CN111712244A

CN111712244A - 包含(t)ew-7197的治疗或预防角膜内皮疾患的组合物或方法

Info

Publication number: CN111712244A
Application number: CN201880088873.9A
Authority: CN
Inventors: 小泉範子; 奥村直毅; 山本真弓
Original assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd
Current assignee: Senju Pharmaceutical Co Ltd; Doshisha Co Ltd
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2018-12-13
Publication date: 2020-09-25
Also published as: CN117045651A; JPWO2019117254A1; RU2020122861A; EP3725313A4; WO2019117254A1; KR20200112834A; JP7398729B2; EP3725313A1; US11857544B2; KR102693138B1; US20210077476A1

Abstract

本发明提供一种用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的组合物。本发明提供一种组合物，包含(T)EW‑7197(N‑((4‑([1,2,4]三唑并[1,5‑a]吡啶‑6‑基)‑5‑(6‑甲基吡啶‑2‑基)‑1H‑咪唑‑2‑基)甲基)‑2‑氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，以治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患为目的。

Description

包含(T)EW-7197的治疗或预防角膜内皮疾患的组合物或方法

技术领域

本发明涉及一种(T)EW-7197的新用途。具体而言，涉及一种包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的技术、方法及用于此的药剂，以及应用该技术的角膜内皮细胞的保存技术。

背景技术

视觉信息通过从眼球最前端的透明组织角膜输入的光到达视网膜，使视网膜的神经细胞兴奋，产生的电信号经由视神经传达到大脑的视皮层被识别。为了得到良好的视力，角膜需要是透明的。角膜的透明性是通过角膜内皮细胞的液泵作用和屏障作用保持一定的含水率从而保持的。

人的角膜内皮细胞在出生时的密度为每平方毫米约有3000个，但受损后的再生能力是十分有限的，角膜内皮病症之一Fuchs角膜内皮营养不良是角膜内侧的内皮细胞异常，产生角膜水肿的疾患，其原因不明。Fuchs角膜内皮营养不良中，胶原蛋白等细胞外基质沉淀在角膜后部的德斯密氏膜后面的一部分，产生角膜滴状物(corneal guttae)和德斯密氏膜肥厚。角膜滴状物(corneal guttae)和德斯密氏膜肥厚是Fuchs角膜内皮营养不良患者产生羞明、雾视的原因，显著地损害患者的生活品质。Fuchs角膜内皮营养不良被认为除角膜移植外没有其他有效的治疗方法，但日本的角膜提供量不足，等待角膜移植的患者有约2600人，但一年间国内进行的角膜移植只有1700例左右。

发明内容

解决课题的方法

本发明者发现，具有以下构造

[化1]

的(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)在角膜内皮障碍模型细胞中，示出了非常优异的抑制细胞障碍的效果。另外，(T)EW-7197即使浓度非常低，也有抑制细胞障碍的效果。并且，本发明人发现，(T)EW-7197可抑制在角膜内皮障碍模型细胞中，纤连蛋白等细胞外基质(ECM)的表达，治疗角膜内皮障碍中的ECM异常。

因此，本发明提供例如以下项目。

(项目1)

一种包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的组合物。

(项目2)

根据项目1所述的组合物，所述组合物用于抑制角膜内皮细胞密度的减少。

(项目3)

根据项目1或2所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

(项目4)

根据项目1所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达。

(项目5)

根据项目4所述的组合物，其中所述细胞外基质(ECM)选自由Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白组成的群。

(项目6)

根据项目4或5所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视组成的群。

(项目7)

根据项目1-6中任一项所述的医药组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良。

(项目8)

根据项目1-7中任一项所述的组合物，其中(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述组合物中的浓度是约0.001mM～约10mM。

(项目9)

根据项目1-8中任一项所述的组合物，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述组合物中的浓度是约0.01mM～约5mM。

(项目10)

根据项目1-9中任一项所述的组合物，其中组合物是滴眼剂。

(项目A1)

一种治疗或预防受试者的角膜内皮症状、障碍或疾患的方法，包含向受试者给药有效量的(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐或其溶剂化物。

(项目A2)

根据项目A1所述的方法，其中所述方法抑制角膜内皮细胞密度的减少。

(项目A3)

根据项目A1或A2所述的方法，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

(项目A4)

根据项目A1所述的方法，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达。

(项目A5)

根据项目A4所述的方法，其中所述细胞外基质(ECM)选自由Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白组成的群。

(项目A6)

根据项目A4或A5所述的方法，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视组成的群。

(项目A7)

根据项目A1-A6中任一项所述的方法，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良。

(项目A8)

根据项目A1-A7中任一项所述的方法，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物以约0.001mM～约10mM的浓度给药。

(项目A9)

根据项目A1-A8中任一项所述的方法，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物以约0.01mM～约5mM的浓度给药。

(项目A10)

根据项目A1-A9中任一项所述的方法，所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物作为滴眼剂给药。

(项目B1)

用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的医药制造中，(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用途。

(项目B2)

根据项目B1所述的用途，其中所述医药用于抑制角膜内皮细胞密度的减少。

(项目B3)

根据项目B1或B2所述的用途，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

(项目B4)

根据项目B1所述的用途，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达。

(项目B5)

根据项目B4所述的用途，其中所述细胞外基质(ECM)选自由Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白组成的群。

(项目B6)

根据项目B4或B5所述的用途，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视组成的群。

(项目B7)

根据项目B1-B6中任一项所述的用途，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良。

(项目B8)

根据项目B1-B7中任一项所述的用途，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述组合物中的浓度是约0.001mM～约10mM。

(项目B9)

根据项目B1-B8中任一项所述的用途，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述医药中的浓度是约0.01mM～约5mM。

(项目B10)

根据项目B1-B9中任一项所述的用途，所述医药是滴眼剂。

(项目C1)

一种用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的化合物，是(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。

(项目C2)

根据项目C1所述的化合物，其中所述化合物用于抑制角膜内皮细胞密度的减少。

(项目C3)

根据项目C1或C2所述的化合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

(项目C4)

根据项目C1所述的化合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达。

(项目C5)

根据项目C4所述的化合物，其中所述细胞外基质(ECM)选自由Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白组成的群。

(项目C6)

根据项目C4或C5所述的化合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视组成的群。

(项目C7)

根据项目C1-C6中任一项所述的化合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良。

(项目C8)

根据项目C1-C7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物以约0.001mM～约10mM的浓度给药。

(项目C9)

根据项目C1-C8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物以约0.01mM～约5mM的浓度给药。

(项目C10)

根据项目C1-C9中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物作为滴眼剂给药。

在本发明中，上述一个或多个特征除明示的组合外，还旨在进一步组合提供。本领域技术人员可根据需要阅读下文的详细说明并理解，从而认识到本发明的进一步实施方式和优点。

发明的效果

本发明提供一种可治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的医药，包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。进一步，本发明提供一种用于保存角膜内皮细胞的组合物或促进角膜内皮细胞增殖的组合物，包含(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。

