CN111707831A - Rock激酶活性在辅助诊断sle以及评价sle病情中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了ROCK激酶活性在辅助诊断SLE以及评价SLE病情中的应用。本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用。所述产品的功能为诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮。所述产品的功能为筛查或辅助筛查系统性红斑狼疮患者。所述产品的功能为评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情严重程度。本发明的发明人发现ROCK激酶可成为新的SLE病情活动度评价指标。本发明对于SLE患者的辅助诊断，SLE患者的辅助筛查，以及SLE患者的病情严重度评价，均具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及ROCK激酶活性在辅助诊断SLE以及评价SLE病情中的应用。
背景技术
系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一种慢性自身免疫性疾病，其临床表现复杂，可同时累及多个器官。目前SLE发病机制仍不是十分明确。系统性红斑狼疮好发于育龄女性，以10-40岁年龄段最为多见，患者女性人数与男性人数之比约为9:1。系统性红斑狼疮的患病率除了性别、年龄，还因人种而异，以黑人为最高，我国汉族次之，全球平均患病率为(12-39)/10万，黑人患病率为100/10万，我国患病率约为(30.13-70.41)/10万。
Rho GTP酶(Rho GTPase)属于Ras蛋白超家族当中的一员，是一种普遍存在于真核生物当中的小分子GTP结合蛋白，在胞质的骨架建成方面发挥了重要作用。Rho激酶(ROCKs)是Rho GTP酶下游重要的效应分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞骨架的形成，细胞的运动，迁移，以及基因的表达等诸多个方面发挥重要的调控作用。
发明内容
本发明的目的是提供ROCK激酶活性在辅助诊断SLE以及评价SLE病情中的应用。
本发明提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮。
本发明还提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查系统性红斑狼疮患者。
本发明还提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情。
本发明还提供了用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情严重程度。
以上任一所述应用中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测P-MYPT1的物质和用于检测MYPT1的物质。
以上任一所述应用中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测人P-MYPT1的物质和用于检测人MYPT1的物质。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质包括Phospho-MYPT1抗体。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
以上任一所述应用中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质包括MYPT1抗体。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
以上任一所述应用中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
以上任一所述应用中，所述产品为试剂盒。
本发明还保护一种产品，包括用于检测ROCK激酶活性的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮；
(b)筛查或辅助筛查系统性红斑狼疮患者；
(c)评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情；
(d)评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情严重程度。
所述产品中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测P-MYPT1的物质和用于检测MYPT1的物质。
所述产品中，所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测人P-MYPT1的物质和用于检测人MYPT1的物质。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质包括Phospho-MYPT1抗体。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
