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CN111718890B - 一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系和应用 - Google Patents

一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系和应用。本发明获得了具有子宫腺上皮特征并且对卵巢激素有反应的化学诱导的腺上皮细胞(ciGE)，它们可以在临床治疗中应用于子宫内膜替代等方面。通过仅使用化学分子诱导成纤维细胞获得ciGE具有几个优点，包括细胞渗透性，操作方便，无免疫原性和易于标准化，这些优点使其成为治疗绝对子宫因子不孕症(AUFI)等子宫疾病的临床应用的有吸引力的策略。此外，本发明发现了功能相关基因的上调，包括ciGE中的雌激素和孕酮反应基因，表明获得的ciGE为可扩增的功能性子宫腺上皮细胞。

Description

一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系 和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系和应用。
背景技术
在世界范围内，大约15％患有不孕不育疾病，其中由于子宫异常导致的不孕不育—绝对子宫因子不孕症(AUFI)占女性总人口的3％-5％。目前，治疗AUFI的主要方法是子宫移植(UTx)(参见
Figure BDA0001999860400000011
M.，et al.Transplantation 102，569-577(2018))。然而，有限的器官来源及伦理问题限制了这一技术广泛的应用。人工子宫可以作为胚胎的孵化器，为子宫受损或患病的妇女带来希望。人工子宫需要完整的结构和充足的细胞来源，目前细胞来源不足阻碍了生物人工子宫的临床应用。哺乳动物子宫组织包括子宫内膜和子宫肌层，子宫内膜主要由腔上皮、腺上皮和基质细胞组成。其中腺上皮是胚胎植入必需的，它对卵巢激素如雌激素(E2)和孕酮(P4)产生响应，合成并分泌生长因子如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，Lif)促进胚胎植入和发育。大量研究显示腺上皮的缺陷引起雌性不育。
哺乳动物子宫腺上皮(GE)是胚泡植入所必需的，其缺乏会导致不孕(参见Gu，T.P.，et al.Nature 477,606-610(7366))。GE对卵巢激素、雌激素和孕酮有反应，并诱导胚胎着床的Lif的表达(参见Carson，D.D.，et al.Dev Biol223，217-237(2000)，以及Demir，R.，et al.Placenta 23，672-684(2002))。先前已经报道了通过特定转录因子(TF)或化学分子直接重编程成纤维细胞(参见Cieslar-Pobuda，A.，et al.Biochim Biophys Acta MolCell Res 1864，1359-1369(2017)，以及Xie，X.，Y.Fu，and J.Liu.Curr Opin Genet Dev46，104-113(2017))。然而，很少有人报道通过成纤维细胞重编程获得子宫细胞。
发明内容
本发明首次利用化学方法直接将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞。本发明开发了在体外长期扩增子宫腺上皮细胞的培养体系，可以为治疗子宫因素导致不育的小鼠模型提供细胞来源，以及为子宫的体外重建提供细胞来源。
本发明是基于发明人的以下发现而完成的：利用含有化学小分子的培养体系能够直接将成纤维细胞重编程为腺上皮细胞，进而完成了本发明。
因此，本发明涉及一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法，其特征在于，在诱导过程中使用脯氨酸羟化酶抑制剂。
本发明涉及一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的非治疗性的方法，其特征在于，在诱导过程中使用脯氨酸羟化酶抑制剂。
本发明还涉及一种在体外扩增子宫腺上皮细胞的培养体系，其特征在于，其中该培养体系包含脯氨酸羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIF脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为1,4-DPCA、BAY87-2243、MK-8617、JNJ-42041935中的一种或几种。其中，1,4-DPCA、BAY87-2243、MK-8617、JNJ-42041935的结构式如下所示。
Figure BDA0001999860400000021
Figure BDA0001999860400000031
在本文中，“脯氨酸羟化酶抑制剂”是能够抑制脯氨酸羟化酶(prolinehydroxylase，PH)活性的一类物质，具有相同的作用机理，通过抑制脯氨酸羟化酶促进低氧诱导因子的稳定。上述脯氨酸羟化酶抑制剂均是已知的常用脯氨酸羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，在诱导过程或培养体系中还加入ALK抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为ALK5抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为A83-01、RepSox、SB431542中的一种或几种。其中，A83-01、RepSox、SB431542的结构式如下所示。
Figure BDA0001999860400000032
