CN111615400B - 作为治疗工具的精确糖缀合物 - Google Patents

Abstract

本说明书涉及包含与免疫原性载体蛋白质偶联的碳水化合物抗原的糖缀合物、糖缀合物免疫原和糖缀合物疫苗，或用于检测和筛选所得抗体的材料。描述了更直接且精确地将碳水化合物抗原缀合至免疫原性载体蛋白质的游离巯基的改进方法，包括基于光催化巯基‑烯反应的“点击化学”方法。

Description

作为治疗工具的精确糖缀合物

本说明书涉及糖缀合物治疗工具。更具体地，本发明涉及与免疫原性和抗原性载体肽和蛋白质的游离巯基非随机偶联的碳水化合物抗原，以及使用例如光催化巯基-烯“点击化学”反应生产其的改进方法。还描述了作为抗原、免疫原、疫苗以及在诊断中的应用。

本说明书涉及多个文件，其全部内容通过引用整体并入本文。

背景技术

免疫疗法的最终目标是以类似于感染或肿瘤进展过程中产生的方式触发免疫系统的先天性和适应性应答。先天性和适应性免疫应答之间的主要界面是抗原呈递细胞(APC)，尤其是树突状细胞(DC)。APC能够通过模式识别受体(PRR)(例如Toll样受体(TLR))识别微生物。在识别微生物表面决定簇或异常和非天然抗原后，APC经历成熟和激活，导致MHC分子从细胞内区室到细胞表面重新分布，分泌细胞因子和趋化因子。微生物或肿瘤及其相关的抗原标志物可以通过内吞途径被APC吞噬，通常在那里被降解。然后将通过蛋白质加工而释放的肽和共价连接的抗原展示在II类MHC分子上，并被CD4+T细胞识别，这些CD4+T细胞转而会在收到来自APC的共刺激信号后经历功能成熟，转变为不同的亚类，例如Th1或Th2细胞。Th1细胞导致显著的促炎反应，并分泌IFN-γ和TNF-α，而Th2细胞则分泌典型的细胞因子。尽管Th1细胞主要与细胞介导的应答有关，但这两种类型的Th细胞都支持B细胞产生抗体，进而影响抗体的同种型和功能。例如，IL-12和TNF-α与Th1细胞的分化和1型IgG亚类的产生有关，而IL-6和其它Th2细胞因子对2型IgG亚类(IgG1)的产生有贡献。因此，期望能够将疫苗诱导的免疫调节为适当应答以处理目标病原体或肿瘤抗原。

与蛋白质和肽相反，碳水化合物是T细胞非依赖性抗原，其未适当地装配以触发Th细胞的参与，并且因此不能诱导免疫细胞增殖、抗体类别转换和亲和力/特异性成熟。基于碳水化合物的疫苗最初遇到的主要早期进展得到了以下发现的支持：当与用作T细胞依赖性表位的蛋白质载体适当地缀合后，细菌荚膜多糖能够获得所需的产生调理吞噬抗体的免疫化学能力。

传统上，将碳水化合物抗原与载体蛋白质缀合的策略依赖于醛衍生糖在赖氨酸残基的ε-氨基上的还原胺化，或仅是酰胺偶联反应。在两种情况下，通常都会发生部分和随机的碳水化合物抗原缀合。此外，如果将所有酰胺配偶体(赖氨酸的胺或谷氨酸/天冬氨酸的酸)用于碳水化合物缀合，则有太多的碳水化合物抗原附着在载体蛋白质上，从而导致掩盖潜在的必需T细胞肽表位并且固有地降低或消除免疫原性。因此，目前制备糖缀合物疫苗的策略是不充分的，并且面临重大的监管和/或商业障碍，因为这些制剂在其碳水化合物分布和可重复性方面缺乏必要的同质性(即，糖在蛋白质上的附着点是随机分布的，并且批次之间的密度不同)。因此，非常需要具有更大的碳水化合物抗原同质性、更精确可表征的结构以及批次间可重复性的糖缀合物疫苗。

发明内容

本说明书涉及糖缀合物免疫原，包含直接偶联在免疫原性载体蛋白质的精确(非随机)位置的碳水化合物抗原。更特别地，载体蛋白质包含一个或多个游离巯基(例如，对应于半胱氨酸残基的侧链)，并且碳水化合物抗原缀合在载体蛋白质的这些游离巯基的一个或多个处。本说明书还涉及用于合成糖缀合物免疫原/疫苗的改进的方法，涉及例如使用“点击化学”方法(例如，光催化巯基-烯反应)将碳水化合物抗原直接缀合至载体蛋白质的游离巯基。可以在足够温和的条件(例如，仅使用水溶性试剂，不存在有机溶剂，或使用浓度足够低(例如，<5％)而避免载体蛋白质变性的有机溶剂，和/或在相对中性的pH值下)进行本文所述的改进的缀合方法，以避免破坏载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构(例如，天然二硫键的断裂和/或变性)，而不会影响缀合的特异性。此外，本文所述的光催化巯基-烯反应可以在存在催化剂的情况下在紫外光(例如355nm或365nm)或者在不存在催化剂的情况下在短波紫外光(例如254nm)下进行，进一步简化了过程。

在一些方面，本说明书涉及用于产生糖缀合物免疫原的方法，所述方法包括：(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基；(b)提供具有一个或多个游离巯基的载体蛋白质；和(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述载体蛋白质的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物免疫原，其中所述载体蛋白质在施用于受试者后具有免疫原性，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述碳水化合物抗原与所述载体蛋白质的缀合增加了所述碳水化合物抗原在施用于所述受试者后的免疫原性。

在一些实施方案中，在避免载体蛋白质变性的反应条件下进行光催化巯基-烯反应。在一些实施方案中，烯基碳水化合物抗原是水溶性的，并且光催化巯基-烯反应在保留载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构的反应条件(例如，不存在任何有机溶剂，或存在浓度足够低(例如，<5％)而避免载体蛋白质变性的有机溶剂)下进行。可以在催化剂(例如水溶性或水不溶性催化剂)的存在下，在短波(例如254nm)和/或长波(例如355或365nm)紫外光的辐照下进行光催化巯基-烯反应。

在一些实施方案中，光催化巯基-烯反应包括载体蛋白质的每个游离巯基与1至200摩尔当量的烯基碳水化合物抗原反应；和/或光催化巯基-烯反应在约3至10、3.5至9.5、4至9、4.5至8.5、5至8、5.5至8、6至8或6.5至7.5的pH下进行。

在一些实施方案中，在与载体蛋白质缀合之后，碳水化合物抗原不能被受试者的内源酶从载体蛋白质上切割。在一些实施方案中，烯基碳水化合物抗原与末端烯烃共价连接，和/或碳水化合物抗原通过糖苷键如O-糖苷键、S-糖苷键、N-糖苷键或C-糖苷键或者通过例如烯丙基胺和还原糖(包括细菌CPS)之间的还原胺化获得的键与载体蛋白质缀合。在一些实施方案中，碳水化合物抗原包含B细胞表位，和/或在受试者中诱导体液免疫应答。在一些实施方案中，碳水化合物抗原包含T细胞表位，和/或在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，碳水化合物抗原包含B细胞表位和T细胞表位二者，和/或在受试者中诱导体液和细胞介导的免疫应答二者。在一些实施方案中，碳水化合物抗原是或包含肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)，例如Tn、S-Tn、Thomsen-Friedenreich(TF)、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、Globo H、GD2、GD3、GM2、GM3、N-乙醇酰-GM3、Lea、sLea、Lex、sLex或其任何组合。在一些实施方案中，光催化巯基-烯反应将至少两个相同的碳水化合物抗原或超过一种类型的碳水化合物抗原缀合至载体蛋白质，从而产生多价糖缀合物免疫原(例如，包含与载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个相同或不同类型的碳水化合物抗原)。在一些实施方案中，碳水化合物抗原是或包含病毒多糖抗原，或细菌荚膜多糖(CPS)(例如，肺炎球菌的和/或链球菌的多糖血清型、脑膜炎球菌CPS；流行性感冒(例如a或b型流感)CPS)。

在一些实施方案中，烯基碳水化合物抗原通过接头(例如，本文所述的接头)与末端烯烃连接。

在一些实施方案中，载体蛋白质包含具有一个或多个游离巯基的一个或多个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，载体蛋白质包含T细胞表位，和/或在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。

在一些实施方案中，载体蛋白质包含B细胞表位，和/或在受试者中诱导体液免疫应答。在一些实施方案中，载体蛋白质包含B细胞表位和T细胞表位二者，和/或在受试者中诱导体液和细胞介导的免疫应答二者。在一些实施方案中，载体蛋白质是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应材料197(CRM197)、脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌D蛋白(HiD)、病毒样颗粒(VLP)、细胞因子、免疫原性肽例如破伤风毒素831-844(SEQ ID NO:1或2)、白蛋白(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)，或其免疫原性片段。在一些实施方案中，载体蛋白质是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中：(i)在所述光催化巯基-烯反应之后，所述一个或多个二硫键保持不受影响；或者(ii)用还原剂预处理载体蛋白质以暴露一个或多个另外的游离巯基，以与碳水化合物抗原缀合。

在一些实施方案中，糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于缀合之前载体蛋白质上可用的游离巯基的数目。在一些实施方案中，糖缀合物免疫原在施用于受试者后诱导针对碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。

在一些实施方案中，本文所述的方法进一步包括：(d)纯化糖缀合物免疫原。

在一些方面，本说明书涉及用于产生糖缀合物疫苗的方法，所述方法包括将通过本文所述方法制备的糖缀合物免疫原与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如，无机化合物、矿物油、微生物衍生物、植物衍生物、细胞因子、角鲨烯、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物、toll样受体激动剂、免疫刺激性多核苷酸(例如CPG)、免疫刺激性脂质、弗氏佐剂、RIBI佐剂、QS-21、胞壁酰二肽或其任何组合)一起配制。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含一个或多个碳水化合物抗原和具有一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基的免疫原性载体蛋白质，其中一个或多个碳水化合物抗原连接在免疫原性载体蛋白质的一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基处，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，一个或多个碳水化合物抗原与免疫原性载体蛋白质的缀合增加了一个或多个碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。在一些实施方案中，一个或多个碳水化合物抗原通过如本文所述的接头与一个或多种溶剂可及的半胱氨酸残基连接，并且一个或多个碳水化合物抗原如本文所述。在一些实施方案中，合成糖缀合物免疫原是如本文所述的多价糖缀合物免疫原，并使用如本文所述的载体蛋白质。在一些实施方案中，糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于载体蛋白质上溶剂可及的半胱氨酸残基的数目。在一些实施方案中，合成糖缀合物免疫原在施用于受试者后诱导针对碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，合成糖缀合物免疫原通过本文描述的方法制备。

在一些方面，本说明书涉及糖缀合物疫苗，通过如本文所述的方法产生，和/或包含如本文所述的合成糖缀合物免疫原和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。在一些实施方案中，糖缀合物疫苗是预防性疫苗或治疗性疫苗。

在一些方面，本说明书涉及免疫、接种或治疗受试者的方法，包括向受试者施用通过如本文所述的方法产生的糖缀合物免疫原，通过如本文所述的方法产生的糖缀合物疫苗，如本文所述的合成糖缀合物免疫原，或如本文所述的糖缀合物疫苗。在一些实施方案中，本说明书涉及如本文所述的合成糖缀合物免疫原或糖缀合物疫苗，用于在免疫、接种或治疗患有疾病的受试者中使用，或用于检测与所述糖缀合物特异性结合的抗体的存在，或用于检测所述免疫、接种或治疗(例如，在来自所述受试者的生物样品中)。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是O、S、NR₁或CH₂；

-R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；并且

-R₂是H或Me；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且；

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-r是1、2、3、4或5；

-R₅是S-PC、共价键或具有以下结构的基团：

其中R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1或2。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1或2。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上设计的合成糖缀合物免疫原，其中y是1至50、1至40、1至30、1至20、1至10、1至5或1至3的整数。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：SA是糖抗原或其一部分；S-PC是载体蛋白质；X是O、S、NR₁或CH₂；R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；n是1、2、3、4或5；并且R₂是H或Me。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：SA是糖抗原或其一部分；S-PC是载体蛋白质；X是S、NR₁、CH₂或O；R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；n是1、2、3、4或5；R₂是H或Me；q是1、2、3、4或5；R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1。

在一些实施方案中，糖抗原是如本文所述的碳水化合物抗原，载体蛋白质如本文所述，并且合成糖缀合物免疫原是如本文所述的多价糖缀合物免疫原。

在一些方面，本说明书涉及疫苗，包含如本文所述的合成糖缀合物免疫原，和如本文所述的药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原或如本文所述的合成糖缀合物免疫原用于制造疫苗的用途。

在一些方面，本发明涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原、通过如本文所述的方法产生的糖缀合物疫苗、如本文所述的合成糖缀合物免疫原或如本文所述的疫苗用于治疗患有与所述一种或多种碳水化合物抗原或糖抗原的表达增加有关的疾病的受试者的用途。

一般定义

标题和其它标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅为了便于阅读说明书和权利要求书而给出。在说明书或权利要求书中标题或其它标识符的使用不一定要求步骤或元素以字母或数字顺序或它们显示的顺序执行。

当在权利要求书和/或说明书中与词语“包含”结合使用时，未用数量词限定的名词可以表示“一个”，但也符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的含义。

术语“约”用于表示值包括用于确定值的设备或方法的误差的标准偏差。通常，术语“约”旨在表示最多10％的可能变化。因此，术语“约”中包括值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的变化。除非另有说明，否则在范围之前使用术语“约”适用于该范围的两个端点。

如本说明书和权利要求书中所使用的，词语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，例如“comprise”和“comprises”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，例如“have”和“has”)、“包括”(以及包括的任何形式，例如“includes””和“include”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，例如“contains”和“contain”)是包含性的或开放的，并且不排除其它未指出的元素或方法步骤。

如本文所用，术语“蛋白质”(例如，在表达“载体蛋白质”中)是指任何肽连接的氨基酸链，其可以包含或可以不包含任何类型的修饰(例如化学或翻译后修饰，例如乙酰化、磷酸化、糖基化、硫酸化(sulfation)、类泛素化(sumoylation)、异戊二烯基化(prenylation)、泛素化(ubiquitination)等)，只要修饰不破坏本文所述的糖缀合物免疫原和糖缀合物疫苗的免疫原性即可。为了进一步清楚，本文所用的术语“蛋白质”和“载体蛋白质”涵盖肽和多肽。

如本文所用，术语“施用”可包括诸如肠胃外(例如，皮下、皮内、肌肉内或静脉内)，口服、透皮、鼻内等施用途径，只要该途径的施用导致在受试者中产生免疫应答即可。

如本文所用，“受试者”通常是指哺乳动物，包括灵长类，尤其是人类。

通过阅读对本说明书具体实施方案的以下非限制性描述，本说明书的其它目的、优点和特征将变得更加显而易见，所述实施方案仅作为示例参照附图给出。

附图说明

在附图中：

图1显示了来自人糖蛋白(MUC)的关键肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)的典型化学结构的实例。

图2显示了提出的“点击化学”方法，其用于将碳水化合物抗原(B细胞表位)直接缀合至免疫原性载体蛋白质(例如T细胞表位，如破伤风类毒素)的可用巯基。

图3显示了通过光催化巯基-烯反应将Tn或TF抗原与载体蛋白质破伤风类毒素上的六个天然“游离”半胱氨酸残基缀合而制备的“精确糖缀合物”的实例。

图4显示了通过使Tn或TF抗原与巯基特异性碘乙酰胺基或马来酰亚胺基连接然后通过pH低于8的反应(碘乙酰胺基或马来酰亚胺基)或巯基-烯反应(马来酰亚胺基)与载体蛋白质上的“游离”半胱氨酸残基缀合而制备的“精确糖缀合物”的实例。

