CN111588840A

CN111588840A - 组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用

Info

Publication number: CN111588840A
Application number: CN202010455165.3A
Authority: CN
Inventors: 吴建国; 田明富; 刘为勇; 谭秋萍
Original assignee: Guangdong Longfan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangdong Longfan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-05-26
Filing date: 2020-05-26
Publication date: 2020-08-28

Abstract

组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。本发明属于生物技术和生物医药技术领域，公开了一种组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用，组蛋白去泛素化酶，核苷酸序列为SEQ ID NO：1。蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。本发明选取带有人源MYSM1的慢病毒作为基因治疗工具，以系统性红斑狼疮病人血液中分离的外周血淋巴细胞为靶点，开展基因治疗。结果显示慢病毒过表达MYSM1可以显著抑制系统性红斑狼疮病人外周血淋巴细胞产生的干扰素及炎症因子。本发明有效的将MYSM1蛋白的抗炎作用应用于自身免疫疾病治疗，具有显著的抗炎效果，因此MYSM1在系统性红斑狼疮基因治疗中甚至自身免疫疾病基因治疗中有潜在的应用前景。

Description

组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用

技术领域

本发明属于生物技术和生物医药技术领域，尤其涉及一种组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。

背景技术

目前，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus，SLE)是一种非常严重的自身免疫性疾病，临床表现多样，可出现各个系统和脏器损伤，如皮肤、关节、浆膜、心脏、肾脏、中枢神经系统、血液系统等。由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体，严重危害身体健康，甚至威胁生命的疾病。在全世界广泛流行，每年新发患者40万。包含盘状红斑狼疮、亚急性皮肤型红斑狼疮、系统性红斑狼疮等多种分型，其中系统性红斑狼疮是红斑狼疮各类型中最为严重的一型。系统性红斑狼疮是一种多发于青年女性的、累及多脏器的、自身免疫性炎症性结缔组织病，绝大多数患者发病时即有多系统损害表现，少数病人由其他类型的红斑狼疮发展而来。部分病人还同时伴有其他的结缔组织病，如硬皮病、皮肌炎、干燥综合征等，形成各种重叠综合征。系统性红斑狼疮临床表现多样，错综复杂，且多较严重，可由于狼疮肾炎、狼疮脑病及长期大量使用药物的副作用而危及患者生命。

诸多研究表明，免疫系统的异常活化以及炎症因子的异常表达是系统性红斑狼疮的一个主要特征，也是临床治疗的靶点之一。

研究发现I型干扰素和促炎细胞因子水平高表达在系统性红斑狼疮病人中广泛存在，提示先天免疫系统的异常活化是系统性红斑狼疮的潜在病因。研究发现系统性红斑狼疮会产生异常的自身DNA，而异常的自身DNA对免疫系统的不恰当激活导致了I型干扰素和促炎细胞因子水平高。因此，靶向炎症相关通路是一个潜在的治疗手段。

截止目前为止，临床治疗红斑狼疮病人的主要方法为药物治疗，主要包括以下几种：

第一，糖皮质激素类药物，糖皮质激素在治疗免疫性疾病当中，尤其是红斑狼疮当中，通常都是首选药物，尤其在病程的早期。

第二，免疫抑制剂，免疫抑制剂也是为达到治疗的效果，尤其是在维持治疗阶段非常重要，它可以缓解病情，维持治疗。

第三，狼疮现在有生物制剂可以选用，也有一些靶向药物可以选用，比如贝利木单抗、白介素-2也是近几年相对来说比较新的治疗的手段。

药物治疗需要终身服用，且大多病人会产生耐药，不良反应等症状，包括骨质疏松，易感染，肥胖等，因此，开发新的治疗手段对红斑狼疮疾病治疗非常关键。

基因治疗(gene therapy)是近几年兴起的一种新新治疗手段，是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗目的。其中也包括转基因等方面的技术应用，也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。目前为止，基因治疗已广泛运用于各类疾病治疗。截至2005年7月，全世界已获准的基因治疗临床实验方案达1076项，其中，66％是针对癌症的治疗。经过十多年的发展，基因治疗的研究已经取得了不少进展。因此，开发新的基因治疗靶点用于治疗红斑狼疮，具有重要临床价值。