在本文中，“ALK5抑制剂”是能够抑制极光样激酶(Aurora-like kinase5，ALK5，是一种转化生长因子信号-β(TGF-β)受体)的一类物质，具有相同的作用机理，通过抑制ALK5进而抑制转化生长因子-β信号通路。上述ALK5抑制剂均是已知的常用ALK5抑制剂。
在上述实施方案中，在诱导过程或培养体系中还加入GSK抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为GSK3α/β抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为CHIR99021、CHIR-98014中的一种或几种。其中，CHIR99021、CHIR-98014的结构式如下所示。
Figure BDA0001999860400000041
在本文中，“GSK3α/β抑制剂”是能够抑制糖原合成酶(glycogen synthasekinase，GSK3α/β)的一类物质，具有相同的作用机理，通过抑制GSK3α/β激活Wnt信号通路。上述GSK抑制剂均是已知的常用GSK3α/β抑制剂。
在上述实施方案中，在诱导过程或培养体系中还加入成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、小鼠白血病抑制因子(mLif)中的任一种或多种。
本发明还涉及上述抑制剂中的任一种或者任意两种或三种的组合在激发成纤维细胞转分化中的非治疗性的应用。
本发明还涉及上述抑制剂中的任一种或者任意两种或三种的组合在制备激发成纤维细胞转分化药物中的应用。
在一个实施方案中，所述激发成纤维细胞转分化为将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞。
本发明还涉及上述方法和/或培养体系在提供治疗子宫因素导致不育的小鼠模型提供细胞来源，或为子宫的体外重建提供细胞来源的应用。
在本发明中，术语“非治疗性”是指本发明的方法和/或应用排除中国专利法第25条所规定的疾病的诊断和治疗方法。
在本发明中，发明人获得了具有子宫腺上皮特征并且对卵巢激素有反应的化学诱导的腺上皮细胞(ciGE)，这意味着它们可以在临床治疗中应用于子宫内膜替代。
通过仅使用化学分子诱导成纤维细胞获得ciGE具有诸多优点，包括细胞渗透性，操作方便，无免疫原性和易于标准化等，这些优点使其成为治疗AUFI等子宫疾病的临床应用的有吸引力的策略。
本发明发现了功能相关基因的上调，包括ciGE中的雌激素和孕酮反应基因，表明获得的ciGE为可扩增的功能性子宫腺上皮细胞。
本发明还涉及脯氨酸羟化酶抑制剂、ALK抑制剂、GSK抑制剂中的任一种或者任意两种或三种的组合在制备用于治疗子宫因子不孕症的药物中的应用。
本发明还涉及脯氨酸羟化酶抑制剂、ALK抑制剂、GSK抑制剂中的任一种或者任意两种或三种的组合在制备用于促进子宫再生的药物中的应用。
本发明通过化学分子诱导，为在受损或衰老的子宫内原位成纤维细胞产生靶细胞提供了一种全新途径。它还为胚胎植入和子宫结构或功能丧失的研究提供了体外模型。同时，本发明为子宫因子不孕症和子宫再生的治疗提供了新的方式。
附图说明
图1a.利用小分子诱导培养液(FBLDAC)将小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)重编程成为ciGE的方案。
图1b-1c.FBLDAC诱导培养液诱导的MEF来源的克隆的代表性形态。b左，对照；b右，第12天；c左，生长于基质胶上；c右，生长于10％FBS上。
图1d.化学诱导的上皮细胞扩增20代以上呈现“38+XX”核型。
图1e.化学诱导的上皮细胞特征蛋白KRT19、EPCAM、CDH1免疫荧光染色，标尺50μm。增殖细胞标记蛋白KI67免疫荧光染色，标尺100μm。
图2.(Fsp1)-Cre/ROSA26mTmG成纤维细胞为上皮细胞。(a)(Fsp1)-Cre/ROSA26mTmG成纤维细胞示意图。(b)染色鉴定起始成纤维细胞的上皮细胞命运。(c)化学诱导后产生GFP阳性克隆。(d)染色鉴定化学诱导后上皮细胞命运。
图3.鉴定化学诱导上皮细胞为腺上皮细胞命运。(a)RNA-Seq数据的热图和基因的层次聚类。(b)差异表达基因的表达热点图和基因本体(Gene Ontology，GO)分析。(c-d)子宫上皮细胞特异相关基因的表达。
图4.化学诱导的子宫腺上皮具有形成类腺体能力。(a)表达成体干细胞/祖细胞相关基因的表达。(b)自组装成空腔结构，标尺75μm。
图5.化学诱导的子宫腺上皮响应卵源激素的刺激。(a-c)孕酮响应基因(5a)、雌激素响应基因(5b)及子宫植入相关基因(5c)都明显上调。(d)MEF与化学诱导子宫腺上皮响应孕酮与雌激素刺激。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本发明的具体实施例。虽然附图中显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
如本文所用，就特定组分而言“基本上不含”在本文中用于表示特定组分未被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何意外污染导致的特定组分的总量低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中特定组分的量用标准分析方法检测不到的组合物。
如在本说明书中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如权利要求中所使用的，当与单词“包含”一起使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。
在权利要求中使用术语“或”用于表示“和/或”，除非明确指出仅指代替代方案或者替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅指代替代方案和“和/或”的定义。如本文所用，“另一个”可以表示至少第二个或更多个。
贯穿本申请，术语“约”用于指示值包括装置的误差的固有变化，该方法用于测定该值或存在于研究对象之间的变化。
