CN111662816A - 基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统及方法，系统包括富集组件：用于通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，形成富集液；微反应组件：用于抽吸富集液至微反应室进行LAMP扩增，使富集液分别与加入染料的反应体系、未加入染料的反应体系进行反应，形成定性结果；通信组件：用于接收反应定量检测结果和预警指令；远程服务器根据电信号计算沉淀浊度值和病毒浓度输出反应定量检测结果和预警指令；预警组件：用于发出声音和/或灯光报警信号。本发明利用高效扩增技术快速检测空气中的致病病毒，并进行定性、定量检测，输出检测结果和报警信号，实现室内空气中的病毒预警。
Description
技术领域
本发明涉及医学和生物领域，尤其涉及等温核酸扩增技术，具体地指一种基于微流控芯片检测的室内环境中病毒病原体的快速检测与预警系统及方法。
背景技术
空气中的致病病毒是疾病传播的一个重要途径，如手足口，流感病毒，SARS病毒等。通常通过一定的方法富集后，将样品采用特殊的培养箱进行病毒培养，病毒培养到一定阶段后再利用电子显微镜检测观察，或者利用免疫技术作病原抗体抗原检测，这些都是需要不同的专业科研人员联合不同的实验室进行，一般过程复杂，耗时较长，设备装置繁多，巨大，而且检测的起始含量要求较高，由于整个过程时间长，涉及的仪器和人员比较多，也有污染的风险。
特别是由于空气中病毒含量拷贝数较低，很多传统的方法需要长时间对空气中的病原体富集，例如膜截留空气收集病原体的方法，往往需要24小时以上，才能收集到检测的初始限度，然后利用特定宿主培养病毒，一般48-72小时，电子显微镜观察，或者结合抗原抗体检测来判断，期间涉及到多组装置：富集装置，培养装置，电子显微镜，抗体抗原试剂等等，程序繁杂且耗时也耗费人工，其中富集装置和电子显微镜庞大；培养病原体，电子显微镜的观察对操作人员的专业性要求高，不适合日常家居，普通生活场所。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述背景技术存在的不足，而提出的一种基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统及方法，利用高效扩增技术快速检测空气中的致病病毒，并进行定性、定量检测，输出检测结果和报警信号，实现室内空气中的病毒预警。
为实现上述目的，本发明所设计的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特殊之处在于，所述系统包括富集组件、微反应组件、通信组件和预警组件；
所述富集组件：用于抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液；
所述微反应组件：用于抽吸富集液至微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增，使富集液分别与加入染料的反应体系、未加入染料的反应体系进行反应，并通过透明视窗展示富集液与加入染料的反应体系反应的定性结果，通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度反应定量结果；
所述通信组件：用于接收光电设备采集的电信号，将电信号无线传输至远程服务器，接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，并发送至显示装置、预警组件；所述远程服务器根据电信号计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果和预警指令；
所述预警组件：用于根据通信组件发送的预警指令发出声音和/或灯光报警信号。
进一步地，所述富集组件包括抽气泵，所述抽气泵通过电磁阀和管路与位于富集仓顶部的出气口连接，所述富集仓的底部设置有超声波震荡盘，所述富集仓的侧面设置有进气口、进液口和出液口，所述富集仓的内腔中设置有微孔滤膜，所述微孔滤膜由上层膜后网槽衬垫和下层膜前收集网槽包覆固定，所述进气口通过电磁阀与进气装置连接，所述进液口通过电磁阀与第一定量注液装置、第二定量注液装置连接，所述出液口与微反应组件连接。
更进一步地，所述微反应组件包括从上向下依次设置的观察视窗、微流控芯片板、测温板和控温板，所述微流控芯片板包括设置于中心的进样孔，所述进样孔的底部与富集组件的输出端连通，沿所述进样孔的外围周向设置有若干个样品流动通道，每一个样品流动通道的尽头设置有一个微反应室，所述观察视窗与微反应室对应位置设置有观察口，所述观察口下方设置有与病原体相对应的比对色卡。
更进一步地，所述第一定量注液装置和第二定量注射装置结构相同，均设置有底座、推杆和腔体，所述推杆和腔体设置于底座上，腔体的一端与推杆连通，另一端通过电磁阀与进液口连通，所述第一定量注液装置的腔体内设置有无核酸缓冲液，所述第二定量注液装置的腔体内无液体，存放无菌无病毒处理过空气。
更进一步地，所述微流控芯片板上的微反应室分别设置于定性检测和定量检测两个区域内，位于定性检测区域内的微反应室与观察口相对，微反应室的内腔中设置有加有染料的干粉状试剂，位于定量检测区域内的微反应室的两端分别设置有LED发射端和LED光接收端，所述LED发射端和LED光接收端与通信组件电连接，微反应室的内腔中设置有未加有染料的干粉状试剂。