前期的研究表明，组蛋白H2A去泛素化酶(MYSM1)又称Myb样SWIRM和MPN结构域蛋白1(Myb-like,SWIRM and MPN domain-containing protein 1)可以抑制自身DNA导致的炎症活化及干扰素反应，并在老鼠模型中证明MYSM1可以保护老鼠免受炎症风暴导致的器官损伤。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：(1)药物治疗需要终身服用，且大多病人会产生耐药，不良反应等症状，包括骨质疏松，易感染，肥胖等，因此，开发新的治疗手段对红斑狼疮疾病治疗非常关键。

(2)现有技术中，没有联合基因治疗相关手段，以及没有将MYSM1蛋白进一步开发作为基因治疗技术，造成用于治疗系统性红斑狼疮的药物治疗效果差。而且也不能为MYSM1蛋白进一步在基因治疗应用上提供理论依据。

解决以上问题及缺陷的难度为：基因治疗主要问题为靶点选择，需要合适的靶位点基因，保证治疗效率的同时，防止引发其他副作用，红斑狼疮为系统性自身免疫疾病，发病机制复杂，参与通路广泛，因此，选择合适的靶标基因尤为关键。

解决以上问题及缺陷的意义为：本发明基于前期的研究基础，联合基因治疗相关手段，将MYSM1蛋白进一步开发作为基因治疗技术，用于治疗系统性红斑狼疮，甚至治疗其它自身免疫疾病。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用。本发明为临床上系统性红斑狼疮的治疗提供一种新的治疗技术。MYSM1过表达在体外细胞实验中能显著降低红斑狼疮病人淋巴细胞所产生的炎症因子及一型干扰素。因此，将MYSM1联合基因治疗手段进一步开发作为预防/治疗系统性红斑狼疮及其它自身免疫疾病的新技术和方法，具有广泛的应用前景。

本发明是这样实现的，一种组蛋白去泛素化酶(慢病毒处理细胞，mol＝0.1)在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用，所述组蛋白去泛素化酶，核苷酸序列为SEQID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述应用中组蛋白去泛素化酶基因编码的蛋白，所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述蛋白在制备预防/治疗自身免疫疾病药物中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述蛋白构建的慢病毒表达载体。

本发明的另一目的在于提供一种在所述蛋白的K119位点上的单泛素化修饰获得的金属蛋白酶。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明公开了组蛋白H2A去泛素化酶(MYSM1)又称Myb样SWIRM和MPN结构域蛋白1(Myb-like,SWIRM and MPNdomain-containing protein 1)在治疗系统性红斑狼疮(Systemic LupusErythematosus，SLE)中的应用。本发明选取带有人源MYSM1的慢病毒作为基因治疗工具，以系统性红斑狼疮病人血液中分离的外周血淋巴细胞为靶点，开展基因治疗。结果显示慢病毒过表达MYSM1可以显著抑制系统性红斑狼疮病人外周血淋巴细胞产生的干扰素及炎症因子。本发明有效的将MYSM1蛋白的抗炎作用应用于自身免疫疾病治疗，具有显著的抗炎效果，因此MYSM1在系统性红斑狼疮基因治疗中甚至自身免疫疾病基因治疗中有潜在的应用前景。

与现有技术相比，本发明的优点进一步包括：

MYSM1与系统性红斑狼疮密切相关，MYSM1具有抗炎效果和治疗系统性红斑狼疮的潜力，有坚实的依据和理论基础，创新性强、应用前景好。

相比传统抗炎相关治疗药物，基因治疗为目前新兴的治疗手段，副作用小，靶向性强。

目前尚未相关基因治疗技术运用于红斑狼疮。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的确认MYSM1与系统性红斑狼疮的相关性。

图中：A和B：系统性斑狼疮病人与健康人外周血单个核细胞(PBMC)中MYSM1 mRNA及MYSM1蛋白的表达情况。C-H：系统性斑狼疮人与健康人外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-βmRNA(C)，ISG56 mRNA(D)，ISG15 mRNA(E)，TNF-αmRNA(F)，IL-6 mRNA(G)和CXCL10 mRNA(H)的表达情况。

图2是本发明实施例提供的Lenti-Mysm1抑制系统性红斑狼疮的效果研究。A和B：系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞(PBMC)感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时，处理后检测MYSM1的mRNA(A)及蛋白(B)表达量。C-H：系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞(PBMC)感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时,处理后检测外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-βmRNA(C)，ISG56 mRNA(D)，ISG15mRNA(E)，TNF-αmRNA(F)，IL-6 mRNA(G)和CXCL10 mRNA(H)的表达量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，没有联合基因治疗相关手段，以及没有将MYSM1蛋白进一步开发作为基因治疗技术，造成用于治疗系统性红斑狼疮的药物治疗效果差。而且也不能为MYSM1蛋白进一步在基因治疗应用上提供理论依据。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。

