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CN111601771A - 颗粒材料的生产方法 - Google Patents

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CN111601771A
CN111601771A CN201880086504.6A CN201880086504A CN111601771A CN 111601771 A CN111601771 A CN 111601771A CN 201880086504 A CN201880086504 A CN 201880086504A CN 111601771 A CN111601771 A CN 111601771A
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CN
China
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nanoparticles
monomer
hollow inorganic
composition
inorganic nanoparticles
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Application number
CN201880086504.6A
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余承忠
宋浩
格雷厄姆·沃勒尔
林恩·唐隆
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N4 Pharma UK Ltd
Original Assignee
N4 Pharma UK Ltd
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Abstract

本发明提供了一种制备多个空心无机纳米颗粒的方法，该方法包括：(a)使第一单体和第二单体在溶剂中接触，以制备包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物；(b)将无机化合物前体添加到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物；(c)将额外量的所述第一单体和第二单体添加到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个复合纳米颗粒的组合物；和(d)加热所述多个复合纳米颗粒以产生所述多个空心无机纳米颗粒；其中，在步骤(a)中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在至少30℃的温度下接触。本发明还涉及多个空心无机纳米颗粒及其用途。

Description

颗粒材料的生产方法
技术领域
本发明涉及一种生产多个空心无机纳米颗粒的方法。本发明还涉及多个空心无机纳米颗粒，包括所述纳米颗粒的组合物及其用途。
背景技术
已经发现包含无机材料的空心纳米颗粒具有广泛的应用。WO 2015/089590 A1描述了一种二氧化硅囊泡及将其作为递送活性剂的载体中的用途。
WO 201/164987 A1描述了一种生产粗糙的介孔空心二氧化硅纳米颗粒的方法。所述方法通过初始形成聚合物纳米颗粒而进行，该聚合物纳米颗粒随后在引入其他聚合物之前被二氧化硅包覆。WO 2016/164987 A1所述的方法涉及冗长的合成过程，然后进行煅烧。期望提供用于生产空心无机纳米颗粒的更有效方法。还期望提供一种生产具有改善的形貌和/或粒径分布的纳米颗粒的方法。
发明内容
发明人惊奇地发现，通过提高聚合物纳米颗粒初始形成的温度，可以显著提高生产多个空心无机纳米颗粒的方法的效率。这种变化可以显著减少生产空心无机纳米颗粒所需的时间，并且不会对纳米颗粒的形貌产生负面影响。还令人惊讶地发现，改进的方法可以导致具有改善的表面形貌的纳米颗粒的生产。还可以观察到所述空心无机纳米颗粒的单分散性增加。本发明的空心无机纳米颗粒在治疗中具有辅助作用。
本发明提供了一种制备多个空心无机纳米颗粒的方法，该方法包括：(a)使第一单体和第二单体在溶剂中接触，以制备包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物；(b)将无机化合物前体添加到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物；(c)将额外量的所述第一单体和第二单体添加到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个复合纳米颗粒的组合物；和(d)加热所述多个复合纳米颗粒以产生所述多个空心无机纳米颗粒；其中，在步骤(a)中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在至少30℃的温度下接触。
本发明还提供了通过本发明的方法获得的多个空心无机纳米颗粒。
本发明进一步提供了多个空心无机纳米颗粒，其中每个所述空心无机纳米颗粒包含：包含无机化合物的壳；设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；和设置在所述壳的外部的多个包含所述无机化合物的突起。所述多个空心无机纳米颗粒的粒径通常为100至500nm。所述空心无机纳米颗粒可进一步包含与所述无机化合物连接的多个酸性基团。
本发明进一步提供了一种组合物，该组合物包含根据本发明的多个空心无机纳米颗粒和活性剂。
本发明还提供了一种根据本发明的组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体。
本发明还提供了一种根据本发明的多个空心无机纳米颗粒，其在通过疗法治疗人体或动物体中用作佐剂。
本发明还提供了一种用于控制场所害虫的方法，该方法包括将所述场所暴露于根据本发明的组合物中。
附图说明
图1：合成SiNP001期间产生的SiNP的SEM图像。上图：包覆颗粒，下图：未包覆颗粒。
图2：合成SiNP002期间产生的SiNP的SEM图像。上图：包覆颗粒，下图：未包覆颗粒。
图3：反应温度、pH和搅拌器速度的在线监控显示了整个合成过程的一致性。
图4：使用动态光散射测定的SiNP的粒径变化。
图5：合成SiNP003期间产生的未包覆SiNP的SEM图像。
图6：合成SiNP004期间产生的未包覆SiNP的SEM图像。
图7：合成SiNP004期间产生的SiNP的煅烧过程的TGA分析。
图8：合成SiNP004，14小时煅烧过程中产生的未包覆SiNP的SEM图像。
图9：合成SiNP005期间产生的SiNP的SEM图像。上图和右下图：未包覆的颗粒；左下图：包覆颗粒。
图10：在合成SiNP005 V2期间制备的未包覆SiNP的SEM图像。
图11：在合成SiNP006期间制备的未包覆SiNP的SEM图像。
图12：在合成S1NP006 II期间制备的未包覆的SiNP的SEM图像。
图13：在合成SiNP006 III期间制备的未包覆SiNP的SEM图像
图14：在合成SiNP006 IV期间制备的未包覆SiNP的SEM图像
图15：在合成SiNP007期间制备的未包覆的SiNP的SEM图像，其中初始单体浓度降低了25％。值得注意的是，粒径减小了，形貌得以保留。
图16：在合成SiNP007 II期间制备的未包覆的SiNP的SEM图像，其中初始单体浓度降低了25％，冷却时间增加了30分钟。值得注意的是，粒径增加了，但是保留了所需的形貌。
图17：在合成SiNP007V过程中制备的未包覆的SiNP的SEM图像，其中初始单体浓度降低了25％。值得注意的是，正确的粒径和形貌。
图18：SiNPs的TEM图像。
图19：在合成SiNP008期间制备的未包覆的SiNP的SEM图像。值得注意的是，颗粒的单峰分散，正确的粒径和“有尖刺的”形貌。
图20：在合成SiNP008期间制备的未包覆的SiNP的SEM图像。注意颗粒的单峰分散，正确的粒径和“有尖刺的”形貌。
图21：使用不同的升温速率煅烧的SiNP0008中制备的未包覆的SiNP的SEM图像。注意颗粒的单峰分散和正确的粒径。在煅烧过程中，形态比使用标准的2℃/min的升温速率有较少“尖刺”，并且还观察到一些团聚。
图22：在SiNP0008 II合成过程中产生的SiNP在不同升温速率下煅烧过程的热重分析。图23：在SiNP0009中制备的未包覆的SiNP的SEM图像。粒径和形态无变化，但是观察到明显的团聚。
图24：在SiNP0009 II中制备的未包覆的SiNP的SEM图像颗粒显示出所需的“有尖刺的”形态，但有较大的粒径和团聚。
图25：在SiNP0009 III中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。具有较大的粒径和团聚。
图26：在SiNP0009 III中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。具有较大的粒径和团聚。
图27：在SiNP0010中制备的未包覆的SiNP的SEM图像。在一些颗粒的壁中观察到孔。
图28：在SiNP0011中制备的未包覆的SiNP的SEM图像。注意颗粒的单峰分散、正确的粒径和“有尖刺的”形貌。
图29：在SiNP0011中制备的未包覆的SiNP的SEM图像。注意颗粒的单峰分散、正确的粒径和“有尖刺的”形态
图30：SiNPs的TEM图像。
图31：在SiNP00l 2中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。注意具有大粒径和单峰的粒径分布。
图32：在SiNP0012 II中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。注意具有大粒径。
图33：在SiNP0012 III中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。注意具有大粒径。
图34：在SiNP00112 IV中制备的未包覆的间苯二酚甲醛颗粒的SEM图像。
图35：包覆和未包覆的SNP008上的Zeta电位随pH的变化。
图36：在不同条件下，PEI负载的SNP008的Zeta电位随pH的变化。
图37：膦酸盐连接的SNP008上的Zeta电位随pH的变化。
图38：膦酸盐连接步骤中碳含量的变化。
图39：PEI负载过程中不同时间的SNP008的Zeta电位随pH的变化。
图40：PEI负载期间IEP随时间的变化。
图41：PEI负载30分钟后，SNP011上的Zeta电位随pH的变化。
图42：在PEI加载5分钟后，SNP011_II上zeta电位随pH的变化。
图43：在以相同方式处理的两种不同颗粒的PEI负载过程中，N含量的变化。
图44：SiNP NUMed二氧化硅纳米颗粒的SEM图像。
图45：SiNP NUMed二氧化硅纳米颗粒的TEM图像。
图46：卵白蛋白(OVA)DNA使用不同媒介物给药时对脾细胞增殖的影响。
图47：载有pDNA编码荧光素酶的SiNPs的转染效率。
图48：(a)合成具有光滑、覆盆子和红毛丹样的表面形貌的二氧化硅纳米颗粒的示意图，(b)S-SNPs的TEM图像，(c)Ras-SNPs的TEM图像和(d)Ram-SNPs的TEM图像，(e)氮吸附等温线，(f)这些纳米颗粒相应的孔径分布，(g)在PEI偶联之前和之后，二氧化硅纳米颗粒的Zeta电位。
图49：二氧化硅纳米颗粒上的PEI连接模式：使用3-GPS的共价结合和使用THPMP的强静电吸引。
图50：用不同分子量的PEI共价改性的二氧化硅纳米颗粒的质粒DNA负载能力。
图51：使用通过不同方法进行10k PEI改性的Ram-SNPs对HEK-293T细胞中的eGFP-pcDNA转染效率的荧光显微镜和流式细胞术分析。
具体实施方式
本发明提供了一种制备多个空心无机纳米颗粒的方法，该方法包括：(a)使第一单体和第二单体在溶剂中接触，以制备包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物；(b)将无机化合物前体添加到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物；(c)将额外量的所述第一单体和第二单体添加到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个复合纳米颗粒的组合物；和(d)加热所述多个复合纳米颗粒以产生所述多个空心无机纳米颗粒；其中，在步骤(a)中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在至少30℃的温度下接触。
使所述第一单体和所述第二单体接触通常包括使所述第一和第二单体反应。例如，所述第一和第二单体都溶解在所述溶剂中。
本发明的方法包括在高于室温的温度下形成多个聚合物纳米颗粒。整个步骤(a)通常在至少30℃的温度下进行。通常使所述第一单体和所述第二单体在30℃至70℃的温度下在所述溶剂中接触。优选地，所述第一和第二单体可以在40.0℃至50.0℃的温度下在所述溶剂中接触。例如，所述温度可以是从42.0℃到48.0℃，或者所述温度可以是大约45℃。
在添加所述无机化合物前体之前，使所述第一和第二单体在至少30℃的温度下接触通常不超过4小时(即不超过240分钟)。通常，使所述第一和第二单体接触10分钟至180分钟，例如30分钟至150分钟。所述第一和第二单体可以接触60分钟至120分钟，例如80分钟至100分钟。当所述第一单体和第二单体在所述溶剂中接触特定的时间后，通常可以：在该特定的时间后开始步骤(b)；在该特定时间后，降低反应温度；或在该特定时间后将反应淬灭(例如，通过添加额外量的溶剂)。
例如，在将包含所述溶剂和所述第一和第二单体的组合物冷却至小于30℃的温度之前，可以使所述第一和第二单体在40.0℃至50.0℃的温度下接触30分钟至150分钟。
所述空心的无机纳米颗粒是空心的纳米颗粒(即，其包含壳，该壳包含围绕中心空间的材料，所述空间不包含该材料)，所述纳米颗粒包含无机化合物(也可以称为无机材料)。所述无机化合物可以是任何合适的无机化合物。例如，所述无机化合物可以是氧化物。所述无机化合物通常是二氧化硅(即SiO2)，二氧化钛(TiO2)或氧化铝(Al2O3)。所述无机化合物优选为氧化硅，并且空心无机纳米颗粒优选为空心氧化硅纳米颗粒。所述术语“氧化硅”(silica)应理解为包括多种硅的氧化物，通常为二氧化硅。
相对于所述空心无机纳米颗粒的总重量，所述空心无机纳米颗粒通常包含至少70重量％的所述无机化合物。例如，所述空心无机纳米颗粒可包含至少90重量％的所述无机化合物或至少95重量％的所述无机化合物。所述多个空心的无机纳米颗粒可以由所述无机化合物组成或基本上由所述无机化合物组成。这些重量百分比指的是在所述多个空心无机纳米颗粒负载活性剂之前的重量百分比。
基本上由指定组分组成的组合物包含该指定组分和任何其他组分，该其他组分的量(例如小于0.5重量％)不会实质性地影响该指定组分的功能。
步骤(a)包括将所述第一和第二单体在溶剂中接触，例如通过将所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中混合。所述溶剂可以是任何合适的溶剂，例如适合于进行
Figure BDA0002583699590000061
工艺的溶剂(
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等，Journal of Colloid and Interface Science.26(1)：62-69；1968)。所述溶剂可以包括极性溶剂。所述极性溶剂可以是极性质子溶剂，例如水、醇或羧酸，或极性非质子溶剂，例如酮(例如丙酮)，腈(例如乙腈)，卤代烷烃(例如氯甲烷或二氯甲烷)或卤代芳烃(例如氯苯)。通常，所述溶剂包括水和/或醇，该醇可以是甲醇、乙醇，正丙醇或异丙醇。通常，所述溶剂包括乙醇和水。所述乙醇：水的体积比通常为60∶20至80∶5，例如约70∶10。
所述溶剂通常可以包含碱(即，所述溶剂可以是包含用作溶剂的惰性液体和用作催化剂的碱的组合物)。所述碱通常是包含氮的化合物，例如氨、氨水或烷基胺。所述溶剂通常包含氨或氨水。所述溶剂可以包含1.0-10.0体积％的28-30体积％氨溶液。
所述溶剂优选包括水、醇和氨。所述溶剂的pH通常为至少9.0，例如10.0至12.0。
用于形成多个聚合物纳米颗粒的所述第一和第二单体的反应通常包括搅拌包含所述第一和第二单体以及所述溶剂的组合物。可以以50至500rpm，例如200至400rpm的速率搅拌组合物。
所述第一和第二单体可以是适合于形成所述多个或聚合物纳米颗粒的任何单体。所述第一单体通常是包含一个或多个羟基的化合物，所述第二单体通常是包含一个或多个醛基的化合物。更典型地，所述第一单体是二醇，所述第二单体是醛。二醇的实例包括乙烷-1,2-二醇，丙烷-1,3-二醇和苯二醇。例如，所述第一单体可以是式HO-Ar-OH的化合物，所述第二单体可以是式HC(O)-R1的化合物，其中Ar是取代或未取代的芳基，R1是H或取代或未取代的C1-6烷基。
取代基可包含一个或多个选自C1-6烷基、羟基、氧代、卤素、氨基、硝基或羧酸酯的取代基。
C1-6烷基是含有1-6个碳原子的直链或支链的饱和烃基。C1-6烷基可以是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基和己基。通常，R1为H或甲基。例如，所述第一单体可以是甲醛或乙醛。
Ar可以是取代或未取代的苯基。例如，Ar可以是苯基、甲基苯基、二甲基苯基或氯苯基。所述第二单体可以是苯二醇，例如间苯二酚、邻苯二酚或对苯二酚。
优选地，所述第一单体是间苯二酚，且所述第二单体是甲醛。
所述第一单体可以是C1-6烷基胺，例如甲基胺。
所述第一单体的浓度通常为1.0mM至0.1M，所述第二单体的浓度通常为1.0mM至0.1M。例如，所述第一单体的浓度可以为0.01M至0.03M，所述第二单体的浓度可以为0.3至0.05M。
所述第一单体(例如间苯二酚)在所述溶剂中的的浓度可以为1.0mg/mL至3.0mg/mL或1.2mg/mL至2.0mg/mL。例如，对于每80mL的溶剂，可以添加0.1至0.4g的间苯二酚。
所述第二单体(例如甲醛)在所述溶剂中的浓度可以是0.001至0.005mL含有20至50wt％的所述第二单体的溶液/mL溶剂。例如，对于每80mL的溶剂，可以添加0.1至0.4mL的37wt％的甲醛水溶液。
所述第一单体：第二单体的摩尔比通常为3.0：1.0至1.0：3.0或2.0：1.0至1.0：2.0。例如，所述第一单体(例如间苯二酚)可能摩尔过量，并且所述第一单体：第二单体的摩尔比可以为2.0∶1.0至1.1∶1.0。
所述第一和第二单体的接触产生多个聚合物纳米颗粒，即，多个包含由所述第一和第二单体的反应产生的聚合物的纳米颗粒。该聚合物通常是所述第一和第二单体的共聚物。所述聚合物通常是缩合聚合物。例如，所述聚合物可以是聚醚、聚酯或聚酰胺。该聚合物通常是交联的聚合物(例如，与线性聚合物相反)。优选地，所述聚合物包括间苯二酚-甲醛共聚物。
所述多个聚合物纳米颗粒的平均粒径(average particle size)(例如平均粒度(mean particle size))通常为50至500nm，例如100至300nm。
本文中的平均粒径(average particle size)通常是指根据使用动态光散射确定的粒径分布测得的平均粒径。所述动态光散射可以例如使用Horiba SZ-100纳米颗粒分析仪来测量。所述平均粒径可以是Dv50值或Dn50值。所述粒径通常是流体力学直径。
所述平均粒径可以可选地通过扫描电子显微镜(SEM)测量。例如，所述平均粒径可以如使用SEM图像的图像分析来测量。
