CN111617059B - 莪术二酮的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其涉及莪术二酮的应用。本发明提供了莪术二酮的应用，实验结果表明，莪术二酮能够有效抑制小胶质细胞活化和炎症因子TNF‑α的分泌，控制神经炎症反应，从而缓解后续炎症因子所致的神经元损伤，改善脑组织的认知功能、记忆障碍和运动协调能力，可用于阿尔兹海默症。莪术二酮应用于制备预防和/或治疗阿尔兹海默症药物，具有很好的应用价值和开发前景。

Description

莪术二酮的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及莪术二酮的应用。

背景技术

阿尔兹海默症(AD)是一种缓慢的中枢神经系统衰退性的疾病，是最常见的老年痴呆。阿尔兹海默症的具体发病机制还未明确，目前主流的学说是患者大脑中异常沉积的Aβ通过自由基反应、线粒体氧化损伤和炎症反应等一系列级联反应，直接或者间接作用于神经元和神经小胶质细胞，最终导致神经元死亡，同时被活化的小胶质细胞在清理死亡的神经元时诱导了炎症反应以及星形胶质细胞的活化，导致更多神经元死亡形成了恶性循环，最终导致阿尔兹海默症。有报告显示，2010年全球大约3560万AD患者，目前，全世界的阿尔兹海默症患者已经超过四千七百万，我国的阿尔兹海默症患者已经超过一千万，预计到2050年，AD患者数将高达1.15亿。AD患者主要临床特征包括进行性记忆功能减退、认知功能障碍、行为障碍及日常生活能力下降等。因此，早期发现并延迟或阻止这类疾病的发生发展十分重要。

小胶质细胞和星形胶质细胞介导的炎症反应是神经炎症疾病病理过程中的一个重要环节。人们大脑生理功能和状态的稳定维持离不开脑内胶质细胞，而神经炎症主要是发生在脑组织的炎症，由脑内胶质细胞过度激活所导致的。神经胶质细胞的激活可能是神经元退行性变导致的结果，而胶质细胞的激活又可能会加剧神经元的死亡。静息状态下的脑内胶质细胞被过度激活会介导释放大量的促炎因子、活性氧/氮以及前列腺素等触发炎症级联反应，而炎症因子会进一步激活星型胶质细胞和损伤神经元，进一步扩大炎症反应，对大脑产生毒害作用。神经系统的炎症功能紊乱会引起长时期的学习记忆功能障碍，其中包括了大量神经炎症因子的释放及免疫系统细胞的激活参与调节神经发生、突触可塑性、神经元的存活等恶性循环的过程从而影响了学习记忆的形成，最终导致阿尔兹海默症的形成。

因此，急需寻求阿尔兹海默症的治疗用药及保健用药。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了莪术二酮的应用，莪术二酮能够抑制小胶质细胞活化，减轻阿尔兹海默症病症，改善记忆障碍和运动协调能力。

本发明的具体技术方案如下：

莪术二酮在制备抑制小胶质细胞活化药物中的应用。

优选的，所述药物用于降低Iba-1蛋白的表达。

优选的，所述药物用于降低炎症因子的表达。

优选的，所述炎症因子为TNF-α。

实验结果表明，莪术二酮能够降低海马组织和大脑皮层中TNF-α蛋白的表达水平。

本发明还提供了莪术二酮在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症药物中的应用。

本发明中，莪术二酮用于预防和/或治疗阿尔兹海默症时，给药剂量优选为50mg/kg/d～100mg/kg/d。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。

本发明中，所述口服制剂选自胶囊剂、微囊剂、丸剂、片剂、汤剂、颗粒剂、膏剂、分散粉末、露剂口服剂、滴丸剂或脂质体；

所述注射剂为粉针剂或注射液。

综上所述，本发明提供了莪术二酮的应用，实验结果表明，莪术二酮能够有效抑制小胶质细胞活化和炎症因子TNF-α的分泌，控制神经炎症反应，从而缓解后续炎症因子所致的神经元损伤，改善脑组织的认知功能、记忆障碍和运动协调能力，可用于阿尔兹海默症。莪术二酮应用于制备预防和/或治疗治疗阿尔兹海默症药物，具有很好的应用价值和开发前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1给药期间小鼠体重变化图；