本发明选用组蛋白H2A去泛素化酶(MYSM1)又称Myb样SWIRM和MPN结构域蛋白1(Myb-like,SWIRM and MPN domain-containing protein 1)，一种金属蛋白酶，可去泛素化组蛋白H2A的K119位点上的单泛素化修饰。同时，MYSM1在造血干细胞、淋巴细胞和成熟血细胞中具有重要功能。此前报道，MYSM1通过与p53相互作用调控小鼠造血和组织发育，并参与调控小鼠皮肤发育和遗传性骨髓衰竭综合征(1.

M,Belle JI,Petrov JC,RyderEJ,Clare S,Nijnik A.Deubiquitinase MYSM1 Is Essential for Normal Fetal LiverHematopoiesis and for the Maintenance of Hematopoietic Stem Cells in AdultBone Marrow.Stem Cells Dev.(2015):24(16):1865-77；

2、Gatzka M,Tasdogan A,Hainzl A,Allies G,Maity P,Wilms C,Wlaschek M,Scharffetter-Kochanek K.Interplay of H2A deubiquitinase 2A-DUB/Mysm1and thep19(ARF)/p53 axis in hematopoiesis,early T-cell development and tissuedifferentiation.Cell Death Differ.(2015):22(9):1451-62.)。本发明将MYSM1与慢病毒载体联合(所用载体为慢病毒PLENTI载体，购买自ADDGENE)，包装形成稳定表达的慢病毒，感染受体细胞，实现相关的蛋白高效异位表达。

本发明提供一种组蛋白去泛素化酶(H2A)在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用，所述组蛋白去泛素化酶，核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

所述制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中，组蛋白去泛素化酶计量为0.1mol。

本发明提供一种利用所述应用中组蛋白去泛素化酶基因编码的蛋白，所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

蛋白氨基酸序列：

MAAEEADVDIEGDVVAAAGAQPGSGENTASVLQKDHYLDSSWRTENGLIPWTLDNTISEENRAVIEKMLLEEEYYLSKKSQPEKVWLDQKEDDKKYMKSLQKTAKIMVHSPTKPASYSVKWTIEEKELFEQGLAKFGRRWTKISKLIGSRTVLQVKSYARQYFKNKVKCGLDKETPNQKTGHNLQVKNEDKGTKAWTPSCLRGRADPNLNAVKIEKLSDDEEVDITDEVDELSSQTPQKNSSSDLLLDFPNSKMHETNQGEFITSDSQEALFSKSSRGCLQNEKQDETLSSSEITLWTEKQSNGDKKSIELNDQKFNELIKNCNKHDGRGIIVDARQLPSPEPCEIQKNLNDNEMLFHSCQMVEESHEEEELKPPEQEIEIDRNIIQEEEKQAIPEFFEGRQAKTPERYLKIRNYILDQWEICKPKYLNKTSVRPGLKNCGDVNCIGRIHTYLELIGAINFGCEQAVYNRPQTVDKVRIRDRKDAVEAYQLAQRLQSMRTRRRRVRDPWGNWCDAKDLEGQTFEHLSAEELAKRREEEKGRPVKSLKVPRPTKSSFDPFQLIPCNFFSEEKQEPFQVKVASEALLIMDLHAHVSMAEVIGLLGGRYSEVDKVVEVCAAEPCNSLSTGLQCEMDPVSQTQASETLAVRGFSVIGWYHSHPAFDPNPSLRDIDTQAKYQSYFSRGGAKFIGMIVSPYNRNNPLPYSQITCLVISEEISPDGSYRLPYKFEVQQMLEEPQWGLVFEKTRWIIEKYRLSHSSVPMDKIFRRDSDLTCLQKLLECMRKTLSKVTNCFMAEEFLTEIENLFLSNYKSNQENGVTEENCTKELLM

