CN111685319A - 一种微生物发酵制备富含gaba的牛蒡发酵基料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，属于生物工程发酵技术领域。本发明以市售牛蒡粉为发酵原料，经食品安全菌株解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌发酵混合发酵，代替大肠杆菌、曲霉和酵母等GABA生产菌株，利用原料中本身含有的大量淀粉、蛋白质和氨基酸，混合发酵产生GABA，降低生产成本。同时，益生菌的引入增加了发酵基料的保健功能和食品应用安全性，赋予产品更高的市场价值。

Description

一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，属于生物工程发酵技术领域。

背景技术

牛蒡富含菊糖、纤维素、蛋白质、氨基酸及矿物质，其中类胡萝卜素含量比胡萝卜高150倍。研究表明，牛蒡具有扩张血管、降血压、降血脂、抑制癌细胞生长和预防老年痴呆的作用，是非常理想的天然保健食品。牛蒡根含有人体必需的各种氨基酸，尤其是具有特殊药理作用的氨基酸含量高，如具有健脑作用的天门冬氨酸占总氨基酸的25％-28％，精氨酸占18％-20％。

γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种四碳非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存于脊椎动物、植物和微生物，被认为是哺乳动物、昆虫或者某些寄生蠕虫神经系统中的神经抑制剂，对神经元的兴奋程度有着重要的影响。GABA因具有抗焦虑、降血压、镇定安神、健肝利肾、增强脑力、调节激素分泌等功能，在食品、医药行业中被广泛应用。

GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种。化学合成法虽然迅速，但具有反应条件苛刻、安全性差等缺点，该方法生产的GABA不宜用于食品添加。相较而言，生物合成法经由谷氨酸脱羧酶(Glutamic acid decarboxylase，GAD)催化L-谷氨酸或L-谷氨酸盐生成的GABA具有安全性高、成本低的优点。

解淀粉芽孢杆菌可产生多种蛋白酶、α-淀粉酶，能够将牛蒡粉中富含的蛋白质、淀粉类物质分解为小分子氨基酸和葡萄糖。解淀粉芽孢杆菌作为一种益生菌，其生长过程中可产生多种抑菌物质，抑制病原菌生长而对谷氨酸棒杆状菌和植物乳杆菌不产生影响。谷氨酸棒状杆菌作为最常用的谷氨酸生产菌能够以葡萄糖、果糖、蔗糖以及一些有机酸如乙酸、乳酸、琥珀酸等为单一碳源生产谷氨酸。植物乳杆菌能够以谷氨酸为底物，高效催化合成GABA。

目前，急需一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种以牛蒡粉为原料，利用解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌混合发酵生产富含GABA的食品用牛蒡基料的方法。在初始发酵体系中，通过解淀粉芽孢杆菌产生的大量淀粉酶分解原料中的淀粉产生大量葡萄糖作为谷氨酸合成的原料。在较高的通气量下，体系中的谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为碳源生产谷氨酸。后期通过减少体系中的通气量，谷氨酸棒状杆菌开始大量合成有机酸降低体系pH，植物乳杆菌开始大量增殖，同时将谷氨酸转化成为GABA。

本发明提供了一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，其特征在于，所述方法为向含有牛蒡粉的培养基中添加解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌；按细胞湿重计，所述解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌菌体的质量比为1:3:2。

在本发明的一种实施方式中，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(BacillusAmyloliquefaciens)B10-127，保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:M2013418；所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2013418；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)GB01-21，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号：CCTCC No:M 209102。

在本发明的一种实施方式中，在初始发酵体系中，解淀粉芽孢杆菌发酵利用原料中的淀粉产生大量葡萄糖；通气量2-3L/min条件下，发酵体系中的谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为碳源生产谷氨酸；减少体系中的通气量，谷氨酸棒状杆菌合成有机酸降低体系pH，植物乳杆菌开始大量增殖，同时将谷氨酸转化成为GABA。

在本发明的一种实施方式中，减少体系中的通气量至1-1.5L/min，同时降低发酵温度至30-32℃，谷氨酸棒状杆菌开始生成有机酸。

在本发明的一种实施方式中，谷氨酸棒状杆菌合成有机酸后，pH降至6.0-6.5，停止通气后，发酵温度升高至37-42℃，植物乳杆菌开始大量增殖。

在本发明的一种实施方式中，控制植物乳酸菌增值时的pH为3.8-4.5。

在本发明的一种实施方式中，初始发酵体系的pH为7.0-7.5。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵周期为3-4d。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为：将所述解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌接种至发酵培养基中，先在34-37℃条件下通气发酵12h；再将温度降至30-32℃，继续发酵14h后，降低通气量直至发酵液的pH降至6.0-6.5停止通气；停止通气后继续发酵培养8h，最后进行转化2d。

