CN111657186B - 一种天然雌核发育团头鲂的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种天然雌核发育团头鲂的培育方法，以团头鲂为母本，黄尾密鲴为父本，对母本亲鱼人工注射LRH‑A和HCG的混合催产剂进行人工催产，LRH‑A的剂量为8‑10μg/kg，HCG的剂量为400‑500IU/kg；先注射母本亲鱼，3h后再对父本亲鱼人工注射LRH‑A和HCG的混合催产剂进行人工催产，其注射剂量是母本亲鱼的一半，采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；再经过人工授精、流水孵化、饲养、检测筛分，即获得天然雌核发育团头鲂。本发明的培育方法，改变了亲本的卵子及精子的活性，进而获得了两性可育的天然雌核发育团头鲂，整个培育过程中无需进行精子灭活及卵子加倍等技术处理，极大的减少了工作量。

Description

一种天然雌核发育团头鲂的培育方法

技术领域

本发明涉及鱼类远缘杂交育种的方法，具体涉及一种团头鲂与黄尾密鲴亚科间远缘杂交制备天然雌核发育团头鲂的方法。

背景技术

远缘杂交是指亲缘关系在种间或种间以上的物种之间的杂交，可以使基因组从一个物种转移到另一个物种中，从而导致后代的基因型和表型发生改变。远缘杂交也可以产生雌核发育后代，从而使得天然雌核发育后代在肉质、抗病性、抗逆性及生长速度等方面表现出异精杂交效应，因此通过远缘杂交形成两性可育的天然雌核发育后代，为遗传育种提供了重要种质资源库。如何用现有的技术来形成新型天然雌核发育鱼，是本领域人员需要解决的问题。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)属鲤形目，鲤科，鲌亚科；团头鲂是我国主要淡水养殖鱼类之一。但是，由于团头鲂是一种对低氧敏感的鱼类，在养殖过程中，低氧含量造成巨大的经济损失，此外，团头鲂生长速度比较慢。在现有技术中，获取雌核发育团头鲂的操作过程繁琐，对精源亲本、精子灭活方法、染色体加倍方法的选择要求十分严格，且得到的雌核发育团头鲂都是雌性后代，这些不足限制了雌核发育团头鲂在生产实践中的应用。因此，探索团头鲂与黄尾密鲴之间远缘杂交获得新型的两性可育的天然雌核发育团头鲂在生产实践与遗传育种具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种两性可育的天然雌核发育团头鲂的培育方法，通过该方法制备获得生长速度快、耐低氧、肉质好、体型优美的两性可育的天然雌核发育团头鲂。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种天然雌核发育团头鲂的培育方法，包括以下步骤：以团头鲂为母本，黄尾密鲴为父本，在繁殖季节将腹部膨胀、松软且富有弹性的母本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，所述促黄体素释放激素类似物的剂量为8-10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为400-500IU/kg；先注射母本亲鱼，3h后挑选轻挤腹部有白色精液挤出的父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，其注射剂量是母本亲鱼的一半，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；注射完毕后将亲鱼放入产卵池中，待亲鱼发情后进行人工授精，然后将受精卵在孵化池中进行流水孵化，待鱼苗孵化完后进行饲养，再对饲养后的鱼进行检测、筛分，即获得所述的天然雌核发育团头鲂。

黄尾密鲴(Xenocypris daviodi Bleeker)属鲤形目，鲤科，密鲴亚科；黄尾密鲴具有生长快、抗病、耐寒、耐低氧、含肉率高、味道鲜美等特点。以黄尾密鲴作为精源提供者与团头鲂远缘杂交产生雌核发育后代，产生异精“杂交”效应可以使天然雌核发育团头鲂具备黄尾密鲴的多种优良特性，进而有望获得生长速度快、耐低氧、肉质好、体型优美的两性可育的天然雌核发育团头鲂。然而，按照常规方法进行培育，团头鲂与黄尾密鲴的远缘杂交后代中仅形成了二倍体杂交鱼，尚未发现天然雌核发育团头鲂。