基因型序列如下：SEQ ID NO：1

atggcgg ctgaagaggc ggatgtggat atcgaagggg acgtggtagc ggcggcgggggcacagccag gaagtggtga aaatacagca tcagttttac aaaaagatca ctatcttgat tcatcttggagaacagagaa tggccttatt ccttggacct tggataacac catcagtgaa gagaacagag ctgttattgagaaaatgttg ttggaagaag aatattattt atctaaaaaa tcacaaccgg aaaaagtctg gcttgatcaaaaggaagatg ataaaaaata catgaagagt ctgcagaaaa cagcaaaaat catggtacac tctcctacaaaaccagccag ttactcagta aagtggacga tagaagaaaa agagctgttt gaacaagggc tggctaaatttggccgaaga tggaccaaaa tttcaaagct aattggaagc cgcactgttt tacaagtgaa gagttatgcaagacagtatt ttaaaaataa ggtcaaatgc ggtctggata aagaaacacc aaatcagaag accggccataatcttcaagt taaaaatgaa gataaaggga caaaggcatg gacaccatca tgtttaaggg gacgtgctgatcccaacttg aatgctgtaa aaattgaaaa gttatctgat gatgaagaag tagacatcac agatgaggtggacgagttgt cttctcaaac accccagaag aattctagca gtgatctctt gttagacttt cctaatagtaaaatgcatga aaccaatcaa ggagaattca ttacttctga cagccaggaa gctctctttt ctaagtcttccaggggctgt cttcaaaatg aaaagcaaga tgaaacactt tcaagctcag aaattacact gtggactgagaaacagagca atggtgacaa aaaatcaatt gaattaaatg accagaaatt taatgaattg attaaaaactgcaacaagca tgatggaagg ggaataatag ttgatgccag gcagttgcct tctccagagc cttgtgaaattcagaaaaat ttgaatgata atgaaatgct ttttcattct tgccaaatgg tagaggaaag ccatgaggaagaagagctta agccaccaga acaggaaata gaaatagata gaaatatcat tcaagaagaa gaaaaacaagcaattcctga gttttttgag gggcgccaag ctaaaacacc agaacgctat ttgaaaatta gaaattatattttggatcaa tgggagatat gcaaaccaaa atacttaaat aagacctcag tacgtcctgg cctgaagaactgtggagatg ttaattgtat tggacggatt catacatacc tcgaattgat aggagcaatc aattttggatgtgaacaggc tgtgtataat aggccacaaa cagttgacaa agtacgaatc agagacagaa aagatgcagtagaagcatac caacttgccc agcgtctgca gtctatgcgt acaaggagac gtagggtccg agacccatggggaaactggt gtgatgcaaa ggacttagaa ggacaaacgt ttgagcatct ctctgctgag gagttggcaaaaagaagaga agaggaaaaa ggcagacctg ttaaatcttt aaaagtgcca agaccaacaa aaagctcgtttgatcccttc caactgatac cttgtaattt ttttagtgaa gaaaagcagg agccatttca ggtgaaagtggcttcagaag cacttttaat aatggatttg catgctcatg tttctatggc agaagtgatt ggtctgttaggaggaagata ctcagaagtt gataaagtag ttgaagtctg tgcagcagaa ccatgtaaca gtctgagtacaggactacag tgtgagatgg atcctgtatc acaaacacag gcctcagaaa ccttggctgt tagaggcttcagtgttattg gatggtatca ttctcatcct gcttttgatc ctaatccttc cttacgagat attgacacacaagctaaata ccagagttac ttctccagag gaggtgcaaa gttcattggg atgattgtta gtccctataatcgaaataat cccttaccat attctcagat tacctgcctg gttataagtg aggaaattag cccagatggctcttatcgct taccttacaa atttgaagta cagcagatgt tagaagaacc tcagtgggga ttagtatttgaaaagacaag atggataata gaaaaataca ggctctccca tagcagcgtc cccatggata aaatctttcgccgggattct gacctgactt gtttgcagaa acttttggag tgtatgagga agactctgag caaagtgaccaattgcttta tggctgaaga attcttgact gaaatagaaa atttgttcct ttccaattat aaaagcaaccaagagaatgg agtaaccgaa gagaactgta caaaggaatt gttaatgtga。

本发明提供一种利用所述蛋白在制备预防/治疗自身免疫疾病药物中的应用。

下面结合具体实施例及相关实验对本发明作进一步描述。

实施例1

本发明提供的MYSM1在系统性红斑狼疮治疗中的作用，其步骤是：

A.确认MYSM1与系统性红斑狼疮的相关性

从健康人的血液以及系统性红斑狼疮病人的血液，分离得到外周血淋巴细胞(PBMCs)。步骤如下：

1.在15ml离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.取肝素抗凝静脉血与等量Hanks缓冲液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm，20分钟。