所述无机化合物前体是适合于形成所述无机化合物的化合物，例如当溶解在所述溶剂中时。所述无机化合物前体通常是氧化硅(silica)前体，氧化钛(titania)前体或氧化铝(alumina)前体。所述无机前体化合物优选为氧化硅前体。
所述氧化硅前体通常是水解以产生氧化硅的化合物。所述氧化硅前体可以例如是式Si(R2)x(OR3)y的化合物，其中：每个R2和R3独立地选自H、C1-6烷基、芳基和C2-6烯基；x为0、1或2；且y是2、3或4。x和y的和通常为4。每个R2和R3通常独立地选自C1-6烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。
本文中，芳基是指在环部分中包含6至14个碳原子，通常6至10个碳原子的单环、双环或多环芳族环。实例包括苯基、萘基、茚基、茚满基、蒽基(anthrecenyl)和芘基。本文中，C2-6烯基是指其中一个或多个碳-碳单键被碳-碳双键取代的C2-6烷基。实例包括乙烯基、丙烯基和丁烯基。
所述无机化合物前体通常是原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四甲酯、原硅酸四丙酯或原硅酸四丁酯。优选地，所述无机前体化合物是原硅酸四乙酯。
在步骤(b)中，在将所述无机化合物前体加入到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中之后，所述无机化合物前体化合物的浓度通常为1.0mM至0.1M。例如，所述无机化合物前体的浓度可以为0.01至0.05M。如果所述无机化合物前体为氧化硅前体，例如TEOS，则所述氧化硅前体化合物的浓度可以为0.002至0.015mL/mL所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物。
在根据本发明的方法中，在步骤(a)中，每391mL溶剂可以使用以下试剂：(i)0.1-2.0g间苯二酚，优选0.2-0.7g间苯二酚；(ii)0.1-3.0mL的37wt％甲醛水溶液，优选0.5-1.0mL的37wt％甲醛水溶液。在步骤(b)中，每391mL溶剂的浓度可以是1.0-5.0mL原硅酸四乙酯，例如2.0-4.0mL原硅酸四乙酯。在步骤(c)中，每391mL溶剂可以使用以下量的试剂：(i)0.2-4.0g间苯二酚，优选1.5-2.0g间苯二酚；(ii)0.5-6.0mL的37wt％甲醛水溶液，优选2.0-3.0mL的37wt％甲醛水溶液。
将所述无机化合物前体添加到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中产生了包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物。每个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒通常包括包含所述聚合物的核和包含所述无机化合物的壳。所述多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的平均粒径通常为120-400nm。
步骤(b)中用于制备所述多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒(例如，所述氧化硅包覆的聚合物纳米颗粒)的条件可以与
Figure BDA0002583699590000091
工艺所需的条件相同(
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等，Journalof Colloid and Interface Science.26(1)：62-69；1968)。
步骤(a)在至少30℃的温度下进行。发明人发现，控制步骤(b)的温度也是有利的，在该步骤中，生产了所述包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒。特别地，在步骤(a)和步骤(b)之间冷却所述反应混合物(即溶剂和聚合物纳米颗粒)是有利的。这可以导致对粒径的更好控制。在步骤(b)中控制温度还导致所述空心无机纳米颗粒具有理想的“有尖刺的”表面形态。
通常，步骤(b)在不超过30℃的温度下进行，例如在10℃-30℃的温度下进行。所述温度可以是18℃-28℃。
该方法通常还包括在步骤(a)和步骤(b)之间冷却所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物的步骤。通常，将所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物以0.5℃/min到1.0℃/min的平均速度冷却。通常将所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物冷却10分钟-60分钟，例如20-50分钟。例如，可将所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物在20-50分钟的时间内从40℃-50℃的温度冷却至10℃-30℃。
在添加所述无机化合物前体之后，通常允许用所述无机化合物对所述聚合物纳米颗粒进行包覆1.0-30分钟的时间。在这段时间之后，在步骤(c)中，开始添加额外量的所述第一和第二单体。在添加额外量的所述第一和第二单体之后，所述反应混合物包含所述第一和第二单体以及所述无机化合物前体。结果，所述聚合物和所述无机化合物同时沉积在包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒上，这导致形成了无机化合物的介孔层，其中所述无机化合物中的介孔被所述聚合物填充。术语“介孔的”是指包含介孔的材料，即具有2nm-50nm的宽度(即孔径)的孔。
步骤(c)，将额外量的所述第一和第二单体加入到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，通常在步骤(b)，将二氧化硅前体化合物加入到所述包含溶剂和多种聚合物纳米颗粒的组合物中，之后1-30分钟进行。优选地，步骤(c)在步骤(b)之后2-10分钟进行。
步骤(c)通常在与步骤(b)相同的温度下进行。例如，在步骤(c)中，所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物的温度通常不超过30℃，例如，为18℃-28℃。
典型地，在向所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中添加额外量的所述第一和第二单体之后，在包含所述溶剂、所述多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒以及所述第一和第二单体的组合物中，所述第一单体的浓度为2.0mM至0.2M，所述第二单体的浓度为2.0mM至0.2M。相对于整个反应混合物的体积，所添加的第一单体(例如间苯二酚)的质量可以为例如1.5mg/mL-6.0mg/mL或2.0mg/mL-4.0mg/mL。所添加的第二单体(例如甲醛)的体积可以为例如0.02-0.1mL包含20至50wt％的所述第二单体的溶液/mL整个反应混合物。例如，每80mL溶剂可添加0.2-0.6g间苯二酚，并且每80mL溶剂可添加0.2-0.8mlL 37wt％的甲醛水溶液。
通常，所述额外量的第一和第二单体可反应1.0-4.0小时。这是形成所述无机化合物的外介孔层的时间。所述无机化合物的介孔层形成表面，该表面在最终除去所述聚合物后可描述为粗糙或有尖刺的。
步骤(c)导致产生多个复合纳米颗粒。所述复合纳米颗粒通常包括：包含所述聚合物的核；包含所述无机化合物的壳层；以及包含所述聚合物和所述无机化合物的外层。所述壳层通常包括一些孔，一旦除去聚合物，这些孔允许材料从所述空心无机纳米颗粒的外部移动到内部。
已经发现本发明的方法可以大规模进行。例如，所述溶剂的总体积可以为至少500mL或至少5L。步骤(a)-(c)可以在容量为至少500mL或至少5L的反应容器中进行。所述反应容器可以是Radleys反应器。
步骤(d)包括加热所述多个复合纳米颗粒以去除聚合物组分，从而产生所述多个空心无机纳米颗粒。通常，步骤(d)包括在适合于从复合纳米颗粒中除去所述聚合物的温度下加热所述多个复合纳米颗粒。例如，可以在400℃-700℃或500℃-600℃的温度下加热所述多个复合纳米颗粒。所述煅烧步骤(即步骤(d)中的加热)期间的升温速率通常为1℃/min-20℃/min。研究发现，在对空心无机纳米颗粒的表面形态无不利影响的情况下，可提高升温速率。所述升温速率可为6℃/min至15℃/min。
已经发现加热(例如煅烧)所述纳米颗粒所需的时间小于先前预期的时间。步骤(d)通常包括将所述多个复合纳米颗粒加热少于4.0小时的时间。例如，可以将所述多个复合纳米颗粒加热1.0-3.0小时或90-150分钟的时间。
在步骤(d)之前，该方法通常包括分离所述多个复合纳米颗粒。这通常包括将所述包含溶剂和复合纳米颗粒的组合物离心，例如在5-20℃的温度下以3000-5000rpm的速度离心1-20分钟。在离心过程中，通常除去上清液，并加入额外的溶剂(例如乙醇)。一旦分离了所述多个复合纳米颗粒，就可以将它们在空气中干燥，例如在室温下干燥12-48小时。
空心无机纳米颗粒的总产率通常为大于或等于1.0g每升步骤(a)至(c)中使用的溶剂，例如大于或等于1.5g/L。
所述多个空心无机纳米颗粒通常是多个介孔空心无机纳米颗粒。每个空心的无机纳米颗粒可包括：包含无机化合物的壳；设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；以及设置在所述壳外部的多个包含所述无机化合物的突起。
所述空心无机纳米颗粒通常具有粗糙的或“有尖刺的”表面形态，其包含多个包含所述无机化合物的突起。所述无机化合物的突起是从所述包含无机化合物的壳向外延伸的所述无机化合物主体(volume)。所述突起通常增加所述空心无机纳米颗粒的表面积。所述壳表面上的突起通常形成所述纳米颗粒的另一层，该层是包含所述无机化合物的介孔层。该介孔层的厚度(即所述突起的长度)通常为10nm-200nm，例如50nm-150nm。从最接近所述包含无机化合物的壳的介孔层的部分到最接近所述空心无机纳米颗粒的外表面的介孔层的部分，所述包含无机化合物的介孔层的孔隙率通常有所增加。
通常，所述空心无机纳米颗粒的平均粒径为100nm-600nm，例如120nm-400nm或150nm-250nm。所述壳内的空间通常具有50nm-500nm，例如100nm-300nm的平均直径。所述包含无机化合物的壳通常具有10nm-200nm的平均厚度。
所述空心无机纳米颗粒的平均粒径为150nm-250nm，所述壳内的空间的平均直径为50nm-150nm。
所述空心无机纳米颗粒通常可用于配制和递送活性剂。因此，该方法可以进一步包括步骤(e)：用试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒，以产生多个负载所述试剂的空心无机纳米颗粒。该试剂可以是任何合适的试剂，并且通常是活性剂，例如疏水活性剂。所述空心无机纳米颗粒可以增强所述活性剂向细胞或生物体内一定位置的运输。例如，所述空心无机纳米颗粒可以通过在穿过细胞的运输过程中保护核酸来增强所述核酸向细胞核的运输。
在用活性剂处理所述多个空心无机纳米颗粒之前，通常期望用电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒。所述电荷改性剂通常是胺聚合物，例如聚胺。或者，所述电荷改性剂可以是壳聚糖或其衍生物，其中壳聚糖中的氨基被三烷基化，例如被三个C1-6烷基烷基化，例如被三个甲基烷基化(三甲基化)。因此，可以使用三甲基壳聚糖。壳聚糖及其衍生物先前已用于非病毒基因递送。
所述空心无机纳米颗粒的表面通常带负电，而电荷改性剂通常是阳离子聚合物。阳离子聚合物的使用使所述空心纳米颗粒可以负载带负电荷的试剂，例如核酸。所述阳离子聚合物通常是聚胺，例如聚乙烯亚胺(PEI)，聚亚甲基亚胺或聚丙烯亚胺。所述阳离子聚合物可以是多肽，例如聚精氨酸、聚赖氨酸或聚组氨酸。所述阳离子聚合物可以是聚酰胺胺(PAMAM)。
通常，所述电荷改性剂是聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺通常是支链聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺可以是线性聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺的分子量可以为5,000MW-40,000MW，例如10,000MW-25,000MW。所述聚乙烯亚胺的分子量通常为5,000MW-15,000MW，例如约10,000MW，该分子量通常为重均分子量。
所述活性剂可以是杀虫剂、除草剂、治疗剂、疫苗、转染剂、核酸或染料。所述杀虫剂可以例如是多杀菌素。
所述治疗剂可以是核酸，例如核酸疫苗。所述核酸通常是DNA(例如质粒DNA)或RNA(例如mRNA、siRNA或sRNA)。因此，所述核酸可以是DNA疫苗或RNA疫苗(例如mRNA疫苗或siRNA疫苗)。所述核酸可以例如是卵白蛋白pDNA，卵白蛋白mRNA，HPV pDNA或HPV mRNA。所述核酸可以是编码萤光素酶的RNA或DNA。当所述试剂是核酸时，通常在缓冲盐溶液中用所述核酸处理所述空心无机纳米颗粒。在用所述核酸处理所述空心无机纳米颗粒之前，可以将所得的组合物冷却至2-10℃的温度1至10小时。
所述治疗剂可以是小分子，例如抗增殖化合物，抗生素化合物或免疫治疗化合物。
所述治疗剂可以是蛋白质，例如它可以是包含蛋白质的疫苗。
研究发现所述空心无机纳米颗粒可以增强治疗剂的活性，因此所述空心无机纳米颗粒具有佐剂作用。例如，所述空心无机颗粒可作为佐剂在疫苗给送后增强免疫应答并由此减少所需疫苗量。
如上所述，所述空心无机纳米颗粒的表面通常带负电。期望通过用酸度改性组分处理纳米颗粒来增强空心无机纳米颗粒表面上的负电荷，所述酸度改性组分向纳米颗粒的表面添加(通常为去质子化的)酸基团，从而增加所述空心纳米颗粒表面的负电荷。这可以改善阳离子电荷改性剂例如聚乙烯亚胺与无机纳米颗粒表面的连接。所述“连接”包括共价和非共价连接，例如离子连接。通常，所述电荷改性剂通过离子相互作用或范德华相互作用与所述空心无机纳米颗粒的经酸度改性的表面连接。
因此，该方法可以包括在用一种试剂(例如电荷改性剂)处理所述多个空心无机纳米颗粒之前，先用酸度改性组分(也可称为酸性连接剂)处理所述多个空心无机纳米颗粒的步骤。
所述酸度改性组分通常包含pKa小于氧化硅(即pKa小于约4.5)的酸性基团。所述酸性基团可以被质子化或去质子化。优选地，所述酸性基团被去质子化，因为这增加了所述空心纳米颗粒表面上的负电荷。通常，所述酸度改性组分包含pKa小于或等于3.5的酸性基团。例如，所述酸度改性组分可包含膦酸根基团、磷酸根基团、羧酸根基团或α-酮基羧酸根基团(-C(O)-COO-)。所述酸度改性组分可包含丙酮酸根(pyruvate)。
所述酸度改性组分可以是式S-R-A的化合物，其中S是含硅的基团，R是二价有机基团并且A是酸性基团。S通常为式-Si(alk)n(OH)m的基团，其中alk为C1-6烷基，n为0-3，OH为0-3。例如，S可为-Si(OH)3。R通常为C1-6亚烷基，例如-(CH2)P-，其中p为1-6的整数。A通常为膦酸根基团(例如-O-P(Rp)(＝O)O-(其中Rp为H或C1-6烷基)，磷酸根基团，硫酸根基团，羧酸根基团或α-酮基羧酸根基团(-C(O)-COO-)。A优选是膦酸根基团，例如甲基膦酸根。A可以是所述酸性基团的盐的形式，例如甲基膦酸单钠盐或丙酮酸单钠盐。例如，S可以是三羟基甲硅烷基，R可以是-(CH2)3-并且A可以是膦酸根基团。所述含硅的基团可与所述空心无机纳米颗粒中的无机材料(例如氧化硅)反应，并将所述酸性基团添加至所述空心无机纳米颗粒的表面。
所述空心无机纳米颗粒通常用所述酸度改性剂以0.005g/mL至0.1g/mL的浓度处理。所述酸度改性剂与所述空心无机纳米颗粒之间的反应温度通常为20-50℃，例如35-45℃。反应时间通常为1-5小时。
该方法可以包括在用所述试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒之前，用膦酸盐连接剂处理所述多个空心无机纳米颗粒的步骤。在那种情况下，所述酸度改性组分是膦酸盐。例如，该方法通常包括在用电荷改性剂(例如聚乙烯亚胺)处理所述多个空心无机纳米颗粒之前，用膦酸盐连接剂处理所述多个空心无机纳米颗粒的步骤。所述膦酸盐连接剂通常是1,3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯单钠盐(THPMP)。
通常，例如，该方法(即其步骤(e))包括：(e1)用电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒；(e2)用活性剂处理所述空心无机纳米颗粒。该方法，即其步骤(e)，例如可以包括：(e1)用酸度改性组分处理所述空心无机纳米颗粒；(e2)用电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒；以及(e3)用活性剂处理所述空心无机纳米颗粒。该方法，即其步骤(e)，例如可以包括：(el)用膦酸盐连接剂处理所述空心无机纳米颗粒；(e2)用电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒；以及(e3)用活性剂处理所述空心无机纳米颗粒。所述空心无机纳米颗粒可以是例如空心氧化硅纳米颗粒。所述膦酸盐连接剂可以是例如THPMP。所述电荷改性剂可以例如上述进一步定义，例如聚胺，，例如PEI或壳聚糖或其衍生物。所述活性剂也可以如上述进一步定义，例如它可以是核酸、蛋白质或小分子，并且可以例如是核酸(例如DNA或RNA)疫苗、或蛋白质或肽疫苗。
已经发现所述空心无机纳米颗粒可以快速地负载所述试剂，例如电荷改性剂。因此，所述多个空心无机纳米颗粒可以用所述试剂，例如所述电荷改性剂，处理少于60分钟或少于15分钟，例如30秒-15分钟。例如，已连接膦酸盐的空心无机纳米颗粒可以用聚乙烯亚胺处理1-10分钟。但是，通常优选用所述电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒至少1小时，例如2-10小时。所述空心无机纳米颗粒可以在20-30℃的温度下用所述电荷改性剂处理。
本发明还提供了可通过根据本发明的方法获得的多个空心无机纳米颗粒。
本发明进一步提供了多个空心无机纳米颗粒，其中每个空心无机纳米颗粒包括：包含无机化合物的壳；设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；以及设置在所述壳外部的多个包含所述无机化合物的突起。所述多个空心无机纳米颗粒的粒径通常为100-500nm。所述空心无机纳米颗粒可以如上所述。所述空心无机纳米颗粒通常是空心氧化硅纳米颗粒。
本发明进一步提供了多个空心无机纳米颗粒，其中每个空心无机纳米颗粒包括：包含无机化合物的壳；设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；以及设置在所述壳的外部的多个包含所述无机化合物的突起，并且所述空心无机纳米颗粒还包含与所述无机化合物连接的多个酸性基团。所述酸性基团通常为膦酸根基团(例如-O-P(Rp)(＝O)O-(其中Rp为H或C1-6烷基)，磷酸根基团，硫酸根基团，羧酸根基团或α-酮基羧酸根基团(-C(O)-COO-)。所述酸性基团可以例如是甲基膦酸根基团。所述包含结合至其表面的酸性基团的空心无机纳米颗粒可以通过用如上定义的式S-R-A的化合物处理所述空心无机纳米颗粒而获得。所述酸性基团通常带负电。例如，所述酸性基团可以是盐的形式，其中平衡离子通常是碱金属阳离子，例如钠。
如上所述，在所述无机纳米颗粒表面上酸性基团例如膦酸根的存在有利地增加了所述空心无机纳米颗粒表面上的负电荷，继而可以改善电荷改性剂(例如聚乙烯亚胺)与所述纳米颗粒之间的连接。
