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CN111587295A - 来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途 - Google Patents

来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途 Download PDF

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CN111587295A CN201980007976.2A CN201980007976A CN111587295A CN 111587295 A CN111587295 A CN 111587295A CN 201980007976 A CN201980007976 A CN 201980007976A CN 111587295 A CN111587295 A CN 111587295A
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parkinson
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Abstract

本发明涉及来源于普氏粪杆菌的囊泡及其用途。本发明人已经通过实验证实了患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病的患者的临床样品中的囊泡与正常人相比显著减少，并且当施用从菌株中分离的囊泡时，由病原囊泡(例如来源于大肠杆菌的囊泡)引起的炎性介质的分泌被显著抑制。期望根据本发明的来源于普氏粪杆菌的囊泡可有效地用于开发用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和/或帕金森氏病的方法以及用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物的目的。

Description

来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及通过使用来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡来诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病的方法，以及包括上述囊泡的用于预防、减轻或治疗所述疾病的组合物。
背景技术
自21世纪初以来，在过去被认为是流行病的急性传染病已变得不那么重要，而由于人类与微生物群落之间的不和谐而导致的伴随免疫功能障碍的慢性炎性病已经改变了疾病模式，成为决定生活质量和人类的寿命的主要疾病。作为21世纪的顽固性慢性炎性疾病，癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、代谢性疾病和神经精神疾病已成为国家公共卫生的重要问题，成为决定人类寿命和生活质量的主要疾病。
众所周知，人体中共存的微生物数量已达到100万亿，是人体细胞数量的10倍，微生物基因数量是人体基因数量的100倍以上。微生物群或微生物组是指微生物群落，包括存在于给定栖息地中的细菌，古细菌和真核生物。
我们体内共存的细菌和周围环境中存在的细菌会分泌纳米大小的囊泡，以便与其他细胞交换有关基因，低分子化合物，蛋白质等的信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒无法通过该物理防御膜，因此，共存于粘膜中的细菌不能通过粘膜，但来源于细菌的囊泡的大小为100纳米或更小并通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞后被吸收到我们体内。细菌局部分泌的来源于细菌的囊泡经粘膜上皮细胞吸收，从而引起局部炎性反应，而穿过上皮细胞的囊泡经淋巴管系统地吸收，从而分布在各个器官中，并且免疫和炎性反应在分布有囊泡的器官中受到调节。例如，来源于诸如大肠杆菌(Escherichia coli)之类的致病性革兰氏阴性细菌的囊泡局部引起结肠炎，并在吸收到血管中时通过血管内皮炎性反应促进全身性炎症反应、大便和血液凝固，并且在吸收进入胰岛素作用的肌肉细胞时引起胰岛素抵抗和糖尿病。另一方面，来源于有益细菌的囊泡可通过控制由致病囊泡引起的免疫功能障碍和代谢功能障碍来控制疾病。
作为对来源于细菌的囊泡等因子的免疫应答，以白介素(以下称IL)-17细胞因子的分泌为特征的Th17免疫应答发生，并且IL-6在暴露于来源于细菌的囊泡时被分泌，从而诱导Th17免疫回应。Th17免疫反应引起的炎症以中性粒细胞浸润为特征，并且在炎症发生过程中，从中性粒细胞和巨噬细胞等炎性细胞分泌的肿瘤坏死因子-α(以下称TNF-α)在炎症和肿瘤发生中起重要作用。
普氏粪杆菌是一种革兰氏阳性细菌，其在人的大肠中共存，已知为一种发酵膳食纤维以产生短链脂肪酸(如丁酸盐)的细菌。据报道，当细菌数量减少时，其与克罗恩病、肥胖、哮喘和抑郁症有关。但是，迄今尚未报道过普氏粪杆菌在细胞外释放囊泡的事实，特别是没有报道过普氏粪杆菌用于癌症或难治性疾病(如心脑疾病)的诊断和治疗的情况。
因此，在本发明中，证实可以通过以下方式诊断疾病：证实与正常个体相比，来源于普氏粪杆菌的囊泡在患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病患者的临床样品中显著减少。此外，通过从普氏粪杆菌分离囊泡并分析其特性，证实了该囊泡可用作预防或治疗诸如胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病之类的疾病的组合物。
发明内容
【技术问题】
为了解决上述问题，经过大量研究，本发明的发明人通过宏基因组学分析证实，与正常个体相比，来源于普氏粪杆菌的囊泡的含量在患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病患者的临床样品中显著减少。还证实了，当从普氏粪杆菌中分离囊泡并用其处理巨噬细胞时，通过致病囊泡进行的IL-6和TNF-α的分泌被显著抑制，从而基于这些发现完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种提供用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的信息的方法。
此外，本发明的另一个目的是提供用于预防、减轻或治疗选自胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病中的一种或多种疾病的组合物，其包含来源于普氏粪杆菌的囊泡作为有效成分。
然而，本发明要实现的技术问题不限于上述问题，并且本领域技术人员根据以下描述可以清楚地理解未提及的其他问题。
【技术方案】
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从正常个体和受试者的样品分离的囊泡中提取DNA；
(b)使用基于16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以获得每种PCR产物；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡含量低于正常个体样品的情况为胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病。
此外，本发明提供了一种诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从正常个体和受试者的样品分离的囊泡中提取DNA；
(b)使用基于16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以获得每种PCR产物；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡含量低于正常个体样品的情况为胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病。
作为本发明的示例性实施方案，步骤(a)中的样品可以是粪便、血液或尿液。
作为本发明的另一个实施方案，步骤(b)中的引物对可以是包含由SEQ ID No.1和2表示的碱基序列的引物对。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡。
此外，本发明提供了一种用于预防或减轻选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡。
另外，本发明提供了一种用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡。