更进一步地，所述通信组件包括A/D转换器、MCU和无线通信模块，所述A/D转换器用于接收LED发射端和LED光接收端的电信号，所述MCU用于通过无线通信模块将电信号无线传输至远程服务器，并通过无线通信模块接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，将反应定量检测结果和预警指令发送至显示装置、预警组件。
更进一步地，所述微孔滤膜为0.01um的聚四氟乙烯膜或截留分子量100000的聚偏氟乙烯膜。
更进一步地，所述上层膜后网槽衬垫和下层膜前收集网槽的直径为a cm，a≥1，以中心为圆点，在半径0.1a，0.2a，0.3a，0.4a cm处分别为半径作圆，中心以及每个圆的边界上均匀分布直径为0.02a cm的小孔。
更进一步地，所述微流控芯片板由聚二甲基硅氧烷聚合物制成。
更进一步地，所述富集仓、第一定量注液装置和微流控芯片板以及相应管路为使用后更换装置。
更进一步地，所述系统还包括远程移动终端，所述远程移动终端通过连接远程服务器接收反应定量检测结果。
本发明还提出一种基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，特殊之处在于，所述方法包括如下步骤：
1)抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液；
2)将富集液注入微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增；
3)将扩增后的富集液引入微流控芯片板中与预装的干粉状反应体系进行反应，控制反应室温度和反应时间，所述微反应室分为定性检测和定量检测两个区域，定性检测区域内的干粉状反应体系加有染料，定量检测区域内的干粉状反应体系未加有染料；
4)通过比对色卡与定性检测区域的微反应室内反应液的颜色相比较判定病原体浓度范围，通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度来计算病原体浓度；
5)根据富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体浓度的标准曲线关系输出反应定量检测结果，当检测结果超过预设值时发出预警指令。
优选地，所述步骤1)中无核酸缓冲液的成分为200mM Tris-HCL(pH8.8 25摄氏度)，100mM(NH4)2SO4,100mM的KCL,20mM MgSO4,1％(v/v)Tritonx-100。
优选地，所述步骤1)中通过无核酸缓冲液溶解病原体的方法为将无核酸缓冲液淹没截留有病原体的滤膜，通过超声波震动滤膜，使病原体分散富集到无核酸缓冲液中。
优选地，所述步骤3)中干粉状反应体系包括H1N1型流感病毒的逆转录-环介导反应体系、肠道病毒71型逆转录-环介导反应体系、科萨奇病毒A组16型逆转录-环介导反应体系。
优选地，所述步骤4)中通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度的方法为在微反应室的两端分别设置LED发射端和LED光接收端，分别采集LED发射端和LED光接收端的电信号得到发射光强值ILED、接收光强值IPD，计算沉淀浊度：
Turbidity＝In(IPD/ILED)。
优选地，所述步骤5)中病原体目标曲线包括H1N1型标准曲线：y＝0.2394x-6.3545、肠道病毒71型标准曲线：y＝0.1983x-3.9727、科萨奇病毒A组16型标准曲线：y＝0.1994x-5.9857。
聚合酶链反应(PCR)是一种DNA链体外高效扩增技术，在体外的特定条件下，数小时内可以将单一的DNA链扩增至数107拷贝，大大增加检测起始含量和特异性。PCR扩增中的环介导的等温扩增技术(LAMP)是扩增单链RNA技术，数小时内可以将单一的DNA链扩增至数107-10拷贝，而空气中的病毒，大多数都是单链RNA，例如流感病毒甲型H1N1，引起手足口病的肠道病毒71型，科萨奇病毒A组16型，所以LAMP是现有的将空气中病原体短时内高效扩增的最有效方法之一。
本发明具有如下优点：
1、快速：从富集病毒病原体到LAMP反应扩增直至最后结果预警，全程仅需约100分钟(3个实施例均为100分钟)，而常规方法需要24h以上；
2、小型：富集仓小到立方厘米级别，微流控芯片板厚度在毫米级别，直径在厘米级别，配合其他零配件，体积小使得便携成为可能；
3、集成集约化的操作：利用自动注液装置，并且富集仓和微流控芯片板以及对应管路都是更换零配件，避免了污染，无需人工操作，只需简单操作几个按键就可以完成；
4、高效且高精度：LAMP扩增技术RNA浓度需求低，因此需要富集的病毒病原体起始浓度比普通的PCR扩增少，所以富集仓小，富集时间短，让高效成为可能；
5、预警效果一目了然：设置定性观察视窗和定量结果显示屏；
6、操作简便：能实时自动监测，仅需定期更换相关配件，操作相关界面，普通人也可以使用，不仅限于科研人员。
本发明把原来需要人工手工的多部门合作的科研工作进化成的集约化、集成化、小型化的设备，以满足实际市场需求的更短更快的定性定量的简易操作，并且能将实验数据通过互联网反映成普通的社会公众信息的来满足社会普通大众的实际需求。
附图说明
图1为本发明基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统的结构示意图。
图2为进气装置结构示意图。
图3为富集仓的整体结构示意图。