本发明还提供了上述方法得到的富含GABA的牛蒡发酵基料。

本发明还提供了上述方法或上述的富含GABA的牛蒡发酵基料在牛蒡发酵食品及代餐产品中的应用。

有益效果：

(1)本发明提供了一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，在牛蒡原料中利用益生菌发酵生产GABA，在丰富发酵基料功能成分的同时引入解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和植物乳杆菌，直接对原料中的淀粉、氨基酸类物质进行混合发酵，相比直接添加GABA此方法更具安全性和经济性。

(2)采用本发明的微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，得到的富含GABA的牛蒡发酵基料中pH为4.3，产品中固形物含量≧30％，产品中总酸含量为1.2％，产品中GABA含量为4.2542g/L。

(3)采用本发明的微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，获得的富含GABA的牛蒡发酵基料，除去其本身含有的功能性成分外，还增加了GABA的保健功能。

(4)采用本发明的微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，发酵所用的菌株均系食品生产安全菌株，其中的解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌为益生菌，无需对产品进行灭菌和分离，既节约了下游加工成本又增加了产品保健功能的多元性。

附图说明

图1：GABA标准品中HPLC图谱。

图2：GABA样品中HPLC图谱。

具体实施方式

本发明所使用的解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(BacillusAmyloliquefaciens)B10-127，保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC No:M2013418，公开于申请号为CN201310342414.8专利中；所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2013418，公开于文献“Efficient one-step preparation ofγ-aminobutyric acid from glucose without an exogenous cofactor by the designedCorynebacterium glutamicum”中；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB01-21，保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，菌种保藏号：CCTCC No:M209102，公开于申请号为CN201010167058.7专利中；所述谷氨酸棒杆菌13032和乳酸菌购自中国微生物菌种保藏中心。

下述实施例中涉及的培养基如下：

LB固态培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L(固体培养基琼脂粉添加量为15g/L)。

BHI固态培养基：胰蛋白胨10g/L、牛心浸粉17.5g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2g/L、磷酸二氢钾2.5g/L(固体培养基琼脂粉添加量为15g/L)。

MRS培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L、酵母膏4g/L、葡萄糖20g/L、吐温-80801mL/L、磷酸氢二钾2g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸三铵2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L(固体培养基琼脂粉添加量为15g/L)。

发酵培养基：牛蒡粉200g/L、玉米浆5g/L、尿素7g/L、MgSO₄ 0.6g/L、K₂HPO₄·3H₂O1g/L、FeSO₄·7H₂O 0.02g/L、MnSO₄·H₂O 0.002g/L，生物素亚适量初始pH 7.0，于121℃下灭菌15-20min备用。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

发酵过程谷氨酸含量的检测方法：

采用SBA-40型生物传感分析仪直接测定发酵过程中发酵液的谷氨酸含量。

GABA含量的检测方法：

HPLC检测采用FDNB(2，4一二硝基氟苯)为柱前衍生剂，色谱条件为：色谱柱LunaC18(21(150mm×4.60mm，5斗m)，乙腈-0.02mmoL/L乙酸铵混合溶液为流动相(V:V＝15：85)，柱温30℃，流速1.0mL/min，测定波长320nm。

pH值的测定方法：

根据GB5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的评价》，于25℃条件下用pH计测定。

可溶性固形物的测定方法：

根据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》规定的方法测定固形物。

取125g样品溶解于蒸馏水定容至250mL，取适量样液(氨基氮含量为1-5mg)用0.1mol/L NaOH标准溶液中和有机酸，当pH达到7.5左右时，用0.05mol/L NaOH标准溶液调pH至8.1，保持1min不变。缓慢加入10-15mL中性甲醛溶液。1min后用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定至pH 8.1，通过消耗0.05mol/L NaOH标准溶液体积数计算可溶性固形物含量。

总酸测定方法：

根据GB/T12456-2008《食品安全国家标准食品中总酸的测定》。

以酚酞试剂为指示剂，0.1mol/L NaOH标准溶液为滴定液，取50g样品于250mL容量瓶进行稀释，离心取上清液进行滴定，滴定至终点是溶液应成微红色且30s不变色，记录0.1mol/L NaOH标准溶液使用体积，计算总酸质量。

实施例1：混合菌种的培养及配制

1、混合菌种的培养

(1)解淀粉芽孢杆菌

解淀粉芽孢杆菌使用LB培养基进行培养，将解淀粉芽孢杆菌接种于LB固态培养基进行保藏菌株的活化和分纯后，以2％的接种量转接至LB液体培养基，37℃，180rpm摇瓶培养。

(2)谷氨酸棒状杆菌

谷氨酸棒状杆菌采用BHI培养基进行培养，将谷氨酸棒状杆菌接种于BHI固态培养基进行保藏菌株的活化和分纯，以2％的接种量转接至BHI液体培养基，30℃，180rpm挡板摇瓶培养。

(3)植物乳杆菌

植物乳杆菌选用MRS培养基对其进行培养，将植物乳杆菌接种于MRS固态培养基进行保藏植物乳杆菌菌株的活化和分纯，以2％的接种量转接至MRS液体培养基进行培养，由于植物乳杆菌为兼性厌氧性型菌株，采用37℃静置培养，上述菌种待菌体OD₆₀₀达到0.6-0.8后进行浓缩收集备用。