在本文中，“分化”是较不特化的细胞变成更特化的细胞类型的过程。“去分化”是这样的细胞过程，其中部分或终末分化的细胞回复到更早期发育阶段，如多能性或多潜能性。“转分化”是将一种分化细胞类型转化为另一种分化细胞类型的过程。典型地，通过编程发生转分化而细胞不经过中间多能性阶段-即，细胞直接从一种分化细胞类型编程为另一种分化细胞类型。
如本文所用，术语“受试者”或“有需要的受试者”是指任何年龄的雄性或雌性的需要细胞或组织移植的哺乳动物，优选人。通常，受试者需要细胞或组织移植(在本文中也称为受体)，这是由于适合经由细胞或组织移植治疗的病症或病理或不期望的状况、状态或综合征或身体、形态学或生理学异常。
在本文中涉及的一些术语的定义如下：
FGF2：成纤维细胞生长因子2。
BMP4：骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4，bmp4)。
mLif：小鼠白血病抑制因子。
高糖DMEM：一种高糖型DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)，即一种含各种葡萄糖和氨基酸的商品化的培养基，在MEM培养基的基础上研制的。
N2B27：一种以DMEM/F12基础培养基和Neurobasal基础培养基以1:1混合而成，包含N2添加剂和B27添加剂的成分明确的细胞培养液，报道有利于小鼠胚胎干细胞向神经方向分化。
DMEM/F12：一种以DMEM培养基和F12培养基1:1混合而成的商品化的基础培养液，适于克隆密度的培养。
Neurobasal：有利于神经细胞培养的商品化基础培养基。
N2添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
B27添加剂：一种商品化无血清的细胞培养添加剂。
1,4-DPCA、BAY 87-2243、MK-8617、JNJ-42041935:脯氨酸羟化酶抑制剂，其中，脯氨酸羟化酶是低氧诱导因子羟基化重要酶。
A83-01：一种具有选择性的TGF-β抑制剂，能够显著抑制ALK4，ALK5和ALK7的活性。
RepSox：一种有效的选择性TGFβR-1/ALK5抑制剂。
SB431542：一种有效的、选择性ALK5抑制剂。
CHIR99021：一种有效的GSK-3α/β抑制剂。
CHIR-98014：一种有效的GSK-3α/β抑制剂。
本发明涉及一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法，其特征在于，在诱导过程中使用脯氨酸羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIF脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为1,4-DPCA、BAY87-2243、MK-8617、JNJ-42041935中的一种或几种。
在上述实施方案中，在诱导过程中还加入ALK抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为ALK5/4/7抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为A83-01、RepSox、SB431542中的一种或几种。
在上述实施方案中，在诱导过程中还加入GSK抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为GSK3α/β抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为CHIR99021、CHIR-98014中的一种或几种。
在上述实施方案中，在诱导过程中还加入成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)、小鼠白血病抑制因子(mLif)中的任一种或多种。
本发明还涉及上述抑制剂中的任一种或者任意两种或三种的组合在激发成纤维细胞转分化中的应用。
在一个实施方案中，所述激发成纤维细胞转分化为将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞。
本发明还涉及一种在体外扩增子宫腺上皮细胞的培养体系，其中该培养体系包含脯氨酸羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIF脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂。
在上述实施方案中，所述脯氨酸羟化酶抑制剂为1,4-DPCA、BAY87-2243、MK-8617、JNJ-42041935中的一种或几种。
在上述实施方案中，在培养体系中还加入ALK抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为ALK5/4/7抑制剂。
在上述实施方案中，所述ALK抑制剂为A83-01、RepSox、SB431542中的一种或几种。
在上述实施方案中，在培养体系中还加入GSK抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为GSK3α/β抑制剂。
在上述实施方案中，所述GSK抑制剂为CHIR99021、CHIR-98014中的一种或几种。
在上述实施方案中，在培养体系中还加入FGF2、BMP4、mLif中的任一种或多种。
本发明还涉及一种化学重编程成纤维细胞为腺上皮细胞的诱导培养液，其特征在于，该诱导培养液包含1,4-DPCA、A83-01、CHIR99021、FGF2、BMP4、mLif中的任一种或多种。
本发明还涉及上述方法和/或培养体系在提供治疗子宫因素导致不育的小鼠模型提供细胞来源，或为子宫的体外重建提供细胞来源的应用。
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制。