图2为实施例1小鼠水迷宫实验结果图，(A)定位航行实验小鼠运动轨迹图(隐藏平台)，(B)定位航行实验小鼠在各象限的逃避潜伏期(隐藏平台)，(C)空间探索实验小鼠在原平台目标象限所花时间百分比(撤除平台)，(D)空间探索实验小鼠跨越原平台区域的次数(撤除平台)，(E)空间探索实验小鼠的运动轨迹图(撤除平台)；

图3为实施例2小鼠脑组织分析图，(A)实施例2小鼠脑组织石蜡切片的尼氏染色图，其中，第一横排为小鼠脑组织冠状切面(放大40倍)，第二横排为海马区(放大400倍)，第三横排为大脑皮层区(放大400倍)，(B)实施例2小鼠脑组织正常健康神经元数目定量分析图；

图4为实施例3小鼠脑组织TNF-α蛋白表达图，其中，(A)实施例3小鼠脑组织石蜡切片的免疫组化图，第一竖排为小鼠脑组织横断图，第二竖排为海马区，第三竖排为大脑皮层区，(B)实施例3小鼠脑组织海马区TNF-α蛋白表达定量图，(C)实施例3小鼠脑组织大脑皮层区TNF-α蛋白表达定量图；

图5为实施例3小鼠脑组织中海马区小胶质细胞Iba-1蛋白表达图，其中，(A)免疫荧光图，第一横排为Iba-1/DAPI荧光图，第二横排为Iba-1荧光图，(B)实施例3小鼠脑组织海马区Iba-1蛋白表达定量图。

具体实施方式

本发明提供了莪术二酮的应用，莪术二酮能够抑制小胶质细胞活化，减轻阿尔兹海默症病症，改善记忆障碍和运动协调能力。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体实施例中，使用的原料及试剂均可由市场购得。实验动物采用体重20～22g的SPF级8～9周龄雄性C57小鼠，购自中山大学实验动物中心，许可证号SCXK(粵)2016-0112。小鼠饲料购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物在清洁级层流架中饲养，饲养环境温度空调控制为23±2℃，相对湿度为75±10％，照明时间12h/d(7:00-19:00)。

实施例1水迷宫试验检测莪术二酮对LPS诱导的小鼠AD症状记忆障碍的改善作用。

本实施例将实验动物随机分为5组，分别是：正常对照组(Control)、LPS组、阳性药物组(LPS+TTP488，5mg/kg/day)、低剂量莪术二酮组(LPS+莪术二酮，Cu-L，50mg/kg/day)和高剂量莪术二酮组(LPS+莪术二酮，Cu-H，l00mg/kg/day)，每组5只。各实验组于LPS注射前1周开始给药，连续给药2周，每天给药250μg/kg/d，并记录小鼠体重变化。除正常组外，其余各组均在给药的第7天开始腹腔注射LPS，连续注射1周后，采用水迷宫实验考察小鼠的记忆功能，实验数据以Mean±SD表示，所有实验数据均采用SPSS软件进行统计分析，各组小鼠的组间参数用ANOVA进行检验，P<0.05被认为有统计学意义。给药期间小鼠体重变化请参阅图1，水迷宫实验结果请参阅图2。

图1为实施例1给药期间小鼠体重变化图。图1表明，Control组的小鼠体重呈现缓慢升高的趋势，注射LPS的前几天小鼠的体重明显下降，LPS是细菌产生的脂多糖，会引发机体炎症。药物治疗后，阳性药物(TTP488)组和莪术二酮组的小鼠体重从下降趋势恢复至正常的速度比LPS模型组快(提前1-2天)，相比之下，高剂量莪术二酮组的小鼠体重变化很小，表明莪术二酮能较好的减小LPS注射后对体重的影响。

