测/监测从细胞或病原体或裂解物中散出/分泌的酶来检测细胞生长、细胞死亡、细胞周期、细胞耐药性、病原体细胞周期、病原体耐药性。本发明的酶传感器阵列能够实时定量监测细胞增殖和凋亡。
使用酶联传感器检测细胞活性：细胞活性将分子和离子物质释放到细胞外环境中，其中释放的物质特定于细胞活性，例如生长、增殖、分裂、死亡、凋亡、坏死、细胞周期等。通过检测细胞释放的这些特定分子，可以检测细胞活性或活力或细胞周期；酶在细胞的生长和死亡周期的不同时间释放。本发明的酶联传感器测定法可以用于检测释放的酶以高灵敏度监测细胞活性。
酶联传感器分析(或ELTAA)
为了检测ALP酶的分泌，当前刺激的酶联传感器测定可以与ALP的商业底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)、4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)或对硝基苯基磷酸酯)一起使用，该底物可以固定在传感器表面上或附近。反应产物是可以被传感器检测到的离子或分子。作为示例性实施方式，通过FDEC FET传感器检测离子，以检测和监测酶活性。
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的胞质酶，目前是细胞裂解的最常见的报告酶之一。通过将培养液样品与丙酮酸钠和NADH一起孵育来测定凋亡细胞释放的LDH。在NADH存在下，LDH催化丙酮酸可逆地还原为乳酸。反应产生NAD+，其在340nm处用分光光度法测量。NADH氧化还可以与硝基蓝四唑的还原耦合产生甲臜(一种发色团)，然后通过比色法对其进行定量。通过LDH酶反应产生的NAD+或氢离子可以使用本发明的传感器酶测定法进行监测，并且作为示例性实施方式，可以使用FDEC FET传感器来监测。
在细胞中，RNAP催化涉及使用DNA模板构建RNA链的转录反应。可以将RNAP添加到含有Mg2+和核糖核苷酸混合物的合适缓冲液中，并暴露于传感器表面。酶反应产生氢离子(H+)，其可以通过本发明的酶传感器测定法检测为电信号。因为凋亡细胞将DNA片段散出到培养基中，所以使用RNAP作为示例性实施方式，本发明的酶-传感器测定法可用于检测DNA片段的散出，并因此检测细胞凋亡。
另一个非限制性示例性应用：基于蛋白组学阵列的ELTAA测定法用于疾病的诊断和预后：
癌症蛋白质组的片上癌症诊断或预后装置：(i)通过将所有与癌症相关的蛋白质排列在芯片上而产生；(ii)在阵列上包括每种与癌症相关的蛋白质的突变形式；(iii)可选地包括翻译后修饰(PTM)蛋白质；(iv)并用于测定产生的蛋白质及其与患者血液的突变文库以进行免疫反应分析；(v)分析与阵列上抗原蛋白结合的抗体、免疫细胞和其他免疫应答成分的信号，确定是否存在癌症、癌症分期或分级、和/或基于免疫特征确定有效的治疗方法。
蛋白质及其突变形式可以来自癌症的一种或亚型，或多种癌症，或所有可能的癌症。以类似的方式，可以排列与其他疾病有关的蛋白质及其突变，以用于芯片上的疾病组，以进行疾病诊断和/或预后和/或有效疗法的开发。
蛋白质和蛋白质突变文库可以在生物传感器的表面上产生，其中通过生物传感器响应来检测结合抗体的免疫特征、与抗原蛋白结合的其他免疫成分，用于疾病诊断和/或预后和/或有效疗法的开发。本发明的酶联传感器测定法可以阵列形式用于检测癌症、疾病生物标志物。
用于本发明的酶联传感器测定的另一个示例性应用：病原体鉴定/检测和/或抗生素敏感性测试系统
细菌鉴定(ID)和抗生素敏感性测试(AST)系统可能包括几个小时内能回应ID和AST系统的样品，包括对几种CFU的检测具有很高的检测灵敏度，包含能够检测未知细菌(未知基因型)或已知细菌新菌株的表型AST，潜在地分析不可培养的细菌，能够检测给定样品中多种抗性菌株引起的异抗性，紧凑且便携，与即时需求(PoN)应用兼容，易于使用的自动化，能够针对大批抗生素进行全面的抗生素敏感性分析的高通量系统，并有可能用于生物监视的实时数据分析。