实施例
以下通过具体实施例来详细阐述和说明本发明的实施方式，但以下内容不应理解为对本发明作任何限制，实施例中采用的物质等如果没有特殊说明均为市售产品。
实施例一
分离小鼠第13.5天胚胎制成胎儿成纤维细胞(MEFs)接种于培养孔板，MEF细胞在0.1％明胶的培养基中培养一天，然后用含有小分子化合物的诱导培养液继续培养12天，每3天换一次液，克隆首次出现在培养8-12天的时间，之后培养基变成扩增培养液EFLAC继续培养，细胞可以在诱导培养液的环境中持续扩增，传代方式为胰酶消化，1:4-1:6传代。如图1a所示。
经过FBLDAC培养液诱导12天之后，MEF细胞将被重编程成为上皮细胞样的克隆，如图1b所示，这些克隆可以在基质胶或10％FBS覆盖的培养皿中稳定传代超过20代，如图1c所示，并且这些细胞具有稳定的“38+XX”的核型，如图1d所示。这些诱导得到的细胞表达上皮细胞的特异性标记基因，例如KRT19、EPCAM和CDH1，以及增值蛋白KI67，如图5所示。
上述的诱导培养液(FBLDAC)包括：DMEM/F12(Gibco，12400-024)和Neurabasal(Gibco，21103-049)(1:1混合物)，N2添加剂(Gibco，17502-048，200×)，B27添加剂(Gibco，17504-044，100×)，胎牛血清(Gibco，16000-044，10％)，GlutaMAXTMSupplement(Gibco，35050079，200×)，血清替代物(Gibco，10828028，10％)，β-巯基乙醇(Gibco，21985，55μM)，牛血清白蛋白(sigma，A7906-100G，0.002％)，成纤维细胞生长因子(FGF2，R&D，233-FB-001MG/CF，20ng/mL)，骨形态发生蛋白4(BMP4，R&D，233-FB-001MG/CF，10ng/mL)，小鼠白血病抑制因子(mLif，Millipore，ESG1007，1000U/mL)，青链霉素(Gibco，15140-122，100×)，再加入化学小分子DAC:D，1,4-DPCA(Enzo，BML-EI377-0050，5μM)；A，A83-01(stemgent，04-0014，10μM)；C，CHIR99021(Stemgent，04-0004，12μM)。
上述的扩增培养液包括：[DMEM/F12和Neurabasal(3:1)，血清替代物(Gibco，10828028，2％)，表皮细胞生长因子(R&D，2028-EG-200，100ng/mL)，成纤维细胞生长因子(R&D，233-FB-001MG/CF，10ng/mL)，小鼠白血病抑制因子(Millipore，ESG1007，1000U/mL)，A83-01(stemgent，04-0014，5μM)，CHIR99021(Stemgent，04-0004，3μM)，肝素(sigma，H4784，1μg/mL)，β-巯基乙醇(Gibco，21985，55μM)，牛血清白蛋白(sigma，A7906-100G，0.002％)，非必需氨基酸(Gibco，11140-050，100×)，N2添加剂(Gibco，17502-048，200×)，B27添加剂(Gibco，17504-044，100×)。
实施例二
接下来，为了评估诱导上皮细胞的致瘤性，我们分别将5x 106个ciGE和小鼠胚胎干细胞(ESC)分别移植到5周龄Balb/c雄性裸鼠的后肢皮下，三周后监测成瘤效果。我们的结果显示，移植ESC的裸鼠在3周后，10只中有8只形成畸胎瘤，移植ciGE的小鼠在两个月后仍没有肿瘤的形成，如表1所示。
表1.肿瘤形成的比率
Figure BDA0001999860400000101
Figure BDA0001999860400000111
实施例三
为了更严格证明上皮细胞确实是由MEF细胞诱导而来的，我们从携带成纤维细胞特异蛋白1(Fsp1)-Cre/ROSA26mTmG的转基因小鼠中分离出MEF来追踪成纤维细胞。成纤维细胞在Fsp1-Cre介导的膜靶向番茄(mT)表达切除后永久表达膜靶向绿色荧光蛋白(mG)，如图2a所示。这些追踪细胞排除了上皮细胞命运的污染，并按照图1a所示的过程诱导。上皮标记物KRT19和EPCAM染色更加确定这一结果，如图2b所示。FBLDAC诱导后细胞出现绿色的克隆，如图2c所示。通过染色KRT19和EPCAM染色确定诱导的上皮细胞命运，如图2d所示。
实施例四
为了进一步确定这些化学诱导的上皮细胞的特征，我们分别对ciGE、起始MEF和从小鼠子宫分离的原代上皮细胞(priUterus)进行了全转录组测序。聚类分析显示ciGE的基因表达模式与priUterus密切相关，而与MEF差异较大，如图3a所示。通过GO分析，我们发现ciGE中表达的基因与子宫发育和雌激素响应有关。与MEF相比，ciGE主要富集了与上皮细胞命运和功能相关的GO术语，通过与已报到的数据比对，发现这表示ciGE具有子宫腺上皮的特征，如图3b所示。利用免疫荧光染色及定量RT-PCR方法验证了子宫腺上皮特征性基因(FOXA2和SOX17)的表达，如图3c、3d所示。
免疫荧光染色：将细胞在玻璃盖玻片上培养，然后用4％PFA固定1小时，随后用PBS洗涤3次。细胞用0.1％Triton X-100封闭30分钟，2％BSA在室温(RT)封闭1小时。然后将细胞与第一抗体在4℃下孵育过夜，然后与物种特异性二抗在室温下孵育1小时。将细胞与DAPI在室温下孵育10分钟。共聚焦显微镜(Leica TCS Sp8)拍摄图像。使用的抗体信息：anti-KRT19(Rabbit，Abcam，Ab52625，1:500)，anti-EPCAM(Rabbit，Abcam，Ab71916，1:500)，anti-CDH1(Rat，Sigma，U3254，1:500)，anti-KI67(Rabbit，Thermo FisherScientific,PA5-19462,1:200)，anti-FOXA2(Goat，SantaCruz，Sc-9187，1:200)，anti-CD133(Rabbit，Abcam，Ab16518，1:500)，anti-SCA-1(Rat，Abcam，Ab51317，1:500)，anti-CDX2(Rabbit，Cell Signaling Technology，3977s，1:200)。