3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，外周血单个核细胞(PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。

4.吸取淋巴细胞层。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hanks缓冲液或RPMI1640，水平离心1500rpm，10分钟，洗涤细胞两次。

5.离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞并计数，37℃培养。

随机抽取健康人群(15例)和系统性红斑狼疮(SLE)患者(14例)的血样。从血样中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。分别用RT-PCR和Western blot方法检测PBMCs中表达的MYSM1 mRNA和MYSM1蛋白，用RT-PCR检测β-干扰素(Interferon-β，IFN-β)mRNA，干扰素刺激基因56(IFN-stimulated gene 56，ISG56)mRNA，干扰素刺激基因15(IFN-stimulatedgene15，ISG15)mRNA，肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)mRNA，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)mRNA和趋化因子(C-X-C motif ligand 10，CXCL10)mRNA。结果显示，MYSM1 mRNA的表达和MYSM1蛋白在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞(PBMCs)中显著降低。相反，干扰素和促炎细胞因子mRNA水平，包括IFN-β，ISG56，ISG15，IL-6，TNF-α和CXCL10在系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞(PBMCs)显著增加。这些结果提示MYSM1表达与系统性红斑狼疮密切相关。

B.MYSM1治疗红斑狼疮

随机抽取武汉同济医院健康人群(5例)和系统性红斑狼疮(SLE)患者(5例)的血样。从血样中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。然后感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时。用RT-PCR和Western blot方法检测MYSM1mRNA和MYSM1蛋白水平。在用用RT-PCR检测IFN-βmRNA，ISG56 mRNA，ISG15mRNA，TNF-αmRNA，IL-6 mRNA和CXCL10 mRNA。实验表明，慢病毒系统可以在PBMC中稳定表达MYSM1，证明系统可行，进一步分析治疗后的炎症因子水平，表明MYSM1过表达显著抑制了系统性红斑狼疮病人中炎症因子的活化，证明MYSM1具有治疗效果，具有潜在的运用价值。

实施例2:确认MYSM1与系统性红斑狼疮的相关性

确认MYSM1与系统性红斑狼疮的相关性，其步骤是：

1.实验材料：

1.1细胞

从健康人血液以及系统性红斑狼疮病人血液中，分离得到的外周血单个核细胞(PBMCs)。

1.2试剂

1640培养基和胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)购自GIBCO公司；RNA提取试剂盒购于庄盟生物。

1.3实验仪器：

LC480为罗氏公司产品；细胞培养箱为Thermofisher公司产品。

2.实验方法与结果：

2.1在15ml离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.2取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm，20分钟。

2.3离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

2.4吸取淋巴细胞层。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hanks液或RPMI1640，水平离心1500rpm，10分钟，洗涤细胞两次。

2.5离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞并计数，37℃培养。

2.6随机抽取健康人群(15例)和系统性红斑狼疮(SLE)患者(14例)的血样。从血样中分离出PBMCs。分别用RT-PCR和Western blot方法检测PBMCs中表达的MYSM1 mRNA和MYSM1蛋白，用RT-PCR检测IFN-βmRNA，ISG56 mRNA，ISG15mRNA，TNF-αmRNA，IL-6 mRNA和CXCL10 mRNA。结果通过GraphPad Prism 6软件计算出平均值和标准差。

2.7利用步骤(6)中的计算结果绘制相关结论，如图1(A，B：系统性斑狼疮病人与健康人外周血单个核细胞(PBMC)中MYSM1 mRNA及MYSM1蛋白的表达情况。C-H：系统性斑狼疮人与健康人外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-βmRNA(C)，ISG56 mRNA(D)，ISG15 mRNA(E)，TNF-αmRNA(F)，IL-6 mRNA(G)和CXCL10 mRNA(H)的表达情况)所示。

实施例3:MYSM1治疗系统性红斑狼疮

1.实验材料

1.1细胞

取得健康人的血液以及系统性红斑狼疮病人的血液，分离得到外周血单个核细胞(PBMCs)。

1.2试剂：

1.3实验仪器：

LC480为罗氏公司产品；细胞培养箱为Thermofisher公司产品。

2.实验方法与结果：

2.1在15ml离心管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.3离心后管内分为三层，上层为皿浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