图5显示了如实施例2-6中所述用于合成准备与载体蛋白质缀合的烯丙基Tn抗原和烯丙基TF抗原的反应方案。

图6A-6D显示了烯丙基2-乙酰氨基-3,6-二-O-新戊酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(化合物2)的¹H-NMR(图6A)和¹³C-NMR(图6B)光谱以及质谱分析结果(图6C和6D)。

图7A-7D显示了烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(烯丙基Tn)的¹H-NMR(图7A)和¹³C-NMR(图7B)光谱以及质谱分析结果(图7C和7D)。

图8A-8C显示了烯丙基2-乙酰氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(化合物4)的¹H-NMR(图8A)光谱以及质谱分析结果(图8B和8C)。

图9A-9D显示了烯丙基(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(化合物6)的¹H-NMR(图9A)和¹³C-NMR(图9B)光谱以及质谱分析结果(图9C和9D)。

图10A-10D显示了化合物7的¹H-NMR(图10A)和¹³C-NMR(图10B)光谱以及质谱分析结果(图10C和10D)。

图11A-11D显示了烯丙基(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(烯丙基TF)的¹H-NMR(图11A)和¹³C-NMR(图11B)光谱以及质谱分析结果(图11C和11D)。

图12显示了单独的TF-TT糖缀合物(左上图)、单独的花生凝集素(右上图)或两者组合(下图)的动态光散射(DLS)分析的结果。

图13显示了在与O-烯丙基-Tn和O-烯丙基-TF的光催化巯基-烯缀合反应中，作为时间的函数的肽dTT831-840的巯基浓度。

图14显示了在与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应中肽dTT831-840的巯基的减少倍数，其为肽的半胱氨酸位置和AAPH或DMPA的存在的函数。

图15显示了凝集素对通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而与Tn缀合的dTT831-840肽的反应性，其为肽的半胱氨酸位置和AAPH或DMPA的存在的函数。

图16显示了在AAPH或DMPA的存在下在不同波长下，在与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应中肽dTT831-840的巯基浓度的动力学。

图17长柔毛野豌豆(Vicia Villosa)凝集素对与Tn缀合的肽dTT831-840的反应性，后者是在AAPH或DMPA的存在下在不同波长下通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合。

图18显示了在与C-烯丙基糖和O-烯丙基糖的光催化巯基-烯缀合反应中，肽dTT831-840的巯基浓度的动力学。

图19显示了凝集素和抗TF抗体对通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的肽dTT831-840的反应性。

图20显示了抗TF抗体对还原的dTT或者通过与O-烯丙基-TF的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的还原的dTT的反应性。

图21显示了在光催化巯基-烯缀合反应以及接下来经缀合dTT的还原的多个步骤中，dTT的巯基的摩尔比。

图22显示了通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的dTT对凝集素和抗TF mAb的反应性。

图23显示了在低或高量的AAPH存在下通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合或未缀合的化学巯基化dTT的巯基的摩尔比。

图24显示了在低或高量的AAPH存在下在两个不同的时间，长柔毛野豌豆凝集素对通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的化学巯基化的dTT的反应性。

图25显示了凝集素和抗TF抗体对通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的还原的BSA的反应性。

图26示出了还原条件与还原的BSA的巯基的摩尔比之间的关系。

图27显示了Tn-特异性长柔毛野豌豆凝集素和抗TF抗体对具有多种游离巯基摩尔比并通过与多种量的O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的BSA的反应性。

图28显示了还原条件、还原的BSA的巯基的摩尔比和通过与O-烯丙基-TF的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的还原的BSA的TF反应性之间的关系。

图29显示了在存在或不存在AAPH和O-烯丙基-Tn的情况下，通过单独的化学巯基化或同时进行巯基化和通过光催化巯基-烯缀合反应的BSA中巯基加合物的摩尔比，其为时间的函数。

图30显示了在存在或不存在AAPH和O-烯丙基-Tn的情况下，Tn-特异性长柔毛野豌豆凝集素与巯基化的BSA或同时巯基化并通过光催化巯基-烯缀合反应而缀合的BSA的反应性。

图31显示了作为时间函数的巯基摩尔比与通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯的缀合反应而缀合的BSA对Tn-特异性长柔毛野豌豆凝集素的反应性之间的关系。

图32显示了在低或高量的AAPH存在下并且在两个波长下，Tn特异性长柔毛野豌豆凝集素对天然或通过与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应而缀合的巯基化BSA的反应性。

图33显示了在低或高量的AAPH下，在不同步骤的巯基化和与O-烯丙基-Tn的光催化巯基-烯缀合反应中，半乳糖摩尔比与抗TF mAb对BSA的反应性之间的关系。

图34显示了分别在C-和N-末端带有半胱氨酸残基的dTT831-844-Cys-βAla和Cys-dTT831-844-βAla的化学结构，以及它们的列表LC-MS数据。

图35显示了肽dTT831-844-Cys-βAla的详细LC-MS数据。

图36显示了肽Cys-dTT831-844-βAla的详细LC-MS数据。

图37显示了C末端肽dTT831-844-Cys-βAla上的O-烯丙基Tn的光解AAPH催化的巯基-烯反应。

图38显示了C末端肽上O-烯丙基Tn的LC-MS谱

图39显示了N末端肽Cys-dTT831-844-βAla上的O-烯丙基Tn的光解AAPH催化的巯基-烯反应。

图40显示了N-末端肽上的O-烯丙基Tn的LC-MS谱。

序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表，其创建于2019年3月19日，大小为约4KB。该计算机可读形式通过引用并入本文。

发明详述

本说明书涉及糖缀合物免疫原(例如，用作疫苗，用于诊断，或用于产生诊断或治疗工具，例如特异性抗糖缀合物抗体)。本文所述的糖缀合物免疫原通常包含与免疫原性载体蛋白质偶联的碳水化合物抗原。更特别地，载体蛋白质包含一个或多个游离巯基(例如，对应于半胱氨酸残基的侧链)，并且碳水化合物抗原缀合至载体蛋白质的这些游离巯基的一个或多个处。本说明书还涉及用于合成糖缀合物免疫原/疫苗的改进的方法，其涉及例如使用“点击化学”方法(例如，光催化巯基-烯反应)将碳水化合物抗原直接缀合至载体蛋白质的游离巯基。可以在足够温和的条件(例如，仅使用水溶性试剂，不存在有机溶剂，使用足够低浓度(例如，<5％)以避免载体蛋白质变性的有机溶剂，和/或在相对中性的pH值下)进行本文所述的改进的缀合方法，以避免破坏载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构(例如，天然二硫键的断裂和/或变性)，而不会影响缀合的特异性。此外，本文所述的光催化巯基-烯反应可以在存在催化剂的情况下在紫外光(例如355nm或365nm)或者在不存在催化剂的情况下在短波紫外光(例如254nm)下进行，进一步简化了过程。

由于本文所述的缀合方法提供更高的精度，因此与依赖于随机偶联至其它氨基酸侧链(例如，来自赖氨酸的胺或来自谷氨酸/天冬氨酸残基的酸)的糖缀合物相比，本文所述的糖缀合物免疫原/疫苗可以具有更高的同质性(就其碳水化合物分布而言)、可再现性，并且可更易于表征。这样的特征可以促进糖缀合物疫苗的监管批准和/或商业化，这两者在历史上基于传统方法被证明是困难的。

在一些方面，本说明书涉及用于产生糖缀合物免疫原(例如，用于施用于受试者)的方法。如本文所用，术语“受试者”通常是指能够对如本文所述的糖缀合物免疫原产生免疫应答，优选地导致产生与糖缀合物免疫原特异性结合的抗体的生物(例如动物或人)。在一些实施方案中，本文所述的受试者可以是待治疗性治疗(例如，通过本文所述的糖缀合物免疫原的疫苗接种)的患者，或可以用作产生用于研究、诊断和/或治疗目的的工具(例如抗体)的手段。用于产生糖缀合物免疫原的方法通常包括提供具有(例如，化学修饰以包含)巯基特异性官能团的碳水化合物抗原；提供具有一个或多个游离巯基(例如，一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基和/或不参与二硫键的半胱氨酸)的载体蛋白质；以及使碳水化合物抗原与载体蛋白质反应，从而使碳水化合物抗原偶联至载体蛋白质的与载体蛋白质的游离巯基的位置相对应的一个或多个可预测的(非随机)附着点处。在一些实施方案中，该方法可以进一步包括纯化或分离糖缀合物免疫原，然后可以将其配制成疫苗(例如，包含佐剂)。

如本文所用，术语“糖缀合物”是指与载体蛋白质偶联的碳水化合物抗原(例如，抗原性单糖、二糖、寡糖或多糖)，以增强碳水化合物抗原在目标受试者中的免疫原性。如本文所用，表述“碳水化合物抗原”和“糖抗原”具有相同含义。术语“免疫原”是指能够在目标受试者中与免疫系统的成分(例如，通过抗体和/或淋巴细胞)特异性结合并且产生体液免疫应答和/或细胞介导的免疫应答的物质。如本文所用，在诸如“糖缀合物免疫原”的表述中的术语“免疫原”是指糖缀合物的能力(即，物理特征或性质)，而不将糖缀合物本身限于特定用途(例如，作为用于在受试者中产生免疫应答的免疫原)。例如，在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可以用于诊断测定或方法(例如，体外方法)中，以检测生物样品(例如来自受试者)中与糖缀合物免疫原结合的抗体的存在或不存在。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可用于筛选、鉴定或评估特异性结合糖缀合物免疫原的抗体(例如，可诊断或治疗应用的单克隆抗体)。

在一些方面，本说明书涉及“点击化学类型”方法用于将碳水化合物抗原直接缀合至载体蛋白质的游离巯基的用途。更具体地，如图2所示，优选光催化巯基-烯反应，其中将碳水化合物抗原(R₂)修饰为包含末端烯烃官能团(烯基碳水化合物抗原)，其适合于使用光催化巯基反应直接共价连接至载体蛋白质(R₁)的半胱氨酸巯基(-SH)。参照图3，可以通过巯基-烯反应将包含B细胞表位的碳水化合物抗原(例如肿瘤相关碳水化合物抗原Tn和TF)光化学缀合至免疫原性载体蛋白质，例如破伤风类毒素(TT)，已知其具有归因于其六个可用的半胱氨酸残基(不包括参与二硫键的四个半胱氨酸残基)的六个游离巯基。在图3所示的破伤风类毒素载体蛋白质的情况下，本文所述的缀合方法优选导致恰好六个碳水化合物抗原在可预测的(非随机)附着点处缀合。本文所述的方法适用于任何天然或合成的单糖、寡糖和多糖，其可以以烯烃基团(末端烯烃)为末端。

在一些实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可以被化学修饰以连接(直接地或通过接头或间隔区间接地)至末端烯烃(例如通过糖苷键或通过例如烯丙基胺和还原糖(优选使用NaBH₄和/或NaBH₃CN)之间的还原胺化获得的键)，其中烯基碳水化合物抗原的末端烯基通过巯基-烯反应(例如，光催化巯基-烯反应)可缀合至载体蛋白质的游离巯基(例如，一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基和/或不参与二硫键的半胱氨酸)。烯基碳水化合物抗原的末端烯基可以是单取代的烯烃、乙烯基或烯丙基。在一些优选的实施方案中，烯基碳水化合物抗原是水溶性的，使其能够用于本文所述的基于水的巯基-烯反应中。

如本文所用，“糖苷键”可以包含以下一种或多种：S-糖苷键、N-糖苷键、O-糖苷键或C-糖苷键，或者通过还原糖(例如使用NaBH₄，或优选NaBH₃CN)的还原胺化而获得的键。在一些实施方案中，糖苷键可以是不可被待施用的受试者的内源酶(例如，甘油水解酶)切割的键。这种不可切割的糖苷键可导致糖缀合物免疫原在施用于受试者后具有更长半衰期，其继而可产生更有利的免疫应答以用于治疗和/或抗体产生目的。在一些实施方案中，糖苷键可以是S-糖苷键、N-糖苷键或C-糖苷键，或者通过例如烯丙基胺和还原糖之间的还原胺化获得的键。

在一些实施方案中，优选使用“接头”或“间隔区(space)”，并且这样的术语在本文中用于指提供碳水化合物抗原与其所缀合的载体蛋白质的充分物理分离的化学连接，从而允许碳水化合物抗原被受试者的免疫系统识别(与被载体蛋白质掩蔽相反)。在一些实施方案中，接头可包含选自C、S、N和O的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续残基的链。

如本文所用，术语“可缀合”是指至少两个分子(例如，碳水化合物抗原和载体蛋白质)通过化学反应彼此共价键合的能力，而不管这些分子是否实际上彼此共价键合。相反地，术语“缀合的”是指彼此共价键合的至少两个分子(例如，碳水化合物抗原和载体蛋白质)。

在一些实施方案中，可以使不同类型的碳水化合物抗原具有末端烯基，所述末端烯基通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基。例如，可以通过调整本文实施例2-7中所述的用于合成烯丙基Tn和烯丙基TF反应物的方法来合成具有末端烯基的碳水化合物抗原。

在一些实施方案中，可使用光催化巯基-烯反应将具有末端烯基的碳水化合物抗原缀合至载体蛋白质的游离巯基，例如，通过调整本文实施例8和9中所述的用于合成Tn-TT和TF-TT缀合物的方法。例如，将溶解在水性溶剂(例如缓冲液，如PBS)中的一种或多种烯基碳水化合物抗原与也溶解于水性溶剂(例如缓冲液，如PBS)中的载体蛋白质在适合于紫外光辐照的容器(例如石英池)内混合。然后在存在或不存在催化剂(例如，光引发剂或活化剂)的情况下，在短波、中波或长波紫外光下(例如，具有在约254nm、在约355nm或在约365nm处的峰值波长)辐照混合物。如本文所用，在巯基-烯反应的情况下，术语“催化剂”、“光引发剂”和“活化剂”可互换使用，指加速碳水化合物抗原通过光催化巯基-烯反应与载体蛋白质在一个或多个游离巯基处缀合的物质。

在一些实施方案中，催化剂可以是水溶性光引发剂，例如水溶性自由基生成偶氮化合物；2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(Vazo 44或VA-044)；2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；具有光引发活性的金属或金属离子；或其在本文所述的光催化巯基-烯反应中具有光引发活性的任何衍生物。在一些实施方案中，催化剂可以是水溶性光引发剂，例如水溶性过氧化物，例如叔丁基过氧化氢或过氧化苯甲酰或过硫酸铵，或其它合适的催化剂。

在一些实施方案中，催化剂可以是水不溶性光引发剂，例如水不溶性自由基生成偶氮化合物；2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、2,2’-偶氮二(2-甲基丙腈)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)、1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)、二氮烯二羧酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二羧酸二胡椒脂(ADD)，或其在本文所述的光催化巯基-烯反应中具有光引发活性的任何衍生物。

在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应可包括控制对应于载体蛋白质的每个游离巯基的烯基碳水化合物抗原(即，包含末端烯烃的碳水化合物抗原)的摩尔当量之比，例如，以减少、最小化或避免糖聚合。在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应可包括使载体蛋白质的每个游离巯基与1至300、1至250、1至200、1至100、或1至10、1至5、或1至2摩尔当量的碳水化合物抗原反应。

在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应进行足够的时间以实现载体蛋白质中的总游离巯基浓度降低至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍(例如，通过Ellman测试确定)。在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应进行10至300、10至270、10至240、10至210、10至180、10至150、10至120、10至90、10至60、或10至30分钟。

在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应可以在约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0至约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH下进行。在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应可以在避免载体蛋白质变性的pH下进行。在一些实施方案中，本文所述的光催化巯基-烯反应可以在4至5的pH下，优选在pH 4.4(例如在乙酸盐缓冲液中)进行。