所述多个空心无机纳米颗粒的平均粒径通常为150-350nm，例如160-250nm。所述多个空心无机纳米颗粒的平均粒径可以为160-200nm。如上所述，所述粒径通常是使用动态光散射测量的。所述粒径可以通过SEM图像的图像分析来测量。
根据本发明制备的所述多个空心无机纳米颗粒可以是高度单分散的。通常，所述多个空心无机纳米颗粒的多分散指数(PDI，也称为分散指数)小于或等于0.3，小于或等于0.15，小于或等于0.1或小于或等于0.05。所述分散指数可以计算为平方的平均值(即，测得直径的平方的平均值，d)与测得直径的算术平均值的平方之比。所述分散指数的计算可以如ISO标准文件13321：1996E和ISO 22412：2008中所述。
例如，根据本发明或通过本发明的方法生产的所述空心无机纳米颗粒可以具有150-200nm的平均粒径(例如通过SEM测量)和不大于0.15的多分散指数。所述空心无机纳米颗粒可以具有150-250nm的平均粒径和不大于0.25的多分散指数。
所述空心无机纳米颗粒通常具有高表面积。例如，所述多个空心无机纳米颗粒的BET表面积可以为至少120cm2/g，例如至少150cm2/g。所述无机纳米颗粒可以具有至少140cm2/g的BET表面积。所述多个空心无机纳米颗粒的平均粒度可以为160-250nm，并且BET表面积为至少120cm2/g。所述BET表面积可以例如使用ISO 9277标准测量。可以基于氮的吸附和解吸附来测量BET表面积。
本发明还提供了包含根据本发明的多个空心无机纳米颗粒和试剂的组合物。该试剂可以如本文所述。所述试剂通常结合至所述空心无机纳米颗粒，例如通过膦酸盐连接剂。当该试剂包含电荷改性剂例如聚乙烯亚胺时，尤其如此。所述膦酸盐连接剂可以是1，3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸单钠盐(THPMP)。
该试剂通常是疏水活性剂。例如，所述试剂可以是杀虫剂、除草剂、治疗剂、疫苗、电荷改性剂、转染试剂、包含DNA的试剂或染料。
通常，该试剂是电荷改性剂，其是聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺通常是支链聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺可以是线性聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺的分子量可以为5,000MW-40,000MW，例如10,000MW-25,000MW。所述聚乙烯亚胺通常具有5,000MW-15,000MW，例如约10,000MW的分子量，该分子量通常是重均分子量。
通常，所述多个空心无机纳米颗粒包含至少1.0重量％的电荷改性剂。例如，所述多个空心无机纳米颗粒可包含至少2.0重量％或至少5.0重量％的电荷改性剂。所述多个空心的无机纳米颗粒可包含6.0至15重量％的电荷改性剂，例如聚乙烯亚胺。
所述多个空心的无机纳米颗粒可以用膦酸盐连接剂例如THPMP官能化。
优选地，该组合物包含电荷改性剂和活性剂。所述电荷改性剂通常结合到所述空心无机纳米颗粒上。例如，它可以通过膦酸盐连接剂(例如THPMP)与所述空心无机纳米颗粒结合。所述电荷改性剂可以如本文进一步定义，并且通常为胺聚合物，例如聚胺。或者，所述电荷改性剂可以是壳聚糖或其衍生物，其中壳聚糖中的氨基被三烷基化，例如被三个C1-6烷基烷基化，例如被三个甲基(三甲基化)烷基化。因此，可以使用三甲基壳聚糖。壳聚糖及其衍生物先前已用于非病毒基因递送。所述电荷改性剂可以是多肽，例如聚组氨酸、聚赖氨酸或聚精氨酸。
所述空心无机纳米颗粒的表面通常带负电，而所述电荷改性剂通常是阳离子聚合物。阳离子聚合物的使用使所述空心纳米颗粒可以负载带负电荷的试剂，例如核酸。所述阳离子聚合物通常是聚胺，例如聚乙烯亚胺(PEI)，聚亚甲基亚胺或聚丙烯亚胺。通常，所述电荷改性剂是聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺通常是支链聚乙烯亚胺。所述聚乙烯亚胺通常具有5,000MW-15,000MW，例如约10,000MW的分子量，该分子量通常是重均分子量。所述活性剂可以是杀虫剂、除草剂、治疗剂、疫苗、转染剂、核酸或染料。所述杀虫剂可以是例如多杀菌素。所述活性剂通常结合到电荷改性剂上，例如，通过静电(例如带负电荷的核酸结合到正电性的聚胺例如PEI，或壳聚糖或壳聚糖衍生物上)。因此，所述治疗剂可以是核酸，例如核酸疫苗。所述核酸通常是DNA(例如质粒DNA)或RNA(例如mRNA，siRNA或sRNA)。因此，所述核酸可以是DNA疫苗或RNA疫苗(例如mRNA疫苗或siRNA疫苗)。所述治疗剂可以是小分子，例如抗增殖化合物、抗生素化合物或免疫治疗化合物。所述治疗剂可以是蛋白质，例如它可以是包含蛋白质的疫苗。
所述活性剂(例如DNA或RNA)与所述空心无机纳米颗粒的重量比通常为1：2-1：100(活性剂：纳米颗粒)，例如1：5-1:50或1:20-1:50。
优选地，该组合物包含电荷改性剂和核酸。所述核酸通常是DNA(例如质粒DNA)或RNA(例如mRNA，siRNA或sRNA)。例如，所述组合物可以包含聚乙烯亚胺(PEI)和核酸，例如PEI和质粒DNA。
所述电荷改性剂，例如PEI通常通过膦酸盐连接剂例如通过1，3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸单钠盐(THPMP)结合至所述空心无机纳米颗粒。所述通过THPMP的PEI和添加到所述空心无机纳米颗粒表面的膦酸根基团之间的结合通常是离子键。
本发明的组合物可以以大于或等于10μg/mL，大于或等于40μg/mL或大于或等于60μg/mL的浓度包含所述空心无机纳米颗粒。
本发明的组合物通常是药物组合物。优选的药物组合物是无菌的且无热原。因此，本发明的组合物通常还包含药学上可接受的载体或稀释剂。例如，用于注射或输注的溶液可以包含例如无菌水作为载体，或者可以例如以无菌的水性等渗盐溶液的形式。另一方面，除所述活性化合物外，固体口服形式还可包含稀释剂，例如乳糖、右旋糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂，例如氧化硅、滑石粉、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；粘合剂，例如淀粉、阿拉伯树胶、明胶，甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂，例如淀粉、藻酸、藻酸盐或羧甲基淀粉钠；泡腾混合物；染料甜味剂；润湿剂，例如卵磷脂，聚山梨酯，月桂基硫酸盐；以及通常用于药物制剂的无毒且无药理活性的物质。这样的药物制剂可以以已知的方式制造，例如通过混合、制粒、压片、糖衣或膜衣过程。口服液体分散剂可以是糖浆剂、乳剂和混悬剂。所述糖浆可包含例如蔗糖或蔗糖与甘油和/或甘露醇和/或山梨糖醇作为载体。混悬剂和乳剂可包含例如天然胶、琼脂、藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。除所述活性化合物外，用于肌内注射的悬浮液或溶液还可以包含药学上可接受的载体，例如无菌水、橄榄油、油酸乙酯、二元醇，例如丙二醇，以及如果需要，适量的盐酸利多卡因。
本发明还提供了本文定义的组合物，用于通过疗法治疗人体或动物体。在这种情况下，治疗包括改善和预防疾病。所述活性剂可以例如是疫苗，并且该组合物可以用于通过使用疫苗使患者针对疾病进行免疫来预防患者的疾病。
本发明还提供了用于治疗疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的本文定义的组合物给予有需要的受试者。所述受试者可以是哺乳动物，并且通常是人类患者。再次，术语“治疗”在此包括改善或预防疾病。所述组合物中的活性剂可以例如是疫苗。该治疗可以例如包括通过使用疫苗使受试者针对该疾病进行免疫来预防该受试者中的疾病。对受试者施用治疗有效量的本发明的组合物，并且该量可以由技术人员根据组合物中使用的特定药剂的活性，待治疗的受试者的年龄、体重和状况、疾病的类型和严重程度以及给药的频率和途径来确定。
所述纳米颗粒可以治疗的疾病包括癌症、细菌感染、病毒感染和免疫紊乱。例如，所述治疗可能包括免疫治疗，例如通过免疫治疗治疗癌症。
本发明还提供了多个根据本发明制备的空心无机纳米颗粒，其用作通过疗法治疗人体或动物体的方法中的佐剂。因此，多个空心无机纳米颗粒可以用于提高治疗剂的效果的方法中。例如，本发明可以提供一种通过将多个空心无机纳米颗粒与治疗剂共同施用来提高治疗剂效果的方法。
所述治疗剂通常是疫苗、核酸或化学治疗剂。所述多个空心无机纳米颗粒因此可以充当疫苗佐剂。所述多个空心无机纳米颗粒可以用于增加对疫苗的免疫应答的方法中。本发明可以提供一种包含所述多个空心无机纳米颗粒作为佐剂和治疗剂例如疫苗的组合物。在没有活性剂的情况下给药时，所述多个空心无机纳米颗粒可能引起免疫应答。因此，本发明提供了用于引起免疫应答的方法的多个空心无机纳米颗粒。
所述多个空心无机纳米颗粒可以用作佐剂用于癌症的治疗，例如用于通过免疫疗法治疗癌症。通过将所述多个空心无机纳米颗粒可以用于通过与多种空心无机纳米颗粒共同施用化学治疗剂来治疗癌症的方法中。
本发明还提供了将核酸转染到细胞中的方法，该方法包括用根据本发明的组合物处理细胞。该组合物可以包含多个空心无机纳米颗粒和核酸。该细胞可以是人类或非人类细胞。该细胞可以是来自CT26、HCT116或HEK293细胞系的细胞。将核酸转染到细胞中的方法可以在体外进行，例如在提到的细胞系中进行。或者，根据本发明的组合物可以用于将核酸转染到人或动物体内的细胞中。
出乎意料地发现，本发明的空心无机纳米颗粒不仅非常成功地转染细胞，而且同时“唤醒”了免疫系统(即作为佐剂)以刺激有利的免疫应答。因此，本发明还提供了将核酸转染到细胞中的方法，该方法包括用根据本发明的组合物处理细胞，所述组合物包含多个空心无机纳米颗粒和核酸，从而用所述核酸转染细胞并刺激免疫应答。有利地，这允许负载有活性剂的SiNP既用作递送活性剂(例如疫苗)的载体和佐剂。这允许简化的包含佐剂的疫苗组合物。
本发明还提供了一种用于控制场所害虫的方法，该方法包括将场所暴露于本文所定义的组合物中。该场所通常是农作物或植物。所述害虫可以例如是昆虫。
通过以下实施例更详细地描述本发明。
实施例
实施例1-空心二氧化硅纳米颗粒(SiNPs)的合成
材料
表1给出了用于二氧化硅(silica)纳米颗粒合成的材料。
表1-二氧化硅纳米颗粒合成中使用的试剂
试剂 等级
乙醇 98％
水 去离子
氨水 28-30％基于NH<sub>3</sub>
间苯二酚 Bioxtra>99％
甲醛 37重量％在水中
原硅酸四乙酯(TEOS) 试剂级98％
方法
方案：二氧化硅纳米颗粒合成，100mL规模
以下方案用作下面列出的实验的基础。应当注意，在该方案中，所述两种单体在环境温度下接触。
用乙醇(70mL)、水(10mL)和氨水(3mL)处理500mL的Duran瓶，并在搅拌器加热板上以～350rpm搅拌(盖上盖子)15分钟。加入间苯二酚(0.2g)和甲醛(0.28mL)，并将该溶液以～350rpm于环境温度下搅拌(盖上盖子)6小时。加入原硅酸四乙酯(0.6mL)，并将该混合物搅拌(盖上盖子)6分钟。另加入间苯二酚(0.4g)和甲醛(0.56mL)，并将该溶液再搅拌(盖上盖子)2小时。
将该反应混合物转移至2个离心管中，并在10℃以4700rpm离心5分钟。除去上清液，将新鲜的乙醇添加到每个管中，并使用2×40mL乙醇重复离心。去除上清液，并将粗样品转移到一个陶瓷皿中。使用乙醇(5毫升)辅助转移。将该粗样品在环境温度下干燥36小时。最后，将该样品煅烧，起始温度：33℃，升温速度：2℃/min，目标温度：550℃，保持时间：2小时。得到最终的二氧化硅纳米颗粒，为白色或类白色固体。
二氧化硅纳米颗粒合成，500毫升和5升规模
在配有4叶片斜置螺旋桨且具有可记录温度、pH和搅拌速度的数据记录功能的500mL或5L Radley反应器中进行反应。所用程序如“方案：二氧化硅纳米颗粒合成，100mL规模”所述，但试剂量和反应条件有所变化，如表2和表3所述。
二氧化硅纳米颗粒合成，10L规模
在配有4叶片斜置螺旋桨且具有可记录温度、pH、电导率、搅拌速度和扭矩的数据记录功能的20升Radley反应器中进行。如“方案：二氧化硅纳米颗粒合成，100mL规模”中所述，但试剂量和反应条件相应地有所变化，如表2和表3所述。对于10L规模的反应，采用了如下所述的安全措施。
使用紫外可见光谱法分析溶液的浊度
使用Avantes UV-Vis分光光度计，光程为1cm的样品池，周期性地取样并在不稀释的情况下分析200-700nm之间的溶液浊度。分析之后，将样品放回至所述反应器容器。
使用动态光散射(dynamic light scattering)分析粒径
周期性地取样并在不稀释的情况下进行分析以观察所述方法中的颗粒生长。使用动态光散射以Horiba SZ-100纳米颗粒分析仪测量粒径。分析之后，将所述样品放回至所述反应器容器。
扫描电子显微镜
使用扫描电子显微镜(Hitachi SU8230)对所有批次进行成像。当使用扫描电子显微镜时，起初在成像之前颗粒包覆有20nm铬层。然而，后续未包覆颗粒的分析在低电压下进行以防止充电，更具代表性地显示了表面形态。
使用热重分析法分析二氧化硅纳米颗粒的煅烧
采用热重分析研究了示例批次的二氧化硅纳米颗粒的质量损失。以2℃/min的升温速率从环境温度升温到550℃(空气中)，然后在550℃保持5小时。如下所述，还研究了煅烧过程的变化。
表2-用于二氧化硅纳米颗粒合成的试剂量
Figure BDA0002583699590000221
Figure BDA0002583699590000233
Figure BDA0002583699590000231
Figure BDA0002583699590000232
Figure BDA0002583699590000241
*该实验中间苯二酚的加入量较高
E使用乙醇(40mL)帮助转移至所述反应器
表3-二氧化硅纳米颗粒合成的工艺条件
Figure BDA0002583699590000242
Figure BDA0002583699590000251
Figure BDA0002583699590000252
结果与讨论
SiNP001和SiNP002(参考示例)
100mL规模进行了两种制备，目标是330nm的SiNP粒径。监测两个反应并在整个过程中拍摄图像。在合成SiNP001期间，还使用UV-Vis分光光度计进行浊度测量，观察到的浊度增加与视觉观察很好地相关。
使用扫描电子显微镜对铬包覆的和未包覆的颗粒成像。对未包覆的颗粒进行成像在较低的电压下进行以防止充电，其可以更好地表示显示表面形态。铬层的施加会导致表面结构被掩盖，错误地增大粒径，在许多情况下会导致颗粒团聚。在SiNP001和SiNP002制备中产生的颗粒的图像分别显示在图1和2中。
在制备SNP001和SNP002中产生的颗粒的平均粒度分别为242nm和300nm。在这两种情况下，表面形态都是有尖刺的。
成功地在制备SiNP002中复制了现有技术的合成后，使用Radley反应器将反应规模放大至500mL。除了规模外，Radley的装置比搅拌器加热板还具有更多优势，包括精确控制温度和搅拌器速度，以及监视工艺条件(搅拌器速度、温度和pH)的能力。迄今为止，已经进行了许多合成，这些总结如下。每个合成的结果将在以下各节中详细讨论。
SINP003-180nm目标粒径，始终25℃，350rpm搅拌器速度(参考示例)
当前工作程序的目标粒径为180nm，因此第一次规模放大制备的目标是该区域的粒径。反应监控显示反应温度、pH和搅拌器速度的一致性，图3。
在所述合成过程中，对所述反应混合物取样并使用动态光散射进行粒径分析。图4显示了约4小时后粒径演变至～200nm的稳定水平，随后在添加二氧化硅壳后粒径迅速增加。但是，最终煅烧的SiNP的SEM图像显示了所述技术之间的粒径差异。该差异可能是由于添加二氧化硅壳后颗粒折射率的变化，导致使用DLS的粒径异常高。包覆和未包覆颗粒的图像如图5所示。观察到一些颗粒团聚，并且难以确定表面形貌。制备SiNP003导致间苯二酚甲醛核的合成过程中，间苯二酚的剂量略有减少，这可能解释了所得的平均粒度(168nm)略小于所需的180nm。与间苯二酚的目标重量的这种小偏差对粒径有影响，在这种小规模下，该影响可能会更加明显，随着规模的扩大，该影响将变得不那么显著。搅拌器速度和类型是可能影响粒径以及观察到的团聚的其他因素。通常，使用螺旋桨桨叶搅拌比磁力搅拌器搅拌效果明显好得多，因此，搅拌器速度较慢导致较少的试剂和颗粒碰撞，利于形成较小的粒径。
SiNP004-180nm目标粒径，始终35℃，搅拌器速度350rpm
为了缩短合成180nm SiNP所需的时间，将SiNP合成的温度从25℃升高到35℃。在RF(间苯二酚-甲醛)核形成期间，间苯二酚略过量。反应温度升高的结果是双重的。首先，获得的颗粒明显更大(平均粒径367nm)，这可能是由于在形成颗粒的核和壳时更快的反应动力学所致。颗粒的分布也是双峰的，较小的颗粒很可能归因于二氧化硅除了所需的添加到RF核中以产生所述有尖刺的结构外，还进行了自缩合，如图6所示。所述颗粒的表面形貌似乎比前面的制备方法“更具有尖刺”，表明使用更高的温度成核而不是成壳，是有希望的。
另外，使用TGA研究了煅烧过程。保持在550℃时未观察到明显的质量损失，图7。此外，将颗粒煅烧14小时，并与缩短的煅烧过程(升温至550℃，然后保持2小时)进行了比较。没有观察到表面形态的明显差异，因此可以缩短煅烧时间，而不会对颗粒形态有不利地影响(图8)。
SiNP005-180nm目标粒径，35℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度
在SiNP004中观察到的双峰粒径分布是由于除了空心有尖刺的纳米颗粒之外还形成了固体二氧化硅纳米球。为了避免形成不希望得到的二氧化硅颗粒，使用35℃的聚合温度进行制备以形成颗粒核，然后在较低的温度(25℃)下进行以形成有尖刺的二氧化硅壳。在RF核的形成过程中间苯二酚的剂量略有过量。
所得的煅烧颗粒的SEM图像示于图9中。壳形成期间温度的降低导致单峰粒径分布，平均粒径为336nm。该结果证实，在核形成过程中提高聚合温度不会对粒径分布或表面形态产生不利影响。但是，在加入TEOS前冷却至25℃有助于消除副反应，特别是固体二氧化硅颗粒的形成。大于预期的粒径可归因于核形成过程中更快的聚合动力学。在该步骤中减少聚合时间应导致减小的粒径。间苯二酚的轻微过量也可能会导致进一步增加粒径。
SiNP005 V2-180nm目标粒径，35℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度
用较少量的间苯二酚重复SiNP005合成，以使试剂浓度的影响与核的聚合温度不相关。煅烧颗粒的SEM图像(图10)显示，与制备SiNP005时产生的颗粒相比，平均粒度减少了约80nm(从336nm减少到258nm)，这表明合成过程中SiNP粒径对试剂浓度敏感。粒径仍大于所需的180nm。这可能归因于核中更快的聚合动力学，并有望通过缩短核聚合时间进行调整。
SiNP006-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度
为了进一步减少聚合时间，间苯二酚甲醛核的聚合在45℃下进行，随后在添加TEOS之前将反应温度降低至25℃。与类似的35/25℃制备(SiNP 0005 II)相比，聚合发生的速度更快，这是由溶液浊度的较早出现所证明的。不含导电涂层的煅烧颗粒的SEM图像显示平均粒度为257nm，图11。颗粒的表面结构比前面的实验看起来“更具有尖刺”，这可能是增加聚合温度的结果。粒径大于预期可以用增加的反应温度来解释。在核形成过程中缩短反应时间可能有助于减小粒径。