2、混合菌种的配置

分别将上述解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和植物乳杆菌的菌体培养液进行离心，浓缩收集菌体，按细胞湿重计，所述解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌菌体的质量比为1:3:2进行发酵混合菌种配制。

实施例2：发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法

将实施例1配置得到的混合菌种接种至发酵培养基中，在37℃，pH 7.0，通气量2.5L/min条件下，发酵体系中的谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为碳源生产谷氨酸；减少体系中的通气量至1L/min，降低发酵温度至30℃，谷氨酸棒状杆菌开始生成乳酸和琥珀酸，pH降至6.0停止通气，发酵温度升高至37℃，此时植物乳杆菌开始大量增殖pH持续下降，在pH 4.0范围内植物乳杆菌产生的谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化成为GABA。

实施例3：富含GABA的牛蒡发酵基料理化性质

对实施例2得到的富含GABA的牛蒡发酵基料理化性质的理化性质测定：

1)pH值的测定：根据GB5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的评价》，于25℃条件下用pH计测定，测定结果：发酵终产物pH为4.3，在3.0-5.0范围之内。

2)可溶性固形物的测定：根据GB/T 12143—2008《饮料通用分析方法》规定的方法测定固形物结果：产品中固形物含量≧30％。

3)总酸测定：根据GB/T12456-2008《食品安全国家标准食品中总酸的测定》，使用NaOH中和滴定法进行测定，测定结果：产品中总酸含量为1.2％。

4)HPLC检测产品中的GABA含量(如图1和图2所示)，结果显示：产品中GABA含量为4.2542g/L。

实施例4：感官品质评价

将原液稀释后，根据香味、色泽、口感、组织形态各25分，随机选取十位评价员对样本进行感官品质评价(评分标准如表1所示)。

表1评价项目及评分标准

评价结果：经十位评价员对样本进行评价，去除偏差较大数据后，最终品质评价平均分为87.31。

对比例1：

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整按照菌体质量解淀粉芽孢杆菌：谷氨酸棒状杆菌：植物乳杆菌比为3:2:1，结果为：发酵过程中谷氨酸含量明显下降，终产品种的GABA含量不足1g/L。

对比例2：

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整按照菌体质量解淀粉芽孢杆菌：谷氨酸棒状杆菌：植物乳杆菌比为1:2:1，结果为：后期植物乳杆菌活力不足，菌体量明显下降发酵过程谷氨酸积累，但GABA含量极低，不足100mg/mL。

对比例3：

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整按照菌体质量解淀粉芽孢杆菌：谷氨酸棒状杆菌：植物乳杆菌比为1:1:1，结果为：发酵过程中谷氨酸棒状杆菌菌浓增长缓慢，产品中GABA产量几乎为0。

对比例4：

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整通气量为2L/min不变，结果：高浓度氧含量导致植物乳杆菌生长缓慢，发酵产品中几乎无GABA。

对比例5：

具体实施方式同实施例2，区别在于，37℃通气发酵12h后，不进行温度调整继续发酵14h后，结果：谷氨酸棒状杆菌菌浓低，体系中积累大量杂酸。

对比例6

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整谷氨酸棒杆菌为调整谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌13032，结果为谷氨酸产量低，影响整体发酵过程，产品中GABA含量极低。

对比例7

具体实施方式同实施例2，区别在于，调整植物乳杆菌为其他筛选自市售酸奶的乳酸菌，结果为谷氨酸转化率低，产品GABA含量不足200mg/L。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种微生物发酵制备富含GABA的牛蒡发酵基料的方法，其特征在于，所述方法为向含有牛蒡粉的培养基中添加解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌；按细胞湿重计，所述解淀粉芽孢杆菌、谷氨酸棒状杆菌和植物乳杆菌菌体的质量比为1:3:2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus Amyloliquefaciens)B10-127，所述谷氨酸棒状杆菌为谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)GB01-21。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法为：在初始发酵体系中，解淀粉芽孢杆菌发酵利用原料中的淀粉产生大量葡萄糖；通气量2-3L/min条件下，发酵体系中的谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为碳源生产谷氨酸；减少体系中的通气量，谷氨酸棒状杆菌合成有机酸降低体系pH，植物乳杆菌开始大量增殖，同时将谷氨酸转化成为GABA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，减少体系中的通气量至1-1.5L/min，同时降低发酵温度至30-32℃，谷氨酸棒状杆菌开始生成有机酸。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，谷氨酸棒状杆菌合成有机酸后，pH降至6.0-6.5，停止通气，将发酵温度升高至37-42℃，植物乳杆菌开始大量增殖。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，控制植物乳酸菌增值时的pH为3.8-4.5。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，初始发酵体系的pH为7.0-7.5。

8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述发酵周期为3-4d。

9.权利要求1-8任一所述的方法得到的富含GABA的牛蒡发酵基料。

10.权利要求1-8任一所述的方法或权利要求9所述的富含GABA的牛蒡发酵基料在牛蒡发酵食品及代餐产品中的应用。

Images