在一些实施方案中，由于本文所述的巯基-烯缀合反应可以仅使用水性试剂和水性溶剂进行，使用水溶性光引发剂(相对于需要有机溶剂的光引发剂)可能是有利的，这是因为有机溶剂可能促进载体蛋白质变性，以及与非游离半胱氨酸残基(例如，参与分子内和/或分子间二硫键的半胱氨酸)的不希望/不可预测的缀合，如Dondoni等人,2009和Dondoni等人,2012中所述。

在替代实施方案中，根据需要，可将水不溶性光引发剂与有机溶剂一起使用以使其溶解。优选地，有机溶剂的存在或浓度不应促进载体蛋白质的变性，以及与非游离半胱氨酸残基(例如，参与分子内和/或分子间二硫键的半胱氨酸)的不希望/不可预测的缀合。例如，这种光引发剂可以是诸如2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)的光引发剂。

在本文所述的巯基-烯方法的替代实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可以被修饰以具有一个或多个巯基特异性官能团，例如碘乙酰胺、马来酰亚胺、苄基卤化物或溴甲基酮，其通过巯基的S-烷基化而反应产生稳定的硫醚产物(例如，在相对较低的pH(例如低于9、8、7.5或7且高于5、5.5或6)下进行，这可以避免不想要的随机的碳水化合物抗原与赖氨酸残基的缀合)。在图4中显示了已被修饰以包含巯基特异性官能团(例如，碘乙酰胺基和马来酰亚胺基)的碳水化合物抗原的实例。在一些实施方案中，马来酰亚胺基有资格作为通过巯基-烯反应可缀合至载体蛋白质的巯基的末端烯烃。

在一些实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可包含一个或多个B细胞表位，和/或可诱导体液免疫应答，和/或可包含T细胞表位，和/或在施用之后在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可在向受试者施用之后至少诱导针对碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答(例如，除了体液应答之外)。

在一些实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可以是或包含例如肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)。癌细胞的外细胞膜的糖蛋白和糖脂过表达特定的O-聚糖。这些糖蛋白构成了统称为粘蛋白(MUC)的蛋白质家族，其中MUC1代表了研究最广泛的。由于导致复杂的糖基化模式的活性糖基转移酶，正常细胞上的MUC被大程度地O-糖基化。在癌细胞中，关键糖基转移酶的下调会触发较短聚糖的积累，导致粘蛋白上非常有限的O-糖基化。正常细胞和癌细胞之间这些糖基化模式改变的结果是TACA的过度积累，否则在正常组织上其被复杂糖基化所隐蔽(掩盖)。最常见的TACA包括Tn抗原(具有N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)结构的单糖)、TF抗原(Thomsen-Friedenreich抗原，具有Galβ1-3GalNAcα1结构的二糖)及其各自的同源唾液酸化类似物。多种类型肿瘤细胞的细胞表面上Tn和TF抗原二者的过表达有助于癌细胞粘附和严重转移到含有受体凝集素的部位(肺、肝、淋巴结等)。因此，在一些实施方案中，本文所述的TACA是、来自或包含：Tn抗原、STn抗原、Thomsen-Friedenreich(TF)抗原、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、Globo H、GD2、GD3、GM2、GM3、N-乙醇酰-GM3、Lea、sLea、Lex、sLex或其任何组合。一些常见的TACA的结构示于图1中。如本文所用，表述“来自”在用于碳水化合物抗原的情况下时是指衍生自已知碳水化合物抗原的碳水化合物变体，其中该变体至少保留已知碳水化合物抗原的抗原性。对于本领域技术人员而言，可以通过化学以及化学酶促方法进行烯基末端的TACA的合成，如Danishefsky等人,2015中所述。

在一些实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可以是或包含与感染原(例如但不限于细菌和/或病毒)相关或与感染(例如但不限于细菌感染和/或病毒感染)相关的碳水化合物抗原。在一些实施方案中，本文所述的碳水化合物抗原可以是或包含例如病毒多糖抗原或细菌荚膜多糖(CPS)。在一些实施方案中，细菌CPS是、来自或包含肺炎球菌的和/或链球菌的多糖血清型、脑膜炎球菌CPS或流感(例如a或b型流感)CPS。

在一些实施方案中，本文所述的缀合方法可以将相同或超过一种类型的碳水化合物抗原缀合至载体蛋白质，从而产生多价糖缀合物免疫原。在一些实施方案中，本文所述的多价糖缀合物免疫原可包含与载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个相同或不同类型的碳水化合物抗原。在一些实施方案中，本文所述的多价糖缀合物免疫原可以包含与载体蛋白质上的单个游离巯基缀合的多于一个碳水化合物抗原(例如，通过分支接头)。在一些实施方案中，本文所述的多价糖缀合物免疫原可包含与作为树枝状大分子的载体蛋白质上的单个游离巯基缀合的多个(例如，至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个)碳水化合物抗原(例如，通过具有广泛分支的接头)。在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白质包含一个或多个游离巯基。如本文所用，“游离巯基”或“游离巯基基团”是指载体蛋白质具有一个或多个可用于化学修饰和/或缀合(例如与本文所述的碳水化合物抗原)的巯基基团。在一些实施方案中，可以例如使用Ellman测试使用半胱氨酸标准曲线测量给定载体蛋白质的游离巯基浓度，如本发明实施例中所述。给定载体蛋白质的游离巯基浓度可以表示为游离巯基浓度的降低倍数。在一些实施方案中，在本文所述的缀合方法之后，本文所述的糖缀合物的游离巯基浓度可以降低至少50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、4、3或2倍(例如，通过Ellman测试测量的)。

在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白质可以被工程化改造以添加一个或多个另外的半胱氨酸残基，例如在载体蛋白质的氨基末端、羧基末端或者上它们之间的任何溶剂可及的位置(与蛋白质载体的三维结构中溶剂不可及或“掩埋”的位置相反)。在一些实施方案中，本文所述的蛋白质载体的游离巯基可以被定义为当在足够温和以不破坏载体蛋白质的免疫原性、结构或活性的条件下进行反应时，通过光催化巯基-烯反应容易地可缀合至烯基碳水化合物抗原的半胱氨酸。在一些实施方案中，本文关于载体蛋白质使用的术语“活性”是指载体蛋白质保持碳水化合物抗原的免疫原性的能力(例如，对已知特异性结合碳水化合物抗原的抗体)。

在一些实施方案中，游离巯基可指载体蛋白质的一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基，和/或不参与二硫键的半胱氨酸，在一些情况下，二硫键对于维持载体蛋白质的结构可能是重要的。在一些实施方案中，载体蛋白质可以是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中在与碳水化合物抗原缀合之后，一个或多个二硫键保持不受影响(即完整)。在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白质在其N末端和/或C末端不包含游离巯基。或者，在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白质可在其N末端和/或C末端包含或被工程化改造成包含游离巯基。在一些实施方案中，载体蛋白质可以是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中可以用还原剂(例如，二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或2-巯基乙胺-HCl)预处理载体蛋白质以暴露一个或多个另外的游离巯基以用于与碳水化合物抗原缀合。例如当变性的(还原的)载体蛋白质在受试者中具有比天然的(未还原的)载体蛋白质更高的免疫原性时，这样的预处理可能是有用的。

在一些实施方案中，在进行光催化巯基-烯反应之前或与之一起，可以用还原剂(例如，如本文所述)预处理载体蛋白质。该预处理可以暴露可用于缀合的另外的游离巯基。在一些实施方案中，在进行光催化巯基-烯反应之前或与之一起，可以用巯基化剂(例如2-亚氨基硫杂环戊烷、N-羟基琥珀酰亚胺二硫代丙酸酯(DPS))预处理载体蛋白质。该预处理可用于增加可用于缀合的游离巯基的数目。在一些实施方案中，在进行光催化巯基-烯反应之前或与之一起，可以用巯基化剂预处理然后用还原剂预处理载体蛋白质。

在一些实施方案中，避免太多的多个碳水化合物抗原与载体蛋白质上的相邻位置缀合可能是有利的。在一些实施方案中，载体蛋白质可优选缺少富含半胱氨酸的结构域(例如，包含至少50％的半胱氨酸残基的至少4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸的片段)。

在一些实施方案中，载体蛋白质可包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个半胱氨酸残基。在一些实施方案中，载体蛋白质可包含总共1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个游离半胱氨酸残基。

在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于缀合之前载体蛋白质上可用的游离巯基的数目。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可包含相对于每个载体蛋白质1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碳水化合物抗原。在一些实施方案中，本说明书涉及包含糖缀合物免疫原的组合物，其在碳水化合物缀合物种方面具有约或至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的同质性(例如，组合物中至少90％的糖缀合物免疫原物种/分子具有相同数目的与载体蛋白质缀合的碳水化合物抗原)。

在一些实施方案中，本文所述的载体蛋白质是优选对于施用糖缀合物免疫原的受试者具有免疫原性的蛋白质(例如，肽或多肽)。优选地，与施用未缀合的碳水化合物抗原(即，单独将碳水化合物抗原施用于受试者)相比，碳水化合物抗原与载体蛋白质的缀合增加了碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。

在一些实施方案中，载体蛋白质可包含T细胞表位，和/或在施用之后在受试者中诱导细胞介导的免疫应答。

在一些实施方案中，载体蛋白质是对于待施用的受试者而言是外源的蛋白质，其优选在受试者中不具有(密切的)直系同源物。在人疫苗生产的情况下，本文所述的载体蛋白质是指“适合人使用的载体蛋白质”或简单地称为“合适的载体蛋白质”，这是指与人蛋白质抗原性不同的载体蛋白质，使得载体蛋白质不会在人中被视为“自身抗原”。使用与相应人蛋白质抗原性太过类似的载体蛋白质可导致载体蛋白质被视为“自身抗原”，这在人疫苗中可能并不是理想。例如，先前已经描述和表征了由与牛血清白蛋白(BSA)的赖氨酸残基的ε-氨基随机缀合的TF抗原组成的糖缀合物免疫原(例如Demian等人,2014；Rittenhouse-Diakun等人,1998；Heimburg等人,2006；Tati等人,2017)。但是，不仅是BSA的59个赖氨酸残基上的碳水化合物水平随机且效率低下(每个BSA分子缀合不超过4至6个TF抗原)，而且BSA不适合作为人疫苗中的载体蛋白质，因为其抗原性与人白蛋白太过类似。在一些实施方案中，载体蛋白质不是白蛋白(例如牛血清白蛋白)。

优选地，本文所述的载体蛋白质可以是已经获得了监管机构(例如，FDA)批准用于向人受试者施用(例如，在批准的疫苗中)的蛋白质。在一些实施方案中，载体蛋白质是、来自或包含破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应材料197(CRM197)、脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌D蛋白(HiD)、细胞因子或其免疫原性片段(或变体)。

在一些实施方案中，载体蛋白质可以是TT，其包含10个半胱氨酸残基，其中4个参与二硫键，从而产生具有6个缀合的碳水化合物抗原的糖缀合物免疫原。在一些实施方案中，载体蛋白质可以是CRM197，其包含4个半胱氨酸残基，从而产生具有4个缀合的碳水化合物抗原的糖缀合物免疫原。

在一些实施方案中，可以对载体蛋白质进行工程化改造以引入另外的半胱氨酸残基，以便引入另外的游离巯基以用于与碳水化合物抗原缀合。在一些实施方案中，可以在载体蛋白质的溶剂暴露部分工程改造半胱氨酸残基。

在一些方面，本说明书涉及用于产生糖缀合物疫苗或触发免疫应答的组合物的方法。所述方法可以包括将本文所述的糖缀合物免疫原与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂一起配制。在一些实施方案中，佐剂是或包含：无机化合物、矿物油、微生物衍生物、植物衍生物、细胞因子、角鲨烯、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物、toll样受体激动剂、免疫刺激性多核苷酸(例如CPG)、免疫刺激性脂质、弗氏佐剂、RIBI佐剂、QS-21、胞壁酰二肽、TiterMax^TM、Steviune^TM、Stimune^TM或其任何组合。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含一个或多个碳水化合物抗原和具有一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基的免疫原性载体蛋白质，其中一个或多个碳水化合物抗原连接至免疫原性载体蛋白质的一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基处。与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，一个或多个碳水化合物抗原与免疫原性载体蛋白质的缀合增加了一个或多个碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。如本文所用，术语“合成”是指不是天然产物的化合物，其是通过人为干预产生的。

在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可以包含缀合至相同载体蛋白质的多于一种碳水化合物抗原(例如，多于一种类型的TACA)。例如，本文所述的糖缀合物免疫原可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多类型或种类的碳水化合物抗原(例如TACA)。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物免疫原可以包含选自以下的TACA的任何组合：Tn、S-Tn、Thomsen-Friedenreich(TF)、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、Globo H、GD2、GD3、GM2、GM3、N-乙醇酰-GM3、Lea、sLea、Lex和sLex。在一些实施方案中，每种TACA的组合中的比例可随目标肿瘤而变化，并可包含1至20摩尔比。以这种方式，可以例如针对与多种TACA的特定组合的表达增加有关的特定形式的癌症来定制本文所述的糖缀合物免疫原。

在一些方面，本说明书涉及糖缀合物疫苗，其通过本文所述的方法产生，和/或包含本文所述的合成糖缀合物免疫原，并且还包含药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。如本文所用，术语“疫苗”是指包含本文所述的糖缀合物免疫原的组合物，其被施用于受试者以向受试者提供治疗益处。在一些实施方案中，本文所述的糖缀合物疫苗可以是预防性疫苗或治疗性疫苗。

疫苗组合物可以在考虑诸如接受者动物的年龄、性别、体重、物种和病症以及施用途径等因素的情况下按照医学或兽医领域技术人员熟知的剂量和技术施用。施用途径可以是经皮的，通过粘膜施用(例如，经口、经鼻、经眼)或通过肠胃外途径(例如，皮内、肌内、皮下)。疫苗组合物可以单独施用，或者可以与其它治疗或疗法共同施用或相继施用。施用形式可包括混悬剂和用于肠胃外、皮下、皮内或肌内施用(例如可注射施用)的制剂，例如无菌混悬剂或乳剂。疫苗可以作为喷雾剂施用或混合在食物和/或水中，或与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合递送。组合物可包含辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、助剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、矫味剂、着色剂等，这取决于施用途径和期望的制剂。可以参考标准药物文献，例如“Remington's PharmaceuticalSciences,”1990，来制备合适的制剂，而无需进行过多的实验。

在一些方面，本说明书涉及免疫、接种或治疗受试者的方法，包括向受试者施用本文所述的糖缀合物免疫原或糖缀合物疫苗。

在一些方面，本说明书涉及经化学修饰以与巯基特异性(硫醇特异性)官能团连接的碳水化合物抗原。在一些实施方案中，碳水化合物抗原被化学修饰以与末端烯烃连接(例如，通过糖苷键)，其中末端烯烃基团通过巯基-烯反应可缀合至载体蛋白质的游离巯基。在一些实施方案中，碳水化合物抗原和末端烯基通过本文所述的接头连接。在一些实施方案中，末端烯烃基团可以是乙烯基或烯丙基。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体(例如，非对映异构体)：

其中：SA是糖抗原或其一部分；S-PC是载体蛋白质；X是O、S、NR₁或CH₂；R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；n是1、2、3、4或5；并且R₂是H或Me。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体(例如，非对映异构体)：

其中：SA是糖抗原或其一部分；S-PC是载体蛋白质；X是S、NR₁、CH₂或O；R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；n是1、2、3、4或5；R₂是H或Me；q是1、2、3、4或5；R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1。在一些实施方案中，当X是O时，糖抗原不包含Tn或STn。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是O、S、NR₁或CH₂；