图4为富集仓的内部结构示意图。
图5为富集仓的俯视图和侧视图。
图6为富集仓的内部膜结构图。
图7为注液装置的结构示意图。
图8为微流控芯片板的结构示意图。
图9为微流控芯片板的侧视图、俯视图以及局部放大图。
图10为观察视窗的结构示意图。
图11为观察视窗中的对比色卡中颜色与浓度的对应表。
图中：进气装置1，富集仓2，进气口A、出气口B，出液口C，进液口D，微孔滤膜2.1，上层膜后网槽衬垫2.2，下层膜前收集网槽2.3，抽气泵3，超声波震荡盘4，第一定量注液装置5A，第二定量注液装置5B，底座5.1，推杆5.2，腔体5.3，伺服电机5.4，微流控芯片板6，进样孔6.1，样品流动通道6.2，微反应室6.3，LED发射端6.4，LED光接收端6.5，测温板7，控温板8，观察视窗9，观察口9.1，比对色卡9.2，第一电磁阀10，第二电磁阀11，第三电磁阀12，第四电磁阀13，第四电磁阀14。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
本发明所提出的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，包括富集组件、微反应组件、通信组件和预警组件。
富集组件：用于抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液。
如图1所示，富集组件包括抽气泵3，抽气泵3通过第二电磁阀11和管路与位于富集仓2顶部的出气口B连接，富集仓2的底部设置有超声波震荡盘4，富集仓2的侧面设置有进气口A、进液口D和出液口C。如图2、3所示，富集仓2的内腔中设置有微孔滤膜2.1。微孔滤膜2.1为直径1cm的0.01um聚四氟乙烯膜(PTFE)或截留分子量100000聚偏氟乙烯膜(PVDF)，可以截留病毒类病原体，但细菌类病原体可以通过不被截留。微孔滤膜2.1夹在中间，利用上下两层蜂窝网状槽固定。上层膜后网槽衬垫2.2和下层膜前收集网槽2.3的直径为1cm，三者之间有极薄的密封圈密封固定。上层膜后网槽衬垫2.2和下层膜前收集网槽2.3以中心为圆点，在半径0.1，0.2，0.3，0.4cm处分别为半径作圆，中心以及每个圆的边界上均匀分布直径为0.02cm的小孔，以便空气和液体可以均匀通过，平衡微孔滤膜承受的压力。
如图1、2所示，进气口A通过第一电磁阀10与进气装置1连接，进液口D通过第三电磁阀12和第四电磁阀13与第一定量注液装置5A、第二定量注液装置5B连接，出液口C通过第四电磁阀14与微反应组件中微流控芯片板6的进样孔6.1连接。
如图1和图7所示，第一定量注液装置5A和第二定量注液装置5B结构相同，类似于注射器结构，均设置有底座5.1、推杆5.2和腔体5.3，推杆5.2和腔体5.3设置于底座5.1上，腔体5.3的后端与推杆5.2连通，前端通过电磁阀与进液口D连通，伺服电机5.4与推杆5.2的后端连接，推杆5.2在伺服电机的驱动下在腔体5.3内运动。第一定量注液装置5A的腔体5.3内设置有无核酸缓冲液。当病毒病原体被富集仓中的膜截留时，第一定量注液装置5A中的无核酸缓冲液通过推杆5.1推动流经导管进入富集仓2。当富集液要引入微流控芯片板6时，利用第二定量注液装置5B中推杆5.1驱动促使富集液进入微流控芯片。无核酸缓冲液的成分是：200mM Tris-HCL(pH8.8 25摄氏度)，
100mM(NH4)2SO4,100mM的KCL,20mM MgSO4,1％(v/v)Tritonx-100。
微反应组件：用于抽吸富集液至微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增，使富集液分别与加入染料的反应体系试剂、未加入染料的反应体系试剂进行反应，并通过透明视窗展示富集液与加入染料的反应体系试剂反应的定性结果，通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系试剂反应产生的沉淀浊度。
如图1、图9、图10所示，微流控芯片组件包括从上向下依次设置的观察视窗9、微流控芯片板6、测温板7和控温板8。微流控芯片板6由光学透性良好且具有弹性的聚二甲基硅氧烷聚合物(pdms)制成，为厚度不超过50um的直径不超过6cm的微圆盘状。如图8所示，微流控芯片板6包括设置于中心的进样孔6.1，进样孔6.1的底部与富集组件的输出端连通，沿进样孔6.1的外围周向设置有12个样品流动通道6.2，12条样品流动通道宽度为50um，深度为20um，长度为150um。每一个样品流动通道6.2的尽头设置有一个容积为30uL的微反应室6.3。观察视窗9与微反应室6.3对应位置设置有观察口9.1，观察口9.1下方设置有与病原体相对应的比对色卡9.2。
如图8所示，微流控芯片板6上的微反应室6.3分别设置于定性检测和定量检测两个区域内，位于定性检测区域内的微反应室6.3与观察口9.1相对，微反应室6.3的内腔中设置有加有染料的干粉状试剂，位于定量检测区域内的微反应室6.3的两端分别设置有LED发射端6.4和LED光接收端6.5。LED发射端6.4即LED光源(含自测定光强度组件)，LED光接收端6.5为LDR光敏阻件(含测定接收光强度组件)。LED发射端6.4和LED光接收端6.5与通信组件电连接，微反应室6.3的内腔中设置有未加有染料的干粉状试剂。