长期注射LPS会导致脑组织发炎，导致大脑神经损伤，从而降低学习和记忆能力。因此，本实施例通过水迷宫实验考察莪术二酮对LPS诱导的小鼠记忆和认知损伤是否有改善作用。在水迷宫定位航行实验中，每只小鼠必须从1，2，3，4个象限开始寻找隐藏的平台。图2为实施例1小鼠水迷宫实验结果图，(A)定位航行实验小鼠运动轨迹图(隐藏平台)，(B)定位航行实验小鼠在各象限的逃避潜伏期(隐藏平台)，(C)空间探索实验小鼠在原平台目标象限所花时间百分比(撤除平台)，(D)空间探索实验小鼠跨越原平台区域的次数(撤除平台)，(E)空间探索实验小鼠的运动轨迹图(撤除平台)。本实施例记录了潜伏时间，可见在定位航行实验的4个象限中，相比Control组，LPS模型组中小鼠腹腔注射LPS明显延长了小鼠在水迷宫定位航行实验中的潜伏期，小鼠运动轨迹结果与潜伏期结果一致(图2A和2B)，同时减少了小鼠在空间探索实验中进入目标象限的次数及时间比例(图2C和2D)，表明腹腔注射LPS导致小鼠的记忆功能受损。连续灌胃给予高剂量和低剂量莪术二酮的实验组小鼠记忆功能得到明显的改善，可见4个象限中潜伏期缩短。在空间探索实验，尤其是高剂量莪术二酮组小鼠进入目标平台的次数和时间比例显著增加，效果与阳性药物组效果相当，低剂量莪术二酮组小鼠进入目标平台的次数显著提高(图2C和2D)，表明莪术二酮能够减缓LPS诱导的小鼠记忆障碍的影响。

实施例2莪术二酮对LPS诱导的小鼠脑组织神经元损伤的影响

本实施例实验分组和给药方案同实施例1，小鼠给药结束后，乙醚麻醉处死，将完整的脑组织取出制作石蜡切片，制作石蜡切片的主要步骤包括组织洗净后置于4％多聚甲醛中固定1周→自来水冲洗掉多余固定液→用不同浓度梯度(70％、80％、90％、95％和100％)的酒精进行梯度脱水→脱水之后浸泡于梯度二甲苯(50％和100％)中透明→将已透明的样品于熔化状态的石蜡中浸蜡4h→包埋(倒入包埋的石蜡至凝固)→切片(以5μm的厚度切片)→展片→烤片→脱蜡复水之后进行尼氏染色，光学显微镜下观察神经元的病理变化，结果请参阅图3。

为了进一步评价莪术二酮对神经系统的保护作用，本实施例用尼氏染色检测神经元的病理变化，实验结果如图3A所示，图3A为实施例2小鼠脑组织石蜡切片的尼氏染色图，第一横排为小鼠脑组织冠状切面(放大40倍)，第二横排为海马区(放大400倍)，第三横排为大脑皮层区(放大400倍)。图3A表明，正常对照组小鼠海马和皮层区域的神经锥体细胞中含有大量的尼氏小体，着色较深，细胞核清晰可见。而注射LPS后的小鼠神经细胞中尼氏小体显著减少，着色较浅，细胞核模糊不清。在给予莪术二酮处理后，尼氏小体数目显著增加，表明莪术二酮能够有效缓解LPS所致的神经元损伤。与正常对照组相比，通过对正常健康神经元数目进行定量分析，结果请参阅图3B，为实施例2小鼠脑组织正常健康神经元数目定量分析图，图3B表明LPS组小鼠海马和皮层区域的神经元出现大量死亡，正常健康神经元存活较少，表明腹腔连续注射LPS会损伤神经元细胞，进而诱导慢性神经炎症，而莪术二酮能够有效缓解LPS所致的神经元细胞损伤。

实施例3莪术二酮对LPS诱导的小鼠脑组织中炎症反应的影响

1)首先，本实施例实验分组和给药方案同实施例1和实施例2，给药结束后将小鼠乙醚麻醉处死，将完整的脑组织取出制作石蜡切片，对切片进行免疫组化或免疫荧光，结果请参阅图4(A)和图5(A)，再通过免疫组化或免疫荧光染色来测定海马和皮层区中炎症因子TNF-α和Iba-1的表达量。实验数据以Mean±SD表示，所有实验数据均采用SPSS软件进行统计分析，各组小鼠的组间参数用ANOVA进行检验，P<0.05被认为有统计学差异。