定量PCR：用TRIzol试剂(Invitrogen，15596-018)提取细胞总RNA。高容量cDNA逆转录试剂盒(ABI，4368814)用于逆转cDNA的转录。基于2-ΔΔCt方法分析相对基因表达，GAPDH作为内部对照。使用的引物信息如表2所示。
表2.实施例四、五、六中定量PCR使用的引物
Figure BDA0001999860400000121
Figure BDA0001999860400000131
实施例五
我们进一步检测ciGE中成体干细胞/祖细胞标志物的高表达，如图4a所示。用0.25％胰蛋白酶部分消化ciGE，将细胞聚集物用移液管轻轻吸出，接种在预先涂有基质胶的培养皿当中，培养7-14天。ciGE能够形成具有腔室的腺体样结构，该腺体样结构表达上皮蛋白，这意味着ciGE可以发生腺体生成，如图4b所示。
实施例六
进一步分析显示，在化学诱导的子宫腺上皮中，孕酮(E2)响应基因(图5a)、雌激素(p4)响应基因(图5b)及子宫植入相关基因(图5c)都明显上调。生理条件下子宫腺上皮在怀孕过程中在卵源激素，如孕酮、雌激素的刺激下会分泌一些因子，如Lif，促进着床及胚胎发育。为进一步探究这些细胞是否具有响应孕酮和雌激素刺激能力。我们在不含mLif、N2和B27的扩增培养基培养条件下，用8nM雌激素(Sigma，E8875)和200ng/mL孕酮(Sigma，p8811)或者DMSO(Sigma，D2650)培养ciGE或MEF 3天，并收集mRNA鉴定基因表达。结果显示：相比于MEF，ciGE在激素处理后，E2和p4响应基因显著上调，如图5d所示。这些结果表明，小分子诱导培养液可以将成纤维细胞重编程为可扩增的功能性子宫腺上皮细胞。
前面仅仅示出了本发明的原理，应理解，本发明的范围不预期限制在本文所述的示例性方面，而应包括所有当前已知的和未来开发的等同物。另外，应当指出，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以作出若干改进和修改，这些改进和修改也应被视为本发明的范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 一种将成纤维细胞转分化为腺上皮细胞的方法及其培养体系和应用
<130> PC00464
<141> 2019-03-19
<160> 34
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgtagaccat gtagttgagg tca 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtcttcagga caggggaaag a 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccctttaca gcagcaagat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaggccctt ggactctgt 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acccactttt ctcatctcgt tc 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggcattcggg ctcctttctt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tggagtggta gtcgatgcta ag 22
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccctacgcca acatgaactc g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gttctgccgg tagaaaggga 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
attgtgccct tactgctgct g 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gccagttgat tcttgatctg gt 22
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcttgggggt tggaggatg 19
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cggaggtaga aagggcgtc 19
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gatgcgggat acgccagtg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccaccacctc gcctttcac 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaggcagcag ttattgtgga t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgttgacctt agtacccagg a 21
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gggggttcag tacgcattgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaggacgagg tcacgaagc 19