在反应微室6.3中已预装好干粉状试剂：其中定性区域为25mmol/L dNTP，20umol/L引物FIP，20umol/L引物BIP，5umol/L引物F3,5umol/L引物B3，Bst DNA聚合酶(8U/uL)，AMV逆转录酶(8U/uL)，Calcein染料2uL；定量区域为反应时，25mmol/L dNTP，20umol/L引物FIP，20umol/L引物BIP，5umol/L引物F3，5umol/L引物B3，Bst DNA聚合酶(8U/uL)，AMV逆转录酶(8U/uL)。含有富集样品的反应缓冲液进入微反应室6.3后，将干粉状试剂溶解反应。干粉状试剂是采用冷冻干燥机的真空冷冻干燥法预先将试剂里面的水分冻结，然后在真空无菌的环境下将试剂里面被冻结的水分升华，从而得到冷冻干燥而成的干粉状试剂；从而可以将8种试剂固定在微流控芯片板6上。
富集仓2、第一定量注液装置5A和微流控芯片板6为更换装置，使用一次后需随连接管路一同更换。
待富集液进入各微反应室6.3后溶解反应室中的干粉状试剂，微流控芯片板6通过加热和控温装置反应，定性区域与定量区域的反应同时开始。定性区域，最后染料在微反应室中产生颜色，与展示窗口中的比色卡对比确认病毒是否有，如果有浓度范围是多少的定性判断。如图10所示，微反应完毕后，关于定性反应，从观察视窗9.1中观察，如果空气中没有对应病毒，则微反应室6.3内呈现橘黄色，如果空气中有对应病毒，则微反应室6.3内呈现黄绿色，根据黄绿色的程度与比色视窗9中的比对色卡9.2对比，得出空气中病毒含量的范围。如图11所示，黄绿色在表中浅黄绿色或者更浅则显示病毒浓度为10copies/m3以下,黄绿色在表中的中间黄绿色和浅黄绿色之间显示病毒浓度为10-100copies/m3,黄绿色在表中的中间黄绿色和深黄绿色之间显示病毒浓度为100-500copies/m3,黄绿色在表中的深黄绿色或者更深显示病毒浓度为500copies/m3以上。定量区域，未加入染料，可以观察到反应自然产生的焦磷酸盐沉淀白色沉淀，利用光电元件对反应产生的沉淀作浊度检测，再通模数转换器转换光信号为电信号，然后通过远程服务器或MCU及应用程序计算出病毒的含量，以定量，检测结果可以通过远程终端直接观察，方便普通人直接察看。
通信组件：用于接收光电设备采集的电信号，将电信号无线传输至远程服务器，接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，并发送至显示装置、预警组件；远程服务器根据电信号计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果和预警指令；计算沉淀浊度值和病毒浓度的过程亦可以在本地完成。
通信组件包括A/D转换器、MCU和无线通信模块，A/D转换器用于接收LED发射端6.4和LED光接收端6.5的电信号，MCU用于通过无线通信模块将电信号无线传输至远程服务器，并通过无线通信模块接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，将反应定量检测结果和预警指令发送至显示装置、预警组件。MCU也可以在本地计算沉淀浊度值和病毒浓度并根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果。
定量判断：微反应产物焦磷酸盐沉淀浊度造成光强度不同，然后利用光敏器件检测，从而间接监测扩增，并分析。实质是从监测病毒的RNA片段扩增的整个过程，浊度形成的时间和DNA的浓度形成有一定的函数关系，当LAMP扩增时，在等温条件下孵化，通过测定浊度出锋的时间来间接定量判断浓度。如图8、图9所示，LED发射端6.4发出的光(650nm)通过微反应室6.3并照射LED光接收端6.5，微流控芯片板6由控温板8加热至LAMP反应的各阶段温度，控温板8的温度是由温度控制器控制。时间监测由系统监视。数模转换器(A/D)转换信号后，接收LED发射端6.4发光强度(ILED)和LED光接收端6.5(IPD)接收的光强度转换后的电信号，单片机(MCU)收集信号，然后无线传输至服务器(SERVER)，服务器后台计算，最后传输给的无线终端设备(RTU)。
服务器负责处理从单片机收集的数据，形成实时图形，并通过数据处理和图形分析，得到目标病毒的含量等信息。工作时，服务器投入运行，系统就进入既定程序，直至微反应结束，同时，系统进行浊度信号实时采集，服务器根据采集到的信号形成实时图形，并进行数据处理和图形分析，得到待测病毒的含量。
服务器与单片机处理器通过无线信号连接，控制单元分别连接温度传感器和环境温度传感器，以及光电系统；温度传感器位于微流控芯片板底部，环境温度传感器位于整个系统内部，光电系统已详述。时间检测传感器位于各关键部件上。
应用软件安装在远程终端上，可以在Windows，Android,iOS系统下运行，实现实验设置，数据管理和其他功能。应用软件将会监测温度控制系统，光电系统等。
预警组件：用于根据通信组件发送的预警指令发出声音和/或灯光报警信号。
整个系统是一个联动运行系统，启动状态时，进液口D和出液口C对应的第三电磁阀13、第四电磁阀14关闭，进气口A和出气口B对应的第一电磁阀10、第二电磁阀11开启，空气中的病原体开始富集，富集完毕，第一电磁阀10、第二电磁阀11关闭，第三电磁阀12，13(5A通路)开启，第一定量注液装置5A的推杆5.1将腔内无核酸缓冲液注入进液口D，启动超声波震荡盘4，然后关闭第三电磁阀12的5A通路，开启第三电磁阀12的5B通路，第二定量注液装置5B的推杆5.2通过进液口D推动富集液自动进入微反应组件中，样品加入完毕后，微反应组件通过控温装置、温敏装置监测反应。a定性反应：最后染料在微反应室中产生黄绿色，与展示窗口中的比色卡对比确认病毒是否有，如果有浓度范围是多少的定性判断；b定量反应:微流控芯片板6中光电设备对反应产生的沉淀作浊度检测，再通过远程服务器以及应用程序计算出病毒的含量，以定量。无需操作人员作其他操作或专业的计算来确定含量，直接有设定好的程序系统操作计算结果，保证了高精度和集成化。