所述产品中，用于检测P-MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质包括MYPT1抗体。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括辣根酶标记羊抗兔IgG抗体。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血单个核细胞提取细胞总蛋白的物质。
所述产品中，用于检测MYPT1的物质还包括用于从外周血提取外周血单个核细胞的物质。
所述产品具体可为试剂盒。
所述产品的功能为(a)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.55，受试者为或候选为SLE患者。
所述产品的功能为(b)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性＞0.55，受试者为或候选为SLE患者。
所述产品的功能为(c)时，所述产品还包括记载有如下方法的载体：
如果ROCK激酶活性≤0.71，受试SLE患者为或候选为轻度活动患者；
如果ROCK激酶活性＞0.71且≤0.79，受试SLE患者为或候选为中度活动患者；
如果ROCK激酶活性＞0.79，受试SLE患者为或候选为重度活动患者。
所述产品还包括记载有如下检测方法的载体：
(1)取受试者的外周静脉血，分离外周血单个核细胞。
(2)取外周血单个核细胞，提取细胞总蛋白。
(3)将细胞总蛋白进行Western-Blot，使P-MYPT1和MYPT1蛋白条带显影；
(4)分析Western-Blot显影图中蛋白条带的灰度值，获得P-MYPT1/MYPT1。
本发明还保护ROCK激酶活性作为标志物的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)作为系统性红斑狼疮患者的标志物的应用；
(Ⅱ)作为系统性红斑狼疮患者的病情严重程度的标志物的应用。
以上任一所述ROCK激酶活性为P-MYPT1/MYPT1。
以上任一所述ROCK激酶活性为P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
以上任一所述ROCK激酶活性为人P-MYPT1丰度/人MYPT1丰度。
以上任一所述ROCK激酶活性为外周血单个核细胞的细胞总蛋白中的P-MYPT1/MYPT1。
以上任一所述ROCK激酶活性为外周血单个核细胞的细胞总蛋白中的P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
本发明的发明人发现，SLE患者ROCK激酶活性较健康者ROCK激酶活性明显升高，其结果提示Rho GTPase/ROCK信号通路参与了系统性红斑狼疮的发生及发展过程。同时SLE病情越重，ROCK激酶活性越高，且SLE患者ROCK激酶活性与SLEDAI-2000评分呈正相关。ROCK激酶可成为新的SLE病情活动度评价指标。本发明对于SLE患者的辅助诊断，SLE患者的辅助筛查，以及SLE患者的病情严重度评价，均具有重大的应用价值。
附图说明
图1为某一例正常组入组者和某一例SLE组入组者的Western-Blot显影图。
图2为正常组和SLE组的ROCK激酶活性比较图。
图3为三个SLE组亚组以及正常组的ROCK激酶活性比较图。
图4为ROCK激酶活性与SLEDAI-2000评分的相关性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
正常组由95例健康人组成。健康人入组标准：选取同期于首都医科大学附属北京朝阳医院体检中心体检的健康志愿者95例；志愿者入组前需排除既往有肝肾疾病史、糖尿病或其他自身免疫性疾病病史以及肿瘤病史。
SLE组由36例SLE患者组成。36例SLE患者按照SLE活动指数2000(SLEDAI-2000)评分评估病情活动度，分为三个亚组：轻度活动组(20人)、中度活动组(12人)、重度活动组(4人)。
SLE诊断标准见表1。在表1中的11项中，符合4项或4项以上者，在除外感染、肿瘤和其他结缔组织病后，可诊断SLE。
表1 系统性红斑狼疮诊断标准(ACR 1997年诊断标准)
SLE活动指数2000(SLEDAI-2000)评分标准见表2。总分为0-4：基本无活动性。总分为5-9：轻度活动。总分为10-14分：中度活动。总分为15分及15分以上：重度活动。总分范围值均含两个端值。
表2 系统性红斑狼疮疾病活动度评分(SLEDAI-2000)
实施例1、ROCK激酶活性在辅助诊断SLE中的应用
研究对象：正常组和SLE组。
1、分别取各位入组者的外周静脉血，分离外周血单个核细胞(PBMCs)。
2、取步骤1得到的外周血单个核细胞，加入淋巴细胞裂解液，冰上孵育20min(每隔5min吹打一次)，然后4℃、12000r/min离心5min，吸取上清液，即为细胞总蛋白溶液。淋巴细胞裂解液：RIPA裂解液1ml、50×cocktail蛋白酶抑制剂20μl、PMSF10μl、磷酸化酶抑制剂A液10μl、磷酸化酶抑制剂B液10μl。
3、取步骤2得到的细胞总蛋白溶液，利用BCA法检测蛋白浓度以确定上样量。