附图说明

[图1]图1示出了作为角膜内皮障碍模型的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞(iFECD)的相差显微镜照片(左：未添加TGF-β，右：添加TGF-β)。

[图2]图2示出了用EW-7197和SB431542处理过的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞(iFECD)的相差显微镜照片。

[图3]图3示出了在图2中观察到的iFECD的细胞损伤抑制效果的评价的总结表。

[图4]图4示出了用EW-7197浓度依赖性地处理过的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞(iFECD)的相差显微镜照片。

[图5]图5示出了在存在SB431542的情况下，iFECD的细胞生存率和Caspase3/7活性的图表。

[图6]图6示出了在存在EW-7197的情况下，iFECD的细胞生存率和Caspase3/7活性的图表。

[图7]图7示出了关于iFECD的纤连蛋白、切割Caspase3和PARP的免疫印迹试验的结果。

[图8]图8示出了0.02％EW-7197滴眼组和溶剂(“vehicle”)点眼组的Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达面积的解析结果。纵轴示出了表达面积(像素(pixel))。

[图9]图9示出了0.02％和0.1％EW-7197滴眼组和溶剂(“vehicle”)滴眼组的纤连蛋白的表达面积的解析结果。纵轴示出了表达面积(像素)。左边图表示出了在40倍视野中，截取30000以下亮度解析的结果(中央部、6点方向及9点方向(耳侧))。右边的图表示出了在100倍视野中的解析结果(3点方向(鼻侧))。

具体实施方式

下文说明本发明。在本说明书的全文中，单数形式的表达在没有特别说明的情况下，应理解为也包含其复数形式的概念。因此，单数形式的冠词(例如英语中的“a”、“an”、“the”等)若未特别说明，应理解为也包含其复数形式的概念。另外，本说明书中使用的用语若未特别说明，为该领域中常用的意思。因此，除另有定义，本发明书中使用的所有专业术语和科学技术术语具有与本领域技术人员的一般性理解相同的意思。若有矛盾，以本说明书(包括定义)为准。

(定义)

在本说明书中，在没有特别说明的情况下，“约”是指其后数值的±10％。

在本说明书中，“受试者”是指本发明的用于治疗和预防的医药或方法的给药(移植)对象，作为受试者，可列举哺乳动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、马、羊、猴等)，优选灵长类，特别优选人。

在本说明书中，“EW-7197”和“TEW-7197”可互换使用，均指N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺。另外，在本说明书中，也有将“EW-7197”和“TEW-7197”一并记为“(T)EW-7197”的情况。

在本说明书中，“起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达”的角膜内皮的症状、障碍或疾患是指，主要与起因于细胞外基质的浑浊、沉淀、肥厚等相关的角膜内皮的症状、障碍或疾患，产生角膜内皮面的赘疣(滴状变性)、德斯密氏膜的浑浊滴状物等德斯密氏膜的肥厚等，与造成视力低下的症状相关。在Fuchs角膜内皮营养不良等角膜内皮障碍中，与角膜内皮细胞的细胞死亡(特别是细胞凋亡)造成的症状恶化不同，该细胞外基质的过剩产生即使没有发生细胞数减少，也会使视力、视感觉恶化，即使抑制了细胞死亡，也要进行处理。

在本发明书中，“衍生物”是指其核心结构与母体化合物相同或相似，但具有不同的官能团或加成的官能团等化学的或物理的修饰的化合物。衍生物具有与母体化合物相同或类似的生物学活性。

在本说明书中，“可药用盐”是指相对而言没有毒性的本发明化合物的无机或有机的酸加成盐。这些盐可以通过使在化合物的最终分离和纯化过程中暂时或以其游离碱形式被提纯的化合物与合适的有机酸或无机酸分别反应，并分离由此形成的盐来制备。

作为本发明化合物的可药用碱性盐，例如可列举钠盐、钾盐等碱金属盐，钙盐、镁盐等碱土金属盐，铵盐，三甲胺盐、三乙胺盐、二环己胺盐、乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、普鲁卡因盐、葡甲胺盐、二乙醇胺盐或乙二胺盐等脂肪族胺盐，N,N-二苄基乙二胺、苯乙苄胺盐等芳烷基胺盐，吡啶盐、甲基吡啶盐、喹啉盐、异喹啉盐等杂环芳香族胺盐，四甲基铵盐、四乙基铵盐、苄基三甲基铵盐、苄基三乙基铵盐、苄基三丁基铵盐，甲基三辛基铵盐、四丁基铵盐等季铵盐，精氨酸盐、赖氨酸盐等碱性氨基酸盐等。

作为本发明化合物的可药用酸性盐，例如可列举盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、高氯酸盐等无机酸盐，醋酸盐、丙酸盐、乳酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐等有机酸盐，甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐等磺酸盐，天冬酰胺酸盐、谷氨酰胺酸盐等酸性氨基酸盐等。

在本说明书中，“溶剂化物”是指本发明的化合物或其可药用盐的溶剂化物，例如包含有机溶剂的溶剂化物(例如醇(乙醇等)化物)、水合物等。形成水合物时，可以与任意数量的水分子配位。作为水合物，可列举1水合物、2水合物等。

在本说明书中，“iFECD”(immobilized Fuchs’endothelial corneal dystrophy)是Fuchs角膜内皮营养不良的永生化细胞的简称。

在本说明书中，“HCEC”(human corneal endothelial cells)是人角膜内皮细胞的简称。“iHCEC”是永生化(immobilized)人角膜内皮细胞的简称。

在本说明书中，“角膜内皮的症状、障碍或疾患”是指与角膜内皮相关联的任意症状、障碍或疾患，可代表性地列举Fuchs角膜内皮营养不良、滴状角膜、角膜移植后障碍、角膜内皮炎、外伤、眼科手术、眼科激光手术后的障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED)、特发性角膜内皮障碍、巨细胞病毒性角膜内皮炎，但不限于此。优选实施方式中，角膜内皮的症状、障碍或疾患包括Fuchs角膜内皮营养不良。在其他实施方式中，角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)过剩表达，例如，起因于Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白的过剩表达。

起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、障碍或疾患包括在角膜内皮中观察到ECM的过剩表达的任意症状、障碍或疾患，例如，Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜的肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视等，但不限于此。

(一般技术)