在本发明中，通过改变催产剂的种类和剂量，改变了亲本的卵子及精子的活性和质量，进而在后代中形成一种新型的两性可育的天然雌核发育团头鲂，且经过试验证实，在该天然雌核发育团头鲂中发现了来自黄尾密鲴的染色体片段，产生了异精“杂交”效应，异精“杂交”效应使天然雌核发育团头鲂具有了黄尾密鲴的一些优良特性，并且在养殖过程中表现出来，这对改良团头鲂的种质资源是至关重要的。

上述的培育方法，优选的，在繁殖季节前2-3个月，选择体型优美、无病无伤、性成熟特征明显的雌性团头鲂及雄性黄尾密鲴作为亲本进行专池饲养，在繁殖季节前1个月，精饵喂食，每天进行流水刺激，促进性腺成熟。

优选的，所述人工催产在繁殖季节且水温稳定在20℃以上时进行，所述混合催产剂注射完毕后，按雌雄亲鱼1：3的比例放入产卵池中。

优选的，所述人工授精包括以下步骤：待亲鱼发情后，用质地柔软的网打捞亲鱼，选择产卵顺利、产卵量大的雌性团头鲂，轻挤腹部，把墨绿色的卵子挤入干净的瓷盆中，同时选择产精大的黄尾密鲴，轻挤腹部，使白色精液挤入瓷盆中，用羽毛快速的混匀，然后迅速倒入事先准备好的棕片中进行授精。

优选的，所述鱼苗的饲养包括以下步骤：鱼苗完全孵化后，在孵化池中培育2-3天，待出现腰点后转移至事先育肥的池塘；鱼苗下池2天后开始泼洒豆浆，要求匀、细。

优选的，所述检测是指利用外形测量法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法以及流式细胞DNA含量测定法对饲养后的鱼进行外形特征、染色体数目以及DNA含量的检测。

本发明培育的天然雌核发育团头鲂的方法，采用团头鲂与黄尾密鲴进行远缘杂交，获得生长速度快、耐低氧、肉质好的两性可育的天然雌核发育团头鲂。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的培育方法，通过团头鲂与黄尾密鲴进行远缘杂交，并结合特定的催产剂类型和剂量，改变了亲本的卵子及精子的活性，进而获得了两性可育的天然雌核发育团头鲂，整个培育过程中无需进行精子灭活及卵子加倍等技术处理，极大的减少了工作量。

2、通过本发明的培育方法得到的新型天然雌核发育团头鲂，在外形及生物学特性上与团头鲂比较相近，两性可育，且具有生长速度快、耐低氧、营养丰富、体型优美等特点，在遗传育种与生产实践等方面具有重要意义；本发明获得两性可育的天然雌核发育团头鲂，可以经过自交获得一种改良的团头鲂品系，为改良团头鲂的种质资源提供了非常好的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为团头鲂的外形照片；

图2为黄尾密鲴的外形照片；

图3为天然雌核发育团头鲂的外形照片；

图4为团头鲂的流式图；

图5为黄尾密鲴的流式图；

图6为天然雌核发育团头鲂的流式图；

图7为团头鲂的染色体图；

图8为黄尾密鲴的染色体图；

图9为天然雌核发育团头鲂的染色体图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例：

一种天然雌核发育团头鲂的培育方法，包括如下步骤：

(1)在繁殖季节前2-3个月，选择体型优美、无病无伤、性成熟特征明显的雌性团头鲂及雄性黄尾密鲴作为亲本进行专池饲养，要求专池水质好，含氧量高，光照充足；此外，特别在繁殖前1个月，细心照看，精饵喂食，每天进行1次流水刺激，用来促进性腺的成熟；

(2)在当年的5月-6月，当水温稳定在20℃以上时，我们从上述亲本中选取腹部膨胀，松软且有弹性的团头鲂作为母本亲鱼，轻轻挤压腹部有白色精液挤出的黄尾密鲴作为父本亲鱼，并且注射促黄体素释放激素类似物(LRH-A)及绒毛膜促性腺激素(HCG)的混合催产剂进行催产，母本亲鱼注射LRH-A的剂量为8-10μg/kg，HCG的剂量为400-500IU/kg；先注射雌性团头鲂，3h后，再注射雄性黄尾密鲴，注射黄尾密鲴的剂量减半，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；注射完毕，把团头鲂与黄尾密鲴按1：3的比例放入催产池中，同时放入一些雄性团头鲂，并向催产池中冲水，用来促进雌雄鱼产精产卵；