-R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；并且

-R₂是H或Me；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且；

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些方面，本说明书涉及合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-r是1、2、3、4或5；

-R₅是S-PC、共价键或具有以下结构的基团：

其中R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1或2。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所限定的合成糖缀合物免疫原，其中所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1或2。

在一些实施方案中，本说明书涉及如上所述的合成糖缀合物免疫原，其中y是1至50、1至40、1至30、1至20、或1至10、1至5、或1至2的整数。

在一些实施方案中，糖抗原可以是如本文所述的碳水化合物抗原，和/或载体蛋白质可以是如本文所述的载体蛋白质。在一些实施方案中，合成糖缀合物免疫原可以是多价糖缀合物免疫原，例如包含与载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个相同或不同类型的碳水化合物抗原。在一些实施方案中，在施用于受试者之后，糖缀合物免疫原可以诱导针对碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。

在一些方面，本说明书涉及疫苗，包含如本文所述的合成糖缀合物免疫原，和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂(例如如本文所述的佐剂)。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原或如本文所述的合成糖缀合物免疫原用于制造疫苗的用途。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原、通过如本文所述方法制备的糖缀合物疫苗、如本文所述的合成糖缀合物免疫原、或如本文所述的疫苗用于治疗患有与所述一种或多种碳水化合物抗原或糖抗原的表达增加有关的疾病的受试者的用途。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原、通过如本文所述方法制备的糖缀合物疫苗、如本文所述的合成糖缀合物免疫原、或如本文所述的疫苗用于产生与糖缀合物免疫原特异性结合的抗体的用途。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法制备的糖缀合物免疫原、通过如本文所述方法制备的糖缀合物疫苗、如本文所述的合成糖缀合物免疫原、或如本文所述的疫苗用于检测与糖缀合物免疫原特异性结合的抗体的用途。

在一些方面，本说明书涉及用于产生糖缀合物的方法，所述方法包括：(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基；(b)提供适合通过本文所述的巯基-烯反应与碳水化合物抗原缀合的缀合物材料，所述缀合物材料具有一个或多个游离巯基；和(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述缀合物材料的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物。在一些实施方案中，缀合物材料是或包含具有游离巯基以适合于通过如本文所述的巯基-烯反应与所述碳水化合物抗原缀合的聚合物、多肽、如本文所限定的载体蛋白质、固体支持物、颗粒或任何其它材料。

在一些方面，本说明书涉及通过如本文所述的方法产生的糖缀合物用于检测或筛选与碳水化合物抗原或包含碳水化合物抗原的肿瘤循环细胞特异性结合的抗体的存在或用于检测由碳水化合物抗原的免疫或接种产生的抗体的存在的用途。在一些实施方案中，检测或筛选通过任何合适的检测方法例如免疫吸附测定，ELISA，微阵列或免疫印迹分析进行。

在一些方面，本说明书涉及治疗受试者的方法，包括施用如本文所限定的或通过如本文所限定的方法产生的糖缀合物或糖缀合物免疫原，以在所述受试者中产生针对碳水化合物抗原的免疫应答，和筛选来自所述受试者的生物样品中与碳水化合物抗原特异性结合的抗体的存在。

通过阅读对本说明书具体实施方案的以下非限制性描述，本说明书的其它目的、优点和特征将变得更加显而易见，所述实施方案仅作为示例参照附图给出。

条款

1.用于产生用于向受试者施用的糖缀合物免疫原的方法，所述方法包括：(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基；(b)提供具有一个或多个游离巯基的载体蛋白质；和(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述载体蛋白质的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物免疫原，其中所述载体蛋白质对所述受试者具有免疫原性，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述碳水化合物抗原与所述载体蛋白质的缀合增加了所述碳水化合物抗原在施用于所述受试者后的免疫原性。

2.根据条款1所述的方法，其中所述烯基碳水化合物抗原是水溶性的。

3.根据条款1或2所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在保留载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构的反应条件下进行。

4.根据条款1至3中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在不存在任何有机溶剂的情况下进行。

5.根据条款1至4中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在催化剂的存在下进行。

6.根据条款5所述的方法，其中所述催化剂是水溶性催化剂。

7.根据条款1至6中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在短波紫外光下的辐照。

8.根据条款7所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在约254nm处的辐照。

9.根据条款1至6中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在长波紫外光下的辐照。

10.根据条款9所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在约365nm处的辐照。

11.根据条款1至10中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括所述载体蛋白质的每个游离巯基与1至10摩尔当量的所述烯基碳水化合物抗原反应。

12.根据条款1至11中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在约3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9或4.0至约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10的pH下进行。

13.根据条款1至12中任一项所述的方法，其中在与所述载体蛋白质缀合之后，所述碳水化合物抗原不能被所述受试者的内源酶从所述载体蛋白质上切割。

14.根据条款1至13中任一项所述的方法，其中所述烯基碳水化合物抗原与所述末端烯烃共价连接，和/或所述碳水化合物抗原通过糖苷键例如O-糖苷键、S-糖苷键、N-糖苷键或C-糖苷键或者通过例如烯丙基胺和还原糖之间的还原胺化获得的键与所述载体蛋白质缀合。

15.根据条款1至14中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原包含B细胞表位，和/或在所述受试者中诱导体液免疫应答。

16.根据条款1至15中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原是或包含肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)。

17.根据条款16所述的方法，其中所述TACA是、来自或包含：Tn、S-Tn、Thomsen-Friedenreich(TF)、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、Globo H、GD2、GD3、GM2、GM3或其任何组合。

18.根据条款1至17中任一项所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应将超过一种类型的碳水化合物抗原缀合至所述载体蛋白质，从而产生多价糖缀合物免疫原。

19.根据条款18所述的方法，其中所述多价糖缀合物免疫原包含与所述载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个不同类型的碳水化合物抗原。

20.根据条款1至19中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物抗原是或包含病毒多糖抗原或细菌荚膜多糖(CPS)。

21.根据条款20所述的方法，其中所述细菌CPS是、来自或包含肺炎球菌的和/或链球菌的多糖血清型。

22.根据条款1至21中任一项所述的方法，其中(a)中的所述碳水化合物抗原通过接头与所述末端烯烃连接。

23.根据条款1至22中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质包含具有一个或多个游离巯基的一个或多个半胱氨酸残基。

24.根据条款1至23中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质包含人T细胞表位，和/或在所述受试者中诱导细胞介导的免疫应答。

25.根据条款1至24中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应材料197(CRM197)、脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌D蛋白(HiD)、细胞因子或其免疫原性片段。

26.根据条款1至25中任一项所述的方法，其中所述载体蛋白质是具有一个或多个二硫键的蛋白质，并且其中：(i)在所述光催化巯基-烯反应之后，所述一个或多个二硫键保持不受影响；或(ii)用还原剂预处理所述载体蛋白质以暴露一个或多个另外的游离巯基以用于与所述碳水化合物抗原缀合。

27.根据条款1至26中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于缀合之前所述载体蛋白质上可用的游离巯基的数目。

28.根据条款1至27中任一项所述的方法，其中所述糖缀合物免疫原在施用于所述受试者后诱导针对所述碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。

29.根据条款1至28中任一项所述的方法，进一步包括：(d)纯化所述糖缀合物免疫原。

30.用于产生糖缀合物疫苗的方法，所述方法包括将通过条款1至29中任一项所述的方法制备的糖缀合物免疫原与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂一起配制。

31.根据条款30所述的方法，其中所述佐剂是或包含：无机化合物、矿物油、微生物衍生物、植物衍生物、细胞因子、角鲨烯、明矾、氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙氢氧化物、toll样受体激动剂、免疫刺激性多核苷酸、免疫刺激性脂质、弗氏佐剂、RIBI佐剂、QS-21、胞壁酰二肽或其任何组合。

32.合成糖缀合物免疫原，包含一个或多个碳水化合物抗原和具有一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基的免疫原性载体蛋白质，其中所述一个或多个碳水化合物抗原连接至免疫原性载体蛋白质的所述一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基处，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述一个或多个碳水化合物抗原与所述免疫原性载体蛋白质的缀合增加了所述一个或多个碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。

33.根据条款32所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原通过接头与所述一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基连接。

34.根据条款32所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原通过如条款13或14中所限定的键与所述接头连接。

35.根据条款32至34中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述一个或多个碳水化合物抗原如条款2、15、16、17、20或21中所限定。

36.根据条款32至35中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，是如条款18或19中所限定的多价糖缀合物免疫原。

37.根据条款32至36中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述载体蛋白质如条款23、24、25或26中所限定义。

38.根据条款32至37中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述糖缀合物免疫原中包含的碳水化合物抗原的总数等于所述载体蛋白质上溶剂可及的半胱氨酸残基的数目。

39.根据条款32至38中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，在施用于所述受试者后诱导针对所述碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。

40.根据条款32至39中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，通过条款1至29中任一项所述的方法制备。

41.糖缀合物疫苗，通过条款30或31所述的方法产生，和/或包含条款32至40中任一项所述的合成糖缀合物免疫原和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

42.根据条款41所述的糖缀合物疫苗，是预防性疫苗或治疗性疫苗。

43.免疫、接种或治疗受试者的方法，包括向所述受试者施用通过条款1至29中任一项所述的方法产生的糖缀合物免疫原，通过条款30或31所述的方法产生的糖缀合物疫苗，条款32至40中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，或条款41或42所述的糖缀合物疫苗。

44.根据条款32至40中任一项所述的合成糖缀合物免疫原或者条款41或42所述的糖缀合物疫苗，用于在免疫、接种或治疗患有疾病的受试者中使用。

45.合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：

-SA是糖抗原或其一部分；

-PC是载体蛋白质；

-X是O、S、NR₁或CH₂；

-R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；并且

-R₂是H或Me。

46.合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：

-SA是糖抗原或其一部分；

-PC是载体蛋白质；

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1。

47.根据条款45或46所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述糖抗原是如条款15、16、17、20或21中所限定的碳水化合物抗原。

48.根据条款45至47中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述载体蛋白质是如条款23、24或25中所限定的载体蛋白质。

49.根据条款45至49中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，是多价糖缀合物免疫原。

50.根据条款49所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述多价糖缀合物免疫原包含与所述载体蛋白质缀合的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个不同类型的碳水化合物抗原。

51.根据条款45至50中任一项所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述糖缀合物免疫原在施用于受试者后诱导针对所述碳水化合物抗原的细胞介导的免疫应答。

52.疫苗，包含条款45至51中任一项所述的合成糖缀合物免疫原和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。

53.条款52所述的疫苗，其中所述佐剂如条款31中所限定。

54.通过条款1至29中任一项所述的方法制备的糖缀合物免疫原或如条款32至40和45至51中任一项所限定的合成糖缀合物免疫原用于制造疫苗的用途。

55.通过条款1至29中任一项所述的方法制备的糖缀合物免疫原、通过条款30或31所述的方法产生的糖缀合物疫苗、如条款32至40和45至51中任一项所限定的合成糖缀合物免疫原、或条款52或63所述的疫苗用于治疗患有与所述一种或多种碳水化合物抗原或糖抗原的表达增加有关的疾病的受试者的用途。

实施例

实施例1：一般方法

使用市售HPLC级在氮气氛下进行反应。使用市售试剂(Sigma Aldrich)而无需进一步纯化。N-乙酰基-D-半乳糖胺和N-乙酰基神经氨酸由Rose Scientific Ltd.Alberta,Canada提供。Fmoc-β-Ala-Wang树脂和Fmoc氨基酸可商购自Peptide Technologies Ltd,Pierrefonds,Qc,Canada。使用硅胶60F₂₅₄涂覆的板(E.Merck)通过薄层色谱法监测反应进程。在放置在两个手持式UV 365nm灯(UV-AC手持式灯,双重254/365nm UV；115V-60Hz,0.16安培,VWRCanada,目录号89131-492)之间的石英比色皿(10x10mm光程,Fisher ScientificCanada,目录号14-958-130)中进行通过点击巯基-烯光反应进行的缀合。使用来自Canadian Life Science的ZEOprep^TM硅胶(40-63μm)进行快速色谱。在紫外光下或通过喷洒20％乙醇硫酸或钼酸盐或KMnO₄溶液然后加热来进行检测。在Bruker ULTRASHIELD^TM300MHz和Bruker Avance^TMIII HD 600MHz光谱仪上记录NMR谱。相对于设置为7.26ppm(¹H)和77.16ppm(¹³C)的残余CHCl₃的化学位移，以ppm为单位报告质子和碳的化学位移(δ)。以赫兹(Hz)为单位报告耦合常数(J)，并且对于峰的多重性使用以下缩写：单峰(s)、二重峰(d)、双二重峰(dd)、具有相等耦合常数的双二重峰(t_ap)、三重峰(t)、多重锋(m)。使用COZY(Correlated SpectroscopY)和HSQC(Heteronuclear Single Quantum Coherence)实验进行分析和分配。通过UQAM的分析平台，使用来自Agilent technologies的LC-MS-TOF(液相色谱质谱飞行时间)仪器以正电和/或负电喷雾模式测量高分辨率质谱(HRMS)。质子化离子(M+H)⁺或钠加合物(M+Na)⁺用于经验公式确认。使用2000KDa苯甲酰化透析管(Sigma-Aldrich(Ontario,Canada))对天然TT和TT-缀合物进行透析。通过412nm处的Ellman测试(Ellman,G.L.Arch.Biochem.Biophys.1959,82,70-77)确定天然和缀合TT二者的巯基含量。通过使用UV/VIS Ultrospec 100prot分光光度计(Biochrom,USA)在492nm处测量的比色DuBois测试(Dubois,M.；Gilles,K.A.；Hamilton,J.K.；Rebers,P.A.；Smith,F.Colorimetric Method for Determination of Sugars and RelatedSubstances.Anal.Chem.,1956,28,350-356)确定TT-缀合物的总糖含量。使用来自Malvern的Zetasizer Nano S90在PBS中测量动态光散射(DLS)颗粒尺寸分布。如Rittenhouse-Diakun等人,1998中先前所述产生小鼠单克隆IgG3抗体JAA-F11。

一般固相肽合成(SPPS)程序

根据文献程序(Papadopoulos等人,2012)并且从Fmoc-β-Ala-Wang树脂(650mg,0.34mmol,1.0当量；100-200目,加载量＝0.52mmol/g)开始进行固相肽合成(SPPS)程序。通过在Econo-Pac一次性柱1.5x 14cm(20mL)(Bio-Rad Laboratories,ON,Canada)中旋转搅拌进行反应。树脂在CH₂Cl₂中溶胀1小时，然后在i 1期间在DMF中过滤和再修复。用DMF中的20％哌啶的溶液(5mL,2x 5min，然后1x 10min)除去商业树脂或氨基酸的Fmoc保护基。通过过滤除去溶剂和试剂，并用DMF、CH₂Cl₂和MeOH(每种溶剂3X)洗涤树脂。通过Kaiser测试或TNBS测试验证游离氨基的存在。树脂上的游离胺在4℃下(10min)用预活化的Fmoc氨基酸溶液处理：DMF中的3当量氨基酸、3当量HBTU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(1H-苯并三唑-1-基)脲六氟磷酸盐)和催化量的HOBt(1-羟基苯并三唑)。然后将DIPEA(二异丙胺，9当量)加入混合物中，并在室温下搅拌1小时30分钟。使用Kaiser或TNBS比色测试确定偶联的完成。过滤后，洗涤树脂，并再次重复Fmoc去除步骤。在合成序列的末端，通过乙酰化(Ac₂O/DIPEA/DMF 1:1:8,1h)对最后的游离胺进行封端。过滤后，将溶液排干，将树脂真空干燥，并使用三氟乙酸/水/乙二硫醇/三异丙基硅烷(94.0/2.5/2.5/1.0)进行切割3小时。用甲基叔丁基醚沉淀所得的肽，并通过离心(20min,2000rpm,3X)与树脂珠分离。用气流将沉淀物小心干燥。将粗制肽溶解在水中以与树脂分离。然后将溶液冻干，得到期望的肽。

dTT831-844-Cys-βAla。从Fmoc-β-Ala-Wang树脂(650mg,0.34mmol,1.0当量；100-200目,加载量＝0.52mmol/g)开始，分离作为白色粉末的期望肽dTT831-844-Cys-βAla(62mg,0.034mmol,10％)。ESI⁺-LC-MS:C₈₃H₁₃₅O₂₄N₁₉S的[M+2H]⁺²计算值,906.9819；实测值,906.9849；CAN/H₂O 5至95％5.42min。