在本说明书中，使用的分子生物学的手法、生物化学的手法、微生物学的手法是在本领域公知、常用的，例如，记载于Sam brook J.et al.(1989).Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor和其第三版(2001)；Ausubel，F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Ausubel，F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology:ACompendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,GreenePub.Associates and Wiley-Interscience；Innis，M.A.(1990).PCR Protocols:A Guideto Methods and Applications，Academic Press；Ausubel，F.M.(1992).Short Protocolsin Molecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols inMolecular Biology，Greene Pub.Associates；Ausubel，F.M.(1995).Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.et al.(1995).PCR Strategies，AcademicPress；Ausubel，F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates；Sninsky，J.J.et al.(1999).PCR Applications:Protocols for Functional Genomics，Academic Press；Gait，M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach，IRL Press；Gait，M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis:A PracticalApproach，IRL Press；Eckstein，F.(1991).Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach，IRL Press；Adams，R.L.et al.(1992).The Biochemistry of theNucleic Acids，Chapman&Hall；Shabarova，Z.et al.(1994).Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids，Weinheim；Blackburn，G.M.et al.(1996).Nucleic Acidsin Chemistry and Biology，Oxford University Press；Hermanson，G.T.(1996).Bioconjugate Techniques，Academic Press；别册实验医学<基因导入&表达解析实验法>(「遺伝子導入&発現解析実験法」)羊土社，1997等。关于角膜内皮细胞，Nancy Joyce等的报告{Joyce，2004#161}{Joyce，2003#7}广为人知，但如上文提到的通过长期培养、继代培养产生成纤维细胞样形态转换，有效的培养法的研究现在也在进行。上述在本说明书中的相关部分(可以是全部)作为参考进行援用。

(优选实施方式的说明)

下文记载了优选实施方式的说明，但该实施方式是本发明的示例，应理解本发明的范围不限于该优选实施方式。应理解本领域技术人员可以参考下文的优选实施例，容易地在本发明的范围内做出改变、变更等。对于这些实施方式，本领域技术人员可以适当地对任意实施方式进行组合。

<组合物>

在一个方面，本发明提供一种包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的组合物。在多个实施方式中，本发明的组合物也可以抑制角膜内皮细胞密度的减少。本发明的组合物使用的(T)EW-7197可以与已知抑制角膜内皮障碍的SB431542同样地抑制角膜内皮障碍。令人吃惊的是，(T)EW-7197对角膜内皮障碍的抑制效果即使在非常低浓度的情况下也能够观察到，相对于SB431542在亚微摩尔(1μM～0.1μM)级没有观察到角膜内皮障碍抑制的效果，(T)EW-7197在0.03μM的低浓度也能够观察到非常优异的角膜内皮障碍的抑制效果。由此，本发明使用的(T)EW-7197可以在角膜内皮发挥非常好的治疗效果。另外，在细胞生存率实验中，基本没有观察到对细胞的毒性，(T)EW-7197的安全性也很好。

在其他方面，提供一种包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，用于抑制角膜内皮细胞密度的减少的组合物。

在其他方面，本发明提供用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物(下文也称为本发明的化合物等)。在多个实施方式中，本发明的化合物等用于抑制角膜内皮细胞密度的减少。本发明的化合物等中的(T)EW-7197与已知抑制角膜内皮障碍的SB431542同样地可以抑制角膜内皮障碍。令人吃惊的是，(T)EW-7197对角膜内皮障碍的抑制效果即使在非常低浓度的情况下也能够观察到，相对于SB431542在亚微摩尔(1μM～0.1μM)级没有观察到角膜内皮障碍抑制的效果，(T)EW-7197在0.03μM的低浓度也能够观察到非常优异的角膜内皮障碍的抑制效果。由此，本发明使用的(T)EW-7197可以在角膜内皮发挥非常好的治疗效果。另外，在细胞生存率实验中，基本没有观察到对细胞的毒性，(T)EW-7197的安全性也很好。

本发明的组合物可以是医药组合物(例如，滴眼剂、前房内注射剂、玻璃体内注射剂、结膜下注射剂)。医药组合物可以进一步包括可药用载体。作为可药用载体，为了适合所需的特定剂型，可列举各种溶剂、稀释剂或其他的液体载体、分散或悬浊助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、保存剂、固体结合剂、润滑剂等，但不限于此。Remington’sPharmaceutical Sciences,Gennaro编，Mack Publishing,Easton,PA,1995年公开了在医药组合物的制剂化和其制备的公知技术中使用的各种载体。作为可达到可药用载体的效果的材料的一部分示例，不限于此但可列举，乳糖、葡萄糖、蔗糖等糖，玉米淀粉和土豆淀粉等淀粉，纤维素及羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素等纤维素衍生物，黄蓍胶末，麦芽，明胶，滑石，可可脂和栓剂蜡等赋形剂，花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油等油，丙二醇等二醇，油酸乙酯和月桂酸乙酯等酯，琼脂，氢氧化镁和氢氧化铝等缓冲剂，海藻酸，不含发热性物质的水，等渗食盐水，林格氏液，乙醇，磷酸缓冲溶液等，根据调配者的判断，月桂基硫酸钠和硬脂酸镁等其他无毒且适合的润滑剂、着色剂、释放剂、涂覆剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、保存剂和防氧化剂也可以存在于组合物中。

在一个实施方式中，本发明的组合物可以治疗或预防起因于角膜内皮细胞密度减少的角膜内皮的症状、障碍或疾患。作为起因于角膜内皮细胞密度减少的角膜内皮的症状、障碍或疾患，可选自由Fuchs角膜内皮营养不良、滴状角膜、后部多形性角膜营养不良、虹膜角膜内皮综合征、先天性遗传性角膜内皮营养不良、病毒性疾患(巨细胞病毒性角膜内皮炎、单纯疱疹病毒性角膜内皮炎)、剥脱性综合征、角膜移植后排斥反应、大泡性角膜病变、角膜移植后障碍、角膜内皮炎、外伤、眼科手术、眼科激光手术后的障碍、老化组成的群。

在一个实施方式中，角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、滴状角膜、角膜移植后障碍、角膜内皮炎、外伤、眼科手术、眼科激光手术后的障碍、老化、后部多形性角膜营养不良(PPD:posterior polymorphous dystrophy)、先天性遗传性角膜内皮营养不良(CHED:congenital hereditary endothelial dystrophy)、特发性角膜内皮障碍、及巨细胞病毒性角膜内皮炎组成的群。在其他的实施方式中，角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

进一步，在其他方面，本发明提供包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物，用于治疗或预防起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、障碍或疾患的组合物。在其他方面，本发明提供用于治疗或预防起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、损害障碍或疾患的(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物(下文也称为本发明的化合物等)。(T)EW-7197意外地，能够抑制角膜内皮细胞的纤连蛋白等细胞外基质(ECM)的异常(例如过剩表达)。另外，例如，在Fuchs角膜内皮营养不良中也确认了Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白等细胞外基质(ECM)的异常(例如过剩表达)，本发明的组合物或本发明的化合物等也可抑制这些细胞外基质(ECM)的异常。作为起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、障碍或疾患，例如可列举Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明、雾视等。Fuchs角膜内皮营养不良是角膜内皮细胞的密度显著减少，而且细胞外基质沉淀于德斯密氏膜，产生角膜滴状物(Corneal guttae)和德斯密氏膜肥厚的疾患，因此抑制细胞外基质的过剩表达可以明显改善Fuchs角膜内皮营养不良的治疗和预防，根据情况，能够完全治愈。另外，可以改善、处理或预防与由Fuchs角膜内皮营养不良等角膜内皮障碍中细胞外基质过剩产生可引起的角膜滴状物(Corneal guttae)和德斯密氏膜肥厚或其他与浑浊、沉淀关联的症状(迁延化角膜水肿引起的不可逆的角膜基质浑浊等)。进一步，聚集蛋白等蛋白聚糖的过剩表达在Fuchs角膜内皮营养不良中也得到了确认，聚集蛋白等蛋白聚糖的过剩表达会引起与上述角膜滴状物(Corneal guttae)和德斯密氏膜肥厚或其他与浑浊、沉淀关联的症状。本发明的组合物或本发明的化合物等也可以抑制聚集蛋白等蛋白聚糖的过剩表达。