本系统还可以设置远程移动终端，远程移动终端通过连接远程服务器接收反应定量检测结果。这样普通人可以直接通过远程终端，如手机，平板电脑等查询检测结果，了解所监测区域的环境病毒情况。
本发明还提出一种基于微流控芯片检测的环境中病原体的快速检测与预警方法，包括如下步骤：
1)抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液。30min的采样时间，抽气泵3的流量约为5L/min的速度，30min采集待检测空间内150L空气的中的病毒病原体。采集完毕后，富集仓2利用第一定量注液装置5A引入无核酸缓冲液，然后启动超声波微型震动盘4，以50KHZ的频率运行10min将滤膜上病毒病原体分散富集到1mL反应缓冲液中，关闭超声波微型震动盘4。无核酸缓冲液的成分为200mM Tris-HCL(pH8.8 25摄氏度),100mM(NH4)2SO4,100mM的KCL,20mM MgSO4,1％(v/v)Tritonx-100。
2)设置的采集时间到达后，富集过程完毕，将富集液注入微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增。
3)设置的扩增时间完成后，扩增过程完毕，将扩增后的富集液引入微反应室中与预装的干粉状反应体系试剂进行反应，控制反应室温度65℃和反应时间50min，所述微反应室分为定性检测和定量检测两个区域，定性检测区域内的干粉状反应体系试剂加有染料，定量检测的干粉状反应体系试剂未加有染料；干粉状反应体系试剂包括H1N1型流感病毒的逆转录-环介导反应体系试剂、肠道病毒71型逆转录-环介导反应体系试剂、科萨奇病毒A组16型逆转录-环介导反应体系试剂。
LAMP扩增反应体系
| 体系明细(浓度) | 体积 |
| 25mmol/L dNTP | 2uL |
| 20umol/L引物FIP | 1.5uL |
| 20umol/L引物BIP | 1.5uL |
| 5umol/L引物F3 | 1.5uL |
| 5umol/L引物B3 | 1.5uL |
| Bst DNA聚合酶(8U/uL) | 2uL |
| AMV逆转录酶(8U/uL) | 2uL |
| 富集样品(含反应缓冲液) | 13uL |
| 25uL体系 |
LAMP反应引物设计：
流感病毒：
H1N1型流感病毒的逆转录-环介导的等温扩增方法(RT-LAMP)等温扩增引物：
F3:AAGACAAGTTCATGGCCCAATC；
B3:CGGCTGCATATCCTGACCC；
FIP:CCGGCTTGAACTTCTTCTTGCTGCTGTAGGGGCATTCACCATCCATCT；
BIP:GTGCTATAAACACCAGCCTCCCAGGCCAGTCTCAATTTTGTGCTT。
手足口病毒：
肠道病毒71型(英文名为:Human enterovirus71)，简称EV71，是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一，逆转录-环介导的等温扩增引物
F3:GCGCAAATGCGTAGAAAGG
B3:AGGGTCTGACAGCTTGACAA；
FIP:CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA；
BIP:TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG。
科萨奇病毒A组16型(英文名为coxsackievirus A16)，简称CA16，是引起婴幼儿手足口病主要病原体之一，逆转录-环介导的等温扩增引物：
F3:AGGAGACAGCCATTGGGAA；
B3:ACTGCAGTAATTGGGGGACT；
FIP:GTTCTGTGTACCCGTGGTGGGTTTCTTTAGCCGTGCTGGTT；
BIP:TGCTCAATTACGGCGCAAATGCGCTTGGCTACGACAAATGTG。
4)通过比对色卡与定性检测区域的微反应室内沉淀物的颜色相比较判定病原体性质，微反应完毕后，如果空气中没有对应病毒，则微反应室内呈现橘黄色，如果空气中有对应病毒，则微反应室内呈现黄绿色，根据黄绿色的程度与比色视窗中的比色卡对比，得出空气中病毒含量的范围。
通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度：在微反应室的两端分别设置LED发射端6.4和LED光接收端6.5，分别采集LED发射端6.4和LED光接收端6.5的电信号得到发射光强值ILED、接收光强值IPD，计算沉淀浊度：
Turbidity＝In(IPD/ILED)。
5)根据富集液与未加入染料的反应体系反应产生的沉淀浊度计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果，当检测结果超过预设值时发出预警指令。