Cys-dTT831-844-βAla。从Fmoc-β-Ala-Wang树脂(650mg,0.34mmol,1.0当量；100-200目,加载量＝0.52mmol/g)开始，分离作为白色粉末的期望肽Cys-dTT831-844-βAla(62mg,0.034mmol,10％)。ESI⁺-LC-MS:C₈₃H₁₃₅O₂₄N₁₉S的[M+2H]⁺²计算值,906.9819；实测值,906.9844；CAN/H₂O 5至95％5.32min。

实施例2：烯丙基2-乙酰氨基-3,6-二-O-新戊酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(化 合物2)

参照图5，在氩气氛下于0℃将乙酰氯(2.76mL，38.80mmol，3.43当量)逐滴加入到烯丙醇(20.8mL)中。在室温下，加入N-乙酰基-D-葡糖胺(化合物1)(2.50g，11.3mmol，1.00当量)。将反应混合物在70℃下搅拌3小时，然后通过添加固体NaHCO₃直至pH 7来淬灭。将混悬液通过硅藻土垫过滤，用MeOH洗涤数次。减压除去溶剂，并通过与Et₂O/乙醇一起研磨来沉淀出粗制烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡糖胺。研磨后，然后减压除去溶剂数次。然后在氮气氛下在-15℃下，向粗制烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷中间体在无水二氯甲烷-吡啶(45mL,v/v,1:2)的混合物中的混悬液中逐滴加入新戊酰氯(3.90mL，31.64mmol，2.80当量)。将该反应混合物搅拌2小时，温热至室温，得到期望的α-异头物(化合物2)(Rf＝0.32)和一些β-异头物(Rf＝0.18)；己烷/EtOAc 1:1。然后将混合物用CH₂Cl₂稀释，并将有机相依次用HCl(1M)数次、KHSO₄的饱和水溶液、NaHCO₃的饱和溶液和盐水洗涤。有机相经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下蒸发。通过在硅胶快速色谱法(己烷-EtOAc 6:4至1:1)纯化微黄色油，得到期望的化合物烯丙基2-乙酰氨基-3,6-二-O-新戊酰基-2-脱氧-α-D-吡喃葡萄糖苷(化合物2)，为白色固体(4.85g，6.78mmol，60％)。Rf＝0.32；己烷/EtOAc 1:1；图6A和B:¹H NMR(CDCl₃,600MHz):δ5.87(dddd,1H,J_H,H＝16.8,10.5,6.2,5.3Hz,OCH₂CH＝CH₂),5.77(d,1H,J_NH,H2＝9.7Hz,NH),5.31-5.25(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.22(dd,1H,J_H,H＝10.4,1.3Hz,OCH₂CH＝CH₂),5.09(dd,1H,J_3,4＝10.7,J_2,3＝9.3Hz,H-3),4.83(d,1H,J_1,2＝3.7Hz,H-1),4.39(m,1H,H-6a),4.35-4.25(m,2H,H-6b和H-2),4.19(m,1H,OCH₂),4.02-3.93(m,1H,OCH₂),3.85(m,1H,H-5),3.59-3.48(m,1H,H-4),3.03(d,1H,J_4,OH＝5.1Hz,OH-4),1.93(s,3H,NHCOCH₃),1.23(s,9H,叔丁基)和1.19ppm(s,9H,叔丁基)；¹³C NMR(CDCl₃,150MHz):δ179.8,179.1(tert-BuCO),169.7(NHCO),133.2(OCH₂CH＝CH₂),118.1(OCH₂CH＝CH₂),96.4(C-1),73.4(C-3),70.5(C-5),69.1(C-4).68.2(OCH₂),63.1(C-6),51.4(C-2),39.0,38.9(2x C(CH₃)₃),27.2,27.0(2x C(CH₃)₃)和23.2ppm(CH₃).Fig.6C和6D:ESI⁺-HRMS:C₂₁H₃₆O₈N的[M+H]⁺计算值,430.2435；实测值,430.2445.分离作为白色固体的β-异头物(971mg,2.26mmol,20％).Rf＝0.18；己烷/EtOAc 1:1；¹H NMR(CDCl₃,300MHz):δ6.00(d,1H,J_NH,H2＝9.3Hz,NH),5.95-5.75(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.35-5.03(m,3H,OCH₂CH＝CH₂和H-3),4.55(d,1H,J_1,2＝8.4Hz,H-1),4.47-425(m,3H,H-6a,6b和OCH₂),4.14-3.90(m,2H,OCH₂和H-2),3.65-3.43(m,2H,H-5和H-4),3.23(sb,1H,OH-4),1.92(s,3H,NHCOCH₃),1.23(s,9H,叔丁基)和1.20ppm(s,9H,叔丁基)。

实施例3：烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(烯丙基Tn)

参照图5，在氩气氛下将在无水二氯甲烷-吡啶(126mL,v/v 20:1)的混合物中的二-O-新戊酰基化合物(化合物2)(5.50g，12.80mmol，1.0当量)冷却至-35℃。然后加入三氟甲磺酸酐(2.58mL，15.36mmol，1.2当量)，并将混合物在该温度下搅拌。将温度温热至室温2小时。然后将水(12mL)加入溶液中。加热混合物，并在回流(约50℃)下搅拌过夜(12小时)。达到室温后，将反应混合物用二氯甲烷稀释，并用1M HCl水溶液洗涤数次。有机层用H₂O、饱和NaHCO₃和盐水洗涤。有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下蒸发。将该粗产物在Zemplen条件(1M甲醇钠的甲醇溶液，40mL，pH 9)下处理。将该溶液在50℃下搅拌过夜。冷却至室温后，将溶液通过加入离子交换树脂(IR 120,H⁺)中和，过滤，用MeOH洗涤，并在减压下除去溶剂。通过在MeOH/EtOAc/己烷中沉淀分离烯丙基T_N，冻干后为白色固体(2.36g,9.10mmol,71％)Rf＝0.32；EtOAc/MeOH 4:1；图7A和7B:¹H NMR(CD₃OD,600MHz):δ5.99-5.88(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.31(dd,1H,J_trans＝17.3,J_gem＝1.3Hz,OCH₂CH＝CH₂),5.17(dd,1H,J_cis＝10.5Hz,OCH₂CH＝CH₂),4.86(d,1H,J_1,2＝3.8Hz,H-1),4.27(dd,1H,J_2,3＝11.0Hz,H-2),4.20(m,1H,OCH₂),4.00(m,1H,OCH₂),3.89(dd,J_3,4＝J_4,5＝2.6Hz,H-4),3.85-3.77(m,2H,H-3和H-5),3.72(m,2H,H-6a和H-6b)和1.99ppm(s,3H,CH₃)；¹³C NMR(CD₃OD,150MHz):δ172.5(NHCO),134.2(OCH₂CH＝CH₂),116.1(OCH₂CH＝CH₂),96.6(C-1),71.2(C-3),69.0(C-4),68.3(C-5).67.8(OCH₂),61.4(C-6),50.2(C-2)和21.2ppm(CH₃).图7C和7D:ESI⁺-HRMS:C₁₁H₂₀O₆N的[M+H]⁺计算值,262.1285；实测值,262.1294。

程序B：也可以根据文献程序(Feng等人,2004)由N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)直接制备烯丙基2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷：在室温下向N-乙酰半乳糖胺(442mg,2mmol,1.0当量)在烯丙醇(8mL)中的溶液中加入BF₃.Et₂O(250μL，2mmol，1.0当量)，并将混合物在70℃下搅拌2小时。将溶液冷却至室温并减压除去溶剂。将干燥的粗产物溶于最低量的EtOH(5mL)中。在二异丙醚中沉淀期望的烯丙基T_N产物并作为白色固体分离(417mg,1.60mmol,80％)。

根据文献程序(Cipolla等人,2000)制备C-烯丙基GalNAc类似物(图5)[1-(2’-乙酰氨基-2’-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基)-2-丙烯]：在Zemplén条件(1M甲醇钠的甲醇溶液，5mL，pH 8-9)下处理3-(2-乙酰氨基-3,4,6-三-O-乙酰基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖基)-1-丙烯(Cui等人,1998)(371mg,1.00mmol,1.0当量)。将溶液在室温下搅拌1h。将反应混合物通过加入离子交换树脂(IR 120,H⁺)中和，过滤，用MeOH洗涤，并在减压下除去溶剂。通过硅胶色谱法(EtOAc/MeOH 9:1至4:1)纯化C-烯丙基T_N，随后在EtOH中结晶为白色固体(213mg，0.87mmol，87％)。Rf＝0.28；EtOH 4:1；mp 230℃(Litt.215-217℃,EtOAc/EtOH)；根据文献NMR数据:¹H NMR(CD₃OD,600MHz):δ5.81(m,1H,¹CH₂CH＝CH₂),5.08(dd,1H,J_trans＝17.2,J_gem＝1.7Hz,¹CH₂CH＝CH₂),5.02(dd,1H,J_cis＝10.2Hz,¹CH₂CH＝CH₂),4.22(dd,1H,J＝9.3,5.0Hz,H-2’),4.14(dt,1H,J＝10.0,5.0Hz,H-1’),3.91(dd,1H,J＝3.0Hz,H-4’),3.82-3.64(m,4H,H-3’,H-5’和H-6’ab),2.45(m,1H,H-1a),3.17(m,1H,H-1b)和1.97ppm(s,CH₃)；¹³C NMR(CD₃OD,150MHz):δ173.6(NHCO),136.2(¹CH₂CH＝CH₂),117.1(¹CH₂CH＝CH₂),72.9(C-1’),69.7(C-4’),69.5(C-3’和C-5’),61.8(C-6’),52.0(C-2’),32.4(¹CH₂)和22.5ppm(CH₃).ESI⁺-LCMS:C₁₁H₂₀O₅N的[M+H]⁺计算值,246.1336；实测值,246.1332；CAN/H₂O 5至95％1.4min。

根据文献Knapp等人,2002制备S-烯丙基GalNAc类似物(图5)。

实施例4：烯丙基2-乙酰氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(化合物 4)

参照图5，向烯丙基GalNAc(Tn)(2.35g，9.0mmol，1.0当量)和苯甲醛二甲基缩醛(6.75mL，45.0mmol，5.0当量)在无水DMF(20mL)中的溶液中加入催化量的对甲苯磺酸一水合物。将混合物在室温搅拌。5小时后，将混合物用CHCl₃稀释，并用饱和NaHCO₃水溶液洗涤。分离有机层并用水洗涤，经Na₂SO₄干燥，并浓缩，得到白色固体。通过在EtOAc/己烷中沉淀分离亚苄基乙缩醛(4)，为白色固体(2.64g,7.56,84％).Rf＝0.21；DCM/MeOH9.0:0.5；Fig.8A:¹H NMR(CDCl₃,300MHz):δ7.59-7.46(m,2H,H-ar),7.43-7.31(m,3H,H-ar),5.91(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.75(d,1H,J_NH,H2＝9.0Hz,NH),5.58(s,1H,PhCH),5.34-5.17(m,2H,OCH₂CH＝CH₂),5.01(d,1H,J_1,2＝3.5Hz,H-1),4.56-4.42(ddd,1H,J_2,3＝10.9Hz,J_2,OH＝9.1Hz,H-2),4.34(dd,1H,J_5,6a＝1.5Hz,J_6a,6b＝12.5Hz,H-6a),4.19(m,2H,H-4和OCH₂),4.04(m,1H,dd,1H,J_5,6b＝1.6Hz,J_6a,6b＝12.5Hz,H-6b),4.01(m,OCH₂),3.86(dd,1H,J_3,4＝10.9Hz,H-3),3.71(sb,1H,H-5),2.80(d,1H,J_3,OH＝10.7Hz,OH-3)和2.05ppm(s,3H,CH₃)；Fig.8B&8C:ESI⁺-HRMS:C₁₈H₂₄O₆N的[M+H]⁺计算值,350.1598；实测值,350.1608。

实施例5：烯丙基(2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰 氨基-4,6-O-亚苄基-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖苷(化合物6)

参照图5，在氮气氛下将化合物4(2.0g，5.72mmol，1.0当量)和氰化汞(2.17g，8.60mmol，1.5当量)溶解在含有分子筛的无水硝基甲烷-甲苯(100mL,3:2,v/v)的混合物中。将混合物在室温搅拌30分钟。将2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-α-D-吡喃半乳糖基溴化物(化合物5)(5.66g，8.58mmol，1.5当量)加入混合物中。将该溶液在70℃下搅拌5小时，然后在室温下继续搅拌过夜(8小时)。在由TLC(DCM/MeOH 9.0:0.5)指示的起始材料(化合物4)全部消耗完后，减压除去溶剂。将残余物溶解在EtOAc中，然后通过硅藻土垫过滤。滤液依次用10％碘化钾水溶液、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤，然后经Na₂SO₄干燥。减压蒸发溶剂，得到白色泡沫。将粗产物通过硅胶色谱法使用100％己烷至己烷/EtOAc 1:2的梯度纯化，得到期望的二糖(化合物6)，为白色固体(4.98,5.38mmol,94％).mp:110-111℃,Rf＝0.20；己烷/EtOAc 1:2；图9A和9B:¹H NMR(CDCl₃,600MHz):δ8.06-7.19(m,5H,H-ar),5.98(dd,1H,J_3,4’＝3.3Hz,J_4,5’＝1.0Hz,H-4^II),5.85-5.78(m,2H,OCH₂CH＝CH₂和H-2^II),5.60(dd,1H,J_2,3’＝10.2Hz,J_3,4’＝3.4Hz,H-3^II),5.48(sb,1H,NH),5.23(m,3H,OCH₂CH＝CH₂和H-1),4.68(dd,1H,J_5’,6a’＝6.9Hz,J_6a’,6b’＝11.4Hz,H-6a^I),4.63-4.58(m,1H,H-2),4.46-4.36(m,3H,H-4.H-5和H-6b^II),4.14-4.07(m,3H,H-6a,OCH₂和H-3),3.96(m,1H,OCH₂),3.75(m,1H,H-6b),3.51(m,1H,H-5)和1.40ppm(s,3H,CH₃)；¹³C NMR(CDC₁₃,150MHz):δ170.0(NHCO),166.0,165.5,165.4,165.2(CO),137.6-126.2(multi,30C-arom),133.2(OCH₂CH＝CH₂),117.8(OCH₂CH＝CH₂),102.0(C-1^II),100.9(CPhCH),97,3(C-1^I),76.1(C-3),75.4(C-4),71.7(C-3^II和C-5^II),70.2(C-2^II),69.1(C-6),68.6(OCH₂),68.1(C-4^II),62.9(C-5),62.6(C-6^I),48.2(C-2)和22.5ppm(CH₃).Fig.9C&9D:ESI⁺-HRMS:C₅₂H₅₀O₁₅N的[M+H]⁺计算值,928.3175；实测值,928.3133。

实施例6：烯丙基(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-α-D-吡喃半 乳糖苷(烯丙基TF)