SiNP006II-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，缩短核聚合时间
为了探索反应时间对粒径的影响，重复进行SiNP006制备，其中将45℃下的聚合时间减少到约90分钟。然后，在添加TEOS之前，与SiNP006一致，将反应温度降至25℃。没有导电涂层的煅烧颗粒的SEM图像显示平均粒度为260nm，与SiNP006中制备的颗粒一致。表面结构也与SiNP006中制备的颗粒一致，比前面的实验“更具有尖刺”(图12)。
SiNP006III-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，250rpm搅拌器速度，缩短核聚合时间
进一步重复SiNP006，其中将搅拌器速度从350rpm降低至250rpm。未涂层颗粒的SEM图像(平均粒度248nm)如图13所示。粒径和表面形态均与前面的SiNP006合成一致，说明降低的搅拌器速度不会导致任何显著差异。
SiNP006IV-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，进一步缩短核聚合时间
在图14中可以看到将核的聚合反应时间从90分钟缩短到60分钟的效果。确定的平均粒径为248nm，与SiNP006III获得的粒径相同。颗粒大于180nm的目标。因此，随后的实验集中在降低聚合物核形成过程中的单体浓度上，以评估其对总体粒径和形态的影响。
SiNP0007-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，降低的试剂浓度
在该实验中，用于制备聚合物核的间苯二酚和甲醛单体的浓度降低了25％。如图15所示，平均粒径已减小到188nm。同样明显的是，这在对颗粒的表面形态没有不利地影响的情况下实现。仔细检查图像也显示出少量的颗粒团聚，尽管在此阶段尚不清楚这是否是测量的伪像。将颗粒分散到缓冲水溶液中的进一步工作可能有助于确定颗粒是否聚集。
SiNP0007 II-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，降低的试剂浓度，延长冷却时间
为了探究冷却时间对粒径和形态的影响，重复进行了SiNP0007，其中冷却时间延长了30分钟。未涂层颗粒的SEM图像(图16)显示平均粒径为205nm。如预期的那样，由于更长的反应时间而增加了粒径。但是，当将延长的冷却时间纳入所述方法时，仍然可以实现所需的“有尖刺的”表面形态。
SiNP0007 V-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，降低的试剂浓度
进行SiNP0007的最终制备，得到的平均粒径为189nm，并且表面形态正确，如图17所示。很明显，可以按500mL的规模制备具有正确尺寸和形态的颗粒。在随后的部分中所示，还提供了出色的DNA负载和转染能力。在规模化上，由于试剂浓度的变化而出现的任何变化预计都不会那么大，在5L的规模制备时，该过程是可重现的，并且颗粒高度一致。
纳米颗粒的表征
通过透射电子显微镜TEM测试了一系列颗粒。进行SEM分析后，粒径和表面形态保持一致(图18)。这些颗粒还显示出所需的空心结构。
基于表征数据，可以确认通过本发明的方法制备的180nm二氧化硅纳米颗粒具有正确的尺寸和形态，适合于该目的，该方法应扩大至5L规模。
5L规模的工艺开发
在成功证明具有正确的表面形态和转染效率的180nm颗粒的合成之后，使用Radley's反应器将该工艺规模扩展至5L。迄今为止，已经进行了许多合成，这些合成总结在表2和3中。每个合成的结果在以下部分中详细讨论。
SiNP0008-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，250rpm搅拌器速度
在该实验中，按照实验SiNP0007保持反应条件，相应地试剂规模为表2。由于体积增加，搅拌器速度从350rpm降低至250rpm；基于SiNP006 III的结果，显示搅拌器速度的降低不会对粒径或形态产生不利影响。
未包覆的颗粒的SEM图像如图19所示。所述颗粒似乎是高度单分散的(PDI 0.11)，平均粒度为183nm，表面形貌恰好符合要求，说明了成功的按比例放大。
SiNP0008II-180nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，250rpm搅拌器速度
为了检查可重复性实验，在相同条件下重复了SiNP0008。未包覆颗粒的SEM成像(图20)显示平均粒径为184nm，单峰颗粒分布(PDI 0.10)和所需的表面形态，表明该过程在5L规模下可重现。
煅烧升温速率对形态的影响
该实验的目的是研究煅烧步骤中不同升温速率对表面形态的影响，以潜在地缩短煅烧步骤所需的时间。在该实验中，使用SNP0008 II粗产物。未包覆颗粒的SEM成像(图21)显示5和10℃/min的平均粒径分别为183nm和186nm。二氧化硅颗粒为“有尖刺的”，但是与SiNP0008 II相比，“尖刺”较少，并且观察到一些团聚。在相同条件下的热重分析(图22)显示，SiNP 0008II的重量损失是相似的，不受升温速率变化的影响。
针对亚180nm颗粒的工艺开发
成功合成180nm颗粒之后，尝试对该方法进行轻微修改以获得较小的二氧化硅纳米颗粒。已经进行了许多合成，其结果在以下各节中详细介绍。
SiNP0009-130nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度
该实验的目的是合成130nm的二氧化硅纳米颗粒。在该实验中，间苯二酚和甲醛的量减少了52％，所有其他反应条件均与合成SiNP 0007实验相同。图23显示了平均大小为135nm的未负载SiNP。尽管观察到团聚，但仍保持了有尖刺的表面形态。此外，形成聚合物核所需的时间从85分钟增加至175分钟。时间的增加是由于间苯二酚和甲醛浓度的降低，以及由此引起的颗粒碰撞，从而降低了聚合反应的速度。
SiNP0009II-130nm目标粒径，45℃ RF核聚合，25℃成壳，350rpm搅拌器速度，减少聚合生长时间
该实验的目的是研究聚合物减少的生长时间是否有利于合成130nm颗粒。未包覆颗粒的SEM图像(图24)显示平均粒径为162nm，并具有所需的“有尖刺的”表面形态。粒径显示出双峰分布，观察到颗粒的团聚。
SiNP0009 III-重复SNP0009(仅形成RF核)，并进一步缩短了聚合物的生长时间
在该实验中，在45℃的聚合生长时间从200分钟(SiNP 0009 II)减少到120分钟，并在添加TEOS之前停止。聚合在大约120分钟发生。所得未包覆颗粒的SEM图像如图25所示。间苯二酚甲醛颗粒的平均粒径为95nm。
SiNP 0009 IV 500mL Radley的反应器(150nm颗粒配方，仅45℃ RF核聚合，间苯二酚和甲醛(R&F)减少～16％)
此实验的目的是合成150nm大小的纳米颗粒。与SiNP0007相比，间苯二酚和甲醛的量减少了16％，并且聚合反应在45℃进行了105分钟。聚合和随后的沉淀在约125分钟发生。所得未包覆的RF颗粒的SEM图像如图26所示。所述RF颗粒的平均粒径为170nm。
SiNP00110-目标粒径180nm，RF核聚合45℃，成壳25℃，搅拌器速度350rpm
该实验的目的是研究氨水在此过程中的作用。在聚合步骤中，没有使用氨水(担心在高温下氨流失)。该实验的主要观察结果是在45℃和350rpm的反应运行时间195分钟后，没有发生聚合反应。加入氨水(14mL)的情况下，95分钟后正常出现沉淀。
在第二次加入间苯二酚和甲醛后20分钟，反应温度也从25℃增加到45℃。所得未包覆颗粒的SEM图像如图27所示。二氧化硅颗粒的平均粒径为305nm，并显示双峰分布。此外，在一些颗粒中观察到孔。所述粒径增加可能是第二次聚合步骤中温度升高的结果。另外，这种升高的温度可能已经削弱了颗粒结构，从而导致颗粒在煅烧步骤中破裂。
10升规模的工艺开发
在成功地证明了180nm的合成具有正确的表面形貌后，使用Radley's反应器将工艺规模扩大至10L。迄今为止，已经进行了许多合成，这些合成总结在表2和3中。每个合成的结果在以下部分中详细讨论。此外，该过程还采用了额外的安全措施。
引入的针对10L规模放大的安全措施
为了达到10L规模的安全运行范围，该过程采用了许多安全措施。
1.氮气吹扫系统-消除反应中的氧气，以最大程度降低着火的可能性。
2.静电放电塞-最小化点火的机会。
3.反应堆夹套中的静电放电添加剂-最小化着火的机会。
4.
Figure BDA0002583699590000311
甲醛检测-测试是否有甲醛暴露迹象。
SiNP001-180nm目标粒径，45℃ RF聚合，25℃成壳，160rpm搅拌器速度
在此实验中，反应条件按照实验SiNP0007保持，并相应调整了试剂量，表2。由于体积增加，搅拌器速度从350rpm降低到160rpm。基于SiNP006 III的结果，显示搅拌器速度的降低不会对粒径或形态产生不利影响。
未包覆的颗粒的SEM图像如图28所示。颗粒表现为高度单分散的(PDI 0.11)，平均粒径为183nm，表面形态完全符合要求，说明成功进行了放大。
SiNP0011 II-重复SiNP011
为了检验可重复性实验，在相同条件下重复了SiNP0011。未涂层颗粒的SEM成像(图29)显示平均粒径为181nm(PDI 0.13)和所需的表面形态，表明该过程在10L规模可重现。观察到小百分比的颗粒有孔，这是由于煅烧步骤中升温速率的意外变化，但是该变化固定在298℃。
通过TEM分析颗粒结构和形态
使用TEM分析5升和10升规模制备的颗粒样品，以确认其为空心结构以及表面形态。图像如图30所示。在所有情况下，所述颗粒都是空心的，具有所需的有尖刺的表面形态，粒径为～180nm，这证实了颗粒合成的成功放大。
增加工艺产量
成功合成180nm颗粒后，尝试对该工艺进行一些细微修改，以增加每体积溶剂的二氧化硅纳米颗粒的数量。已经进行了许多合成，其结果在以下各节中详细介绍。
SiNP0012-500 mL Radley's反应器(180nm目标粒径，在45℃下90分钟，在添加TEOS之前停止，5倍R&F浓度)
该实验的目的是在溶液中以较高的试剂浓度合成180nm二氧化硅纳米颗粒。在该实验中，间苯二酚和甲醛的量相对于实验SiNP0007增加了5倍。在停止实验之前，反应在45℃进行90分钟并冷却至25℃。图31显示了平均粒径为890nm的未负载SiNP。在实验过程中，聚合发生在大约23分钟中。由于间苯二酚和甲醛的浓度增加，预期聚合速率增加和粒径会增加。较大颗粒而不是大量颗粒的形成表明试剂浓度处于过饱和状态。
SiNP0012II-500mL Radley's反应器(180nm目标粒径，10℃，在添加TEOS之前停止，5倍R&F浓度)(参考示例)
在该实验中，反应条件类似于SiNP0012，间苯二酚和甲醛的量保持不变，在加入TEOS之前反应停止，但是反应在10℃下进行。图32显示了平均大小为644nm的未负载SiNP。在10℃时，从初始开始120分钟后，未发生聚合反应，温度升至25℃(11分钟)，在45分钟后发生聚合。
SiNP0012 III-缩短聚合时间并重复SiNP0012
反应在45℃下进行7分钟，然后冷却至25℃，然后停止反应。聚合发生了23分钟，进入所述冷却阶段。图33显示了平均粒径为412nm的未包覆的RF颗粒。与SiNP0012相比，减少聚合时间的确降低了粒径，但是如果没有更高的冷却功率，则不可能达到180nm的平均粒径。
SiNP00ll IV-500mL Radley's反应器，(180nm目标粒径，在添加TEOS之前停止，R&F降低～24％)
为了确认已知合成过程的RF核尺寸，重复了SiNP0007批次，但是在添加TEOS之前停止了反应。图34示出了平均粒径为128nm的未包覆的RF颗粒与观察到的180nm核/壳有尖刺的颗粒的核的大小一致。
制备的SiNP的粒径比较
表4显示了在CPI进行的每种二氧化硅纳米颗粒制备得到的粒径。大多数早期样品显示平均粒度在250nm左右，这表明反应时间落在所述聚合物核尺寸发展的稳定水平内。降低单体浓度会导致核尺寸相应减小，如SiNP0007(500mL规模)，SiNP0008(5L规模)和SiNP011(10L规模)所示。
表4-使用SEM测量的平均粒度(未包覆的颗粒)
Figure BDA0002583699590000331
Figure BDA0002583699590000341
结论
以100mL的规模制备了平均粒径为～300nm的颗粒。然后，工作重点是放大(500mL，5L和10L)，并使用Radley反应器对180nm SiNP的制备进行工艺改进，以精确控制工艺参数。在减少形成间苯二酚甲醛核的工艺时间方面取得了重大进展。另外，可在核形成过程中增加聚合温度，而对颗粒表面结构没有不利影响，实际上这通常是有益的。二氧化硅壳的形成优选在25℃下进行，以避免形成双峰颗粒分布，该双峰颗粒分布除了期望的空心、有尖刺的颗粒之外，还可能包含固体二氧化硅纳米球。
该方法已成功放大至500mL、5L和随后的10L，得到180nm的颗粒，具有低多分散性，正确的表面形态(如SEM和TEM所证明)和孔隙率。随着工艺规模的扩大，对粒径的控制得到了显着改善。还观察到每升反应溶剂中获得的颗粒浓度增加，在10升规模时增加到最大1.7克/升。根据表征数据，可以证实以10L规模制备的180nm二氧化硅纳米颗粒具有正确的尺寸和形态，适合所述目的。在实施例2中考虑了用聚乙烯亚胺改性的制备方法负载所制备的SiNP。
实施例2-用PEI负载SiNPs
材料和方法
表5给出了用于二氧化硅纳米颗粒改性的材料
Figure BDA0002583699590000351
表5：所用的材料
方法
进行实施例1中制备的二氧化硅纳米颗粒的PEI负载。这包括两个步骤，第一步是膦酸盐连接，即将膦酸盐连接剂3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基磷酸单钠盐溶液(THPMP)与所述二氧化硅纳米颗粒(SNP)在40℃下混合2小时。第二步是负载聚乙烯亚胺(PEI)，即将膦酸盐连接的二氧化硅纳米颗粒与PEI混合，与二氧化硅相比，PEI 5倍过量。此过程在室温下进行超过4小时。
如上所述，该方法耗时超过4个小时，因此进行了一系列实验，通过减少每个步骤的混合时间并确定升温效果，并跟踪每个步骤在不同时间的反应来改善所述方法。已通过两种不同方式分析了变化：Zeta电位和碳氢氮(CHN)分析。
PEI负载-实验室规模
对实施例1中生产的纳米颗粒批次SNP008，SNP008-II，SNP007，SNP007-VI，SNP011和SNP011-II进行PEI负载。由于产品的量低，为了进行CHN分析，使用200至300mg的二氧化硅放大了规模。组分之间的所有比率都保持在同一水平。
PET负载-250mL规模和100mg SNP008
反应在250毫升Radley反应器中进行，该反应器配备有4叶片斜置螺旋桨，并具有温度、pH和搅拌器速度的数据记录功能。引入的SNP的量从30mg增加到1000mg。增加其他反应物的量以保持反应物在相同比例。调节所用溶剂的体积以适合反应器，即，使用100mL的H2O溶解和分散所述THPMP和SNP。此外，分别使用100mL和50mL的碳酸盐缓冲液(pH 9.8)来分别使PEI和膦酸盐连接的SNP悬浮。获得产率50％(53mg)。
所用的材料在下表6中给出。
试剂 用量
SNP 100mg
THPMP 710μL
PEI-10K 500mg
表6：使用的材料
膦酸盐连接的研究-500ml规模，500mg SNP008
反应在配备有4叶片斜置螺旋桨和具有温度、pH值和搅拌器速度数据记录功能的500ml Radley反应器中进行。重点是优化膦酸盐连接步骤的反应时间。SNP和THPMP混合后，首先将颗粒以10000rpm的速度离心10分钟，然后除去上清液，并将所述颗粒重新悬浮在H2O中，并在相同条件下再次离心。最后再次除去上清液，并将所述颗粒在室温下干燥两天。
在此吸附研究中，每30分钟采集40mL样品。实验是在3个不同的温度(40℃、50℃、60℃)下进行的，以探索温度对反应速度的影响。
SNP的量从30mg增加到500mg，但是反应物之间的比例保持不变。这样做是为了确保在每个样品中获得足够量的产物。调节所用溶剂的体积以适合反应器，即，使用220mL的H2O来分散SNP并溶解THPMP。下表7中给出了所使用的材料。
反应物 用量
SNP 500mg
THPMP 3.550mL
表7：使用的材料PEI负载的研究-500mL规模，500mg SNP008
反应在配有4叶片斜置螺旋桨的具有温度、pH和搅拌器速度数据记录功能的500mLRadley反应器中进行。重点是在PEI负载步骤中优化反应时间。首先制备膦酸盐连接的颗粒的溶液。因此，对于随后的不同实验，从相同的制备溶液中负载PEI。
该溶液的条件如下：
反应物 用量
SNP 1500mg
THPMP 10.650mL
H<sub>2</sub>O 220mL×2
表8：使用的材料
在40℃混合并搅拌2小时后，离心和洗涤，然后将颗粒重新悬浮在480毫升碳酸盐缓冲溶液中。然后将这种溶液的三分之一(160mL)用于不同的实验。与此步骤并行，将2.5gPEI-10K悬浮在320mL的碳酸盐缓冲溶液中。
在此研究中，实验在2个不同的温度30℃和50℃下进行。在每种温度下在45分钟、1小时45分钟、2小时45分钟和4小时之后取样。在30℃下收集的样品体积为40mL，在50℃下收集的体积为80mL。之所以决定将收集的体积增加一倍，是因为在30℃实验后获得的产物(～15mg)很少。
最终放大的改性过程
在完成几次实验后，采用了最终放大的改性过程，该过程可以提供良好的吸附，如氮含量所示。所有量都乘以10。膦酸盐连接反应是在250mLRadley反应器中于40℃进行2小时，该反应器配备有成4叶片斜置螺旋桨，并具有温度、pH和搅拌器速度的数据记录功能。PEI负载在热板搅拌器上的玻璃瓶内室温下完成。
使用的条件如下：
反应物 用量
SNP 300mg
THPMP 2.150mL
H<sub>2</sub>O 100×2
碳酸盐缓冲液pH9.8 100+50
PEI 1.5g
表9：使用的材料
使用动态光散射Zeta电位分析表面电荷
使用动态光散射来表征表面电荷，尤其是颗粒的等电点(IEP)。使用Horiba SZ-100纳米颗粒分析仪测量Zeta电位随pH的变化。使用此技术可提供有关颗粒表面电荷的信息。当Zeta电位达到0mV时达到IEP。了解未改性和PEI饱和颗粒的IEP，使我们能够跟踪PEI负载的演变。当在裸颗粒表面开始吸附时，IEP将向完全饱和的表面移动。此外，应注意的是，此技术对于pH<2和pH>12而言是非常不准确的。
通过将固体颗粒分散在酸性或碱性溶液中来制备样品。通过在100mL 10-3M KCL溶液中逐滴加入HCl或NaOH(10-2M)来制备该溶液。当期望高IEP时，将颗粒分散在酸性介质中，反之亦然。然后滴加酸或碱以改变溶液的pH并监测颗粒表面电荷的演变。
使用C：H：N分析对PEI浓度进行分析
C：H：N分析使我们能够检查PEI是否已成功负载到颗粒上并量化了吸附量。该技术测量颗粒表面上碳、氮和氢的百分比。为了本研究的目的，分析的重点是PEI的主要成分氮的含量。通过在不同的时间和不同的温度下分析不同的样品，它提供了有关对反应及其速度的理解的信息。这是Zeta电位分析的一项补充技术，可将两组结果关联起来。进行一次分析至少需要30mg的样品。
扫描电子显微镜
扫描电子显微镜用于检查膦酸盐连接或PEI负载是否引起了颗粒形态的任何变化。
结果与讨论
SNP008上的PEI负载
对未改性和改性的二氧化硅纳米颗粒进行了Zeta电位分析。图35显示了使用DLS进行Zeta电位分析的结果。观察到IEP的巨大差异。未包覆的SNP008的IEP约为pH3，而负载PEI时，IEP升高至pH10。二氧化硅未包覆时表面带负电，而一旦负载PEI，则带正电，这与预期一致。这些结果是可预期的，因为未包覆的颗粒表面上含有羟基，而负载PEI的颗粒含有pKa约为10.5的二甲胺基。