4、进行蛋白质印迹法(Western-Blot)，使PBMCs中P-MYPT1和MYPT1和β-Actin的蛋白条带显影。β-Actin为内参。
SDS-PAGE参数：8％分离胶，5％浓缩胶；初始电压为80V，当蛋白跑至浓缩胶-分离胶界面时，调整电压为120V，然后继续电泳约30min，直至观察到蛋白maker及蓝色蛋白条带跑至凝胶底部时关闭电源，停止电泳。
用于检测P-MYPT1：一抗为Phospho-MYPT1抗体，一抗工作浓度为1:1000倍稀释，美国Cell Signaling生物，货号为#4563；二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG抗体，二抗工作浓度为1:1000倍稀释，北京中杉金桥生物技术公司，货号为ZB-2301。
用于检测MYPT1：一抗为MYPT1抗体，一抗工作浓度为1:1000倍稀释，美国CellSignaling生物，货号为#2634；二抗为辣根酶标记羊抗兔IgG抗体，二抗工作浓度为1:1000倍稀释，北京中杉金桥生物技术公司，货号为ZB-2301。
显影方式为ECL化学发光显影。
示例性的，某一例正常组入组者和某一例SLE组入组者的Western-Blot显影图见图1。
5、利用Image J软件分析Western-Blot显影图中蛋白条带的灰度值，用P-MYPT1/MYPT1代表ROCK激酶活性。
正常组各位受试者的ROCK激酶活性见表3。
SLE组各位受试者的ROCK激酶活性见表4。
正常组的ROCK激酶活性为0.38±0.01。SLE组的ROCK激酶活性为0.71±0.08。正常组和SLE组的ROCK激酶活性比较图见图2(*p<0.05)。
结果表明，与正常组相比，SLE组的ROCK激酶活性显著升高。
将ROCK激酶活性＞0.55作为诊断SLE阈值，假阴性率为0％，假阳性率为0％。
实施例2、ROCK激酶活性在辅助诊断SLE病情中的应用
研究对象：正常组和SLE组。
SLE组各位受试者的SLEDAI-2000评分见表4。
获取实施例1中的各位受试者的ROCK激酶活性数据。
SLE组轻度活动组的ROCK激酶活性为0.65±0.03。SLE组中度活动组的ROCK激酶活性为0.76±0.02。SLE组重度活动组的ROCK激酶活性为0.86±0.05。三个SLE组亚组以及正常组的ROCK激酶活性比较图见图3(*p<0.05)。
使用SPSS统计软件分析ROCK激酶活性与SLEDAI-2000评分的相关性。结果见图4。Pearson系数为0.931*，p<0.05。
结果表明：轻度活动组、中度活动组、重度活动组的ROCK激酶活性均高于正常组；SLE患者ROCK激酶活性与SLEDAI-2K评分呈正相关，SLE病情越重(SLEDAI-2000评分越高)，ROCK激酶活性越高。
将ROCK激酶活性＞0.71且≤0.79作为诊断SLE患者中度活动阈值，假阴性率为0％，假阳性率为0％。
将ROCK激酶活性＞0.79作为诊断SLE患者重度活动阈值，假阴性率为0％，假阳性率为0％。
表3
表4
Claims (10)
1.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮。
2.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为筛查或辅助筛查系统性红斑狼疮患者。
3.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情。
4.用于检测ROCK激酶活性的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情严重程度。
5.如权利要求1至4中任一所述的应用，其特征在于：所述ROCK激酶活性为P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
6.如权利要求1至5中任一所述的应用，其特征在于：所述用于检测ROCK激酶活性的物质为用于检测P-MYPT1的物质和用于检测MYPT1的物质。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：用于检测P-MYPT1的物质包括Phospho-MYPT1抗体，用于检测MYPT1的物质包括MYPT1抗体。
8.一种产品，包括用于检测ROCK激酶活性的物质；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：
(a)诊断或辅助诊断系统性红斑狼疮；
(b)筛查或辅助筛查系统性红斑狼疮患者；
(c)评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情；
(d)评价或辅助评价系统性红斑狼疮患者的病情严重程度。
9.ROCK激酶活性作为标志物的应用，为如下(Ⅰ)或(Ⅱ)：
(Ⅰ)作为系统性红斑狼疮患者的标志物的应用；
(Ⅱ)作为系统性红斑狼疮患者的病情严重程度的标志物的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述ROCK激酶活性为P-MYPT1丰度/MYPT1丰度。
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