2.6.随机抽取健康人群(5例)和系统性红斑狼疮(SLE)患者(5例)的血样。从血样中分离出外周血单个核细胞(PBMCs)。然后感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时。用RT-PCR和Western blot方法检测MYSM1 mRNA和MYSM1蛋白水平。在用RT-PCR检测IFN-βmRNA，ISG56 mRNA，ISG15 mRNA，TNF-αmRNA，IL-6 mRNA和CXCL10 mRNA结果通过GraphPad Prism 6软件计算出平均值和标准差。

2.7利用步骤2.6中的计算结果绘制相关结论，如图2(A，B：系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞(PBMC)感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时，处理后检测MYSM1的mRNA(A)及蛋白(B)表达量。C-H：系统性红斑狼疮病人外周血单个核细胞(PBMC)感染表达MYSM1的慢病毒(Lenti-Mysm1)或其对照慢病毒(Lenti-Ctrl)48小时,处理后检测外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-βmRNA(C)，ISG56 mRNA(D)，ISG15mRNA(E)，TNF-αmRNA(F)，IL-6 mRNA(G)和CXCL10 mRNA(H)的表达量)所示。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东龙帆生物科技有限公司

<120> 组蛋白去泛素化酶在制备治疗系统性红斑狼疮药物的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2487

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcggctg aagaggcgga tgtggatatc gaaggggacg tggtagcggc ggcgggggca 60