SNP 008-250mL规模-100mg SNP
通过在250mLRadley反应器中将颗粒量增加至100mg(与30mg相比)来进行首次放大。图36显示了按比例放大的颗粒的Zeta电位分析的结果。观察到IEP的细微差别，但是由于设备的精度，差别并不明显。但是，对于较低的pH值，当达到稳定水平时，我们注意到在两个样品之间的大小相差约20mV。通常，电荷量越高，颗粒越稳定。
膦酸盐连接的SNP008
进行了一系列与优化膦酸盐连接步骤有关的实验，以确定是否可以更早地停止改性过程。图37描述了如上所述获得的SNP的Zeta电位随pH的变化。
如未改性的SNP所观察到的那样，表面带负电，IEP约为pH3，但是在处理后，IEP略有下降，小于pH2。低于pH2的结果是不准确的，但可以认为这些颗粒的IEP趋于亚磷酸的pKa约为1.5。该结果证实在PEI负载期间颗粒带负电更多。使用Zeta电势分析无法通过在不同时间收集样品来监测膦酸盐连接以优化流程是不可能的，因为所述IEP低于设备的pH极限。
稍后使用C：H：N分析对所得颗粒进行分析以优化此步骤。所述膦酸盐连接剂包含丙基和甲基，并且表面的碳含量可以作为很好的指标来监测这一步骤。但是，批次之间获得的结果是相当随机的，表明可能有来自环境的污染(观察到一些样品的C和N含量都很低)。
然而，在同一批次内，随时间变化，碳含量相当恒定，如图38所示。通过此结果，我们认为可以大大减少此步骤中的混合时间，因此仅混合了30分钟(第一个测量点)即达到了稳定水平。
PEI负载步骤的优化-SNP008-500mL规模，500mg SNP，30℃
上面的图描述了上述所得的SNP的Zeta电位随pH值的变化。图39还描述了在不同反应时间，Zeta电位随pH的变化。进行这些实验是为了减少PEI负载混合步骤的最初4小时。大多数样品是通过将2mg颗粒溶解在100mL酸溶液中制备的。通过这样做，预期IEP将从约2(膦酸盐连接的颗粒)变为10(完全包覆的颗粒)，但也可能达到稳定水平，这意味着所有表面都被PEI饱和。但是，反应开始后仅用了45分钟(即第一个测量点)即达到稳定水平，如图38所示。基于这些结果的假设是，反应45分钟后达到了颗粒的最大PEI负载能力。因此，该反应无需进行4小时。这可以通过以下事实解释：与二氧化硅颗粒相比，引入了5倍过量的PEI。考虑到这一点，可以进行进一步的实验以减少引入的PEI的量，从而降低成本。
关于分析期间颗粒的分散性进行了第二次观察。图39顶部的两个图表显示了将颗粒分散在酸和碱性介质中时的结果。尽管尚未完全理解，该曲线始于如所预期的涂覆表面的高正电荷(pH值为10)，但随着介质变得更酸性，该曲线可能显示PEI不稳定。
PEI负载率的评估
如图40所示，IEP在第一个测量点(45min)达到一个稳定水平。基于这些结果，做出如下假设：反应45分钟后达到了全负载量，不需要将反应进行4小时。还认为，尽管需要进行优化，由于PEI是过量加入，可以减少PEI的量。
进行了以下一组实验，以确定引入的PEI的量是否可以减少，还可以确定颗粒表面的负载率。为此，对SNP011和SNP011-2的实验使用比平时低2.5倍的PEI含量。条件如表10所示。
Figure BDA0002583699590000401
Figure BDA0002583699590000411
表10：实验条件
首先，在反应30分钟后进行zeta电位分析，以检查IEP最终是否在2到10之间变化。结果显示在下面的图41中。
在图41中，IEP在pH10.5左右。该值与先前发现的IEP十分相似，尽管在这种情况下，PEI的引入量是2倍过量(与之前的5倍相比)，并且吸附反应仅进行了30分钟。为了更好地估计负载速率，PEI负载(2倍过量)仅5分钟后，进行了另一次分析(图42)。
反应5分钟后，IEP仍然与之前非常相似。但是，所述稳定水平的大小急剧下降，如图41所示约为40mV，此处约为20mV。
假定PEI非常快地覆盖了颗粒表面，这就是为什么仅在5分钟的反应后颗粒表面带正电的原因。但是，在图41和图42之间，在pH<9时，总的Zeta电位观察到巨大的差异。假定该差异是由于反应5分钟后负载的PEI量较低，但也可能是由于使用每个实验的样品类型不同。此外，还注意到，对于图41中显示的结果，(PEI量比平时低2.5倍，并且仅30分钟的反应)的电荷量水平和IEP与通常条件下(PEI 5倍过量-4小时)改性的颗粒相同。为了证实这些观察结果，对表10中列出的一组实验进行了C：H：N分析。结果显示在下面的图43中。
图43显示了在两个不同批次的颗粒(10L批次)和两个不同的时间尺度上，PEI负载过程中氮含量的变化。在两个曲线图上均示出了平均氮含量。
图43中所示的结果是使用PEI 2倍过量(与5倍UQ工艺相比)获得的，这意味着聚合物比通常少60％。首先，两个批次的总氮含量均随时间恒定，约为2％，高于所观察到的使用常规方法的平均含量。在下一部分中通过以下事实来解释该较高的值：在此，膦酸盐连接已在能够更好地控制温度的Radley反应器中完成。其次，观察到混合仅5分钟后，达到2％的氮含量，此后氮含量保持在相同水平。这是一个有趣的结果，因为它可能表明(i)PEI量可以显着减少，并且(ii)最初4小时的混合可以减少到5分钟。然而，在这种情况下，在混合结束和随后的离心步骤之间的过渡没有特别的控制，因此在混合完成后，通过扩散可以继续进行负载过程。另外进行一个实验，其中在混合后立即转移至离心机以确认负载水平。获得的氮含量在相同范围(1.82％)中，这说明5分钟的混合足以使PEI负载发生。
PEI负载在SNP07/07_VI/08/08II/011/011_II
Figure BDA0002583699590000421
表11：实验室规模的颗粒的氮含量(wt％)
为了检查PEI是否正确负载在先前合成的颗粒上，进行C：H：N分析。结果显示在上面的表11中。PEI负载是通过第一种工艺执行的。由于对某些样品收集的产品量少，为进行C：H：N分析，通过在第一工艺上增加用量(第二工艺)进行PEI负载。使用加热板搅拌器在玻璃瓶中进行反应。昆士兰大学(University of Queensland)观察到，这些PEI负载颗粒的总氮含量低于预期水平2.5-3.4％。此外，观察到颗粒之间的细微差异。为了找到差异的原因，对不同的未负载颗粒进行了BET表面分析。表7中的结果表明08_II和011_II具有较高的表面积和PEI含量。此外，如前所述，使用250mL玻璃瓶和电热板搅拌器对某些样品进行了改性(第二工艺)。假设溶液内部的热量分布不均，这解释了如在SNP01 1_2第二种工艺上观察到的氮含量为1.23％，而且总体氮含量较低的异常现象。
PEI负载量的增加
在表11中显示的C：H：N分析的结果后，进行了几次增加PEI装载量的尝试。颗粒中的氮的百分比低于预期的2.5-3.5％。为了达到该值，重点是增加与颗粒连接的膦酸盐的量。首先，用Radley反应器而不是加热板搅拌器上的玻璃瓶进行了膦酸盐连接步骤，因此可以更好地控制温度。然后通过将反应温度从40℃升高至60℃和90℃来进行膦酸盐连接步骤。
在另一个实验中，碳酸盐缓冲液的pH从9.8增加到10.96，因为人们认为带更多负电荷的连接剂会增加聚合物的负载，引入的PEI数量是通常的两倍量。注意，由于在表12中显示了高氮含量，因此决定对SNP008-2进行这些实验。
在下表中了所用条件的总结：
名称 加热 内部T pH 具体情况
40C PEI 40C 37.5C 9.8 标准PEI负载
40C PEI×2 40C 37.5C 9.8 PEI负载过程中双倍PEI量
40C PEI pH+1 40C 37.5C 9.8 碳酸盐缓冲溶液pH+1(10.96替代9.8)
60C PEI 60C 55C 9.3 标准PEI负载
90C PEI 110C 90C ～9 标准PEI负载
表12：实验条件
这组实验的C：H：N分析的结果在下面的表13中显示：
样品 N(wt％) PEI含量
40C-PEI 2.295 7.3％
40C-PEI*2 1.973 6.3％
40C-PH+1 2.050 6.5％
60C-PEI 1.807 5.8％
90C-PEI 1.483 4.7％
表13：氮和PEI含量(wt％)
大体而言，与表11所见结果相比，氮含量有所增加。证实了Radley反应器的PEI负载更好，因为溶液中的热量分布更好。然而，如上表所示，温度升高，PEI量或碳酸盐pH均未进一步提高PEI含量。实际上，当温度升高时，氮含量会降低。这可以通过以下事实解释：在此期间，pH降低，并且反应似乎对pH的敏感性比对温度的敏感性更高。
结论
工作重点是使用Radley反应器进行工艺改进，精确控制工艺参数。在减少处理时间以及减少用于PEI负载的材料量方面取得了重大进展。结果表明，PEI量至少可以减少60％，并且负载过程仅需要持续5分钟。还确定可以减少进行膦酸盐连接步骤所需的时间，但是需要进一步的实验来确认这一发现。与进行该方法的温度有关的另一项关键观察结果是，升高温度会降低该方法的有效性，从而导致较低的聚合物含量。如果需要考虑到生物相容性问题，需要将PEI负载设置为较低的值，则此参数可能是有用的控制参数。
实施例3-制备SiNPs并负载核酸
方法
未负载的二氧化硅纳米颗粒的合成和分析
未负载的二氧化硅纳米颗粒的合成-10L规模
反应是在20升Radley反应器中进行，该反应器配有4叶片斜置螺旋桨，并且具有温度、pH、电导率、搅拌器速度和扭矩的数据记录功能。
将Radley Pilot反应器(20L)抽真空至约-0.75bar，并用氮气吹扫3次。将恒定的氮气以0.1mL/min的速度送入该容器。在该容器中装入乙醇(8200mL)、水(1178mL)和氨水(350mL)，并以160rpm搅拌(盖上盖子)。然后将反应介质加热至45℃。将间苯二酚(12.8702g)溶解在乙醇(130mL)中。加入间苯二酚和甲醛(18L)，并将该溶液于45℃搅拌90分钟(盖上盖子)。在35分钟内将温度从45℃降至25℃。加入原硅酸四乙酯(70mL)，并将该混合物搅拌(盖上盖子)6分钟。再称取间苯二酚(47.2829g)并溶于乙醇(100mL)中。加入间苯二酚和甲醛(66mL)，并将该溶液进一步搅拌(盖上盖子)2小时。
将该反应混合物转移至15L的瓶中。将反应混合物装入四个离心瓶(ThermoScientific Nalgene，1L)中，并在10℃下以4700rpm离心5分钟。除去上清液，将更多的反应混合物装入离心瓶，并在相同条件下离心。重复离心步骤，直到所有反应混合物都进行了离心。将新鲜乙醇(100mL)加入每个瓶中，并在相同条件下离心。除去上清液，将粗样品在空气中于环境温度下干燥～17小时。
将干燥的粗样品转移到陶瓷皿中，并放入炉中。将样品以每分钟2℃的速度从环境温度加热到550℃，并保持5小时，然后自然冷却。
表14.合成二氧化硅纳米颗粒的实验用量-10L规模
试剂 SiNP NUMed(批次11(IV))
乙醇/mL 8230
水/mL 1178
氨水/mL 350
间苯二酚/g[第一次添加] 12.8702
甲醛/mL[第一次添加] 18
原硅酸四乙酯/mL 70
间苯二酚/g[第二次添加] 47.2829
甲醛/mL[第二次添加] 66
SiNP产量/g 17.239
表15.合成二氧化硅纳米颗粒的实验过程参数-10L规模
Figure BDA0002583699590000451
未负载的二氧化硅纳米颗粒的SEM分析
SEM样品制备：将所述样品从小瓶中取出，并用刮刀的平端压在带有粘性碳片的SEM螺柱上。SEM分析：使用Hitachi SU8230扫描电子显微镜对所有批次的SiNP成像。
未负载的二氧化硅纳米颗粒的TEM分析
使用以下方案完成TEM分析：将10μL溶液滴加到包覆碳的400目铜网上。用一张滤纸除去过量的溶液，并将该网干燥。在Philips CM 100TEM上以100kV观察样品。使用具有AMT40版本5.42图像捕获引擎的CCD摄像机Optronics 1824x1824像素捕获图像。铜网由Gilder grids提供，并使用Quorum Q 150T ES镀膜装置进行碳包覆。
未负载的二氧化硅纳米颗粒的BET分析
使用MicroActive for TriStar II Plus软件在Micromeritics TriStar IIPlus和Micromeritics VacPrep 061 Sample Degas System上进行了分析。
称重空的试管，并使用金属漏斗将样品添加到该试管中，直到球管充满一半。添加后称重试管。将试管置于80℃的真空下至少12小时。脱气后称重试管并进行分析。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的合成和分析
二氧化硅纳米颗粒的PEI负载-30mg规模
二氧化硅纳米颗粒(见表16中的质量)悬浮在去离子水中(10mL)并进行超声处理10分钟。将3-(三羟基甲硅烷基丙基甲基膦酸酯)(THPMP)(0.21mL)溶于去离子水(10mL)中。合并溶液，并用磁力搅拌器在40℃、200rpm下搅拌2小时。将得到的浑浊白色溶液在25℃下以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并用去离子水(10mL)悬浮颗粒。将得到的溶液在25℃以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并将该颗粒用碳酸盐缓冲溶液(5mL，碳酸钠(1.5926g)和碳酸氢钠(2.9333g)在去离子水(1000mL)中)悬浮。
聚乙烯亚胺(PEI)(参见表16中的质量)通过剧烈摇动溶解在碳酸盐缓冲溶液(10mL)中。合并溶液，并用磁力搅拌器在200rpm、25℃下搅拌4小时。将得到的浑浊白色溶液在25℃下以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并用去离子水(10mL)悬浮颗粒。将得到的溶液在25℃以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并将该颗粒在室温下干燥，得到固体白色产物。
表16.二氧化硅纳米颗粒的PEI负载的实验细节-30mg规模
样品 质量/mg PEI/mg PEI SiNP产品/mg
SINP NUMed第1轮 30.1 149.9 37.7
SINP NUMed第2轮 30.0 149.7 31.5
SINP NUMed第3轮 30.0 149.8 31.5
二氧化硅纳米颗粒的PEI负载-5g规模
二氧化硅纳米颗粒(见表17中的质量)悬浮在去离子水中(300mL)，超声处理15分钟。将3-(三羟基甲硅烷基丙基甲基膦酸酯)(THPMP)(12.8mL)溶于去离子水(300mL)中。合并溶液，并用磁力搅拌器在40℃、500rpm下搅拌2小时。将所得(带有可见颗粒)的浑浊白色溶液在25℃以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，将颗粒悬浮在去离子水中(约15mL/管)。将得到的溶液在25℃以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并将该颗粒在室温下干燥，得到固体白色产物。
将负载有所述膦酸盐的二氧化硅纳米颗粒取样，并将剩余的颗粒用碳酸盐缓冲溶液(200mL)悬浮。将聚乙烯亚胺(PEI)(见表17中的质量)通过剧烈摇动溶解在碳酸盐缓冲溶液(300mL)中。合并溶液，并用磁力搅拌器在25℃，500rpm下搅拌4小时。将得到的具有可见颗粒的浑浊白色溶液在25℃下以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并用去离子水(约15mL/管)悬浮。将得到的溶液在25℃以10,000rpm离心10分钟。除去上清液，并将该颗粒在室温下干燥，得到固体白色产物。
表17.二氧化硅纳米颗粒PEI负载的实验细节-5g规模
Figure BDA0002583699590000471
PEI负载二氧化硅纳米颗粒的DLS zeta电位分析
在Horiba，Scientific Nanopartica，纳米颗粒分析仪SZ-100上使用Horiba SZ-100软件进行分析。测量是在25℃的水中进行，重复两次(in duplicate)。
将二氧化硅纳米颗粒样品(2mg)分散在去离子水中(1mL)中，在透明水溶液中得到白色固体颗粒。超声处理样品直至出现浑浊的白色溶液，无可见固体白色颗粒。将6滴(pipette drops)样品滴加到KCl溶液(10-3M，100mL)中。用注射器(2mL)将所得溶液注入到电极池中，确保在池中看不到气泡，并记录了zeta电位。
DNA/RNA和PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的合成与分析
PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的DNA负载用于DNA定量
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与无核酸酶10mM磷酸盐缓冲盐溶液(1000μL)混合形成的储备溶液超声处理5分钟，移液，然后超声处理5分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。将该溶液等分(10μL)。将DNA制成储备溶液，以等分1μL。从DNA储备溶液中加入DNA(1μg)，移液3次以混合。将溶液在5℃的冰箱中静置4小时。然后将该溶液在25℃下以10,900rpm微量离心13分钟。吸出上清液用于DNA定量。
阳性对照：将DNA(1μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液的混合物中移液3次以混合。将该溶液在5℃的冰箱中静置4小时。然后将溶液在25℃下以10,900rpm微量离心13分钟。吸出上清液用于DNA定量。
阴性对照：无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(10μL)。
用于DNA定量的DNA和PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的紫外可见分析
使用NanoDrop 8000分光光度计和2μL样品测定所述上清液中的DNA浓度。
DNA和PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的DLS zeta电位分析
使用Horiba SZ-100软件在Horiba的Scientific Nanopartica纳米颗粒分析仪SZ-100上进行分析。在10mM磷酸盐缓冲盐溶液中在25℃进行测量，重复两次(induplicate)。
将PEI-SiNP颗粒(100μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(200μL)混合形成的溶液超声处理5分钟，移液，然后超声处理5分钟，得到均质的浑浊白色溶液。将DNA制成储备液以等分1μL。从DNA储备溶液中加入DNA(10μg)，移液3次以混合。将该溶液在5℃的冰箱中静置4小时。然后将该溶液在25℃下以10,900rpm微量离心13分钟。将所得产物重悬于10mM磷酸盐缓冲盐溶液(5mL)中。使用注射器(2mL)用所得溶液填充电极池，确保在池中看不到气泡，并记录了zeta电位。
在此应该注意的是，对于所有DNA和RNA负载的zeta电位分析，不能确保所有设备都不含核酸酶，但是已采取措施尝试使实验尽可能地不含核酸酶。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的RNA负载用于RNA定量
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(1000μL)混合形成的储备溶液中进行超声处理5分钟，移液，然后再超声处理5分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。将该溶液等分(10μL)，将RNA(1μg)直接从原料中加入，移液3次以混合。将该溶液在5℃的冰箱中静置4小时。然后将该溶液在25℃下以10,900rpm微量离心3分钟。吸出上清液用于RNA定量。