参照图5，将化合物6(1.12g，1.20mmol，1.0当量)在甲醇中的1M甲醇钠(12mL，pH8-9)中的溶液在室温下搅拌直至起始材料消耗。1小时30分钟后，将溶液通过添加离子交换树脂(Amberlite IR 120,H⁺)中和，过滤，用MeOH洗涤，并且将溶液用硅胶混悬，过滤，并在减压下除去溶剂。将硅胶用100％EtOAc洗涤数次，然后用第二种溶液(EtOAc/MeOH/H₂O 1:1:0.1)洗涤。减压蒸发合并的滤液，得到中间体(化合物7)，为白色固体。Rf＝0.20；CHCl₃/MeOH/H₂O 11:6:1；图10A和10B:¹H NMR(D₂O,600MHz):δ7.47-7.39(m,2H,H-ar),7.37-7.26(m,3H,H-ar),5.82(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.61(s,1H,PhCH),5.20-5.09(m,2H,OCH₂CH＝CH₂),4.88(d,1H,J_1,2＝3.4Hz,H-1),4.47(dd,H-4),4.37-4.25(m,2H,H-2和H-1^II),4.13-3.98(m,4H,H-3,H-6a,H-6b,OCH₂),3.96-3.88(m,1H,H-5),4.56-4.42(ddd,1H,J_2,3＝10.9Hz,J_2,OH＝9.1Hz,H-2),4.34(dd,1H,J_5,6a＝1.5Hz,J_6a,6b＝12.5Hz,H-6a),4.19(m,2H,H-4和OCH₂),4.04(m,1H,dd,1H,J_5,6b＝1.6Hz,J_6a,6b＝12.5Hz,H-6b),4.01(m,OCH₂),3.86(dd,1H,J_3,4＝10.9Hz,H-3),3.71(sb,1H,H-5),2.80(d,1H,J_3,OH＝10.7Hz,OH-3)和2.05ppm(s,3H,CH₃)；3.83(s,1H,OCH₂),3.72(d,1H,J_3’,4’＝J_4’,5’＝3.2Hz,H-4^II),3.65-3.55(m,2H,H-6a,b),3.49,(m,1H,H-5^II),3.43(dd,1H,J_2’,3’＝10.0Hz,J_3’,4’＝3.3Hz,H-3^II),3.33-3.24(m,1H,H-2^II)和1.86ppm(s,3H,CH₃)；¹³C NMR(D₂O,150MHz):δ174.6(NHCO),136.8(C-arom),133.6(OCH₂CH＝CH₂),129.9,128.7,126.5(C-arom),118.0(OCH₂CH＝CH₂),104.9(C-1^II),101.3(CHPh),97.0(C-1),76.0(C-4),75.0(C-3),75.0(C-5^II),72.4(C-3^II),70.4(C-2^II),69.0(C-6),68.7(OCH₂CH＝CH₂),68.6(C-4^II),63.0(C-5),61.0(C-6^II),48.6(C-2)和22.0ppm(CH₃).Rf＝0.38；EtOAc/MeOH/H₂O 7:3:0.1；Rf＝0.46；ACN/MeOH/H₂O7:2:1.图10C和10D:ESI⁺-HRMS:C₂₄H₃₄O₁₁N的[M+H]⁺计算值,512.2126；实测值,512.2119。

然后将白色固体中间体溶解在10mL 60％乙酸水溶液中，并将所得溶液在60℃下搅拌1.5小时。减压除去溶剂，并将残余物冻干，得到最终的烯丙基TF，为白色固体(427mg,1.0mmol,84％).mp＝230-232℃；Rf＝0.53；CHCl₃/MeOH/H₂O 11:6:1；图11A和11B:¹H NMR(D₂O,600MHz):δ5.80(m,1H,OCH₂CH＝CH₂),5.19(dd,1H,J_trans＝17.3Hz,OCH₂CH＝CH₂),5.09(dd,1H,J_cis＝10.4Hz,OCH₂CH＝CH₂),4.77(d,1H,J_1,2＝3.7Hz,H-1),4.29(d,1H,J_1,2＝3.7Hz,H-1),4.29(d,1H,J_1,2＝7.8Hz,H-1^II),4.16(dd,1H,J_2,3＝11.2Hz,J_1,2＝3.7Hz,H-2),4.08-4.01(m,2H,H-4和OCH₂),3.92-3.82(m,3H,H-3,H-5和OCH₂),3.73(dd,1H,H-4^II),3.63-3.52(m,4H,H-6a,b和H-6’a,b),3.47(m,2H,H-3^II和H-5^II),3.39(dd,1H,J_2’,3’＝10.0Hz,J_1’,2’＝7.7Hz,H-2^II)和1.85ppm(s,3H,CH₃)；¹³C NMR(150MHz,CDC₁₃):δ174.6(NHCO),133.7(OCH₂CH＝CH₂),117.9(OCH₂CH＝CH₂),104.7(C-1^II),96.4(C-1),77.2(C-3),75.0(C-5^II),72.5(C-3^II),70.7(C-5),70.6(C-2^II),68.8(C-4),68.6(C-4^II),68.4(OCH₂),61.2(C-6^II),61.0(C-6),48.6(C-2)和22.0ppm(CH₃).图11C和11D:ESI⁺-HRMS:C₁₇H₂₉O₁₁NNa的[M+Na]⁺计算值,446.1633；实测值,446.1613。

实施例7：破伤风类毒素单体的纯化

在缀合之前，通过凝胶过滤色谱法获得破伤风类毒素(TT)单体。将一毫升含有4.5mg/ml蛋白质(通过改良的Lowry蛋白质测定法确定)的液体制剂上样到填充有制备级(E Healthcare Life Sciences,Uppsala,Sweden)的XK16-100柱中，该柱在PBS(20mM NaHPO₄[pH 7.2],150mM NaCl)中平衡，并且用相同的缓冲液洗脱。从柱上洗脱的蛋白质有两个峰：较早洗脱的峰包含低聚类毒素，而较晚洗脱的峰(对应于Mr为150,000)包含TT单体。合并对应于较晚(单体)峰的级分，用去离子水脱盐，使用Plus-70离心过滤器装置(30K Ultracel PL membrane；Millipore,Billerica,MA)浓缩，然后冻干。

实施例8：Tn-破伤风类毒素缀合物(Tn-TT缀合物)

程序A：在石英池中，向烯丙基Tn(0.15mg，0.56μmol，18.0当量)在500μL PBS中的溶液中加入1.5mL含有4.7mg(0.03μmol)破伤风类毒素的PBS。在氩气氛下脱气(degazing)后，将该溶液在254nm下辐照7小时。将溶液在双重蒸馏水的数次洗涤下透析24小时，并冻干，得到为白色固体的Tn-TT-A缀合物(2.0mg，43％)。程序B：在相同的巯基-烯点击反应下，将催化量的乙腈中的DMPA(100μL)加入PBS(2mL,4.5mg/mL,0.06μmol)中的含有破伤风类毒素的烯丙基Tn(3mg，10.8μmol，180.0当量)溶液中。将该溶液在365nm下辐照15分钟。然后将溶液透析24小时，并冻干，得到为白色固体的Tn-TT-B缀合物(5.4mg，61％)。

实施例9：TF-破伤风类毒素缀合物(TF-TT缀合物)

程序A：在石英池中，向烯丙基TF(0.24mg，0.56μmol，18.0当量)在500μL PBS中的溶液中加入1.5mL含有4.7mg(0.03μmol)破伤风类毒素的PBS。在氩气氛下脱气(degazing)后，将该溶液在254nm下辐照7小时。然后将溶液透析24小时，并冻干，得到为白色固体的TF-TT-A缀合物(2.1mg，45％)。程序B：在相同的巯基-烯点击反应下，将催化量的乙腈中的DMPA(100μL)加入烯丙基TF(5mg，10.8μmol，180.0当量)和破伤风类毒素在PBS(2mL,4.5mg/mL,0.06μmol)中溶液中。将该溶液在365nm下辐照15分钟。然后将溶液透析24小时，并冻干，得到为白色固体的TF-TT-B缀合物(5.3mg，60％)。

实施例10：Tn-TT和TF-TT缀合物的表征

通过进行以下分析了单独的破伤风类毒素(TT)和疫苗缀合物(Tn-TT-A；Tn-TT-B；TF-TT-A；和TF-TT-B)：SDS凝胶电泳，用于糖含量的存在的比色分析(Dubois测试)，通过Ellmann测试的巯基含量，动态光散射(DLS)(图12)，以及使用双向免疫扩散的与已知小鼠单克隆抗体JAA-F11的反应性。SDS凝胶电泳结果清楚地指示了缀合物的单体形式，其对于碳水化合物抗原(Tn和TF)的存在也呈阳性染色。比色分析(Dubois测试)证实了碳水化合物抗原的存在(按重量计10％)，并且在缀合之后在载体蛋白质上没有残留的游离巯基。双向免疫扩散分析显示出沉淀带，清楚地指示了新的TF-TT缀合物与抗TF单克隆抗体JAA-F11的交叉反应性，从而证实了TF-TT缀合物上免疫原性碳水化合物抗原(TF)的存在，使用单独载体蛋白质(破伤风类毒素)未观察到沉淀带。

缀合物的HPLC分析。通过尺寸排阻色谱法进行糖缀合物制剂的HPLC分析。用前面是SB-807G保护柱(Showa Denko)的三个串联连接的8x 300mm Shodex OHpak凝胶过滤柱(两个SB-804和一个SB-803)进行色谱分离。使用配备有差示折光仪(RI)检测器2300型和280nm波长的UV检测器2600型的Knauer Smartline系统，用0.1M NaNO₃以0.4mL/min的流速洗脱糖缀合物免疫原。使用50-μΛ注射环注射缀合物制剂(流动相中的8mg/mL溶液)。在选择的实验中，合并在空隙体积洗脱的级分，其对应于缀合物级分，用截留分子量(MWCO)为12,000至14,000[Spectrum Laboratories])的水Spectra/Por透析，并且冻干。这对应于2:1分级的缀合物。

实施例11：通过巯基-烯光反应缀合O-烯丙基糖对肽dTT831-844-Cys-βAla的游离 巯基的影响

将肽dTT831-844-Cys-βAla(破伤风毒素(831-844)；分子量：1813，SEQ ID NO:2)以3.7e-3M的浓度溶于水中，并且将(500uL)肽与(6uL，0.1M，3.0当量)O-烯丙基-Tn或O-烯丙基-TF和水溶性催化剂AAPH(2,2’-偶氮双(2-甲基丙腈，23uL，0.025M，3.0当量在石英比色皿(光程10x10毫米，Fisher)中在室温下搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV。在0、45、90和135分钟对溶液取样，并使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试测量游离巯基浓度。图13显示由于光巯基-烯反应，游离巯基浓度以时间依赖性方式降低。

实施例12：dTT831-844-Cys-βAla中半胱氨酸的定位/可及性以及所用活化剂的类 型对O-烯丙基-Tn的缀合和巯基-烯光反应产物的免疫反应性的影响

合成具有N末端或C末端半胱氨酸的肽dTT831-844，并将其以2mM(1mL)的浓度溶于水中，将其与200uL,0.1M,10当量)的O-烯丙基-Tn和催化量(0.2当量)的活化剂AAPH在石英比色皿(光程10x10毫米，Fisher)中在室温下搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入活化剂之后立即打开UV并使其反应60分钟。在时间0和60分钟使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试测量游离巯基浓度。游离巯基的减少倍数对应于t＝0/t＝60的巯基浓度。

结果示于图14中，其显示了在巯基-烯光反应缀合中使用水溶性活化剂(AAPH)或水不溶性活化剂(DMPA)的具有N末端(“SH-肽”)或C末端(“肽-SH”)半胱氨酸的dTT831-844肽的游离巯基浓度的减少倍数。

通过酶联凝集素测定法(ELLA)测量巯基-烯光反应产物的免疫反应性。使100μLPBSpH 7.4中的1μg肽吸附至96孔板(Maxisorp^TM,Nunc)，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用PBS-T+1％BSA封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(抗Tn VVA)或花生凝集素(抗TF PNA)(VVA-hrp,PNA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将孔用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,Thermo Scientific)。通过加入100μL0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于OD 450nm下读板。

结果显示在图15中，其显示了在使用水溶性活化剂(AAPH)或水不溶性活化剂(DMPA)的情况下凝集素对不同Tn肽(即，未缀合的：“肽-Cys”和“Cys-肽”；Tn缀合的：“Tn-肽”和“肽-Tn”；“unc”：未涂覆的板)的反应性。有趣的是，具有C末端半胱氨酸的TT肽被抗Tn凝集素VVA特异性识别，并且利用水溶性活化剂AAPH时缀合反应最有效。Tn糖缀合物均未被用作阴性对照的抗TF凝集素(花生凝集素，PNA)识别。

实施例13：波长对肽dTT831-844-Cys-βAla与O-烯丙基-Tn的巯基-烯光反应缀合 的影响

将肽dTT831-844-Cys-βAla(MW:1813，SEQ ID NO:2)与1mL水中的0.55mM O-烯丙基-Tn和(1.44mg，5.5nmol，10.0当量)AAPH或(0.3mg，1.1nmol，2.0当量)DMPA在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中在室温下搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV365nm或355nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV，并在(60min)后关闭以停止反应。还在不存在活化剂的情况下在UV254nm使肽与O-烯丙基-Tn缀合。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试测量游离巯基浓度。图16示出了对于三种不同的缀合条件(“355nm+AAPH”；“365nm+DMPA”和“254nm”)，游离巯基随时间(分钟)的减少。

通过酶联凝集素测定法(ELLA)测量巯基-烯光反应产物的免疫反应性。使100μLPBSpH 7.4中的指示量的肽吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，并将孔用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将孔用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

ELLA结果显示在图17中，其显示了在AAPH或DMPAP存在下在365nm，或者在不存在活化剂的情况下在254nm，VVA凝集素对多种量的通过巯基-烯光反应缀合的Tn肽的反应性。通过凝集素检测缀合产物，而未缀合的肽(“肽”)或单独的O-烯丙基-Tn(“Tn”)则没有反应。有趣的是，图17显示在不存在活化剂的情况下在254nm处的缀合产生的糖缀合物产物比在存在活化剂的情况下365nm或355nm产生的糖缀合物产物具有更高的免疫反应性。

实施例14：C-烯丙基糖和O-烯丙基糖通过巯基-烯光反应与肽dTT831-844-Cys-β Ala的缀合和反应性

将dTT831-844-Cys-βAla肽(MW:1813)以0.55mM的浓度溶解于水中，并将其1mL与O-烯丙基-Tn、O-烯丙基-TF或C-烯丙基-Tn(100uL，11mM，2.0当量)和AAPH(1.44mg，5.5nmol，10.0当量)在石英比色皿(光程10x10mm，Fisher)中在室温下搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV。在指定的时间对溶液取样，并使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试测量游离巯基浓度。图18显示了测试的不同烯丙基糖的游离巯基随时间(分钟)的减少：O-烯丙基-Tn(“Tn”)、O-烯丙基-TF(“TF”)或C-烯丙基-Tn(“cTn”)。

通过酶联凝集素测定法和酶联免疫吸附测定法测量巯基-烯光反应产物的免疫反应性。使100μL PBS pH 7.4中的指示量的肽缀合物吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用PBS-T+1％BSA封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素或花生凝集素(VVA-hrp,PNA-hrp,EY LAbs)的100μL1/100稀释液或用0.1μg/ml纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将含有JAAF11的孔用PBS-T洗涤，然后与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)进一步孵育60分钟。然后将孔用PBS-T清洗4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

图19显示抗-Tn凝集素VVA仅识别由O-烯丙基-Tn(而不是由C-烯丙基-Tn)产生的肽缀合物。这些结果表明，虽然与肽缀合，但C-烯丙基-Tn不具有允许与凝集素结合的构象。