(3)当发现亲鱼在池中追逐，池中网片有少许卵子时，开始打网，打网时动作要轻；在池中选取产卵量大、产卵顺利的团头鲂及产精顺利的黄尾密鲴，然后把团头鲂卵子挤入干净的瓷盆中，同时挤入黄尾密鲴的精液，使用羽毛进行快速的搅拌，搅拌均匀后，均匀的平铺在事先准备好的棕片上，将受精卵放入孵化池中进行孵化，直至出苗；

(4)等待鱼苗在孵化池中孵化完全，先在孵化池中培育2-3天，待鱼苗出现“腰点”后再转移至事先育肥的土池中养殖，转移至池子2天后泼洒豆浆，一天3次，沿壁泼洒一圈，要求匀、细，直到鱼苗开始正常摄食。

鱼苗饲养4个月后，随机抽样，并测量分析其生物学相关数据，然后分别与团头鲂及黄尾密鲴成鱼外形照片及各项已知数据进行比较，结果如图1-图3、表1所示：

表1：天然雌核发育团头鲂与团头鲂及黄尾密鲴的可数性状比较

注：上表中大写的罗马数字代表硬棘条的数目，阿拉伯数字代表鳍条的数目。

由图1-图3、表1的可数相关性状表明：天然雌核发育团头鲂与团头鲂相似，说明经过远缘杂交形成了一种新型的天然雌核发育团头鲂。

采用团头鲂作为参照，用流式细胞仪检测了天然雌核发育团头鲂的DNA含量，图4、图5、图6分别为团头鲂、黄尾密鲴及天然雌核发育团头鲂的流式图。团头鲂、黄尾密鲴及天然雌核发育团头鲂平均的DNA含量分别为70.03、65.70、67.29。天然雌核发育团头鲂与团头鲂的DNA平均含量的比值为0.96，与预期的比值1没有显著的差异。同时，采用尾鳍细胞培养法培养尾鳍细胞制备染色体检查倍性，图7、图8、图9分别为团头鲂、黄尾密鲴及天然雌核发育团头鲂的染色体图；检测发现天然雌核发育团头鲂的染色体数目与团头鲂的染色体数目相同，符合使用流式细胞仪检测DNA含量的结果，证明天然雌核发育团头鲂是二倍体2n＝48。

为了证明不同剂量催产剂的催产效果，我们还进行了对照试验，在人工催产过程中，试验对照组的母本亲鱼注射LRH-A的剂量为20-30μg/kg，HCG的剂量为600-800IU/kg；先注射雌性团头鲂，3h后，再注射雄性黄尾密鲴，注射黄尾密鲴的剂量减半，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；其他操作与本发明的操作相同；结果如表2所示：

表2：不同剂量催产剂的催产效果

本发明	试验对照组
		LRH-A:8-10μg/kg；HCG：400-500IU/kg	LRH-A：20-30μg/kg；HCG：600-800IU/kg
发现天然雌核发育团头鲂	未发现天然雌核发育团头鲂

由表2可知，本发明通过减少催产剂的注射剂量，改变了亲本的卵子及精子的活性和质量，进而在后代中形成一种新型的两性可育的天然雌核发育团头鲂。

为了研究天然雌核发育团头鲂的特性，我们把天然雌核发育团头鲂与普通团头鲂在同等的条件下进行养殖，在闷热的夏季，普通团头鲂出现大量的浮头甚至死亡，但是天然雌核发育团头鲂却很少发现这样的现象，从养殖经验来看，天然雌核发育团头鲂更耐低氧。且天然雌核发育团头鲂的肉质更加鲜美。说明本发明培育得到的天然雌核发育团头鲂，产生了异精“杂交”效应，使天然雌核发育团头鲂具备了黄尾密鲴的一些优良特性。

使用分子标记对天然雌核发育团头鲂进行了检测，在天然雌核发育团头鲂中发现了黄尾密鲴的DNA片段，说明这些DNA片段在天然雌核发育团头鲂中形成“杂交”效应。进一步证明了团头鲂与黄尾密鲴杂交形成天然雌核发育团头鲂产生了异精“杂交”效应。