在一个实施方式中，作为本发明的利用方法，例如可列举滴眼剂，但不限于此，可列举眼软膏、前房内注射，缓释剂的浸渍，结膜下注射，全身给药(内服、静脉注射)等给药方式(给药方法和剂型)。

本发明中使用的(T)EW-7197的浓度一般约0.001～约100μM(μmol/l)，优选约0.01～约30μM，更优选约0.03～约10μM，进一步优选约0.03～约1μM，其他浓度范围例如一般可列举约0.01nM～约100μM、约0.1nM～约100μM、约0.001～约100μM、约0.01～约75μM、约0.05～约50μM、约1～约10μM、约0.01～约10μM、约0.05～约10μM、约0.075～约10μM、约0.1～约10μM、约0.5～约10μM、约0.75～约10μM、约1.0～约10μM、约1.25～约10μM、约1.5～约10μM、约1.75～约10μM、约2.0～约10μM、约2.5～约10μM、约3.0～约10μM、约4.0～约10μM、约5.0～约10μM、约6.0～约10μM、约7.0～约10μM、约8.0～约10μM、约9.0～约10μM、约0.01～约50μM、约0.05～约5.0μM、约0.075～约5.0μM、约0.1～约5.0μM、约0.5～约5.0μM、约0.75～约5.0μM、约1.0～约5.0μM、约1.25～约5.0μM、约1.5～约5.0μM、约1.75～约5.0μM、约2.0～约5.0μM、约2.5～约5.0μM、约3.0～约5.0μM、约4.0～约5.0μM、约0.01～约3.0μM、约0.05～约3.0μM、约0.075～约3.0μM、约0.1～约3.0μM、约0.5～约3.0μM、约0.75～约3.0μM、约1.0～约3.0μM、约1.25～约3.0μM、约1.5～约3.0μM、约1.75～约3.0μM、约2.0～约3.0μM、约0.01～约1.0μM、约0.05～约1.0μM、约0.075～约1.0μM、约0.1～约1.0μM、约0.5～约1.0μM、约0.75～约1.0μM、约0.09～约35μM、或约0.09～约3.2μM，更优选约0.01～约10μM、约0.1～约3μM，或约0.1～约1.0μM，但不限于此。

作为滴眼剂使用时，考虑用泪液等稀释，也考虑到毒性，可以以上述有效浓度的约1～10000倍，优选约100～10000倍，例如约1000倍为基准，决定制剂浓度，也可以设定为超出上述的浓度。例如，约0.01μM(μmol/l)～约1000mM(mmo1/1)、约0.03μM～约1000mM、约0.1μM～约100mM、约0.3μM～约100mM、约1μM～约100mM、约3μM～约100mM、约10μM～约100mM、约30μM～约100mM、约0.1μM～约30mM、约0.3μM～约30mM、约1μM～约30mM、约3μM～约30mM、约1μM～约10mM、约3μM～约10mM、约10μM～约1mM、约30μM～约1mM、约10μM～约10mM、约30μM～约10mM、约100μM～约10mM、约300μM～约10mM、约10μM～约100mM、约30μM～约100mM、约100μM～约100mM、约300μM～约100mM，可以是约1mM～约10mM、约1mM～约50mM、约1mM～约100mM，这些上限、下限可以适当组合进行设定。

在一个实施方式中，(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物可以约0.03μM～约10μM，优选约0.03μM～约1μM的浓度存在于所述组合物中。

更进一步的实施方式中，本发明的组合物作为滴眼剂被提供，(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物可以约0.03mM～约100mM存在，优选以约0.001mM～约10mM，更优选约0.05mM～约10mM，进一步优选约0.01mM～约5mM，最优选0.1mM～约5mM存在。在特定的实施方式中，作为滴眼药被提供的本发明的组合物可包含约0.5mM的(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。

对治疗特定疾患、障碍或状态有效的本发明的医药的有效量可根据障碍或状态的性质变动，本领域技术人员可以基于本说明书的记载根据标准的临床技术决定。进一步，根据需要，可以使用体外试验，辅助鉴定最适合给药量范围。欲用于调配物的正确用量可根据给药途径以及疾患或障碍的严重性变动，因此必须根据主治医生的判断和各患者的状况决定。但是，给药量没有特殊限制，例如，每次可以为0.001、1、5、10、15、100或1000mg/kg体重，也可以是上述任两个值的范围内。给药间隔没有特殊限制，例如可以是每1、7、14、21或28天给药1或2次，也可以是每上述任两个值范围内给药1或2次。给药量、给药次数、给药间隔、给药期间、给药方法可以根据患者的年龄、体重、症状、给药方式、对象器官等适当选择。例如，本发明可作为滴眼剂使用。另外，也可以将本发明的医药注射到前房。另外，治疗药优选包含治疗有效量，或发挥预期作用的有效量的有效成分。在给药后治疗标记显著减少的情况下，则可判断具有治疗效果。有效用量可以通过体外(in vitro)或动物模型实验得到的用量-反应曲线推测。

<治疗或预防方法>

在一个方面，本发明提供一种治疗或预防受试者的角膜内皮的症状、障碍或疾患的方法，包含将(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的有效量给药至该受试者。在本说明书中，在<组合物>等中记载的上述一个或多个实施方式可在本发明的方法中适当使用。

进一步在其他方面，本发明提供一种治疗或预防起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、障碍或疾患的方法，包含将(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的有效量给药至该受试者。在本说明书中，在<组合物>等中记载的上述一个或多个实施方式可在本发明的方法中适当使用。

<用途>

在一个方面，本发明提供一种用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的医药的制造中(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用途。在本说明书中，在<组合物>等中记载的上述一个或多个实施方式可在本发明的用途中适当使用。

进一步在其他方面，本发明提供一种用于治疗或预防起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达的角膜内皮的症状、障碍或疾患的医药的制造中(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的使用。在本说明书中，在<组合物>等中记载的上述一个或多个实施方式可在本发明的用途中适当使用。

<用于保存的组合物和保存方法>

在其他方面，本发明提供一种包含(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用于角膜内皮细胞的保存的组合物。在优选实施方式中，保存是冻结保存。应当理解，在本发明中使用的(T)EW-7197能够使用本说明书中说明的任意状态，例如，在作为医药所说明的实施方式中，作为用于保存的组合物的适合的状态。在本说明书中，“用于保存的组合物”是指用于将从供体取出的角膜片在直到移植到受体为止的期间进行保存，或用于保存增殖前或已增殖的角膜内皮细胞的组合物。