实施例15：O-烯丙基TF通过巯基-烯光反应与化学还原的dTT缀合

将解毒的破伤风类毒素(dTT)在PBS pH 7.4(MWCO 2,000)中透析，然后与1000eqDTT孵育。在室温旋转孵育2小时后，将还原的蛋白质溶液通过离心过滤(MWCO 10,000，Amicon)在PBS pH 7.4中洗涤。然后将还原的蛋白质(1mL，3.51mg/mL，0.02nmol)在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中与终体积为1.0mL的PBS中的O-烯丙基-TF(30.0当量)和AAPH(2.0当量)一起搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH后立即打开UV以引发反应，然后在2小时后停止。

使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试在缓冲交换的dTT样品上测量与天然dTT相比通过DTT处理产生的还原dTT的游离巯基浓度，并且使用BSA标准曲线通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。

为了测量dTT样品的免疫反应性，将1μg蛋白样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用100μL 0.1μg/mL纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将板用PBS-T洗涤，然后再与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)的100μL的1/1000稀释液孵育60分钟。然后将孔用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA，ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

图20显示了dTT-TF对JAAF11(“dTT(DTT)-TF”)的免疫反应性，而还原的dTT(“dTT(DTT)”)或天然dTT(数据未显示)没有反应性。这表明O-烯丙基-TF确实通过巯基-烯光反应以免疫反应构象与dTT缀合。

实施例16：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与化学还原的dTT缀合

将dTT在PBS pH 7.4(MWCO 30,000)中透析，然后将0.5mL(5.8mg/mL)与50或500eqDTT在室温下旋转孵育。2小时后，将还原的蛋白质溶液通过离心过滤(MWCO10,000，Amicon)在PBS pH 7.4中洗涤。然后将用500eq DTT还原的蛋白质(70uL，0.5mmol/mL)与0.1M O-烯丙基-TF(60.0当量)和0.1M AAPH(4.0当量)在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应，然后在45分钟后停止。为了验证还原的dTT的游离巯基是因缀合而形成了具有抗还原性的硫醚键，还是被重新氧化为二硫键，将缀合产物用100Eq的DTT处理1小时，然后通过离心过滤洗涤，然后在还原处理之前和之后测量巯基含量。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测试测量游离巯基剂量。使用BSA标准曲线通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。

图21显示了不同缀合条件之后dTT中游离巯基的摩尔比。结果表明，dTT蛋白以剂量依赖性方式被还原，并且在用500Eq DTT处理之后，达到9个游离巯基(在dTT中最大10个半胱氨酸的理论值中)。通过巯基-烯光反应与O-烯丙基-Tn或O-烯丙基-TF缀合将游离巯基降低至等于或低于未还原的dTT的水平。dTT-Tn缀合物对还原的抗性证实了由巯基-烯光反应形成的抗还原性硫醚键的存在。

为了测量dTT样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素或花生凝集素(VVA-hrp,PNA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液或用0.1μg/ml纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将含有JAAF11的孔用PBS-T洗涤，然后再与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)的100μL1/1000稀释液进一步孵育60分钟。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将板用PBS-T洗涤4次，然后向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA，ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

图22显示了与未缀合的dTT相比，dTT-Tn缀合物对凝集素VVA的高反应性。

通过在10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE电泳然后用考马斯亮兰染色来分析天然dTT和dTT-Tn缀合物。凝胶电泳结果表明，dTT-Tn缀合物以比天然非缀合dTT高的分子量迁移(数据未显示)。

实施例17：AAPH浓度对O-烯丙基-Tn与化学巯基化的dTT通过巯基-烯光反应性的 缀合的影响

将dTT在PBS pH 8(MWCO 30,000)中透析，然后将100μL(0.8mg)与200Eq/蛋白质的水中的0.1M 2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(Sigma)、200Eq/蛋白质的水中的0.1M O-烯丙基-TF和0.8Eq/蛋白质或约450Eq/蛋白质的水中的AAPH以124μL的终体积在石英比色皿(光程10x10mm，Fisher)中搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。在光反应过程中的15分钟以及45分钟的反应完成时回收样品。使用Sephadex^TM G25-填充的mini-spin柱通过尺寸排阻色谱法将缀合产物缓冲交换至PBS pH 7.4。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量游离巯基浓度。通过使用BSA作为标准品的Bradford测定法测量蛋白质浓度。

图23显示了在用2-亚氨基硫杂环戊烷进行化学巯基化和在不存在O-烯丙基-Tn的情况下进行巯基-烯光反应后的dTT样品中游离巯基的比例达到25-30，而O-烯丙基-Tn的存将dTT的巯基比例以与AAPH浓度有关的剂量依赖性方式降低至约20和5，表明巯基-烯光反应形成了硫醚键。

为了测量dTT样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将板用PBS-T洗涤4次，然后向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

图24显示了dTT样品对凝集素VVA-hrp的反应性。观察到与天然未缀合的dTT相比，Tn缀合物的更高反应性。此外，反应性与光反应的持续时间和所使用的AAPH活化剂的量相关。

通过10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE电泳分析dTT缀合物(5μg)，该凝胶用考马斯亮蓝染色或转移到膜(Immobilon-P，Merck Millipore)上进行western印迹分析。将膜在PBS-T+1％BSA中封闭1小时，用PBS-T洗涤，然后用PBS-T中的与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp，EY LAbs)的1/100稀释液孵育，在室温下1小时或在4℃过夜。然后将膜用PBS-T充分洗涤，并用辣根过氧化物酶显色底物4-氯1-萘酚(在含有0.03％过氧化氢的PBS中的0.3mg/mL，Sigma)检测结合的VVA-hrp。考马斯染色的SDS-PAGE和用VVA-hrp染色的相应的Western印迹两者的结果表明，dTT-Tn以比天然dTT更高的分子量迁移，并且对VVA具有特异性反应性，表明产物确实与Tn缀合(数据未显示)。

实施例18：O-烯丙基-Tn和O-烯丙基-TF与化学还原的BSA通过巯基-烯光反应的缀 合

将BSA(7mg在1mL PBS中，pH 7.4)与600eq的DTT孵育2小时，然后通过离心过滤(MWCO 10,000，Amicon)在PBS pH 7.4中洗涤。然后使还原的蛋白质通过巯基-烯光反应与O-烯丙基-Tn或与O-烯丙基-TF缀合。将还原的BSA(600uL，5.3mg/mL，0.047nmol)与O-烯丙基糖(60eq)和AAPH(4.0当量)和PBS pH 7.4(720uL)在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher))中搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。45分钟后，通过离心过滤(MWCO 10,000，Amicon)用PBS pH 7.4洗涤产物，以除去任何未反应的O-烯丙基和试剂。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量还原的BSA的游离巯基浓度，并且使用BSA作为标准品通过Bradford测定法测量蛋白浓度。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素或花生凝集素(VVA-hrp,PNA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液或用0.1μg/ml纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将含有JAAF11的孔用PBS-T洗涤，然后再与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)进一步孵育60分钟。然后将孔用PBS-T清洗4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA，Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(BiotekEL808)中于450nm读板。

图25显示了在这些条件下产生的BSA-TF和BSA-Tn分别对抗TF JAAF11单克隆抗体和抗Tn凝集素VVA具有高反应性和特异性。

通过考马斯亮蓝染色的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE电泳分析BSA-Tn缀合物和BSA-TF缀合物(5μg)。通过Ellman测试测量在所用条件下BSA的还原产生19.29巯基的摩尔比。与任一O-烯丙基糖缀合后，Ellman测试为阴性，表明游离巯基通过巯基-烯光反应与O-烯丙基糖化学偶联(数据未显示)。考马斯染色的SDS-PAGE凝胶显示出两种BSA-缀合物均以预期的BSA分子量迁移到较高分子量的物种(数据未显示)。

实施例19：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与化学还原的BSA缀合

将BSA(500μL，7mg/mL)与400、200或1000Eq的DTT(0.5M)在室温下旋转孵育1小时。然后将还原的BSA溶液在PBS pH 7.4中透析过夜。然后使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量还原的BSA的游离巯基浓度，并且使用BSA作为标准品通过Bradford测定法测量蛋白质浓度，由此计算出游离巯基/BSA的摩尔比。

图26显示了产生的游离巯基的量与还原剂DTT的量之间的相关性，当在所用条件下用1000Eq DTT进行还原时，达到约10巯基/BSA。

然后使还原的蛋白质与多种比例的O-烯丙基-Tn缀合。将还原的BSA(5nmol)与100Eq的O-烯丙基-Tn/还原的BSA或100Eq的O-烯丙基-Tn/BSA-巯基和AAPH和PBS pH 7.4以500μL的终体积在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。45分钟后，通过离心过滤(MWCO 10,000，Amicon)用PBS pH 7.4洗涤产物，以除去未反应的O-烯丙基和试剂。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp,EYLAbs)的100μL 1/100稀释液或用0.1μg/ml纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将含有JAAF11的孔用PBS-T洗涤，然后再与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)进一步孵育60分钟。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将板用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100ul hrp底物(Ultra TMB-ELISA，Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm读板。

图27显示了多种BSA-Tn缀合物对凝集素VVA和抗TF单克隆抗体JAAF11(+山羊抗小鼠IgG-hrp缀合物)的反应性。由于巯基-烯光反应，发现以最高O-烯丙基比例缀合的两种BSA-缀合物对VVA具有特异性高反应性。

在用考马斯亮蓝染色或根据制造商的说明书(Pierce)针对糖蛋白染色的10％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE电泳分析BSA-Tn缀合物(5μg)。结果表明，以高分子量迁移的BSA缀合物对聚糖染色为阳性，而天然未缀合的BSA没有(数据未显示)。

实施例19：O-烯丙基-TF通过巯基-烯光反应与化学巯基化的BSA缀合

将BSA(1mL，0.088μmol，5.89mg/mL，PBS pH 8.0)与5、10或20Eq的2-亚氨基硫杂环戊烷(5,10,20μL,0.1mmol/mL)孵育1小时。然后通过离心过滤(MWCO 10,000，Amicon)洗涤巯基化的BSA以除去未反应的试剂，然后通过巯基-烯光缀合与O-烯丙基-TF缀合。将巯基化BSA(440；480；575μL,6.8；6.4；5.2mg/mL)与3eq/巯基的O-烯丙基-Tn和AAPH(0.2Eq/巯基)和PBS pH 7.4以1mL的终浓度在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中搅拌，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。1小时后，通过离心过滤(MWCO10,000，Amicon)用PBS pH 7.4洗涤产物，以除去未反应的O-烯丙基和其它试剂。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量BSA样品的游离巯基浓度，并且使用BSA作为标准品通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的凝集素花生凝集素(PNA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液或用0.1μg/ml纯化的TF特异性鼠单克隆抗体JAAF11填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将含有JAAF11的孔用PBS-T洗涤，然后再与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)进一步孵育60分钟。然后将孔用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA，Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm下读板。

在图28中，双轴图显示了BSA-TF缀合物对抗TF凝集素PNA或mAb JAAF11的反应性，其与TF缀合之前测得的各个缀合物的巯基比例相关。这些结果表明，用巯基化程度最高的BSA检测到JAAF11反应性。

实施例20：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与化学巯基化的BSA缀合

将BSA(250μL，4.3mg/mL)在存在或不存在200Eq的0.1M O-烯丙基-Tn和约450EqAAPH和PBS pH 8的情况下与200eq的0.1M 2-亚氨基硫杂环戊烷(Sigma)以316μL的终体积在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中孵育，所述石英比色皿放置在距离比色皿2-5cm的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。在反应期间的指定时间取样。45分钟后终止反应，然后使用Sephadex^TM G25mini spin柱通过凝胶过滤色谱法将产物缓冲交换至PBS pH 7.4。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量BSA样品的游离巯基浓度，并且使用BSA作为标准品通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。

图29显示了在BSA与单独的或365nm光存在下的2-亚氨基硫杂环戊烷反应之后游离巯基官能团的时间依赖性增加，而在存在或不存在O-烯丙基-Tn的情况下在光反应中添加AAPH阻止了可检测的游离巯基的形成。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶(VVA-hrp,EY LAbs)偶联的长柔毛野豌豆凝集素的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将孔用PBS-T洗涤4次，然后向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm读板。

在图30中，BSA缀合物对凝集素VVA的反应性表明，仅在O-烯丙基-Tn存在下由巯基-烯光反应产生的BSA被VVA检测到，而在不存在O-烯丙基-Tn的情况下产生产物在ELLA中为阴性。这些结果表明，在不存在O-烯丙基糖的情况下，AAPH和UV365nm光催化游离二硫化物再氧化为二硫化物，其与O-烯丙基-Tn存在下硫醚键的形成进行竞争。

实施例21：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与化学巯基化的BSA缀合

将BSA(250μL，4.3mg/mL)与200Eq的0.1M 2-亚氨基硫杂环戊烷(Sigma)、200Eq的0.1M O-烯丙基-Tn以及0.8Eq的AAPH或约450Eq的AAPH和PBS pH8以316μL的终体积在石英比色皿(10x10mm光程，Fisher)中孵育。在含有大量AAPH的条件下测试了抗氧化剂维生素C(约5mM)对缀合的影响。将比色皿放置在距离比色皿2-5cm处的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。在反应期间的指定时间取样。45分钟后终止反应，然后使用Sephadex^TM G25mini spin柱通过凝胶过滤色谱法将产物缓冲交换至PBS pH 7.4。使用半胱氨酸标准曲线通过Ellman测定法测量缀合的BSA样品的游离巯基浓度，并且使用BSA作为标准品通过Bradford测定法测量蛋白质浓度。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将孔用PBS-T洗涤4次，然后向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm读板。

具有双Y轴的图31显示了作为时间的函数，缀合产物对凝集素VVA的反应性增加，并且由于O-烯丙基-Tn与BSA的巯基-烯光缀合，游离巯基相应减少。这些结果表明，在较高浓度的AAPH下反应更有效。在维生素C存在下产生的产物对VVA凝集素不反应(未显示)。

通过考马斯亮蓝染色的10％聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE电泳分析BSA-Tn缀合物(5微克)。结果表明，在高AAPH下的反应中高分子量物质的量高于在较低AAPH下的反应。维生素C阻止了高分子量物质的形成(数据未显示)。

实施例22：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与BSA缀合是蛋白质巯基化的函数

将BSA(93μL，11.7mg/mL)与200Eq的0.1M 2-亚氨基硫杂环戊烷(Sigma)、200Eq的0.1M O-烯丙基-Tn和0.08Eq、0.8Eq或约450Eq的AAPH和PBS pH8以316μL的终浓度在石英比色皿(光程为10x10mm，Fisher)中孵育。在一些样品中，省略了2-亚氨基硫杂环戊烷和/或AAPH并用PBS pH 8代替。将比色皿放置在距离比色皿2-5cm处的两个手持式UV 365nm或UV254nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。45分钟后终止反应，然后使用Sephadex^TM G25mini spin柱通过凝胶过滤色谱法将产物缓冲交换至PBS pH 7.4。通过使用BSA作为标准品的Bradford测定法测量蛋白质浓度。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将孔用PBS-T洗涤3次，并用与辣根过氧化物酶偶联的长柔毛野豌豆凝集素(VVA-hrp,EY LAbs)的100μL 1/100稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，将孔用PBS-T洗涤4次，然后向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA,ThermoScientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm读板。

图32显示了当在不存在蛋白质巯基化的情况下进行缀合时或者当在不存在活化剂AAPH的情况下使硫醇化蛋白质缀合时，产物对VVA具有最小的反应性。但是，在不存在蛋白质巯基化和AAPH的情况下，通过UV254nm产生了VVA反应产物。