外周血细胞培养的染色体倍性检测方法操作步骤为：1)在超净工作台中配制培养基，100ml培养基含以下成分：84ml RPMI-1640，15ml小牛血清，2支PHA，1ml 0.1％肝素钠，以7.5％NaHCO₃(无菌)或1NHCl调pH至7.2～7.4；2)用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，于用碘酒消毒后的实验鱼尾部静脉取血；3)按每10ml培养液中加入约0.2ml抗凝血的标准将抗凝血加入培养液中，于24℃5％二氧化碳浓度的培养箱中培养68～72h，培养期间，定期轻摇匀，以使细胞充分接触培养基；4)终止培养前24h，在培养液中用1ml注射器滴加入10μg/ml的秋水仙碱，使终浓度为0.05～0.07μg/ml。以上步骤均需无菌操作。

染色体制备步骤为：1)将培养物全部转入洁净的10ml离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃上清液；2)向离心管中加入低渗液9ml，混匀，低渗25～30分钟；3)加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5分钟，弃上清液；4)加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟后1000rpm离心5分钟，弃上清液；5)重复步骤4一次；6)视最后细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液(一般为1～2ml)后，吸取细胞悬液自20～30cm高处滴片，轻吹散，空气中自然干燥；7)Giemsa染液染色20～40分钟，细水流冲洗载玻片背面去除染液，空气干燥后镜检、拍照。

流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。

本发明的培育方法，通过团头鲂与黄尾密鲴进行远缘杂交，并结合特定的催产剂类型和剂量，改变了亲本的卵子及精子的活性，进而获得了两性可育的天然雌核发育团头鲂，整个培育过程中无需进行精子灭活及卵子加倍等技术处理，极大的减少了工作量。通过本发明的培育方法得到的新型天然雌核发育团头鲂，在外形及生物学特性上与团头鲂比较相近，两性可育，且具有生长速度快、耐低氧、营养丰富、体型优美等特点，在遗传育种与生产实践等方面具有重要意义；本发明获得两性可育的天然雌核发育团头鲂，可以经过自交获得一种改良的团头鲂品系，为改良团头鲂的种质资源提供了非常好的基础。

Claims (2)

1.一种天然雌核发育团头鲂的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：在繁殖季节前2-3个月，选择体型优美、无病无伤、性成熟特征明显的雌性团头鲂及雄性黄尾密鲴作为亲本进行专池饲养，在繁殖季节前1个月，精饵喂食，每天进行流水刺激，促进性腺成熟；

以团头鲂为母本，黄尾密鲴为父本，在繁殖季节将腹部膨胀、松软且富有弹性的母本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，所述促黄体素释放激素类似物的剂量为8-10μg/kg，绒毛膜促性腺激素的剂量为400-500 IU/kg；先注射母本亲鱼，3h后挑选轻挤腹部有白色精液挤出的父本亲鱼人工注射促黄体素释放激素类似物和绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行人工催产，其注射剂量是母本亲鱼的一半，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；所述人工催产在繁殖季节且水温稳定在20℃以上时进行，所述混合催产剂注射完毕后，按雌雄亲鱼1：3的比例放入产卵池中，待亲鱼发情后进行人工授精，然后将受精卵在孵化池中进行流水孵化，待鱼苗孵化完后进行饲养，再对饲养后的鱼进行检测、筛分，即获得所述的天然雌核发育团头鲂；

所述人工授精包括以下步骤：待亲鱼发情后，用质地柔软的网打捞亲鱼，选择产卵顺利的雌性团头鲂，轻挤腹部，把墨绿色的卵子挤入干净的容器中，同时选择产精顺利的黄尾密鲴，轻挤腹部，使白色精液挤入容器中，用羽毛混匀，然后迅速倒入事先准备好的棕片中进行授精；

所述鱼苗的饲养包括以下步骤：鱼苗完全孵化后，在孵化池中培育2-3天，待出现腰点后转移至事先育肥的池塘；鱼苗下池2天后开始泼洒豆浆，要求匀、细。

2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于，所述检测是指利用外形测量法、外周血细胞培养的染色体倍性检测方法以及流式细胞DNA含量测定法对饲养后的鱼进行外形特征、染色体数目以及DNA含量的检测。

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