浓度计算：利用各种病毒对照的RNA模版建立浊度出峰时间与浓度之间的定量关系，发现它们的出峰时间与以10为底的浓度数值有稳定的线性关系，可以作为标准曲线从而实现对样品的定量检测。
H1N1型标准曲线绘制：浓度为100ng/uL,101ng/uL,102ng/uL,103ng/uL,104ng/uL,105ng/uL的RNA样品各一个，可以利用以上系统将浊度的出峰时间捕捉到，制作出H1N1标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表，如表1所示，并与以上浓度做成标准曲线，获得方程：y＝0.2394x-6.3545。从标准曲线来看相关系数为R2＝0.9899，呈现良好的相关线性关系。测试时，根据测定出的目标富集病毒反应出峰时间，即可根据标准曲线计算出富集的病毒浓度S(数值)，则可以计算出所测区域目标病毒浓度为20/3*S mg/M3。
表1H1N1标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表
| 时间(min) | 26.5 | 31.2 | 33.8 | 40.1 | 43.6 | 46.75 |
| 浓度的-log | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
肠病毒71型标准曲线绘制：浓度为100ng/uL,101ng/uL,102ng/uL,103ng/uL,104ng/uL,105ng/uL的RNA样品各一个，可以利用以上系统将浊度的出峰时间捕捉到，制作出肠病毒71型标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表，如表2所示，并与以上浓度做成标准曲线，获得方程：y＝0.1983x-3.9727。从标准曲线来看相关系数为R2＝0.9861，呈现良好的相关的线性关系。测试时，根据测定出的目标富集病毒反应出峰时间，即可根据标准曲线计算出富集的病毒浓度S(数值),则可以计算出所测区域目标病毒浓度为20/3*S mg/M3。
表2
肠病毒71型标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表
| 时间(min) | 20.5 | 24.6 | 29.3 | 36.1 | 41.6 | 43.75 |
| 浓度的-log | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
科萨奇病毒A组16型标准曲线绘制：浓度为100ng/uL,101ng/uL,102ng/uL,103ng/uL,104ng/uL,105ng/uL的RNA样品各一个，可以利用以上系统将浊度的出峰时间捕捉到，制作出科萨奇病毒A组16型标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表，如表3所示，并与以上浓度做成标准曲线，获得方程：y＝0.1994x-5.9857。从标准曲线来看相关系数为R2＝0.9909，呈现良好的相关的线性关系。测试时，根据测定出的目标富集病毒反应出峰时间，即可根据标准曲线计算出富集的病毒浓度S(数值),则可以计算出所测区域目标病毒浓度为20/3*S mg/M3。
表3
科萨奇病毒A组16型标准曲线绘制时浊度出峰时间与浓度的负对数关系表
| 时间(min) | 30.3 | 35.7 | 39.3 | 43.9 | 51.3 | 54.8 |
| 浓度的-log | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
实施例1：
某公司会议室30m2，2018年9月20日，会议室有10人在开会。
将装置放置于教室中央，全过程约100min。
a.30min采样时间，通过进气装置1和抽气泵3将约有150L室内空气流过采样装置，富集装置中的膜截留空气中的病毒；
b.超声波震荡盘4震动10min，将滤膜上的病毒均匀分散到1ml反应缓冲液中，1ml反应缓冲液由定量注液装置注入富集仓2；
c.将富集液注入微流控芯片板6的中心孔中60uL，然后在分别均匀注入各个微反应室6.3中13uL，等待1min中，微反应室6.3中的冻干试剂完全溶于缓冲液中，约1min；
d.在微流控芯片板6上启动LAMP扩增反应，65℃，50min。
e.反应过程中，A：定性检测所有目标病毒对应孔皆观察到橘黄色，基本确定无流感病毒，手足口病毒。B：定量检测，远程终端软件程序中所有目标病毒皆未观察到浊度出峰，即表明反应未产生焦磷酸沉淀，确定无流感病毒，手足口病毒。
实施例2：
某小学二年级教室30m2，2018年9月20日，教室内有3个学生有咳嗽症状。
将装置放置于教室中央，全过程约100min。
a.30min采样时间，通过进气装置1和抽气泵3将约有150L室内空气流过采样装置，富集装置中的膜截留空气中的病毒
b.超声波震荡盘4震动10min，将滤膜上的病毒均匀分散到1ml反应缓冲液中，1ml反应缓冲液由定量注液装置注入富集仓
c.将富集液注入微流控芯片板6的中心孔中60uL，然后在分别均匀注入各个微反应室6.3中13uL，等待1min中，微反应室6.3中的冻干试剂完全溶于缓冲液中。约1min
d.在微流控芯片板上启动LAMP扩增反应，65℃，50min。