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<213> 人工序列
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gccagctacc tggataaggt g 21
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cagatgccag tcacgaatct tc 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccttgtggtt cttacgtttg ttg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
cgttgacgac attctcaagc tg 22
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cccctcacca tcagccaag 19
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ggttctgaga ttgctgggga tt 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gcctgcaaat gcaaacaatg c 21
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
agctgcactt gtcggaagc 19
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列
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accaactgcg tacaagacga g 21
<210> 30
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<212> DNA
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<400> 30
cagagccgcc aacaggaaa 19
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<213> 人工序列
<400> 31
cccagagccg ggtacagaa 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggagttgg tcagcttcg 19
<210> 33
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctctgtcctt aaagcggctt ac 22
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
gttgcggagg ttcaagatgt t 21

Claims (7)

1.一种将成纤维细胞转分化为子宫腺上皮细胞的非治疗性的方法，其特征在于，在诱导过程中使用HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂，ALK5抑制剂，GSK3α/β抑制剂，成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和小鼠白血病抑制因子(mLif)。
2.一种在体外扩增子宫腺上皮细胞的培养体系，其特征在于，所述培养体系包含HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂，ALK5抑制剂，GSK3α/β抑制剂，成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和小鼠白血病抑制因子(mLif)。
3.如权利要求1所述的方法或如权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂选自1,4-DPCA、BAY 87-2243、MK-8617、JNJ-42041935中的一种或几种；所述ALK5抑制剂选自A83-01、RepSox、SB431542中的一种或几种；所述GSK3α/β抑制剂选自CHIR99021、CHIR-98014中的一种或几种。
4.HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3α/β抑制剂、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和小鼠白血病抑制因子(mLif)的组合在激发成纤维细胞转分化为子宫腺上皮细胞中的非治疗性的应用。
5.HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3α/β抑制剂、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和小鼠白血病抑制因子(mLif)的组合在制备激发成纤维细胞转分化为子宫腺上皮细胞的药物中的应用。
6.HIFα脯氨酰4-羟化酶抑制剂、ALK5抑制剂、GSK3α/β抑制剂、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、骨形态发生蛋白4(BMP4)和小鼠白血病抑制因子(mLif)的组合在制备用于治疗子宫因子不孕症的药物和促进子宫再生的药物中的应用。
7.一种化学重编程成纤维细胞为子宫腺上皮细胞的诱导培养液，其特征在于，该诱导培养液包含1,4-DPCA、A83-01、CHIR99021、FGF2、BMP4、mLif。
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