2)对组织切片进行免疫组化染色，检测炎症因子TNF-α的表达水平。制作石蜡切片过程同实施例2，切好的石蜡切片进行烤片(置于温度62～65℃的烘箱中烤片1h后，二甲苯乙醇溶液中脱蜡水化)→抗原修复(组织切片置于盛EDTA抗原修复缓冲液pH8.0的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复)→阻断内源性过氧化物酶(使用3％过氧化氢溶液室温避光孵育25min，再PBS洗涤)→血清封闭(3％BSA孵育30min)→一抗孵育4℃过夜(滴加一抗TNF-α，1：100，1×PBS稀释)→一抗洗涤→二抗孵育室温50min(滴加与一抗相应种属的二抗，1：100，1×PBS稀释)→二抗洗涤→DAB显色(显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色)→苏木素复染细胞核→酒精脱水封片(摇床洗涤3次后，晾干，中性树胶封片)→二甲苯脱水透明→镜检拍照(切片于显微镜下观察并采集图像)，结果请参阅图4(A)。

3)对组织切片进行免疫荧光试验，检测莪术二酮对LPS诱导的小胶质细胞活化程度的抑制作用。制作石蜡切片过程同实施例2，切好的石蜡切片进行烤片(置于温度62～65℃的烘箱中烤片1h后，二甲苯乙醇溶液中脱蜡水化)→抗原修复(组织切片置于盛满柠檬酸pH6.0抗原修复液的修复盒中，于微波炉内进行抗原修复)→防止荧光淬灭(切片稍干后用组化笔在组织周围画圈)→血清封闭(3％BSA孵育30min)→一抗孵育4度过夜(滴加一抗Iba-1，1：100，1×PBS稀释)→一抗洗涤→二抗孵育室温50min(滴加与一抗相应种属的二抗，1：100，1×PBS稀释)→二抗洗涤→DAPI复染细胞核(滴加DAPI染液，避光室温孵育l0min)→洗涤封片(摇床洗涤3次后，晾干，用抗荧光淬灭封片剂封片)→镜检拍照(片于尼康到置荧光显微镜下观察并采集图像，DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；CY3激发波长510-560nm，发射波长590nm，发红光)，结果请参阅图5(A)。

正常情况下，小胶质细胞处于静止状态，产生抗炎因子和神经营养因子，保护大脑组织。而病理状态下，小胶质细胞被广泛激活，产生大量的炎症因子损伤神经元，甚至引起脑组织认知和代谢障碍。图4为实施例3小鼠脑组织TNF-α蛋白表达图，其中，(A)免疫组化图，第一竖排为小鼠脑组织横断图，第二竖排为海马区，第三竖排为大脑皮层区，(B)采用Image-Proplus4.1软件对大脑海马体图像进行TNF-α蛋白表达定量分析，(C)采用Image-Proplus4.1软件对大脑皮层区域图像进行TNF-α蛋白表达定量分析。图4表明，结合免疫组化切片表征海马和皮层中TNF-α的表达水平(图4A)和图像分析量化海马和皮层中TNF-α的表达水平(图4B)，LPS注射后，引起炎症因子TNF-α的过度表达，在给予莪术二酮后，尤其在还海马区，Cu-L和Cu-H组炎症因子TNF-α浓度均显著减少。图5为实施例3小鼠脑组织中海马区小胶质细胞Iba-1蛋白表达图，其中，(A)免疫荧光图，第一横排为Iba-1/DAPI荧光图，第二横排为Iba-1荧光图，(B)采用Image-Proplus4.1软件对大脑海马体图像进行Iba-1蛋白荧光量表达定量分析。图5表明，LPS注射后，引起小胶质细胞的广泛活化。相对于正常对照组，LPS组中大量的小胶质细胞被激活，红色荧光明显增多，注射LPS引起了神经炎症反应。再给予莪术二酮后，小胶质细胞的活化水平被抑制，红色荧光标记的细胞明显减少。与LPS组相比，给予高剂量莪术二酮可以显著降低海马中的Iba-1蛋白表达水平，表明莪术二酮能够有效抑制小胶质细胞的活化。

以上结果显示，莪术二酮能够有效抑制小胶质细胞活化和炎症因子TNF-α的分泌，控制神经炎症反应，从而缓解后续所致的神经元损伤，改善记忆障碍和运动协调能力，可用于制备预防和/或治疗阿尔兹海默症的药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.莪术二酮作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗阿尔兹海默症药物中的应用；

所述药物抑制小胶质细胞活化。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于降低Iba-1蛋白的表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物用于降低炎症因子的表达。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述炎症因子为TNF-α。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求1至4任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服制剂或注射剂。