阳性对照：将RNA(1μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(10μL)的混合物移液3次以混合。将该溶液在5℃的冰箱中静置4小时。然后将该溶液在25℃下以10,900rpm微量离心3分钟。吸出上清液用于RNA定量。
阴性对照：无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(10μL)。
用于RNA定量的RNA和PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的荧光分析
使用Qubit 3.0荧光计和Qubit RNA BR试剂盒测定上清液中的RNA浓度。将该样品和试剂盒RNA标准品与Qubit染料混合，并使用Qubit 3.0荧光计上的RNA广谱分析程序进行分析。
RNA和PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的DLS zeta电位分析
使用Horiba SZ-100软件在Horiba的Scientific Nanopartica纳米颗粒分析仪SZ-100上进行分析。10mM磷酸盐缓冲盐溶液中在25℃进行测量，重复两次(in duplicate)。
将PEl-SiNP颗粒(100μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(200μL)的混合物超声处理5分钟，移液，然后再超声处理5分钟，得到均质的浑浊白色溶液。直接从原料中加入RNA(10μg)，移液3次以混合。将该溶液在5℃的冰箱中静置4小时。将所得产物重新悬浮在10mM磷酸盐缓冲盐溶液(4.8mL)中。使用注射器(2mL)用所得溶液填充电极池，确保在池中看不到气泡，并记录了zeta电位。
用于稳定性测试的PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的体外DNA负载
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(1250μL)混合形成的储备溶液进行超声处理5分钟，移液，然后再超声处理5分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。将该溶液等分(100μL)。将DNA制成储备溶液，以等分1μL。从DNA储备溶液中加入DNA(4μg)，移液3次以混合。将该溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物取样以进行DNA定量。然后在6小时的时间点，将溶液在25℃以10,900rpm微量离心13分钟。取上清液进行DNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阳性对照：将DNA(4μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)的混合物移液3次以混合。该操作重复两次(in duplicate)，其中一个样品取样进行DNA定量，并立即速冻用于毛细管电泳。将另一溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物取样以进行DNA定量。然后在6小时的时间点，将所述溶液在25℃以10,900rpm微量离心13分钟。上清液取样进行DNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阴性对照：无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)。
用于稳定性测试的负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的体外RNA负载
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(1250μL)混合形成的储备溶液中进行超声处理5分钟，移液，然后再超声处理5分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。将该溶液等分(100μL)，直接从原料中加入RNA(4μg)，再移液3次以混合。将该溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物进行采样以进行DNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阳性对照：将RNA(4μg)与无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(1250μL)的混合物移液3次以混合。该操作重复两次(in duplicate)，其中一个样品取样用于RNA定量，并立即速冻用于毛细管电泳。将另一溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物进行采样以进行RNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阴性对照：无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)。
用于稳定性测试的PEI负载的二氧化硅纳米颗粒的体内DNA负载
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与0.22μm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)混合形成的溶液在平板振荡器上以500rpm的速度搅拌1分钟。然后将该溶液超声处理10分钟，移液，再超声处理10分钟，再移液，然后再超声处理10分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。将DNA制成储备溶液，以等分1μL。从DNA储备溶液中加入DNA(50μg)，移液3次以混合。将该溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物进行DNA采样。然后在6小时时，将所述溶液在25℃以10,900rpm微量离心13分钟。取上清液进行DNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阳性对照：将DNA(50μg)与0.22μm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)混合形成的溶液移液3次以混合。该操作重复两次(induplicate)，其中一个样品取样进行DNA定量，并立即速冻用于毛细管电泳。将另一溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对混合物进行DNA采样。然后在6小时的时间点，将所述溶液在25℃以10,900rpm微量离心13分钟。取上清液进行DNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阴性对照：0.22μm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)。
用于稳定性测试的负载PET的二氧化硅纳米颗粒的体内RNA负载
将PEI-SiNP颗粒(500μg)与0.22μm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)混合形成的溶液在平板振荡器上以500rpm的速度搅拌1分钟。然后将该溶液超声处理10分钟，移液，再超声处理10分钟，再移液，然后再超声处理10分钟，得到均匀的浑浊白色溶液。直接从原料中添加RNA(50μg)，移液3次以混合。将该溶液在平板振荡器上在冰浴中4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物进行取样以进行RNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阳性对照：将RNA(50μg)与0.22pm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)混合形成的溶液移液3次以混合。重复两次(induplicate)，其中一个样品取样进行DNA定量，并立即速冻用于毛细管电泳。将另一溶液在平板振荡器上在冰浴中在4℃以550rpm搅拌6小时。在0、2和6小时的时间点对所述混合物进行取样以进行RNA定量，并在6小时的时间点进行速冻以进行毛细管电泳。
阴性对照：0.22μm过滤的0.5％(w/v)羟甲基纤维素的无核酸酶的10mM磷酸盐缓冲盐溶液(100μL)。
用于DNA分析的毛细管电泳(CE)
在CE分析之前，将上清质粒DNA样品(卵白蛋白(OVA)pDNA和人乳头瘤病毒(HPV)pDNA)用BamHI酶消化并用Monarch PCR&DNA纯化试剂盒纯化。然后将预处理的质粒DNA样品在Lab Chip GXii系统上运行。使用PerkinElmer的DNA 5K试剂盒分析样品。一个较低和较高的分子量标记(存在于试剂盒标记缓冲液中)与每个样品一起运行。一个分子量标记(DNA5K试剂盒中的DNA ladder)与样品同时运行。
用于RNA分析的毛细管电泳
将上清液mRNA样品(OVA mRNA)在Lab Chip GXii系统上运行。使用来自PerkinElmer的RNA pico分析试剂盒分析样品。用RNA pico分析试剂盒样品缓冲液对mRNA样品进行预处理，并在70℃下加热2分钟。一个较低的分子量标记(存在于试剂盒样品缓冲液中)与每个样品一起运行。一个分子量标记(RNA Pico分析试剂盒中的RNA ladder)与样品同时运行。
结果与讨论
纳米颗粒的合成，表征和负载
10L批次二氧化硅纳米颗粒的合成
制备了10L批次的二氧化硅纳米颗粒，称为SiNP NUMed(批次11(IV))。通过SEM表征所得的空白二氧化硅纳米颗粒的粒径和外观。
图44显示了SiNP NUMed的SEM图像。在SEM图像上进行了颗粒分析，计算的结果表明颗粒的平均粒径为203±25nm(计数161，标准偏差为24.6nm，模式为204nm)。在SEM图像中观察到均匀的颗粒(PD1 0.12)，并且颗粒似乎具有所需的有尖刺的表面形态。
图45显示了SiNP NUMed的TEM图像。从TEM图像的分析计算出195nm的平均粒径。平均核直径计算为96nm，平均壳厚度计算为51.35nm。
所述颗粒的表面积对于PEI和随后的核酸负载非常重要，并由Brunauer-Emmett-Teller(BET)氮吸附确定。对于SiNP NUMed纳米颗粒，测定的表面积为172m2/g。
二氧化硅纳米颗粒30mg规模的PEI负载
发现PEI SiNP NUMed第1、2和3轮实验的zeta电位分别为3.9、7.9和22.2mV。这表明PEI已负载。
二氧化硅纳米颗粒5mg规模的PEI负载
发现PEI SiNP 0011 II第1和2轮实验的zeta电位分别为18.1和15.8mV。这表明PEI已负载。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的DNA负载
多批负载PEI的SiNP纳米颗粒进行了eGFP pDNA负载，实验重复三次(intriplicate)。表18显示，所述颗粒已成功负载eGFP DNA。
表18.eGFP DNA负载的DNA定量结果
Figure BDA0002583699590000531
OVA和HPV核酸(pDNA和mRNA)的负载和定量
通过分析溶液中DNA/RNA的浓度以算出颗粒表面相对于阳性对照的浓度，来测试OVA pDNA，HPV pDNA和OVA mRNA的负载。Zeta电位分析还用于确认颗粒表面电荷从正(PEI)到负(核酸)的变化。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的OVA pDNA负载
负载PEI的SiNPs进行OVA DNA负载，实验重复三次(in triplicate)。如表19所示，相对于阳性对照，在0和4小时的时间点，实现了在目标负载范围为100-140ng/μg内的负载，如表19所示。
表19.OVA DNA负载DNA定量的结果
Figure BDA0002583699590000532
Figure BDA0002583699590000541
负载有HPV DNA的颗粒的Zeta电位分析显示了预期的负表面电荷(-8.8mV)，表明核酸负载。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的HPV pDNA负载
观察到PEI负载的SiNP纳米颗粒成功地负载了HPV pDNA。pDNA装载的结果显示在表20中。
表20.HPV DNA负载的DNA定量分析结果
Figure BDA0002583699590000542
负载HPV DNA的颗粒的相应zeta电位分析显示了预期的负表面电荷(-7.8mV)，表示核酸负载。
负载PEI的二氧化硅纳米颗粒的OVA mRNA负载
使用OVA mRNA重复负载实验，并使用Qubit荧光测定法进行分析。由于担心在环境温度下离心过程中mRNA的稳定性，离心进行的时间(3分钟)比DNA(的13分钟)短。
发现OVA mRNA成功负载到负载PEI的SiNPs上。负载结果显示在表21中。
表21.OVA RNA在NV00100018上负载的RNA定量结果
Figure BDA0002583699590000543
Figure BDA0002583699590000551
类似于OVA和HPV pDNA的结果，OVA mRNA的zeta电位分析显示负表面电荷(-6.7mV)，表示颗粒表面已被mRNA改性。
负载到PEI-SiNPs上的pDNA和mRNA的稳定性
在负载后六小时通过DNA定量和毛细管电泳评估负载到PEI-SiNPS上的pDNA和mRNA的稳定性。发现OVA pDNA、OVA mRNA和HPV pDNA均在6小时后仍成功保持负载到SiNP上，并且未观察到pDNA或mRNA的降解。
实施例4-负载OVA pDNA的SiNP对脾细胞增殖的影响
在小鼠脾细胞增殖中评估了负载有不同量的OVA pDNA(Ram-DNA)的SiNP空心纳米颗粒对免疫反应的影响，并与对照(PBS)、OVA(卵白蛋白)、OVA-CFA(卵白蛋白/完全弗氏佐剂)，pDNA(仅卵白蛋白DNA)，JET-DNA(卵白蛋白DNA/JET PEI转染试剂)和未负载SiNPs相比(Ram-75mg/kg)。在第0、7和14天免疫小鼠，并在第28天收集脾脏用于脾细胞分离。将脾细胞接种在有和没有OVA刺激的96孔板中48小时。进行MTT分析测定脾细胞的相对数目，每组六只小鼠，实验重复三次(in triplicate)。
结果显示在图46中。可以看出，SiNP空心纳米颗粒导致脾细胞增殖的刺激增加。
实施例5-使用SiNPs转染癌细胞株
在空心的SiNPs上负载pGL4.13[luc2/SV40]质粒DNA(从Promega获得)。pGL4.13[luc2/SV40]pDNA编码荧光素酶，可用于通过发光检测成功的转染。
评估在三种细胞系CT26、HCT1 16和HEK293中转染48小时后的转染效率。CT26是一种经常用作癌症模型的小鼠结肠癌细胞系。CT26细胞与侵袭性、未分化、难治性人类结肠直肠癌细胞具有相同的分子特征。HCT116是用于治疗研究和药物筛选的人结肠癌细胞系。HEK293是从原代胚胎人肾细胞建立的永久细胞系。它用于生产重组DNA或基因产物，以及用于细胞治疗的病毒生产。
在三种细胞系中的转染结果如图47所示。将使用负载pDNA的SiNPs转染与使用裸pDNA和不负载pDNA的SiNPs转染进行了比较。发现SiNPs允许荧光素酶基因成功转染到三种不同的细胞类型中，其中两种是用于癌症治疗的模型，并且其中一种通常用于生产细胞治疗载体。
实施例6-SiNPs的表面修饰
合成直径约330nm的Ram-SNPs。
将间苯二酚(0.2g)和甲醛(37wt％，0.28mL)添加到由氨水(28wt％，3.0mL)、去离子水(10mL)和乙醇(70mL)组成的溶液中。将该混合物在室温下剧烈搅拌6h，将0.6mL正硅酸四乙酯(TEOS)添加到该溶液中并搅拌8分钟后，第二次添加间苯二酚(0.4g)和甲醛(37wt％，0.56mL)。将该混合物在室温搅拌2小时，然后转移到高压釜中以在150℃下进行水热处理24小时。然后通过离心收集RF-二氧化硅颗粒，用乙醇洗涤并在50℃下干燥。最后，在550℃空气中煅烧5小时后收集Ram-SNPs(其中“Ram”是指红毛丹样结构)。
合成光滑的二氧化硅纳米颗粒(S-SNPs)，覆盆子二氧化硅纳米颗粒(Ras-SNPs)和花状二氧化硅纳米颗粒(Flw-SNPs)。
为了合成S-SNP，将间苯二酚(0.2g)和甲醛(37wt％，0.28mL)添加到由氨水(28wt％，3.0mL)、去离子水(10mL)和乙醇(70mL)组成的溶液中。将该混合物在室温下剧烈搅拌6小时，然后将1.4mL的TEOS加入该溶液中并搅拌2小时，离心以收集固体产物。为了合成Ras-SNP，将间苯二酚(0.2g)和甲醛(37wt％，0.28mL)添加到由氨水(28wt％，3.0mL)、去离子水(10mL)和乙醇(70mL)组成的溶液中。将该混合物在室温下剧烈搅拌18小时，然后将0.6mL的TEOS加入该溶液中并搅拌2h，离心以收集固体产物。对于Flw-SNP的合成，该方案基于我们以前的文献。在60℃下将9mL Milli-Q水，0.3gTEA和1mL CTAC溶液混合1h，然后加入9.5mL氯苯和25μL APTES的混合物。将该反应溶液在60℃下搅拌1小时。然后，将0.5mL的TEOS加入到该反应溶液中，并搅拌24h。通过以20,000rpm离心10分钟收集固体样品，然后用乙醇洗涤。将所有样品在空气中于550℃下进一步煅烧5h，以除去模板或表面活性剂。
表征
使用在100kV下运行的JEOL 1010显微镜，通过透射电子显微镜(TEM)表征二氧化硅纳米颗粒的形貌。使用Micromeritics Tristar 3020进行氮吸附分析。在测量之前，将所有样品在80℃的真空下脱气至少12h。根据衍生自吸附分支的Barret-Joyner-Halenda(BJH)方法计算孔径分布。使用来自Malvern Instrument的Zetasizer Nano-ZS在PBS中测量二氧化硅纳米颗粒的Zeta电位。通过CHNS-O Elemental Analyzer使用Thermo Flash EA1112系列测定连接PEI的纳米颗粒中的氮含量。
结果
可以使用RF-二氧化硅合成系统通过更改合成参数来获得S-SNPs，Ras-SNPs和Ram-SNPs，TEM图像(图48b-d)清楚地显示了它们的表面形貌。根据TEM计算，这三种类型的SNPs的粒径相似，范围为310至350nm。氮吸附分析结果显示在图48e-f中，其中Ram-SNPs的表面积为142m2/g，孔体积为0.64cm3/g，孔径大于20nm。裸露的二氧化硅纳米颗粒的表面电荷为负，如图48g所示。在连接PEI后，这些二氧化硅纳米颗粒的Zeta电位从约-20～-30mV变为+10mV。
表面官能化方法的选择
众所周知，当穿过细胞膜屏障的颗粒带正电时，转染更有效。这是由于带正电的颗粒与细胞膜带负电的表面具有良好的相互作用。因此，表面改性方法集中于在裸二氧化硅的固有带负电荷的表面上产生正电荷的不同方法。众所周知聚乙烯亚胺(PEI)可产生带正电的表面，因此探索了各种类型的聚乙烯亚胺改性。
方法
二氧化硅纳米颗粒的PEI改性-通过环氧基团与PEI的共价连接