在一个方面，本发明提供一种用于保存角膜内皮细胞的组合物的制造中(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用途。在其他方面，提供一种用于保存角膜内皮细胞的(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。进一步在其他方面，提供一种保存角膜内皮细胞的方法，包括使用包含(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用于保存角膜内皮细胞的组合物进行保存。

在1个实施方式中，本发明的用于保存的组合物可以通过添加本发明的(T)EW-7197至传统使用的保存剂或保存液中来制备。作为上述角膜保存液可以列举角膜移植时常用的保存液(角巩膜片保存液(Optisol GS：注册商标)，角膜移植用眼球保存液(EPll：注册商标))，生理盐水，磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。

本发明的用于保存的组合物用于器官移植等时的角膜保存。另外，本发明的用于保存的组合物用作用于冻结保存角膜内皮细胞的保存液或其成分。

在用于冻结保存的本发明用于保存的组合物的其他实施方式中，也可以向已知的冻结保存液添加本发明的包含(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物的用于保存的组合物进行使用。作为冻结保存液，可列举Takara Bio提供的CELLBANKER(注册商标)系列(CELL BANKER PLUS(目录编号:CB021)、CELL BANKER 2(目录编号:CB031)、STEM-CELLBANKER(目录编号:CB043)等)，KM BANKER(Kohjin Bio目录编号:KOJ-16092005)，和无动物源成分冻存液(Freezing Medium，Animal Component Free，CRYO Defined)(也记载为Cnt-CRYO)(CELLNTEC目录编号:CnT-CRYO-50)，但不限于此。进一步，在其他的实施方式中，使用的冻结保存液也可以是KM BANKER。另外，本领域技术人员可适当变更上述冻结保存液的构成成分，或进一步添加构成成分，使用经改良的适当的冻结保存液。为了冻结保存，可以进一步向本发明的保存液中添加甘油，二甲基亚砜，丙二醇，乙酰胺等。

在本说明书中，引用的科学文献、专利、专利申请等参考文献其全部，与各自的具体记载相同程度地，作为参考引用至本说明书中。

为了便于理解，上文示出了优选实施方式说明了本发明。下文基于实施例对本发明进行说明，上述说明和下文实施例仅作为示例，不以限定本发明为目的。因此，本发明的范围不限于本说明书中具体记载的实施方式和实施例，仅限定于权利要求书。

实施例

下文记载了本发明的示例。适用的生物样品等的处理符合厚生劳动省、文部科学省等规定的标准，在适用的情况下，基于赫尔辛基宣言或基于该宣言制定的伦理规定下进行。研究用眼的捐赠已获得所有已故捐赠者亲属的同意。本研究得到了埃尔朗根大学(德国)、SightLife^TM(华盛顿州，西雅图市)眼库伦理委员会或其相应机构的批准。

(制备例:来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞株(iFECD)模型的制作)

在本实施例中，从来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞制作了永生化角膜内皮细胞株(iFECD)。

(培养方法)

将角膜内皮细胞与基底膜一起从由西雅图眼库购入的研究用角膜机械剥离，使用胶原酶从基底膜分离并回收后，进行初代培养。培养基使用在Opti-MEM I减血清培养基，液体(Reduced-Serum Medium，Liquid)(INVITROGEN目录编号:31985-070)中添加了8％FBS(BIOWEST、目录编号:S1820-500)、200mg/m1 CaCl₂·2H₂O(SIGMA目录编号:C7902-500G)、0.08％硫酸软骨素(SIGMA目录编号:C9819-5G)、20μg/ml抗坏血酸(SIGMA目录编号:A4544-25G)、50μg/ml庆大霉素(INVITROGEN目录编号:15710-064)和5ng/ml表皮生长因子(EGF)(INVITROGEN目录编号:PHG0311)，并用于3T3饲养细胞使之驯化后的培养基作为基础培养基。另外用向基础培养基中添加了SB431542(1μmol/l)和SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5(4-吡啶基)咪唑<4-[4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-1H-咪唑-5-基]吡啶>)(1μmol/l)的培养基(在本说明书中也称为“SB203580+SB431542+3T3驯化培养基”)进行培养。

(取得方法)

经根据Fuchs角膜内皮营养不良的临床诊断确认发展为大泡性角膜病变而进行了角膜内皮移植(德斯密氏膜内皮角膜移植＝DMEK)的3名人类患者的书面同意和伦理委员会的批准下，获得角膜内皮细胞。在进行DMEK时，机械地将病变的角膜内皮细胞和基底膜即德斯密氏膜一起剥离，浸渍于角膜保存液Optisol-GS(Bausch&Lomb公司)。之后，进行胶原酶处理，酶法回收角膜内皮细胞，通过SB203580+SB431542+3T3驯化培养基进行培养。培养的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞通过PCR使SV40大T抗原和hTERT基因扩增，导入至慢病毒载体(pLenti6.3_V5-TOPO；Life Technologies公司)。之后，将慢病毒载体与3种辅助质粒(helper plasmid)(pLP1，pLP2，pLP/VSVG；Life Technologies公司)一起，使用转染试剂(Fugene HD；Promega公司，威斯康星州，麦迪逊市)，感染293T细胞(RCB2202；Riken生物资源中心,日本，茨城)。感染48小时后，收集含有病毒的培养上清液，使用5μg/ml的聚凝胺，加入至培养的来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的角膜内皮细胞的培养液，导入SV40大T抗原和hTERT基因。确认来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化角膜内皮细胞株(iFECD)的相差显微镜照片。作为对照，将从西雅图眼库进口的研究用角膜培养的角膜内皮细胞以相同的方法永生化，制备正常角膜内皮细胞的永生化细胞株(iHCEC)。来自健康供体的永生化角膜内皮细胞株(iHCEC)和永生化角膜内皮细胞株(iFECD)的相差显微镜照片显示，iHCEC和iFECD均与正常角膜内皮细胞同样地具有一层多边形形状。iHCEC和iFECD通过杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM))+10％胎牛血清(FBS)进行维持培养。

(相差显微镜的观察例)

从正在培养来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化人角膜内皮细胞(iFECD)的培养皿去除培养基，添加事先加热到37℃的1×PBS(-)，洗涤。重复两次该操作。再添加1×PBS(-)，在37℃(5％CO₂)下，进行5分钟温育。去除PBS(-)后，添加0.05％胰蛋白酶-EDTA(Nacalai Tesque，32778-34)，在37℃(5％CO₂)下，进行5分钟温育。之后，用培养基悬浮，以1500rpm离心3分钟来回收细胞。培养基使用了DMEM(Nacalai Tesque，08456-36)+10％FBS(Biowest,S1820-500)+1％P/S(Nacalai Tesque，26252-94)。

以一个孔8.0×10⁴个的比例向12孔板播种来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化人角膜内皮细胞(iFECD)，在37℃(5％CO₂)下，培养24小时。培养基使用了DMEM+10％FBS+1％P/S。