e.反应过程中，定性检测H1N1流感病毒对应孔观察到黄绿色，比对显色卡，病毒浓度为500copies/m3以内，其他病毒对应检测孔为橘黄色，基本确定有流感病毒，无手足口病毒。B：定量检测，远程终端软件程序中流感病毒观察到浊度出峰曲线，出锋时间为21.7min，远程应用程序根据公式直接计算空气中流感病毒的浓度约为14.2mg/M3，其他目标病毒无浊度出锋曲线，则无其他目标检测病毒。
实施例3
某教室30m2，2018年9月5日，班级曾有学生因为手足口病并请假回家，现全班休息半天，教室准备马上做消毒处理。
将装置放置于教室中央，全过程约100min。
a.30min采样时间，通过进气装置1和抽气泵3将约有150L室内空气流过采样装置，富集装置中的膜截留空气中的病毒；
b.超声波震荡盘4震动10min，将滤膜上的病毒均匀分散到1ml反应缓冲液中，1ml反应缓冲液由定量注液装置注入富集仓2；
c.将富集液注入微流控芯片板6的中心孔中60uL，然后在分别均匀注入各个微反应室6.3中13uL，等待1min中，微反应室6.3中中的冻干试剂完全溶于缓冲液中。约1min；
d.在微流控芯片板上启动LAMP扩增反应，65℃，50min。
e.反应过程中，定性检测科萨奇病毒A组16型对应孔观察到黄绿色，比对显色卡，病毒浓度为500copies/m3以上，其他病毒对应检测孔为橘黄色，基本确定有手足口病毒，无流感病毒。B：定量检测，远程终端软件程序中科萨奇病毒A组16型观察到浊度出峰曲线，出锋时间为31.2min，远程应用程序根据公式直接计算空气中流感病毒的浓度约为11.5mg/M3，其他目标病毒无浊度出锋曲线，则无其他目标检测病毒。
本领域的技术人员应当理解，此处所述的具体实施方案仅用解释本发明专利，并不用于限制本发明专利。在本发明专利的精神和原则之内作出的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之中。
Claims (17)
1.一种基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述系统包括富集组件、微反应组件、通信组件和预警组件；
所述富集组件：用于抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液；
所述微反应组件：用于抽吸富集液至微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增，使富集液分别与加入染料的反应体系试剂、未加入染料的反应体系试剂进行反应，并通过透明视窗展示富集液与加入染料的反应体系试剂反应的定性结果，通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系试剂反应产生的沉淀浊度；
所述通信组件：用于接收光电设备采集的电信号，将电信号无线传输至远程服务器，接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，并发送至显示装置、预警组件；所述远程服务器根据电信号计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果和预警指令；
所述预警组件：用于根据通信组件发送的预警指令发出声音和/或灯光报警信号。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述富集组件包括抽气泵(3)，所述抽气泵(3)通过电磁阀和管路与位于富集仓(2)顶部的出气口(B)连接，所述富集仓(2)的底部设置有超声波震荡盘(4)，所述富集仓(2)的侧面设置有进气口(A)、进液口(D)和出液口(C)，所述富集仓(2)的内腔中设置有微孔滤膜(2.1)，所述微孔滤膜(2.1)由上层膜后网槽衬垫(2.2)和下层膜前收集网槽(2.3)包覆固定，所述进气口(A)通过电磁阀与进气装置(1)连接，所述进液口(D)通过电磁阀与第一定量注液装置(5A)、第二定量注液装置(5B)连接，所述出液口(C)与微流控芯片组件连接。
3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述微反应组件包括从上向下依次设置的观察视窗(9)、微流控芯片板(6)、测温板(7)和控温板(8)，所述微流控芯片板(6)包括设置于中心的进样孔(6.1)，所述进样孔(6.1)的底部与富集组件的输出端连通，沿所述进样孔(6.1)的外围周向设置有若干个样品流动通道(6.2)，每一个样品流动通道(6.2)的尽头设置有一个微反应室(6.3)，所述观察视窗(9)与微反应室(6.3)对应位置设置有观察口(9.1)，所述观察口(9.1)下方设置有与病原体相对应的比对色卡(9.2)。
4.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述第一定量注液装置(5A)和第二定量注液装置(5B)结构相同，均设置有底座(5.1)、推杆(5.2)和腔体(5.3)，所述推杆(5.2)和腔体(5.3)设置于底座(5.1)上，腔体(5.3)的一端与推杆(5.2)连通，另一端通过电磁阀与进液口(D)连通，所述第一定量注液装置(5A)的腔体(5.3)内设置有无核酸缓冲液，所述第二定量注液装置(5B)的腔体(5.3)内无液体，存放无菌无病毒处理过的空气。