在这一组中，通过将PEI分子与环氧基团共价键合，将大小不同的PEI分子附着在二氧化硅颗粒的表面。将100mg的二氧化硅纳米颗粒浸入30mL甲苯中，然后在搅拌和氮封(nitrogen gas blanket)保护下于70℃回流15分钟。然后将1.5mL的(3-缩水甘油基氧基丙基)三甲氧基硅烷(3-GPS)添加至该溶液中以产生具有环氧基团的二氧化硅表面，并进一步回流24小时。通过以10,000rpm离心10分钟收集固体产物，并先后用甲苯和甲醇洗涤两次。然后将具有环氧基团的颗粒在室温下在空气中干燥。将50mg环氧基团改性的二氧化硅纳米颗粒与250mg PEI分子(不同分子量：1.8k，10k和25k)在100mL的50mM(pH 9.5)碳酸盐缓冲溶液中混合。将该混合物搅拌24小时，然后通过离心和水洗收集固体产物。然后将该固体产物重悬于20mL的1g/L(pH 9)乙醇胺溶液中，并在室温下搅拌6h。通过离心收集最终的PEI改性颗粒，通过水/乙醇洗涤纯化，并在室温下干燥。
二氧化硅纳米颗粒的PEI改性-通过膦酸根基团产生强静电吸引
探索了另一种通过与PEI的强静电作用将PEI附着在二氧化硅上的方法。其使用结合到该二氧化硅表面的膦酸根基团与PEI分子静电键合。为了连接所述膦酸根表面基团，将30mg的二氧化硅纳米颗粒分散在10mL的水中，并使用氨水将pH调节至10。然后将10mL的该颗粒溶液与10mL的56mM的3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸酯(THPMP)溶液在40℃下搅拌混合2h以进行表面膦酸根改性。离心收集固体产物，并用水彻底洗涤。然后将固体产物重悬于15mL含有150mg PEI分子的水或乙醇中。在室温下搅拌4小时后，通过离心、水洗和室温干燥获得PEI改性的纳米颗粒。
结果
裸二氧化硅纳米颗粒具有预期的负表面电荷，这对于吸附带负电荷的pcDNA而言不是理想的。为了实现二氧化硅纳米颗粒和pcDNA之间的牢固结合，将PEI连接到二氧化硅纳米颗粒表面以获得正表面电荷。然而，存在多种将PEI连接到二氧化硅纳米颗粒上的方法，包括共价结合和强静电吸引。根据这两种PEI连接模式对二氧化硅纳米颗粒进行了改性，以进行比较。如图49所示，首先通过3-GPS对二氧化硅纳米颗粒进行修饰，将环氧基团连接到该颗粒表面，该表面可进一步与PEI分子上的氨基形成共价键。或者，用THPMP对该二氧化硅纳米颗粒的表面进行修饰，将大量膦酸根基团附着到二氧化硅表面，从而进一步增强了二氧化硅纳米颗粒的负表面电荷，实现了对带正电的PEI分子的强静电吸引。
通过连接后颗粒的元素分析来分析改性过程中附着的PEI量。由于在裸二氧化硅纳米颗粒或3-GPS/THPMP改性颗粒中不包含氮原子，因此仅有的氮含量是由附着在颗粒上的PEI贡献的。如表22所示，测试的四种类型颗粒的氮含量显示Ram-SNPs>Ras-SNPs>S-SNPs的趋势，这可能归因于它们的表面积差异。比较这两种类型的PEI连接，膦酸根改性后的纳米颗粒在表面上结合更多的PEI。除了这两种类型的PEI连接以外，还测试了PEI在二氧化硅纳米颗粒表面的物理吸附，结果表明颗粒中的氮含量为3.1％。但是，物理吸附的PEI预计比通过3-GPS和THPMP连接的PEI的结合力较小。
Figure BDA0002583699590000591
除了所述PEI连接方式外，PEI的分子量也影响pcDNA的连接和转染效率。在此，将分子量为1.8k、10k和25k的PEI与二氧化硅纳米颗粒共价结合以进行进一步比较。
pcDNA负载和凝胶电泳
方法
pcDNA负载
在4℃的10μL PBS溶液中，将1μg pcDNA与5μg PEI共价改性的二氧化硅纳米颗粒混合4小时。之后，将该混合物以15,000rpm离心10分钟，并将上清液用于通过Nanodrop进行pcDNA残留量定量。
凝胶电泳
将0.5μg的pcDNA与二氧化硅纳米颗粒混合，二氧化硅用量范围为0至5、10、20、40和60μg。将该混合物在4℃下孵育4h，然后将2mL核酸样品缓冲液加入该混合物中，形成10μL的总溶液体积。为了制备琼脂糖凝胶，将2.5g超纯琼脂糖添加到250mL Milli-Q水中，然后在微波辐射下煮沸以完全溶解琼脂糖。在该琼脂糖溶液冷却后，将25μL SYBR-Safe凝胶染料(10,000x)添加到该溶液中。最后将该溶液倒入凝胶容器中，冷却20分钟以形成凝胶。将具有凝胶的凝胶容器转移到槽中，并充满TEA缓冲液以浸没凝胶。然后将10μL的该pcDNA溶液一一注入到凝胶的孔中，并将电压设置为80V，以电泳50分钟。电泳后的凝胶被一一记录。
结果
本研究使用表达分子量为6.1kD的pcDNA的GFP。研究了pcDNA在与PEI共价连接的二氧化硅纳米颗粒上的负载能力。如图50所示，用不同分子量的PEI修饰的Ram-SNPs的最高DNA负载能力约为100ng/μg。但是，S-SNPs和Ras-SNPs只能达到小于50ng/μg的负载。这可能是由于它们的表面积和容纳pcDNA的孔体积不同所致。Ram-SNPs的红毛丹样结构可能有利于绳状pcDNA缠住其表面尖刺，从而可以简单、牢固地与溶液中的pcDNA连接。
使用凝胶电泳进行比较，以进一步证明PEI改性的二氧化硅纳米颗粒和pcDNA之间的结合亲和力的差异。在所有组中，增加二氧化硅纳米颗粒与pcDNA的比率(降低pcDNA的负载)，减少了释放的pcDNA的量。从直观的角度来看，这是有道理的，因为低负载量的pcDNA与颗粒表面紧密结合，因此将被牢固连接。随着更多的pcDNA负载到颗粒上，预计负载的pcDNA的其他层将不那么牢固地连接，因为这些外层越来越多地与下面的pcDNA层相关，而不是与设计用来牢固连接pcDNA的改性二氧化硅表面相关。该发现可能对转染效率有影响，因为如果pcDNA太紧密地连接到二氧化硅颗粒上，当颗粒进入细胞就无法被释放，则可能会阻碍有效的转染。因此，可通过增加二氧化硅颗粒上的pcDNA负载来提高转染效率。
对于大多数的测试颗粒，连接在二氧化硅纳米颗粒表面上的PEI的分子量越大，结合亲和力就越强。比较四种类型的二氧化硅颗粒，通常可在所有负载量下检测到从制剂释放的pcDNA条带。Ras-SNPs相对于S-SNPs仅显示出稍微改善的结合亲和力，这表明pcDNA与S-SNP表面之间的结合较弱。用10k PEI改性的Ram-SNPs在pcDNA/SiO2重量比为1/10时显示出最强的结合力，没有pcDNA释放。
筛选HEK-293细胞中转染效率的颗粒库
使用众所周知的HEK-293细胞系比较上述二氧化硅/pcDNA变体和Lipofectamine2000商业试剂的体外转染效率。
方法
在这组测试中使用了通过共价键连接到PEI的二氧化硅纳米颗粒。对于典型的转染过程，将HEK-293T细胞以每孔2x 105个细胞的密度接种在6孔板中，并孵育24小时以达到70-90％的融合度。将80μg PEI改性的UQ二氧化硅颗粒与2.5μg eGFP-pcDNA(负载量31μgpcDNA/mg二氧化硅)在50μL PBS中4℃下混合4h。请注意，这是一个相对较低的pcDNA负载量(显著低于上述Ram-SNP颗粒的100μg/μg量)，选择该负载量以便不同的颗粒类型可使用相同的负载，其中一些不能进行更高的负载，如图50所示。然后将该混合物转移到2mL含10％FBS和1％PS的DMEM培养基中。然后将该板中的培养基替换为含颗粒的培养基，然后进一步培养48小时。随后，将细胞用PBS洗涤，然后用500μL的4％PFA固定。使用共聚焦显微镜(LSMZeiss 710)观察细胞，或收集细胞用于流式细胞仪分析(Accuri M6)。
结果
如上所示，与PET共价连接的二氧化硅纳米颗粒显示出高的pcDNA负载能力和强大的结合亲和力。在此，在HEK-293T细胞系中进一步研究了转染效率。共聚焦显微镜图像清楚地显示了使用不同类型的二氧化硅纳米颗粒的HEK-293T细胞中的GFP表达。与用1.8k PEI改性的二氧化硅纳米颗粒相比，用更大分子量的PEI改性的载体显示出更高的pcDNA的传递效率，更亮的绿色荧光。但是，有充分的文献证明25k PEI表现出严重的细胞毒性。因此，使用10k PEI进行改性被认为是最佳的。比较这三种类型的二氧化硅纳米颗粒，Ram-SNPs显示出显著增强的pcDNA的传递效率，并具有明显而强烈的绿色荧光。该结果清楚地证明，与不具有Ram-SNPs的独特有尖刺的表面的类似二氧化硅颗粒相比，Ram-SNsP的独特结构提供了优异的转染效率。Ram-SNPs相对于其他SNPs而言观察到更强的pcDNA结合亲和力，使Ram-SNPs处于不利地位，这可能导致pcDNA在细胞质中释放不完全，这一事实更加突出了这一比较的重要性。
使用流式细胞仪进一步定量分析了pcDNA的转染效率。如表23所示，裸pcDNA的转染效率可忽略不计，为0.8％，而用10k PEI改性的Ram-SNPs的最高转染效率超过27％，高于其他不具备相同有尖刺的二氧化硅表面的二氧化硅颗粒，S-SNPs和Ras-SNPs的效率分别为4.4％和9.6％。对具有使用分子量为1.8k、10k和25k的PEI改性表面的Ram-SNPs的转染效率进行比较，结果显示10k PEI变体具有最高的转染效率，而1.8k和25k变体的效率降至19.7％和22.8％。
如预期的，相对于未优化的Ram-SNPs，商业产品Lipofectamine 2000显示出更高的转染效率，为98.8％。Lipofectamine配方使用制造商建议的最佳pcDNA负载量。
Figure BDA0002583699590000611
Figure BDA0002583699590000621
为了进一步提高依赖共价连接的PEI表面改性的上述Ram-SNPs的转染效率，研究了Ram-SNPs的其他PEI连接方式。在这里，Ram-SNPs通过10k PEI改性，结合到二氧化硅表面的膦酸根基团作为与PEI的连接基，从而实现与PEI的强静电吸引。还研究了具有物理吸附的PEI的Ram-SNPs。这些纳米颗粒负载了相同剂量的pcDNA(31μg/mg)，用于在HEK-293T细胞中进行转染。使用荧光显微镜和流式细胞仪分析转染效率。如图51所示，Lipofectamine2000显示出强烈的绿色荧光，成功转染的细胞超过80％。环氧-PEI改性和物理PEI吸附的转染效率都非常有限，只有不到40％的细胞被转染。膦酸根-PEI改性显示出显著改善的转染效率，如荧光显微镜所示，成功转染的细胞超过51％。因此，膦酸根-PEI改性被认为是最佳的PEI改性方式。
还研究了用膦酸根-10k PEI改性的Ram-SNPs的剂量(二氧化硅剂量)依赖转染行为。通过将二氧化硅剂量从40μg(二氧化硅)/mL增加到60μg/mL和80μg/mL，转染效率分别从53％增加到77％和89％。这些实验中使用的pcDNA的质量保持恒定，80μg/mL制剂的颗粒数是40μg/mL制剂的两倍，而80μg/mL制剂的pcDNA负载量是40μg/mL制剂的一半(μg/mg)。在80μg/mL的剂量下，Ram-SNPs的转染效率类似于商业产品Lipofectamine 2000(90％)。但是，需要注意的是，Ram-SNPs在80μg/mL的剂量下具有很高的细胞毒性，这对于实际配方中可能使用的最大二氧化硅颗粒剂量给出了一些指示。在开发商业制剂时，可能必须在转染效率和细胞毒性之间折衷。然而，增加pcDNA在Ram-SNP颗粒上的负载量可以提供避免这种折衷的一种有吸引力的方法，因为使用较高的pcDNA负载量实际上意味着需要使用的二氧化硅更少，并且细胞毒性可能更低。
在转染实验中，首先将pcDNA负载到PEI改性的Ram-SNPs上，通常需要4h负载pcDNA。对负载过程进行研究，发现在前5分钟内，有90％以上的pcDNA被负载到PEI改性的Ram-SNPs上。该结果与先前关于pcDNA和Ram-SNP之间的强结合亲和力的观察结果一致。将pcDNA和PEI改性的Ram-SNPs混合4小时和5分钟后，通过流式细胞术研究它们的转染效率。仅将pcDNA和颗粒混合5分钟，转染效率达到43.6％，低于4h负载过程测得的效率53.4％。
核酸保护
目的：测定Ram-SNPs保护pcDNA免受酶促降解的能力，并将其性能与商用Lipofectamine 2000产品进行比较。
方法
将0.5μg pcDNA与15μg PEI改性的Ram-SNPs(膦酸根基团)混合，然后在4℃孵育2h以实现pcDNA和颗粒的牢固结合。将相同量的pcDNA与1μL Lipofectamine 2000在室温下孵育5分钟。对于用DNase I消化颗粒或Lipofectamine中的pcDNA，将1μL的2U/μL DNase I添加到该混合物中，并在37℃下孵育30分钟。为了终止降解，向该混合物中加入1μL 500mMEDTA，然后在65℃孵育10分钟。为了进一步测定DNase I处理后的pcDNA残留，向该混合物中加入1μL 40mg/mL肝素PBS溶液，并在37℃下孵育1h。通过凝胶电泳分析pcDNA-转染剂复合物。为了测定活性pcDNA残留，将DNase I处理后的pcDNA转染剂制剂转移到HEK-293T细胞中以测定转染效率。
结果
为了证明Ram-SNPs对DNase I的pcDNA保护能力，将eGFP-pcDNA负载到PEI改性的Ram-SNPs上，然后与DNase I溶液孵育30分钟。
电泳结果表明，DNase I处理后裸pcDNA容易降解。负载在Ram-SNPs中的pcDNA与颗粒牢固结合，没有释放任何游离pcDNA。DNase I处理后，无法鉴定出pcDNA降解带。肝素处理进行pcDNA置换后，在凝胶中未鉴定出释放出的pcDNA条带，但是孔中出现了明显的条带信号，这可能是pcDNA与Ram-SNP之间的强结合亲和力导致的。由于不存在pcDNA片段，这些数据表明Ram-SNP颗粒可为pcDNA提供良好的保护，使其免于核酸酶降解，但是Ram-SNP与pcDNA之间的强结合阻止了完整pcDNA的直接可视化。
对于商用转染产品Lipofectamine 2000，发现pcDNA易于从制剂中释放，显示pcDNA与Lipofectamine之间的结合亲和力弱。经过DNase I处理后，松散结合的pcDNA容易被该酶降解，表明该松散结合的pcDNA没有存活。肝素置换后，显示从Lipofectamine中释放出少量受保护的pcDNA。
为了进一步证明DNase I处理后Ram-SNP中仍然存在活性pcDNA，将DNase I处理前后的pcDNA/Ram-SNP颗粒和pcDNA-Lipofectamine制剂用于HEK-293T细胞的体外转染比较。荧光显微镜图像显示，DNase I处理后，由于pcDNA的严重降解，Lipofectamine 2000的转染效率急剧下降。然而，在DNA酶I处理前后，Ram-SNPs的转染效率保持相对不变，进一步证明了Ram-SNPs成功地保护了pcDNA免受酶消化。该结果表明，由于在降解酶的存在下Lipofectamine的性能显著降低，相对于Lipofectamine,Ram-SNPs显示出了转染效率的优势。
体外转染效率
目的：比较具有不同粒径的Ram-SNPs与商业Lipofectamine和In-vivo JET产品的转染效率，并阐明细胞摄取机制。
比较不同粒径、游离pcDNA、Lipofectamine和In-vivo JET的Ram-SNPs的转染效率方法-合成不同粒径的Ram-SNPs
在典型的RF-二氧化硅合成中，通过改变间苯二酚和甲醛的起始量为0.2g/0.28mL至0.1g/0.14mL或0.3g/0.4 2mL，相应地改变了聚合物核的尺寸，最终导致了较小或较大的Ram-SNP粒径。要注意的是，通过减少间苯二酚和甲醛的量，在加入TEOS之前需要更长的聚合时间8小时。通过增加间苯二酚和甲醛的量，可以将添加TEOS之前的时间缩短至5小时。在RF核聚合之后，TEOS和第二次RF添加之后是典型的合成过程。收集最终的二氧化硅纳米颗粒，并用膦酸根基团修饰，并与10k PEI连接以进行进一步的转染研究。
结果
在上述研究中使用的Ram-SNPs的粒径约为330nm，但是该粒径也可能影响pcDNA转染效率。在此，通过在RF-二氧化硅合成中改变聚合物核的尺寸，制备了具有较小直径(大约为180nm)和较大直径(大约500nm)的Ram-SNPs。这三个Ram-SNP变体的TEM图像均显示出有尖刺的表面形貌。
具有不同粒径的PEI改性的Ram-SNPs以40μg/mL的二氧化硅剂量用于HEK-293T细胞中的eGFP-pcDNA转染。作为对比，按照厂家推荐的方案使用市售转染试剂，Invitrogen的Lipofetamine 2000和Polyplus的In-vivo JET。使用荧光显微镜和流式细胞术分析转染效率。Lipofetamine，尤其是In-vivo JET，显示出强烈的绿色荧光，成功转染的细胞超过90％。对于40μg/mL的低二氧化硅剂量，Ram-SNPs显示出较低的荧光强度。最重要的是，随着粒径从500nm减小到180nm，明显看到了Ram-SNPs的转染效率从43％增加到63％的趋势。
使用特定内吞途径的抑制剂探索细胞摄取和细胞内运输
方法
此处使用了粒径为180nm的Ram-SNPs。在PEI改性后，通过在2mg/mL RITC乙醇溶液中搅拌PEI改性颗粒4小时，将罗丹明异硫氰酸酯(RITC)进一步连接到该颗粒上。用乙醇彻底清洗RITC标记的颗粒，直到在上清液中未发现红色。然后将RITC标记的颗粒负载pcDNA进行进一步的摄取分析。在添加颗粒之前，通过在37℃下于培养基中孵育1h，可以实现多种内在化抑制条件。将100μL 1μg/mL蔗糖添加到2mL培养基(5％w/v)中以抑制网格蛋白介导的内吞作用。将Dynasore添加到该培养基中，使最终浓度达到80μM，以抑制依赖于动力蛋白的内吞作用。细胞的低温处理(4℃)用于一般的内吞途径分析。然后将pcDNA纳米颗粒制剂添加到融合度80-90％的HEK-293T细胞中，并根据需要在4或37℃下孵育4小时。孵育4小时后收获细胞，并通过流式细胞仪分析。每组实验重复三次(in triplicate)。
结果
为了鉴定Ram-SNPs进入HEK-293T细胞的特异性内吞途径，在添加颗粒之前，采用了不同类型的抑制剂进行细胞处理。Ram-SNPs用显示红色荧光的RITC染色，用流式细胞仪分析经或未经抑制剂处理的颗粒摄取情况。加入蔗糖作为抑制剂后，没有明显的摄取抑制作用，表明内吞途径不是网格蛋白介导的。然而，经低温处理和添加Dynasore的HEK-293T细胞显示出显著降低的颗粒摄取，表明Ram-SNPs被一般的和依赖于动力蛋白的的内吞途径摄取。
pcDNA和Ram-SNP结合亲和力
方法
将15μg PEI改性的Ram-SNPs(180nm)与0.5μg pcDNA孵育2h，然后将该混合物与最终浓度为0.5-10mg/mL的肝素一起在37℃下孵育2h。然后通过凝胶电泳进一步分析该混合物，以鉴定pcDNA和Ram-SNP颗粒的结合亲和力。
结果
为了进一步鉴定pcDNA和Ram-SNPs的结合亲和力，以剂量依赖的方式研究了肝素竞争测定。观察到在高浓度肝素下，pcDNA可以从pcDNA-Ram-SNP颗粒中替换。要注意的是，在肝素浓度为0.5mg/mL时，释放的pcDNA结合强度远低于在较高肝素浓度下处理的pcDNA结合强度。这表明在pcDNA和Ram-SNP颗粒之间存在很强的结合亲和力。

Claims (55)

1.一种制备多个空心无机纳米颗粒的方法，该方法包括：
(a)使第一单体和第二单体在溶剂中接触，以制备包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物；
(b)将无机化合物前体添加到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物；
(c)将额外量的所述第一单体和第二单体添加到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，以产生包含溶剂和多个复合纳米颗粒的组合物；和
(d)加热所述多个复合纳米颗粒以产生所述多个空心无机纳米颗粒；
其中，在步骤(a)中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在至少30℃的温度下接触。