实施例23：在高缀合率下不存在BSA-TF反应性

在存在或不存在200Eq的0.1M 2亚氨基硫杂环戊烷(Sigma)、200Eq的0.1M O-烯丙基-TF和0.8Eq或约450Eq AAPH和PBS pH8的情况下，将BSA(93μL，11.7mg/mL)以316μL的终体积在石英比色皿中(光程10x10mm，Fisher)中孵育，所述比色皿在室温下的工作台上或放置在距离比色皿2-5cm处的两个手持式UV 365nm灯(0.16安培，VWR)之间。加入AAPH之后立即打开UV以引发反应。45分钟后终止反应，然后使用Sephadex^TM G25mini spin柱通过凝胶过滤色谱法将产物缓冲交换至PBS pH 7.4。通过使用BSA作为标准品的Bradford测定法测量蛋白质浓度。使用半乳糖标准品通过Dubois方法测量TF表位的缀合的半乳糖。

为了测量BSA样品的免疫反应性，将1μg蛋白质样品稀释到100μL PBS pH 7.4中，并使其吸附至96孔板(Maxisorp，Nunc)的孔，在室温下持续最少1小时或在4℃下持续过夜。然后将孔用PBS-吐温^TM 0.05％(PBS-T)洗涤两次，然后用封闭溶液填充30分钟。然后将这些孔用PBS-T洗涤3次，并用抗TF单克隆抗体JAAF11的100μL 0.1μg/mL稀释液填充。在室温下轻轻摇动孵育1小时或在4℃孵育12小时之后，然后将孔用PBS-T洗涤4次，并且与二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)-hrp(Jackson Immunoresearch)的100μL 1/1000稀释液进一步孵育60分钟。然后将孔用PBS-T洗涤4次，并向每个孔中加入100μL hrp底物(Ultra TMB-ELISA，Thermo Scientific)。通过加入100μL 0.5N硫酸终止反应，并在酶标仪(Biotek EL808)中于450nm读板。

具有双Y轴的图33显示了与较低的半乳糖缀合物相比，具有高的半乳糖比的BSA-TF的较低的免疫反应性。两种缀合物中半乳糖的检测证实了TF与BSA缀合，但是在高比例下缀合的TF免疫反应性降低。

实施例24：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与肽dTT831-844-Cys-(Tn)-βAlaBSA 缀合

图34显示了分别在C-末端和N-末端具有半胱氨酸残基的dTT831-844-Cys-βAla和Cys-dTT831-844-βAla的化学结构，以及它们的列表LC-MS数据。

图35显示了肽dTT831-844-Cys-βAla(C-末端)的详细LC-MS数据。

图36显示了肽Cys-dTT831-844-βAla(N-末端)的详细LC-MS数据。

程序A：在UV比色皿中向肽的水溶液(1mL，2mM)中加入O-烯丙基-Tn的H₂O溶液(200μL，0.1M，10当量)和催化量的AAPH。将混合物在室温下在365nm辐照下搅拌60分钟。Ellman的测试表明反应在45分钟内完成。然后将溶液冻干以提供白色粉末，并且LC-MS显示存在期望的Tn缀合的肽。LC-MS:C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀S的[M]计算值,2089.0653；实测值,2089.0780；CAN/H₂O 5至95％5.08min。

程序B在有机溶剂中：dTT831-844-Cys-(Tn)-βAla(图34)。在UV比色皿中向肽的MeOH溶液(1mL，2mM)中加入Tn的H₂O溶液(200μL，0.1M，10当量)和催化量的DMPAP。将混合物在室温下在365nm辐照下搅拌60分钟。Ellman的测试表明反应在45分钟内完成。然后将溶液冻干以提供白色粉末，并且LC-MS表明存在期望的肽-TN。LC-MS:C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀S的[M]计算值,2089.0653；实测值,2089.0675；CAN/H₂O 5至95％5.07min。

图37显示了C末端肽dTT831-844-Cys-βAla上的O-烯丙基Tn的光解AAPH催化的巯基-烯反应。

图38显示了C末端肽上O-烯丙基Tn的LC-MS谱。

实施例25：O-烯丙基-Tn通过巯基-烯光反应与肽Cys-(Tn)-dTT831-844-βAla缀合

程序A：在UV比色皿中向肽Cys-(Tn)-dTT831-844-βAla(图33)的水溶液(2mL，0.482mM)中加入Tn的H₂O溶液(100μL，0.1M，10当量)和催化量的AAPH。将混合物在室温下在365nm辐照下搅拌60分钟。Ellman的测试表明，反应可在45分钟内完成。然后将溶液冻干以提供白色粉末，并且LC-MS显示存在期望的肽-Tn缀合物。LC-MS：C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀S的[M]计算值，2089.0653；实测值：2089.0719；CAN/H₂O5至95％5.11min。

程序B：Cys-(Tn)-dTT831-844-βAla(图33)。在UV比色皿中向肽的甲醇溶液(2mL，0.482mM)中加入Tn的H₂O溶液(100μL，0.1M，10当量)和催化量的DMPA。将混合物在室温下在365nm辐照下搅拌60分钟。Ellman的测试表明，反应可在45分钟内完成。然后将溶液冻干以提供白色粉末，并且LC-MS显示存在期望的肽-Tn。LC-MS：C₉₄H₁₅₂O₃₁N₂₀S的[M]计算值：2089.0653；实测值：2089.0817；CAN/H₂O5至95％5.10min。

图39显示了N末端肽Cys-dTT831-844-βAla上的O-烯丙基Tn的光解AAPH催化的巯基-烯反应。

图40显示了N-末端肽上的O-烯丙基Tn的详细LC-MS谱。

参考文献：

Cipolla et al.，“Stereoselective synthesis of α-C-glycosides of N-acetylgalactosamine”，Tetrahedron Asymm.(2000)，11：295-303.

Cui et al.，“Stereocontrolled allylation of 2-amino-2-deoxy sugarderivatives by a free-radical procedure”，Carbohydr.Res.，(1998)，309：319-330.

Danishefsky et al.，“Development of Globo-H Cancer Vaccine”，Acc.ChemRes.，(2015)，48(3)：643-652.

Demian et al.，“Direct targeted glycation of the free sulfhydryl groupof cysteine residue(Cys-34)of BSA.Mapping of the glycation sites of the anti-tumor Thomsen-Friedenreich neoglycoconjugate vaccine prepared by Michaeladdition reaction，”J.Mass Spectrom.，(2014)，49：1223-1233.

Dondoni et al.，“A new ligation strategy for peptide and proteinglycosylation：Photoinduced thiol-ene coupling”，Chem.Eur.J.，(2009)，15：11444-11449.

Dondoni et al.，“Recent applications in thiol-ene coupling as a clickprocess for glycoconjugation”，Chem.Soc.Rev.，(2012)，41：573-586.

Feng et al.，“Chemo-enzymatic synthesis of fluorinated 2-N-acetamidosugar nucleotides using UDP-GlcNAc pyrophosphorylase”，Org.Biomol.Chem.(2004)，2：1617-1623.

Heimburg et al.，“Inhibition of spontaneous breast cancer metastasisby anti-Thomsen-Friedenreich antigen monoclonal antibody JAA-F11.”，Neoplasia，(2006)8(11)：939-48.

Knapp et al.，“Synthesis of α-GalNAc Thioconjugates from an α-GalNAcMercaptan”，J.Org.Chem.(2002)，67：2995-2999.

Papadopoulos，“Diazo transfer and click chemistry in the solid phasesyntheses of lysine-based glycodcndrimcrs as antagonists against Escherichiacoli FimH.”Molecular Pharmaceutics(2012)，9(3)：394-403.

Rittenhouse-Diakun et al.，“Development and characterization ofmonoclonal antibody to T-antigen：(gal betal-3GalNAc-alpha-O)”，Hybridoma，(1998)，17：165-173.

Tati et al.，“Humanization of JAA-F11，a Highly Specific Anti-Thomsen-Friedenreich Pancarcinoma Antibody and InVitro Efficacy Analysis.”，Neoplasia，(2017)，19(9)：716-733.

序列表

<110> 科纳克斯资本（KORANEX CAPITAL）

<120> 作为治疗工具的精确糖缀合物

<130> 18513-3

<140> 待指定

<141> 2019-03-22

<150> US 62/647,151

<151> 2018-03-23

<160> 2

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 破伤风梭菌（Clostridium tetani）

<400> 1

Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dTT831-844-Cys-beta-Ala

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> 乙酰化

<220>

<221> MOD_RES

<222> (16)..(16)

<223> bAla

<400> 2

Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Ala

1 5 10 15

Claims (23)

1.用于产生糖缀合物免疫原的方法，所述方法包括：

(a)提供与末端烯烃共价连接的碳水化合物抗原(烯基碳水化合物抗原)，所述末端烯烃通过巯基-烯反应直接可缀合至巯基，其中所述烯基碳水化合物抗原是未受保护的水溶性烯基碳水化合物抗原；

(b)提供具有一个或多个游离巯基的载体蛋白质；和

(c)进行光催化巯基-烯反应，以使所述碳水化合物抗原直接缀合至所述载体蛋白质的所述一个或多个游离巯基处，从而产生糖缀合物免疫原，其中所述光催化巯基-烯反应：

(i)在6至8的pH下进行；

(ii)在避免载体蛋白质变性和/或保留所述载体蛋白质的活性、抗原性和/或结构的反应条件下进行；和

(iii)在不存在任何有机溶剂的情况下进行，或在浓度足够低以避免载体蛋白质变性的有机溶剂的存在下进行，

其中所述载体蛋白质在施用于受试者后具有免疫原性，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述碳水化合物抗原与所述载体蛋白质的缀合增加了所述碳水化合物抗原在施用于所述受试者后的免疫原性，并且

其中所述碳水化合物抗原包含B细胞表位并且在所述受试者中诱导体液免疫应答。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在6.5至7.5的pH下进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应在催化剂的存在下进行。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述催化剂是水溶性催化剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述水溶性催化剂是水溶性自由基生成偶氮化合物；2,2’-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(Vazo 44或VA-044)；2,2’-偶氮双(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)；具有光引发活性的金属或金属离子；过氧化物；叔丁基过氧化氢；过氧化苯甲酰；过硫酸铵；或其具有光引发活性的任何衍生物。

6.根据权利要求3所述的方法，其中所述催化剂是水不溶性催化剂。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述水不溶性催化剂是水不溶性自由基生成偶氮化合物、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(DMPA)、偶氮二异丁腈(AIBN)、2,2′-偶氮双(2-甲基丙腈)、4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)(ACVA)、1,1'-偶氮双(氰基环己烷)(ACHN)、二氮烯二羧酸双(N,N-二甲基酰胺)(TMAD)；偶氮二羧酸二胡椒脂(ADD)或其具有光引发活性的任何衍生物。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括在短波或长波紫外光下的辐照。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应包括所述载体蛋白质的每个游离巯基与1至200摩尔当量的所述烯基碳水化合物抗原反应；和/或其中所述光催化巯基-烯反应进行10至300、10至270、10至240，10至210、10至180、10至150、10至120、10至90、10至60、或10至30分钟，和/或持续足够的时间以实现所述载体蛋白质中的总游离巯基浓度降低至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50倍。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在与所述载体蛋白质缀合之后，所述碳水化合物抗原不能被所述受试者的内源酶从所述载体蛋白质上切割。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述烯基碳水化合物抗原与所述末端烯烃共价连接，和/或所述碳水化合物抗原通过O-糖苷键、S-糖苷键、N-糖苷键或C-糖苷键或通过烯丙基胺和还原糖之间的还原胺化获得的键与所述载体蛋白质缀合。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳水化合物抗原是或包含肿瘤相关碳水化合物抗原(TACA)、病毒多糖抗原、或细菌荚膜多糖(CPS)。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述TACA是、来自或包含：Tn、S-Tn、Thomsen-Friedenreich(TF)、(2,3)-S-TF、(2,6)-S-TF、Globo H、GD2、GD3、GM2、GM3、N-乙醇酰-GM3、Lea、sLea、Lex、sLex或其任何组合；并且其中所述细菌CPS是、来自或包含肺炎球菌的和/或链球菌的多糖血清型、脑膜炎球菌CPS或流感CPS。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述光催化巯基-烯反应将至少两个相同碳水化合物抗原或超过一种类型的碳水化合物抗原缀合至所述载体蛋白质，从而产生多价糖缀合物免疫原。

15.根据权利要求1所述的方法，其中(a)中的所述碳水化合物抗原通过接头与所述末端烯烃连接。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体蛋白质包含具有一个或多个游离巯基的一个或多个半胱氨酸残基，或被工程化改造以在所述载体蛋白质的氨基末端、羧基末端或溶剂可及位置添加一个或多个另外的半胱氨酸残基。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体蛋白质包含人T细胞表位，和/或在所述受试者中诱导细胞介导的免疫应答。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体蛋白质是、来自或包含：破伤风类毒素(TT)、白喉类毒素(DT)、交叉反应材料197(CRM197)、脑膜炎球菌的外膜蛋白复合物(OMPC)、流感嗜血杆菌D蛋白(HiD)、细胞因子、免疫原性肽，破伤风毒素831-844(SEQ ID NO:1或2)、白蛋白，或其免疫原性片段。

19.合成糖缀合物免疫原，由权利要求1至18中任一项所述的方法制备，包含一个或多个碳水化合物抗原和具有一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基的免疫原性载体蛋白质，其中所述一个或多个碳水化合物抗原连接在所述免疫原性载体蛋白质的所述一个或多个溶剂可及的半胱氨酸残基处，并且其中与施用未缀合的碳水化合物抗原相比，所述一个或多个碳水化合物抗原与所述免疫原性载体蛋白质的缀合增加了所述一个或多个碳水化合物抗原在施用于受试者后的免疫原性。

20.根据权利要求19所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述合成糖缀合物免疫原是：

(a)合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：

-SA是糖抗原或其一部分；

-S-PC是载体蛋白质；

-X是O、S、NR₁或CH₂；

-R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；并且

-R₂是H或Me，或

(b)合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中每个接头具有以下结构或其立体异构体：

其中：

-SA是糖抗原或其一部分；

-S-PC是载体蛋白质；

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1，或

(c)合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由一种或多种糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自一个或多个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z是至少1且至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是O、S、NR₁或CH₂；

-R₁是-H、-COH、-COCH₃或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；并且

-R₂是H或Me；并且

当y大于1时，L相同或不同，或

(d)合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自z个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中：

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同，或

(e)合成糖缀合物免疫原，包含通过接头与载体蛋白质的一个或多个游离巯基共价连接的一个或多个糖抗原，其中所述合成糖缀合物免疫原具有以下结构或其立体异构体：

其中

-y是至少1；

-SA选自由糖抗原或其免疫原性部分组成的组，并且当y大于1时，SA相同或不同；

-[S]_z-PC是具有源自z个游离巯基的一个或多个硫原子的载体蛋白质；

-z至少等于y；并且

-L是接头，选自由具有以下结构的接头组成的组：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；

-r是1、2、3、4或5；

-R₅是S-PC、共价键或具有以下结构的基团：

其中R₃和R₄各自是氢原子且m是1、2、3、4或5，或者R₃和R₄一起形成基团-CO-CH₂-或基团-CO-CH₂-CH₂-，其中羰基连接至氮原子，并且m是1；并且

当y大于1时，L相同或不同。

21.根据权利要求20所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述合成糖缀合物免疫原(e)的所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1、2、3、4或5。

22.根据权利要求20所述的合成糖缀合物免疫原，其中所述合成糖缀合物免疫原(e)的所述接头具有以下结构：

其中

-X是S、NR₁、CH₂或O；

-R₁是-H、-COH、-COMe或-COEt；

-n是1、2、3、4或5；

-R₂是H或Me；

-q是1、2、3、4或5；并且

-r是1或2。

23.糖缀合物疫苗，包含权利要求19至22中任一项所述的合成糖缀合物免疫原和药学上可接受的赋形剂和/或佐剂。