cagccaggaa gtggtgaaaa tacagcatca gttttacaaa aagatcacta tcttgattca 120

tcttggagaa cagagaatgg ccttattcct tggaccttgg ataacaccat cagtgaagag 180

aacagagctg ttattgagaa aatgttgttg gaagaagaat attatttatc taaaaaatca 240

caaccggaaa aagtctggct tgatcaaaag gaagatgata aaaaatacat gaagagtctg 300

cagaaaacag caaaaatcat ggtacactct cctacaaaac cagccagtta ctcagtaaag 360

tggacgatag aagaaaaaga gctgtttgaa caagggctgg ctaaatttgg ccgaagatgg 420

accaaaattt caaagctaat tggaagccgc actgttttac aagtgaagag ttatgcaaga 480

cagtatttta aaaataaggt caaatgcggt ctggataaag aaacaccaaa tcagaagacc 540

ggccataatc ttcaagttaa aaatgaagat aaagggacaa aggcatggac accatcatgt 600

ttaaggggac gtgctgatcc caacttgaat gctgtaaaaa ttgaaaagtt atctgatgat 660

gaagaagtag acatcacaga tgaggtggac gagttgtctt ctcaaacacc ccagaagaat 720

tctagcagtg atctcttgtt agactttcct aatagtaaaa tgcatgaaac caatcaagga 780

gaattcatta cttctgacag ccaggaagct ctcttttcta agtcttccag gggctgtctt 840

caaaatgaaa agcaagatga aacactttca agctcagaaa ttacactgtg gactgagaaa 900

cagagcaatg gtgacaaaaa atcaattgaa ttaaatgacc agaaatttaa tgaattgatt 960

aaaaactgca acaagcatga tggaagggga ataatagttg atgccaggca gttgccttct 1020

ccagagcctt gtgaaattca gaaaaatttg aatgataatg aaatgctttt tcattcttgc 1080

caaatggtag aggaaagcca tgaggaagaa gagcttaagc caccagaaca ggaaatagaa 1140

atagatagaa atatcattca agaagaagaa aaacaagcaa ttcctgagtt ttttgagggg 1200

cgccaagcta aaacaccaga acgctatttg aaaattagaa attatatttt ggatcaatgg 1260

gagatatgca aaccaaaata cttaaataag acctcagtac gtcctggcct gaagaactgt 1320

ggagatgtta attgtattgg acggattcat acatacctcg aattgatagg agcaatcaat 1380

tttggatgtg aacaggctgt gtataatagg ccacaaacag ttgacaaagt acgaatcaga 1440

gacagaaaag atgcagtaga agcataccaa cttgcccagc gtctgcagtc tatgcgtaca 1500

aggagacgta gggtccgaga cccatgggga aactggtgtg atgcaaagga cttagaagga 1560

caaacgtttg agcatctctc tgctgaggag ttggcaaaaa gaagagaaga ggaaaaaggc 1620

agacctgtta aatctttaaa agtgccaaga ccaacaaaaa gctcgtttga tcccttccaa 1680

ctgatacctt gtaatttttt tagtgaagaa aagcaggagc catttcaggt gaaagtggct 1740

tcagaagcac ttttaataat ggatttgcat gctcatgttt ctatggcaga agtgattggt 1800

ctgttaggag gaagatactc agaagttgat aaagtagttg aagtctgtgc agcagaacca 1860

tgtaacagtc tgagtacagg actacagtgt gagatggatc ctgtatcaca aacacaggcc 1920

tcagaaacct tggctgttag aggcttcagt gttattggat ggtatcattc tcatcctgct 1980

tttgatccta atccttcctt acgagatatt gacacacaag ctaaatacca gagttacttc 2040

tccagaggag gtgcaaagtt cattgggatg attgttagtc cctataatcg aaataatccc 2100

ttaccatatt ctcagattac ctgcctggtt ataagtgagg aaattagccc agatggctct 2160

tatcgcttac cttacaaatt tgaagtacag cagatgttag aagaacctca gtggggatta 2220

gtatttgaaa agacaagatg gataatagaa aaatacaggc tctcccatag cagcgtcccc 2280

atggataaaa tctttcgccg ggattctgac ctgacttgtt tgcagaaact tttggagtgt 2340

atgaggaaga ctctgagcaa agtgaccaat tgctttatgg ctgaagaatt cttgactgaa 2400

atagaaaatt tgttcctttc caattataaa agcaaccaag agaatggagt aaccgaagag 2460

aactgtacaa aggaattgtt aatgtga 2487

<210> 2

<211> 828

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Ala Glu Glu Ala Asp Val Asp Ile Glu Gly Asp Val Val Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gly Ala Gln Pro Gly Ser Gly Glu Asn Thr Ala Ser Val Leu

20 25 30

Gln Lys Asp His Tyr Leu Asp Ser Ser Trp Arg Thr Glu Asn Gly Leu

35 40 45

Ile Pro Trp Thr Leu Asp Asn Thr Ile Ser Glu Glu Asn Arg Ala Val

50 55 60

Ile Glu Lys Met Leu Leu Glu Glu Glu Tyr Tyr Leu Ser Lys Lys Ser

65 70 75 80

Gln Pro Glu Lys Val Trp Leu Asp Gln Lys Glu Asp Asp Lys Lys Tyr

85 90 95

Met Lys Ser Leu Gln Lys Thr Ala Lys Ile Met Val His Ser Pro Thr

100 105 110

Lys Pro Ala Ser Tyr Ser Val Lys Trp Thr Ile Glu Glu Lys Glu Leu

115 120 125

Phe Glu Gln Gly Leu Ala Lys Phe Gly Arg Arg Trp Thr Lys Ile Ser

130 135 140

Lys Leu Ile Gly Ser Arg Thr Val Leu Gln Val Lys Ser Tyr Ala Arg

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Lys Asn Lys Val Lys Cys Gly Leu Asp Lys Glu Thr Pro

165 170 175

Asn Gln Lys Thr Gly His Asn Leu Gln Val Lys Asn Glu Asp Lys Gly

180 185 190

Thr Lys Ala Trp Thr Pro Ser Cys Leu Arg Gly Arg Ala Asp Pro Asn

195 200 205

Leu Asn Ala Val Lys Ile Glu Lys Leu Ser Asp Asp Glu Glu Val Asp

210 215 220

Ile Thr Asp Glu Val Asp Glu Leu Ser Ser Gln Thr Pro Gln Lys Asn

225 230 235 240

Ser Ser Ser Asp Leu Leu Leu Asp Phe Pro Asn Ser Lys Met His Glu

245 250 255

Thr Asn Gln Gly Glu Phe Ile Thr Ser Asp Ser Gln Glu Ala Leu Phe

260 265 270

Ser Lys Ser Ser Arg Gly Cys Leu Gln Asn Glu Lys Gln Asp Glu Thr

275 280 285

Leu Ser Ser Ser Glu Ile Thr Leu Trp Thr Glu Lys Gln Ser Asn Gly

290 295 300

Asp Lys Lys Ser Ile Glu Leu Asn Asp Gln Lys Phe Asn Glu Leu Ile

305 310 315 320

Lys Asn Cys Asn Lys His Asp Gly Arg Gly Ile Ile Val Asp Ala Arg

325 330 335

Gln Leu Pro Ser Pro Glu Pro Cys Glu Ile Gln Lys Asn Leu Asn Asp

340 345 350

Asn Glu Met Leu Phe His Ser Cys Gln Met Val Glu Glu Ser His Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Leu Lys Pro Pro Glu Gln Glu Ile Glu Ile Asp Arg Asn