存活的细菌细胞在生长和增殖过程中会分泌或散出依赖ATP/NADH的细胞外酶(外酶)，例如磷酸酶、蛋白酶、脂肪酶、酯酶等。碱性磷酸酶(ALP)就是这样一种酶，它在细胞壁生物合成中起作用。类似地，细胞死亡和裂解后，依赖细胞质ATP/NADH的酶(例如DNA促旋酶、细菌激酶、RNAP、MurA-F等)被释放到培养基中。这些酶类别需要ATP或NADP作为催化活性的辅助因子，并且经常导致带电离子作为反应产物——可以通过本发明的酶联传感器检测到。检测分泌/散出/漏出的离子产生酶的活性可以作为细菌细胞周期的特定功能性生物标志物。通过在独特的传感器附近印刷(固定)酶的独特底物，由于快速的底物周转和离子释放，甚至可以检测到单个外酶对于印刷底物的催化活性。FDEC传感器对离子甚至部分电荷高度敏感。由单个酶分子(报告酶)周转数百到数百万个酶底物而产生的离子急流可以很容易地由具有高信噪比的FDEC传感器检测到。来自传感器-底物对的信号表明培养基中相应特异性酶的活性。
本发明的酶联传感器阵列可以检测抗生素稀释滴度中的细菌分离物的代谢组学和细胞周期生物标志物，以确定MIC。通过以高灵敏度检测(i)细菌细胞活力和增殖的生物标志物，例如碱性磷酸酶(ALP)、蛋白酶、脂肪酶、酯酶(ii)以及细菌细胞裂解后细菌细胞死亡的生物标志物，例如胞质酶DNA促旋酶、细菌激酶、MurA-F、RNAP等，可以监测细菌对抗生素的敏感性。可以同时对细菌细胞和50种抗生素进行测定，每种抗生素以20种不同的连续稀释度进行测定，以确定50种抗生素的MIC，并在数小时内进行全面的样品应对抗微生物药敏试验。
图14示出了可以用于检测在细胞活动和死亡期间细胞释放的特定酶的存在的装置1400，以指示特定的细胞活性或死亡，通过在固定在传感器表面附近的各个底物的存在下通过传感器检测酶活性来进行测定。可以在用于药物发现的假定药物分子存在下进行测定，也可以在药物分子存在下进行以检测耐药性。装置1400包括传感器装置900、特定的酶1402、报告酶1404和酶底物1406。
图15示出了根据本公开的附加示例的装置1500。装置1500可用于检测细胞死亡或生长或另一细胞周期特征。或者检测测试介质中特定细胞或病原体的存在。感兴趣的特定酶的酶底物可以固定在传感器表面上或附近。酶底物或者可以固定在珠子或另一种互补基材上，然后可以使其靠近传感器表面。在存在其他反应组分的情况下，将酶底物固定在附近，检测到的传感器信号暗示特定酶的存在，该酶催化酶底物，从而导致传感器响应。作为非限制性实例，活细菌可以分泌或散出酶，例如磷酸酶、ALP、蛋白酶、脂肪酶，其可以通过本发明的酶联传感器在各自的酶底物和其他辅因子存在下被检测到。作为非限制性实例，死细菌或裂解细菌可以分泌或散出酶，例如细菌激酶、Mur A-F酶、DNA促旋酶，其可以通过本发明的酶联传感器在各自的酶底物和其他辅因子存在下被检测到。在本发明的酶联传感器的进一步示例性应用中，细菌细胞(或其他病原体)测定可以在药物或抗生素存在下进行。可以通过监测细菌细胞散出/分泌的对细胞生长和细胞死亡或细菌细胞周期具有特异性的酶来检测抗生素耐药性或耐药性。
装置1500包括传感器装置900，该传感器装置900包括与环境1502接触的表面1504，该环境1502包括例如活细菌和/或去毒裂解细胞。在这种情况下，将特定的酶底物固定在靠近表面1504的位置，这会导致传感器装置900的电响应或其他响应发生改变。
图16示出了使用本发明的酶联传感器来检测人和细菌细胞的示例活性测定法和细胞毒性测定法。图16(A)示出了在细胞壁合成过程中细菌细胞释放的ALP磷酸酶的实例。通过将ALP底物固定在本发明的酶联传感器附近，可以监测细菌细胞的ALP释放，以检测细菌细胞的生长。图16(B)作为非限制性示例示出了LDH酶(乳酸脱氢酶)在应激或死亡时由人细胞释放，这可以使用本发明的酶联传感器在存在于传感器附近的LDH底物的存在下进行检测到。图16(C)举例说明了RNA聚合酶(RNAP)酶联的传感器测定法，以检测细胞在细胞周期、细胞通讯、应激和死亡过程中释放的DNA链。在这种示例性情况下，RNAP酶被固定在传感器表面附近，在其他反应组分的存在下，RNAP酶将细胞释放的任何DNA链转录为除其他反应产物外的释放H+离子的RNA。H+离子的酶联传感器阵列检测可用于监测DNA分泌，从而告知细胞活性或细胞状态。