5.根据权利要求3所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述微流控芯片板(6)上的微反应室(6.3)分别设置于定性检测和定量检测两个区域内，位于定性检测区域内的微反应室(6.3)与观察口(9.1)相对，微反应室(6.3)的内腔中设置有加有染料的干粉状试剂，位于定量检测区域内的微反应室(6.3)的两端分别设置有LED发射端(6.4)和LED光接收端(6.5)，所述LED发射端(6.4)和LED光接收端(6.5)与通信组件电连接，微反应室(6.3)的内腔中设置有未加有染料的干粉状试剂。
6.根据权利要求5所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述通信组件包括A/D转换器、MCU和无线通信模块，所述A/D转换器用于接收LED发射端(6.4)和LED光接收端(6.5)的电信号，所述MCU用于通过无线通信模块将电信号无线传输至远程服务器，并通过无线通信模块接收远程服务器发送的反应定量检测结果和预警指令，将反应定量检测结果和预警指令发送至显示装置、预警组件。
7.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述微孔滤膜(2.1)为孔径≤0.01um的滤膜，例如聚四氟乙烯膜PTFE或聚偏二氟乙烯膜PVDF或截留分子量100000的聚偏氟乙烯膜VDF。
8.根据权利要求2所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述上层膜后网槽衬垫(2.2)和下层膜前收集网槽(2.3)的直径为a cm，a≥1，以中心为圆点，在半径0.1a，0.2a，0.3a，0.4a cm处分别为半径作圆，中心以及每个圆的边界上均匀分布直径为0.02a cm的小孔。
9.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述微流控芯片板(6)材质由聚二甲基硅氧烷聚合物PDMS制成。
10.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述富集仓(2)、第一定量注液装置(5A)和微流控芯片板(6)及对应管路为使用后更换装置。
11.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警系统，其特征在于：所述系统还包括远程移动终端，所述远程移动终端通过连接远程服务器接收反应定量检测结果。
12.一种基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
1)抽吸待检测空间内的空气，通过结构件将空气中的病原体截留到滤膜上，再通过无核酸缓冲液溶解，从而使空气中的病原体被捕获到无核酸缓冲液中形成富集液；
2)将富集液注入微流控芯片板进行LAMP扩增，即进行特异性病原体核酸片段的扩增；
3)将扩增后的富集液引入微反应室中与预装的干粉状反应体系进行反应，控制反应室温度和反应时间，所述微反应室分为定性检测和定量检测两个区域，定性检测区域内的干粉状反应体系试剂加有染料，定量检测两个区域内的干粉状反应体系试剂未加有染料；
4)通过比对色卡与定性检测区域的微反应室内反应液的颜色相比较判定病毒病原体浓度范围，通过光电设备采集富集液与未加入染料的反应体系试剂反应产生的沉淀浊度从而间接监测病毒病原体浓度；
5)根据富集液与未加入染料的引物反应产生的沉淀浊度计算沉淀浊度值和病毒浓度，根据病毒浓度与病原体目标曲线输出反应定量检测结果，当检测结果超过预设值时发出预警指令。
13.根据权利要求12所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述步骤1)中无核酸缓冲液的成分为200mM Tris-HCL(pH8.8 25摄氏度),100mM(NH4)2SO4,100mM的KCL,20mM MgSO4,1％(v/v)Tritonx-100。
14.根据权利要求13所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述步骤1)中通过无核酸缓冲液溶解病毒病原体的方法为将无核酸缓冲液淹没截留有病原体的滤膜，通过超声波震动滤膜，使病原体分散富集到无核酸缓冲液中。
15.根据权利要求13所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述步骤3)中干粉状反应体系包括H1N1型流感病毒的逆转录-环介导反应体系试剂、肠道病毒71型逆转录-环介导反应体系试剂、科萨奇病毒A组16型逆转录-环介导反应体系试剂。
16.根据权利要求13所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述步骤4)中通过光电设备采集富集液与未加入染料反应体系试剂的反应产生的沉淀浊度的方法，为在微反应室的两端分别设置LED发射端(6.4)和LED光接收端(6.5)，分别采集LED发射端(6.4)和LED光接收端(6.5)的电信号得到发射光强值ILED、接收光强值IPD，计算沉淀浊度：
Turbidity＝In(IPD/ILED)。
17.根据权利要求13所述的基于微流控芯片的环境病原体快速检测与预警方法，其特征在于：所述步骤5)中病原体目标曲线包括H1N1型标准曲线：y＝0.2394x-6.3545、肠道病毒71型标准曲线：y＝0.1983x-3.9727、科萨奇病毒A组16型标准曲线：y＝0.1994x-5.9857。
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