2.根据权利要求1的方法，其中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在30℃-70℃的温度下，优选在40℃-50℃的温度下接触。
3.根据权利要求1或2的方法，其中，所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中在至少30℃的温度下接触不超过4小时，优选10分钟-180分钟。
4.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述无机化合物是氧化硅，并且，所述空心无机纳米颗粒是空心氧化硅纳米颗粒。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，步骤(a)包括将所述第一单体和所述第二单体在所述溶剂中混合，所述溶剂优选包含水、醇和氨。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，所述第一单体是包含一个或多个羟基的化合物，所述第二单体是包含一个或多个醛基的化合物，
优选地，其中所述第一单体是二醇，所述第二化合物是醛。
7.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，所述第一单体是式HO-Ar-OH的化合物，并且所述第二单体是式HC(O)-R1的化合物，其中Ar是取代的或未取代的芳基，并且R1是H或取代或未取代的C1-6烷基，
优选地，其中所述第一单体是间苯二酚，且所述第二单体是甲醛。
8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一单体的浓度为1.0mM-0.1M，并且所述第二单体的浓度为1.0mM-0.1M，
优选地，所述第一单体的浓度为0.01M-0.03M，并且所述第二单体的浓度为0.3-0.05M。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述无机化合物前体是氧化硅前体。
10.根据权利要求9的方法，其中所述氧化硅前体是式Si(R2)X(OR3)y所示化合物，其中：
每个R2和每个R3独立地选自H、C1-6烷基、芳基和C2-6烯基；
x为0、1或2；
并且y是2、3或4。
11.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述无机化合物前体是原硅酸四乙酯(TEOS)、原硅酸四甲酯、原硅酸四丙酯或原硅酸四丁酯，优选原硅酸四乙酯。
12.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在将所述无机化合物前体加入到所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物中之后，所述无机化合物前体化合物的浓度为1.0mM-0.1M，优选0.01-0.05M。
13.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(b)在不高于30℃的温度下进行，优选在10℃-30℃的温度下进行。
14.根据前述权利要求中任一项的方法，该方法还包括在步骤(a)和步骤(b)之间冷却所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物的步骤，
优选地，其中将所述包含溶剂和多个聚合物纳米颗粒的组合物以0.5℃/min-1.0℃/min的平均速率冷却10分钟至60分钟。
15.根据前述权利要求中任一项的方法，其中，步骤(c)，将额外量的所述第一和第二单体加入到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中，在步骤(b)，将二氧化硅前体化合物加入到包含溶剂和多种聚合物纳米颗粒的组合物中，之后1-30分钟进行，
优选地，其中步骤(c)在步骤(b)后2-10分钟进行。
16.根据前述权利要求中任一项的方法，其中在将额外量的所述第一单体和第二单体添加到所述包含溶剂和多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒的组合物中之后，在包含所述溶剂、所述多个包覆有无机化合物的聚合物纳米颗粒以及所述第一和第二单体的组合物中，所述第一单体的浓度为2.0mM至0.2M，所述第二单体的浓度为2.0mM至0.2M。
17.根据前述权利要求中任一项的方法，其中使所述额外量的第一和第二单体反应1.0-4.0小时。
18.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)包括在适于从复合纳米颗粒中除去聚合物的温度下加热所述多个复合纳米颗粒，
优选在400℃-700℃的温度下。
19.根据前述权利要求中任一项的方法，其中步骤(d)包括将所述多个复合纳米颗粒加热小于4.0小时的时间，优选加热1.0-3.0小时。
20.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述多个空心无机纳米颗粒是多个介孔空心无机纳米颗粒。
21.根据前述权利要求中任一项的方法，其中每个所述空心无机纳米颗粒包含：
包含无机化合物的壳；
设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；和
设置在所述壳的外部的多个包含所述无机化合物的突起。
22.根据权利要求21的方法，其中：
所述空心无机纳米颗粒的粒径为100nm-600nm；和/或，所述壳内的空间的平均直径为50nm-500nm；和/或，所述包含无机化合物的壳的平均厚度为10nm-200nm。
23.根据前述权利要求中任一项的方法，该方法还包括：
(e)用试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒，以产生多个负载所述试剂的空心无机纳米颗粒。
24.根据权利要求23的方法，其中所述试剂是杀虫剂、除草剂、治疗剂、疫苗、电荷改性剂、转染试剂、核酸、蛋白质或染料。
25.根据权利要求23或24的方法，其中所述试剂是电荷改性剂，任选地，其中所述电荷改性剂是聚乙烯亚胺。
26.根据权利要求23或24的方法，其中所述电荷改性剂是多肽，任选地，其中所述多肽中是聚组氨酸、聚精氨酸或聚赖氨酸。
27.根据权利要求23-25中任一项的方法，该方法包括在用所述试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒之前用膦酸盐连接剂处理所述多个空心无机纳米颗粒的步骤。
28.根据权利要求23-25中任一项的方法，该方法包括在用所述试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒之前用酸度改性组分处理所述多个空心无机纳米颗粒的步骤，任选地，其中所述酸度改性组分包含膦酸根基团、磷酸根基团、羧酸根基团或α-酮基羧酸根基团。
29.根据权利要求23-28中任一项的方法，其中用所述试剂处理所述多个空心无机纳米颗粒少于60分钟，优选少于15分钟。
30.根据权利要求23-29中任一项的方法，其中步骤(e)包括：
(e1)任选地，用膦酸盐连接剂处理所述空心无机纳米颗粒，优选其中所述膦酸盐连接剂是1，3-(三羟基甲硅烷基)丙基甲基膦酸单钠盐；
(e2)用电荷改性剂处理所述空心无机纳米颗粒，任选地，其中所述电荷改性剂是聚乙烯亚胺；和
(e3)用活性剂处理所述空心无机纳米颗粒，任选地，其中所述活性剂包含核酸。
31.可通过根据权利要求1-30中任一项的方法获得的多个空心无机纳米颗粒。
32.多个空心无机纳米颗粒，其中每个所述空心无机纳米颗粒包含：
包含无机化合物的壳；
设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；和
设置在所述壳的外部的多个包含所述无机化合物的突起；且
其中所述多个空心无机纳米颗粒的粒径为100至500nm。
33.多个空心无机纳米颗粒，其中每个所述空心无机纳米颗粒包含：
包含无机化合物的壳；
设于所述壳内且不包含所述无机化合物的空间；和
设置在所述壳的外部的多个包含所述无机化合物的突起；且
其中所述空心无机纳米颗粒还包含与所述无机化合物连接的多个酸性基团。
34.根据权利要求33的多个空心无机纳米颗粒，其中所述酸性基团选自膦酸根基团、磷酸根基团、羧酸根基团和α-酮羧酸根基团，优选其中酸性基团是膦酸根基团。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的多个空心纳米颗粒，其中所述多个空心无机纳米颗粒的粒径为150-350nm，优选160-250nm。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的多个空心纳米颗粒，其中所述多个空心无机纳米颗粒的多分散性分散指数小于或等于0.5、小于或等于0.2、小于或等于0.1、或小于或等于0.05。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的多个空心无机纳米颗粒，其中所述纳米颗粒具有至少120cm2/g，优选至少150cm2/g的BET表面积。
38.根据权利要求31-37中任一项所述的多个空心无机纳米颗粒，其中所述空心无机纳米颗粒是空心氧化硅纳米颗粒。
39.根据权利要求31-37中任一项的多个空心无机纳米颗粒，其用作通过疗法治疗人体或动物体的方法中的佐剂。
40.根据权利要求39所述的多个空心无机纳米颗粒，其中所述方法包括通过将所述治疗剂与多个所述空心无机纳米颗粒共同施用来增加治疗剂的效果。
41.根据权利要求31-37中任一项所述的多个空心无机纳米颗粒，其用于通过使用疫苗使受试者针对疾病进行免疫来预防或治疗受试者中的疾病，其中所述多个空心无机纳米颗粒增加对所述受试者对所述疫苗的免疫应答。
42.一种组合物，其包含根据权利要求31-37中任一项的多个空心无机纳米颗粒和试剂。
43.根据权利要求42的组合物，其中所述试剂与所述空心无机纳米颗粒连接。
44.根据权利要求42或43的组合物，其中所述试剂是疏水性活性剂。
45.根据权利要求42-44中任一项的组合物，其中所述试剂是杀虫剂、除草剂、治疗剂、疫苗、电荷改性剂、转染试剂、核酸或染料。
46.根据权利要求42-45中任一项的组合物，其中所述试剂是聚乙烯亚胺。
47.根据权利要求42-46中任一项的组合物，其中所述多个空心无机纳米颗粒用膦酸盐连接剂官能化。
48.根据权利要求42至47中任一项的组合物，其中所述组合物包含电荷改性剂和活性剂，
优选地，其中所述电荷改性剂是聚乙烯亚胺(PEI)，所述活性剂是核酸，例如质粒DNA。
49.如权利要求42-48中任一项所述的组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述活性剂是疫苗，并且所述组合物用于通过使用疫苗使受试者针对疾病进行免疫来预防或治疗受试者中的疾病。
51.一种将核酸转染到细胞中的方法，该方法包括用权利要求42-48中任一项所述的组合物处理所述细胞。
52.如权利要求42-48中任一项所述的组合物，其用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中，其中所述空心无机纳米颗粒用作所述试剂的佐剂。
53.用于根据权利要求52的用途的组合物，其中该方法包括增加所述药剂的作用。
54.如权利要求42-48中任一项所述的组合物，其用于将核酸转染入细胞的方法中，其中所述试剂是核酸，并且所述方法包括用包含所述多个空心无机纳米颗粒和所述核酸的组合物处理所述细胞，从而使所述核酸转染细胞并刺激免疫应答。
55.一种用于控制场所害虫的方法，该方法包括将场所暴露于权利要求42-48中任一项所述所述的组合物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113896206A (zh) * 2021-11-18 2022-01-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种空心介孔硅纳米微球及其制备方法和用途
CN113955762A (zh) * 2021-11-18 2022-01-21 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种介孔硅纳米材料及其制备方法和应用
CN116250537A (zh) * 2021-12-10 2023-06-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有spiky形貌的农药载药颗粒及其制备方法与应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3048354B1 (fr) * 2016-03-04 2021-12-10 Michael Sadoun Preforme destinee a la fabrication d'une prothese dentaire
EP3799952A1 (fr) * 2019-10-04 2021-04-07 Surfactis Technologies Procede de preparation de nanoparticules framboise
GB202005957D0 (en) * 2020-04-23 2020-06-10 N4 Pharma Uk Ltd Transfection and transduction system
EP3909612A1 (en) * 2020-05-12 2021-11-17 Life Science Inkubator Betriebs GmbH & Co. KG Composition of nanoparticles
CN113061038B (zh) * 2021-03-30 2021-11-26 西北有色金属研究院 一种聚硅氮烷转化的覆盆子状SiCxNyOz微米球制备方法
WO2023018232A1 (ko) * 2021-08-10 2023-02-16 주식회사 에스엠엘제니트리 생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법
KR102453872B1 (ko) * 2022-04-15 2022-10-14 주식회사 에스엠엘제니트리 생물학적 샘플 내 핵산 분자의 검출을 위한 비드 복합체 및 이를 이용한 핵산을 검출하는 방법

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050129935A1 (en) * 2002-05-09 2005-06-16 Riken Thin-film material and method for producing same
CN102811969A (zh) * 2010-02-17 2012-12-05 昆士兰大学 制备中空纤维陶瓷膜的方法
CN104334269A (zh) * 2012-05-22 2015-02-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 杂化有机-无机纳米颗粒
WO2015138158A1 (en) * 2014-03-11 2015-09-17 E I Du Pont De Nemours And Company Process for preparing recyclable template hollow particles using water-based silica precursors
WO2016164987A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 The University Of Queensland Composition, particulate materials and methods for making particulate materials.
CN107174919A (zh) * 2017-06-28 2017-09-19 中国航发北京航空材料研究院 石墨烯改性的复合介孔碳微球空气净化剂

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050129935A1 (en) * 2002-05-09 2005-06-16 Riken Thin-film material and method for producing same
CN102811969A (zh) * 2010-02-17 2012-12-05 昆士兰大学 制备中空纤维陶瓷膜的方法
CN104334269A (zh) * 2012-05-22 2015-02-04 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 杂化有机-无机纳米颗粒
WO2015138158A1 (en) * 2014-03-11 2015-09-17 E I Du Pont De Nemours And Company Process for preparing recyclable template hollow particles using water-based silica precursors
WO2016164987A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 The University Of Queensland Composition, particulate materials and methods for making particulate materials.
CN107614430A (zh) * 2015-04-17 2018-01-19 昆士兰大学 组合物、粒状材料和用于制造粒状材料的方法
CN107174919A (zh) * 2017-06-28 2017-09-19 中国航发北京航空材料研究院 石墨烯改性的复合介孔碳微球空气净化剂

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN LIU ET. AL: "Extension of The Stöber Method to the Preparation of MonodisperseResorcinol–Formaldehyde Resin Polymer and Carbon Spheres", 《ANGEWANDTE CHEMIE》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113896206A (zh) * 2021-11-18 2022-01-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种空心介孔硅纳米微球及其制备方法和用途
CN113955762A (zh) * 2021-11-18 2022-01-21 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种介孔硅纳米材料及其制备方法和应用
CN116250537A (zh) * 2021-12-10 2023-06-13 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有spiky形貌的农药载药颗粒及其制备方法与应用
CN116250537B (zh) * 2021-12-10 2025-07-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种具有spiky形貌的农药载药颗粒及其制备方法与应用

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