24小时后，更换培养基，再培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，添加10ng/ml的重组人转化生长因子β2(TransformingGrowth Factor-β2Human recombinant)(WAKO，200-19911)，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。24小时后，在相差显微镜下观察细胞形态和细胞凋亡。

如图1所示，来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化人角膜内皮细胞(iFECD)经TGF-β刺激的情况下，明显发生细胞障碍。

(实施例1：EW-7197对角膜内皮细胞障碍的抑制效果)

在本实施例中，使用来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化人角膜内皮细胞(iFECD)，观察EW-7197对角膜内皮细胞障碍的抑制效果。细胞的观察方法是基于上述观察例进行的。作为对象，使用了已知抑制角膜内皮细胞障碍的SB431542(参照国际公开第2015/064768号)。

(材料和方法)

向12孔板播种iFECD，培养24小时后，去除培养基，添加SB431542(WAKO，192-16541)和EW-7197(Selleck Chemicals，S7530)分别至0.1，0.3,1,3,10μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，与10ng/ml的重组人转化生长因子β2(WAKO，200-19911)一起，添加SB431542和EW-7197分别至0.1，0.3,1,3,10μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，在相差显微镜下观察细胞形态和细胞凋亡。

(结果)

图2、图3示出了结果。使用SB431542预处理时，在3μM和10μM，特别是10μM时，观察到了角膜内皮细胞的障碍被抑制，特别是10μM时，观察到角膜内皮细胞的障碍被有效地抑制。另一方面，使用EW-7197预处理时，特别是在0.1，0.3,1μM时，观察到角膜内皮细胞的障碍被有效地抑制。另外，也确认了在3μM和10μM时的角膜内皮细胞障碍的抑制效果。令人吃惊的是，显然可见EW-7197与迄今已知可抑制角膜内皮细胞障碍的SB431542相比，在极低浓度的情况下，也能够抑制角膜内皮细胞的障碍。

(实施例2：EW-7197浓度的探讨)

在本实施例中，探讨了观察到角膜内皮细胞障碍有效得以抑制的效果的EW-7197浓度。角膜内皮细胞障碍的抑制效果使用与实施例1相同的方法进行了观察。

(材料和方法)

以7.0×10⁴个的比例向12孔板播种iFECD，培养24小时后，去除培养基，添加EW-7197(Selleck Chemicals，S7530)至0.001，0.003,0.01，0.03，0.1，0.3，1,3,10，30μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，添加10ng/ml的重组人转化生长因子β2(WAKO，200-19911)和EW-7197至0.001，0.003,0.01，0.03，0.1，0.3，1,3,10，30μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，在相差显微镜下观察细胞形态和细胞凋亡。

(结果)

结果如图4所示。来自Fuchs角膜内皮营养不良患者的永生化人角膜内皮细胞(iFECD)经TGF-β刺激的情况下，细胞明显受损。在添加了EW-7197的组中，特别是0.03，0.1，0.3，1μM时，观察到了非常优异的角膜内皮细胞障碍的抑制效果。另外，也确认了在3μM和10μM时，可有效地抑制角膜内皮细胞的障碍。由此，显然可见EW-7197在广泛的浓度范围能够有效地抑制角膜内皮细胞的障碍。

(实施例3:细胞生存率和Caspase3/7活性)

在本实施例中，进行了在EW-7197存在下的细胞生存率和Caspase3/7活性的解析。SB431542用作比较对照。

(材料和方法)

(细胞生存率的解析)

以每个孔3×10³个的比例向96孔板播种iFECD，在37℃(5％CO₂)下培养至融合。培养基使用了DMEM+10％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，添加SB431542(WAKO，192-16541)和EW-7197(SelleckChemicals，S7530)分别至0.01，0.1,1,10μM的终浓度，培养48小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，在相差显微镜下观察细胞形态。

观察后，以下述顺序，通过Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测(LuminescentCell Viability Assay)进行细胞生存率的解析。舍弃培养基以使得每孔为50μl，以50μl/孔添加Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测溶液(Promega，G7572)以与培养基成1:1。之后的操作在遮光环境下进行。使用振荡器以约120min^-1充分混合2分钟，静置10分钟。静置后，向检测板(Assay plate)(Corning，3912，96孔检测板，白聚苯乙烯)转移80μl，使用GloMax多功能检测系统(Multi Detection System)(Promega、E7051)测定吸光度。

(Caspase 3/7的解析)

24小时后，去除培养基，添加SB431542(WAKO，192-16541)和EW-7197(SelleckChemicals，S7530)分别至0.01，0.1,1,10μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，添加10ng/ml的重组人转化生长因子β2(WAKO、200-19911)和SB431542至0.01，0.1,1,10μM的终浓度，培养24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后在相差显微镜下观察细胞形态。

观察后，以下述顺序，通过Caspase-Glo 3/7检测进行Caspase 3/7活性的测定。舍弃培养基以使得每孔为50μl，以50μl/孔添加Caspase Glo 3/7检测试剂(Caspase-Glo 3/7检测缓冲液和Caspase-Glo 3/7检测底物的混合液)(Promega、G8091)溶液以与培养基成1:1。之后的操作在遮光环境下进行。使用振荡器以约120min^-1充分混合2分钟，在室温下静置40分钟。静置后，向检测板(Corning，3912，96孔检测板，白聚苯乙烯)转移80μl，使用GloMax多功能检测系统(Promega、E7051)测定吸光度。

另外，作为阳性对照，使用了Caspase抑制剂10μM Z-VD-FMK(WAKO，262-02061)。

(结果)

(细胞生存率的解析)

图5和图6示出了结果。通过Cell Titer-Glo发光法细胞活力检测对细胞生存率进行了测定，其结果显示，在添加了SB431542时，0.01，0.1，1，10μM的所有的浓度下，与对照组相比，细胞生存率不具备显著性差异。由此，在0.01，0.1，1，10μM的浓度下，添加SB431542没有对细胞产生损害。同样，在添加了EW-7197时，0.01，0.1，1，10μM的所有的浓度下，与对照组相比，细胞生存率不具备显著性差异。由此，在0.01，0.1，1，10μM的浓度下，添加EW-7197没有对细胞产生损害。

(Caspase 3/7的解析)

图5和图6示出了结果。Caspase-Glo 3/7检测能够测定伴随着细胞凋亡诱导的Caspase 3/7活性。换言之，Caspase 3/7活性越高，越表示诱导出细胞障碍。通过图5可知，使用TGF-β刺激时，与未刺激时相比，Caspase 3/7有显著活性。另一方面，添加SB431542时，以0.01，0.1，1，10μM的顺序，Caspase 3/7的活性降低，特别是在10μM时，与未受TGF-β刺激的对照组的值相当。因此，SB431542浓度依赖性地抑制Caspase 3/7的活性，10μM时最有效地示出了其效果。添加EW-7197时，0.01μM时显著抑制了Caspase 3/7的活性，特别是0.1，1，10μM时，与未受TGF-β刺激的对照组的值相当。显然可见EW-7197也与SB431542同样地，会抑制Caspase 3/7的活性。特别是EW-7197即使在0.1μM的浓度时，也观察到了与SB431542相比更大的抑制效果。