370 375 380

Ile Ile Gln Glu Glu Glu Lys Gln Ala Ile Pro Glu Phe Phe Glu Gly

385 390 395 400

Arg Gln Ala Lys Thr Pro Glu Arg Tyr Leu Lys Ile Arg Asn Tyr Ile

405 410 415

Leu Asp Gln Trp Glu Ile Cys Lys Pro Lys Tyr Leu Asn Lys Thr Ser

420 425 430

Val Arg Pro Gly Leu Lys Asn Cys Gly Asp Val Asn Cys Ile Gly Arg

435 440 445

Ile His Thr Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Ala Ile Asn Phe Gly Cys Glu

450 455 460

Gln Ala Val Tyr Asn Arg Pro Gln Thr Val Asp Lys Val Arg Ile Arg

465 470 475 480

Asp Arg Lys Asp Ala Val Glu Ala Tyr Gln Leu Ala Gln Arg Leu Gln

485 490 495

Ser Met Arg Thr Arg Arg Arg Arg Val Arg Asp Pro Trp Gly Asn Trp

500 505 510

Cys Asp Ala Lys Asp Leu Glu Gly Gln Thr Phe Glu His Leu Ser Ala

515 520 525

Glu Glu Leu Ala Lys Arg Arg Glu Glu Glu Lys Gly Arg Pro Val Lys

530 535 540

Ser Leu Lys Val Pro Arg Pro Thr Lys Ser Ser Phe Asp Pro Phe Gln

545 550 555 560

Leu Ile Pro Cys Asn Phe Phe Ser Glu Glu Lys Gln Glu Pro Phe Gln

565 570 575

Val Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Leu Ile Met Asp Leu His Ala His

580 585 590

Val Ser Met Ala Glu Val Ile Gly Leu Leu Gly Gly Arg Tyr Ser Glu

595 600 605

Val Asp Lys Val Val Glu Val Cys Ala Ala Glu Pro Cys Asn Ser Leu

610 615 620

Ser Thr Gly Leu Gln Cys Glu Met Asp Pro Val Ser Gln Thr Gln Ala

625 630 635 640

Ser Glu Thr Leu Ala Val Arg Gly Phe Ser Val Ile Gly Trp Tyr His

645 650 655

Ser His Pro Ala Phe Asp Pro Asn Pro Ser Leu Arg Asp Ile Asp Thr

660 665 670

Gln Ala Lys Tyr Gln Ser Tyr Phe Ser Arg Gly Gly Ala Lys Phe Ile

675 680 685

Gly Met Ile Val Ser Pro Tyr Asn Arg Asn Asn Pro Leu Pro Tyr Ser

690 695 700

Gln Ile Thr Cys Leu Val Ile Ser Glu Glu Ile Ser Pro Asp Gly Ser

705 710 715 720

Tyr Arg Leu Pro Tyr Lys Phe Glu Val Gln Gln Met Leu Glu Glu Pro

725 730 735

Gln Trp Gly Leu Val Phe Glu Lys Thr Arg Trp Ile Ile Glu Lys Tyr

740 745 750

Arg Leu Ser His Ser Ser Val Pro Met Asp Lys Ile Phe Arg Arg Asp

755 760 765

Ser Asp Leu Thr Cys Leu Gln Lys Leu Leu Glu Cys Met Arg Lys Thr

770 775 780

Leu Ser Lys Val Thr Asn Cys Phe Met Ala Glu Glu Phe Leu Thr Glu

785 790 795 800

Ile Glu Asn Leu Phe Leu Ser Asn Tyr Lys Ser Asn Gln Glu Asn Gly

805 810 815

Val Thr Glu Glu Asn Cys Thr Lys Glu Leu Leu Met

820 825

Claims

1.一种组蛋白去泛素化酶在制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中的应用，其特征在于，所述组蛋白去泛素化酶，核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述制备预防和治疗系统性红斑狼疮药物中，组蛋白去泛素化酶剂量为0.1mol。

3.一种利用权利要求1所述应用中组蛋白去泛素化酶基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

4.一种利用权利要求3所述蛋白在制备预防/治疗自身免疫疾病药物中的应用。

5.一种利用权利要求3所述蛋白构建的慢病毒表达载体。

6.一种在权利要求3所述蛋白的K119位点上的单泛素化修饰获得的金属蛋白酶。