图17示出了响应在传感器装置附近的环境中的活动而检测到的示例性的传感器装置信号。图17(A)和(B)示出了FDEC传感器检测由酶底物或辅因子的流动或添加引发的激酶酶活性。图17(C)示出了在药物分子存在下FDEC传感器检测激酶酶活性的抑制，例如药物发现筛选或抗药性检测应用的情况。图17(D)示出了FDEC传感器检测磷酸酶对Tau酶底物的去磷酸化作用。
图18示出了根据本公开的示例性实施方式的连接传感器测定1800(或ELTAA)。连接传感器测定1800可以用于检测测试介质中导致传感器响应的细菌细胞的存在。包覆有抗体的磁珠可用于捕获测试介质中存在的任何细菌细胞(测试分析物)。然后可以使用初级结合剂结合至细菌细胞(测试分析物)，然后结合至与抗体偶联的报告酶。然后可以将珠子引入FDEC传感器装置，以在传感器附近呈现与分析物(细菌细胞)结合的ALP报告酶，并在其他反应成分存在下引入酶底物以启动ALP酶活性。FDEC传感器对ALP酶反应产生的离子的反应表明测试培养基中细菌细胞的存在。
在此所引用的所有出版物和参考文献的内容均与本公开内容不冲突，其全部内容通过引用整体并入本文。
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Claims (27)

1.一种用于检测目标分析物的装置，该装置包含：
传感器装置，其包含暴露于环境的表面；
捕获剂，其位于表面上或表面附近，捕获剂配置为选择性结合目标分析物；
任选地，初级结合剂，其与目标分析物结合；
报告酶，其与初级结合剂或目标分析物结合；以及
酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物，
其中传感器装置通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境电性质或表面机械性质的改变来产生信号。
2.如权利要求1所述的装置，其中所述捕获剂固定于表面上或表面附近。
3.如权利要求1所述的装置，其中所述目标分析物包括测试介质中的分子或生物标志物或离子物质。
4.如权利要求1所述的装置，其中所述酶反应产物包含离子。
5.如权利要求1所述的装置，其中所述酶反应产物与表面结合。
6.如权利要求1所述的装置，其中所述电性质包括一种或多种电荷和电位。
7.如权利要求1所述的装置，其中所述传感器装置包括场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。
8.如权利要求1所述的装置，其中所述传感器装置以阵列形式存在，其包括多个传感器装置和固定在每个传感器装置上或附近的独特的捕获剂。
9.如权利要求1所述的装置，其中所述传感器装置以阵列形式存在，其包括多个传感器装置和固定在阵列中的多个传感器装置上或附近的独特的捕获剂。
10.一种用于检测目标分析物的装置，该装置包含：
传感器基材，其包括传感器装置；
互补基材，其包括与目标分析物选择性结合的捕获剂；
任选地，初级结合剂，其与目标分析物结合；
报告酶，其与初级结合剂或目标分析物结合；以及
酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物，
其中传感器装置通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境电性质或表面机械性质的改变来产生信号。
11.如权利要求10所述的装置，其中所述互补基材包括捕获剂的阵列。
12.如权利要求10所述的装置，其中所述传感器基材包括传感器装置的阵列。