(实施例4:免疫印迹试验)

在本实施例中，使用免疫印迹试验确认了添加EW-7197时iFECD的纤连蛋白(约240kDa)、活化型切割Caspase 3(约17kDa)和PARP(约89kDa)的表达。

(材料和方法)

以每个孔8.0×10⁴个的比例向12孔板播种iFECD，在37℃(5％CO₂)下，培养24小时。培养基使用了DMEM+10％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，以使得EW-7197(Selleck Chemicals，S7530)的终浓度为0.1，1，10μM，SB431542(WAKO，192-16541)的终浓度为10μM的方式培养了24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，去除培养基，以使得10ng/ml的重组人转化生长因子β2(WAKO、200-19911)和EW-7197的终浓度为0.1，1，10μM，SB431542的终浓度为10μM的方式培养了24小时。培养基使用了DMEM+2％FBS+1％P/S。

24小时后，在相差显微镜下观察细胞形态和细胞凋亡。

观察后，以下述顺序，进行蛋白质的免疫印迹试验。

1)蛋白质的回收

为了也回收浮游细胞和死细胞，在冰上回收培养基，也回收将细胞用1×PBS(-)洗涤2次的溶液，以4℃、800g、5min离心，舍去上清液，得到沉淀物。

经洗涤的细胞在冰上加入蛋白质提取用缓冲液(RIPA；50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％SDS、0.5％DOC、1％NP-40)，提取蛋白质。

之后，与上述浮游细胞和死细胞的离心后的沉淀物一起悬浮，提取。回收的液体用超声波装置(BIORUPTOR、TOSHO DENKI制)在冷水中以30秒粉碎3次后，以4℃、15000rpm、10min离心，回收蛋白质的上清液。

2)免疫印迹试验法

用SDS-PAGE分离上述提取的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上。另外，蛋白量是纤连蛋白、PARP和GAPDH为4μg，Caspase3为10μg。一抗使用了小鼠抗纤连蛋白抗体(BDBiosciences、610077)，兔抗Caspase3抗体(Cell Signaling、9662)，兔抗PARP抗体(CellSignaling、9542)，小鼠抗GAPDH抗体(MBL社、M171-3)。

二抗使用了过氧化物酶标记的抗兔抗体，抗小鼠抗体(GE HealthcareBiosciences、NA931V，NA934V)。对一抗而言，20000倍稀释小鼠抗纤连蛋白抗体，1000倍稀释兔抗PARP抗体，1000倍稀释兔抗Caspase3抗体，3000倍稀释小鼠抗GAPDH抗体，二抗均5000倍稀释。检测使用了Chemi Lumi ONE UItra(Nacalai Tesque、11644-40)。检测的带强度通过Lumino图像分析仪LAS-4000mini(富士film社)和ImageQuantTM软件(GEHealthcare社)进行解析。

(结果)

图7示出了结果。使用TGF-β刺激iFECD的情况下，确认了纤连蛋白(约240kDa)，活化型切割Caspase 3(约17kDa)和PARP(约89kDa)的表达。另一方面，在EW-7197存在时，在任一浓度下，纤连蛋白的表达被抑制到与未使用TGF-β刺激的对照组和10μM的SB431542相同程度。另外，活化型切割Caspase 3和PARP的活性也被抑制到与未使用TGF-β刺激的对照组和10μM的SB431542相同程度。因此，通过免疫印迹试验解析，显然可见EW-7197与SB431542同样地抑制纤连蛋白的表达。

(实施例5：使用Col8a2基因敲入小鼠进行的EW-7197滴眼液对于Fuchs角膜内皮营养不良的药效评价)

在本实施例中，使用Fuchs角膜内皮营养不良模型动物Col8a2基因敲入小鼠，对EW-7197滴眼液对于Fuchs角膜内皮营养不良的药效做了评价。Col8a2基因敲入小鼠是建立的Fuchs角膜内皮营养不良动物模型(文献Jun et al.，Hum Mol Genet.2012Jan 15；21(2):384-93)。

(材料和方法)

向4个月龄的Ⅷ型胶原蛋白α2基因(Col8a2)敲入小鼠两眼进行滴眼给药，给予0.02％(约0.5mM)EW-7197滴眼液或溶剂(含有7％DMSO的PBS)5μL，1日4次，持续8周。滴眼前，滴眼2，4，6，8周后使用角膜内皮显微镜KS3M(株式会社Konan Medical)测量角膜内皮细胞密度。滴眼8周后，将过量(200mg/kg体重以上)的戊巴比妥钠(Somnopentyl)麻醉用注射液(共立制药株式会社)通过腹腔给药使小鼠安乐死，确认心脏停止后，采取双眼眼球。切开采取的眼球，做成角膜片，按照下文步骤进行Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的免疫染色。使用Image-Pro(株式会社Nippon Roper)解析了Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达面积。

(Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的免疫染色方法)

将小鼠角膜片在4％多聚甲醛中室温下固定10分钟后，加入0.5％TritonX-100，进行5分钟浸透化处理。加入1％牛血清白蛋白(BSA)，室温下进行1小时温育后，将角膜片浸渍于一抗液，在4℃温度下反应一晚。一抗使用了Ⅰ型胶原蛋白多克隆抗体(RocklandImmunochemicals)的1:200稀释液，纤连蛋白多克隆抗体(abcam)的1:250稀释液。接下来，将角膜片浸渍于二抗液和DAPI溶液(株式会社同仁化学研究所)的混合液，遮光并在室温下反应1个小时。二抗使用了Alexa Fluor(注册商标)488标记羊抗兔IgG(LifeTechnologies)的1:2000稀释液。DAPI溶液1:1000稀释后使用。使角膜片伸展，放置于载玻片上，盖上盖玻片封存。使用共聚焦激光扫描型显微镜奥林巴斯FV1000 FLUOVIEW(奥林巴斯株式会社)观察制作的标本。

(结果)

表1示出了Col8a2基因敲入小鼠从滴眼前到滴眼4周和8周后的角膜内皮细胞密度的变化量(ΔECD(细胞/mm²))的结果。另外，观察到未导入Col8a2基因的正常小鼠4周后角膜内皮细胞密度减少51.5个细胞/mm²，8周后角膜内皮细胞密度减少123.6个细胞/mm²。正常小鼠角膜内皮细胞的少量减少原因可认为是因为年龄增长，角膜内皮细胞减少。

[表1]

表1Col8a2基因敲入小鼠角膜内皮细胞密度的变化量(ΔECD(细胞/mm²))

表1显示，在0.02％EW-7197滴眼液给药组，与溶剂给药组相比，角膜内皮细胞密度的减少显著地被抑制。在Col8a2基因敲入小鼠中，通过免疫染色观察到Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达显著增加。图8示出了Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达面积的解析结果。在0.02％EW-7197滴眼液给药组，与溶剂给药组相比，Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白的表达有减少的倾向。