13.如权利要求10所述的装置，其中，包括传感器装置阵列的传感器基材与包括捕获剂的匹配阵列的互补基材对准、叠置，以形成微流体通道，用以在传感器基材和互补基材之间形成流体流动。
14.如权利要求13所述的装置，其中所述流动引发报告酶反应，从而产生酶反应产物。
15.如权利要求10所述的装置，其中所述互补基材包括多种捕获剂、和固定于多个点的每个点的独特的捕获剂。
16.如权利要求10所述的装置，其中所述互补基材包括使用抗表位抗体固定在表面上的表位标签融合蛋白，其中融合蛋白可以以阵列形式原位表达。
17.一种检测目标分析物的方法，该方法包括以下步骤：
提供传感器装置，其包括表面；
提供捕获剂，其位于表面或在表面附近；
将表面暴露于包括目标分析物的环境；
任选地，提供与目标分析物结合的初级结合剂；
提供与主要结合剂或目标分析物结合的报告酶；
提供酶底物，其在报告酶的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物；以及
使用传感器装置，通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境电性质或表面机械性质的改变来产生信号。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述传感器装置是场效应晶体管(FET)传感器或完全耗尽的指数耦合(FDEC)FET传感器。
19.一种用于检测目标分析物的装置，该装置包含：
传感器装置，其包含暴露于环境的表面；
捕获剂，其位于表面上或表面附近，捕获剂配置为选择性结合目标分析物；
任选地，初级结合剂，其与目标分析物结合；
酶底物偶联物，其与初级结合剂或目标分析物结合；以及
报告酶，其在酶底物的存在下进行生物化学反应以产生酶反应产物，
其中传感器装置通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境电性质或表面机械性质的改变来产生信号。
20.如权利要求19所述的装置，其中所述酶底物包含DNA链、RNA链、寡核苷酸链中的一个或多个，并且所述报告酶包含但不限于聚合酶或RNA聚合酶或转录酶或逆转录酶中的一个或多个。
21.一种酶联传感器测定，其包括：
传感器装置，其包含暴露于环境的表面；
任选地，捕获剂，其在表面上或表面附近，捕获剂被配置为与固定在传感器表面上或附近的与酶底物偶联物或报告酶偶联物之一互补的酶底物偶联物或报告酶偶联物之一结合，直接或使用捕获剂，互补报告酶或酶底物中的另一种在固定的偶联物存在下进行生物化学反应，以生成酶反应产物，
其中传感器装置通过检测由于酶反应产物的产生而导致的环境电性质或表面机械性质的改变来产生信号。
22.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中所述目标分析物是测试介质中分泌报告酶的细胞或病原体。
23.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中所述报告酶由细胞或病原体分泌。
24.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中药物分子被添加在生物化学反应中以测试耐药性。
25.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中将推定的药物分子添加到生物化学反应中，以筛选或发现新药物。
26.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中所述报告酶或酶底物是从患者的患病血液或组织或唾液或其他生物样品中分离出来的。
27.如权利要求21所述的酶联传感器测定，其中所述报告酶或酶底物是从病原体中分离出来的。
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