由此，显然可见，通过EW-9197滴眼，EW-9197充分移至角膜内皮，有效地抑制了以角膜内皮细胞的减少(角膜内皮细胞的细胞凋亡等)和/或细胞外基质(Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白等)的过剩表达为代表的角膜内皮障碍。

(实施例6:使用Col8a2基因敲入小鼠进行的各种浓度的EW-7197滴眼液对于Fuchs角膜内皮营养不良的药效评价)

在本实施例中，使用Col8a2基因敲入小鼠，进行了各种浓度的EW-7197滴眼液对于Fuchs角膜内皮营养不良的药效的评价。

(方法)

向4个月龄的Ⅷ型胶原蛋白α2基因(Col8a2)敲入小鼠两眼进行滴眼给药，给予0.02％(约0.5mM)EW-7197滴眼液、0.1％(约2.5mM)EW-7197滴眼液或溶剂(含有DMSO的磷酸缓冲液)5μL，1日4次，持续12周。根据需要，溶剂中加入了表面活性剂。只要是本领域技术人员，均可使用适当的表面活性剂(本濑贤治(1984).《滴眼剂》南山堂；日本医药品添加剂协会(2016).《医药品添加物辞典》药事日报社)。滴眼前，滴眼3，6，9，12周后使用角膜内皮显微镜KS3M(株式会社Konan Medical)测量角膜中央部的角膜内皮细胞密度。滴眼12周后，将过量(200mg/kg体重以上)的戊巴比妥钠麻醉用注射液(共立制药株式会社)通过腹腔给药使小鼠安乐死，确认心脏停止后，采取双眼眼球。切开采取的眼球，做成角膜片，进行纤连蛋白的免疫染色。免疫染色方法如下所述。使用Image-Pro(株式会社Nippon Roper)解析了纤连蛋白的表达面积。

(纤连蛋白的免疫染色方法)

将小鼠角膜片在4％多聚甲醛中室温下固定10分钟后，加入0.5％TritonX-100，进行5分钟浸透化处理。加入1％牛血清白蛋白(BSA)，室温下进行1小时温育后，将角膜片浸渍于一抗液，在4℃温度下反应一晚。一抗使用了纤连蛋白多克隆抗体(abcam)的1:250稀释液。接下来，将角膜片浸渍于二抗液和DAPI溶液(株式会社同仁化学研究所)的混合液，遮光并在室温下反应1个小时。二抗使用了Alexa Fluor(注册商标)488标记羊抗兔IgG(LifeTechnologies)的1:2000稀释液。DAPI溶液1:1000稀释后使用。使角膜片伸展，放置于载玻片上，盖上盖玻片封存。使用共聚焦激光扫描型显微镜奥林巴斯FV1000 FLUOVIEW(奥林巴斯株式会社)或共聚焦激光扫描显微镜LSM880(Carl Zeiss Microscopy株式会社)观察制作的标本。在角膜的中央部、6点方向、9点方向(耳侧)、3点方向(鼻侧)区域，用40倍或100倍的视野进行了观察。

(结果)

至第6周，在EW-7197滴眼组中，观察到了抑制角膜中央部的角膜内皮密度减少的倾向，但在第12周，在EW-7197滴眼组和溶剂滴眼组之间没有观察到角膜中央部的角膜内皮密度的较大差异。与角膜中央部相比，角膜周边部有滴状物多的倾向，因此在第12周，在EW-7197滴眼组和溶剂滴眼组之间没有观察到角膜中央部的角膜内皮密度的较大差异。实际上，与中央部相比，周边部有纤连蛋白的表达量高的倾向(图9)。如图9所示，在0.02％和0.1％EW-7197滴眼组中，观察到了纤连蛋白明确的表达抑制。为了试验在低浓度下的药理效果，在0.02％EW-7197滴眼液的五分之一浓度即0.004％(0.1mM)下也做了相同的实验，其结果，观察到了抑制纤连蛋白表达的倾向。由此，显然可见EW-7197在很大范围的浓度下有效。

(实施例7:含有EW-7197的角膜保存液的制剂例)

在本实施例中，作为制剂例，含有EW-7197的角膜保存液如下制造。

通过常规方法，制备下述保存液。

EW-7197 有效量(例如0.1μM)

Optisol-GS(Bausch-Lomb) 适量

总量 100mL

(实施例8:滴眼剂的制备例)

各浓度的被试物质组成如下。

浓度可使用由下述物质组成的溶剂进行稀释。

作为有效成分以外的各成分，例如可使用适用于日本药典或其等价物的市售品。

(实施例9:诊断和治疗例)

在诊断为Fuchs角膜内皮营养不良和相似的角膜内皮疾病时(作为具体例：1)通过裂隙灯显微镜观察角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜上皮水肿或角膜基质水肿，2)通过角膜内皮显微镜观察角膜滴状物图像和角膜内皮障碍图像，3)通过眼前节分析仪(Pentacam)，OCT，超声波角膜厚度测量仪等观察角膜水肿，4)经基因诊断判断为高风险时)使用。本发明的组合物可以以滴眼剂、前房内注射、使用缓释剂的给药、玻璃体内注射和结膜下注射用于治疗。

作为除有效成分以外的各成分，例如可使用适用于日本药典或其等价物的市售品。

尽管上文使用本发明的优选实施例对本发明进行了说明，但是本发明的范围仅由权利要求进行解释。还应理解，本说明书中引用的专利、专利申请和文献应该以与本说明书中具体描述的内容本身相同的方式作为参考通过引用并入本文。本申请主张日本专利申请2017-239049号(2017年12月13日申请)和日本专利申请2018-184783号(2018年9月28日申请)的优先权，其全部内容作为参考通过引用并入本文。

产业上利用可能性

提供一种包含(T)EW-7197，用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的医药，特别是用于治疗或预防Fuchs角膜内皮营养不良的角膜内皮障碍的医药。提供一种技术，可用于与基于该技术的制剂等相关的技术关联的产业(制药等)。

Claims

1.一种用于治疗或预防角膜内皮的症状、障碍或疾患的组合物，包含(T)EW-7197(N-((4-([1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)-5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-咪唑-2-基)甲基)-2-氟苯胺)或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物用于抑制角膜内皮细胞密度的减少。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良或滴状角膜。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患起因于细胞外基质(ECM)的过剩表达。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述细胞外基质(ECM)选自由Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、Ⅴ型胶原蛋白及纤连蛋白组成的群。

6.根据权利要求4或5所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患选自由Fuchs角膜内皮营养不良、角膜滴状物的形成、德斯密氏膜肥厚、角膜肥厚、浑浊、瘢痕、角膜云翳、角膜斑翳、角膜白斑、羞明和雾视组成的群。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述角膜内皮的症状、障碍或疾患是Fuchs角膜内皮营养不良。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述组合物中的浓度是约0.001mM～约10mM。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述(T)EW-7197或其衍生物、或其可药用盐、或其溶剂化物在所述组合物中的浓度是约0.01mM～约5mM。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，所述组合物是滴眼剂。