此外，本发明提供了来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡的用途，其用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病。
作为本发明的示例性实施方式，所述囊泡的平均直径可以为10nm至200nm。
作为本发明的另一个示例性实施方案，所述囊泡可以是天然或人工地从普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)分泌的。
[有益效果]
本发明人证实肠细菌没有被吸收到体内，但是来源于细菌的囊泡通过上皮细胞被吸收到体内，全身地分布，并通过肾脏、肝脏和肺从体内排泄，并且通过宏基因组学分析来源于患者的粪便、血液或尿液中存在的细菌的囊泡，证实了与正常个体相比，在患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病患者的粪便、血液或尿液中的来源于普氏粪杆菌的囊泡的含量已显著减少。此外，已经观察到，当肠道共生的普氏粪杆菌被分离，体外培养以分离囊泡，并且在体外将囊泡施用到炎性细胞中时，由病原囊泡引起的炎性介质的分泌被显著抑制。因此，预期根据本发明的来源于普氏粪杆菌的囊泡可有效地用于诊断例如胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病之类的疾病的方法，以及用于预防、减轻或治疗上述疾病的食品或药物组合物。
附图说明
图1A是在对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡(EV)之后按时间捕获细菌和来源于细菌的囊泡(EV)的分布模式的一系列照片。图1B是通过在口服施用细菌和囊泡后12小时收集血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估细菌和囊泡的体内分布模式的结果。
图2是在对胃癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图3是在对结直肠癌患者和正常个体的粪便中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图4是在对肝癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图5是在对胰腺癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图6是在对胆管癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图7是在对卵巢癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图8是在对膀胱癌患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图9是在对淋巴瘤患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图10是在对心肌梗塞患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图11是在对心房颤动患者和正常个体的血液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图12是在对帕金森氏病患者和正常个体的尿液中存在的来源于细菌的囊泡进行了宏基因组学分析之后，比较来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布的结果。
图13A和13B显示了通过用各种浓度的来源于普氏粪杆菌的囊泡处理巨噬细胞而导致的炎症介质的分泌与通过用诸如大肠杆菌囊泡(E.coli EVs)之类的病原囊泡处理巨噬细胞而导致的炎症介质的分泌的比较的结果以评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的炎症诱导效果。其中，图13A是IL-6分泌的比较结果。图13B是TNF-α分泌的比较结果。
图14A和14B显示了通过在治疗诸如大肠杆菌EV之类的病原囊之前预处理来源于普氏粪杆菌的囊泡而评估对大肠杆菌EV引起的炎性介质的分泌的作用，以评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的抗炎和免疫调节作用的结果。其中图14A是IL-6分泌的比较。图14B是TNF-α分泌的比较。
具体实施方式
本发明涉及来源于普氏粪杆菌的囊泡及其用途。
本发明人通过宏基因组学分析证实，与来自正常个体的样品相比，来源于患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病的患者的样品中的来源于普氏粪杆菌的囊泡的含量显著减少，从而基于此完成了本发明。
因此，本发明提供了一种提供用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从正常个体和受试者的样品分离的囊泡中提取DNA；
(b)使用基于16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以获得每种PCR产物；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于普氏粪杆菌的囊泡含量低于正常个体样品的情况为胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病。
如本文所用，术语“诊断”是指广义上在所有方面确定患者的疾病状况。确定的内容是疾病的实体、病因、发病机理、严重程度、疾病的详细方面、是否存在并发症、预后等。本发明中的诊断是指确定胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和/或帕金森氏病是否发生，疾病的程度等。
如本文所用，术语“纳米囊泡”或“囊泡”是指由从各种细菌分泌的纳米尺寸的膜组成的结构。来源于革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(OMV)具有内毒素(脂多糖)、毒性蛋白、细菌DNA和RNA，以及来源于革兰氏阳性细菌的囊泡除了蛋白质和核酸之外还具有属于细菌的细胞壁成分的肽聚糖和脂磷壁酸。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是由普氏粪杆菌天然分泌的或人工产生的，呈球形，平均直径为10至200nm。
如本文所用，术语“宏基因组”还指微生物组，是指在诸如土壤和动物肠等独立区域中的包括所有病毒、细菌、真菌等的基因组的全部，并且通常用作基因组的概念，解释通过使用序列分析仪一次鉴定大量微生物以分析未培养的微生物(uncultivatedmicroorganisms)。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指一种混合基因组，作为一种环境单位的所有物种的基因组。当在组学生物学的发展过程中定义一个物种时，该宏基因组就是一个从形成一个完整物种的观点衍生的术语，它是由各种彼此相互作用的物种以及一种功能上存在的物种形成的。从技术上讲，宏基因组是一种技术的目标，该技术通过一种快速序列分析方法，通过分析所有DNA和RNA来识别一个环境中的所有物种，并研究相互作用和代谢，而与物种无关。
在本发明中，来源于患者的样品可以是粪便、血液或尿液，但不受限于此。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或治疗选自胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病中的一种或多种疾病的药物组合物，其包含来源于普氏粪杆菌的囊泡作为有效成分。
作为本发明的另一方面，本发明提供了用于预防或减轻选自胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病中的一种或多种疾病的食品组合物，其包含来源于普氏粪杆菌的囊泡作为有效成分。
如本文所用，术语“预防”是指通过施用根据本发明的食品或药物组合物抑制胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和/或帕金森氏病等和延迟其发作的所有动作。
如本文所用，术语“治疗”是指通过施用根据本发明的食品或药物组合物减轻或有益地改变胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和/或帕金森氏病等的症状的所有动作。
如本文所用，术语“缓解”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有动作。
可通过使用选自离心，超高速离心，高压处理，挤出，超声处理，细胞裂解，匀浆，冷冻-解冻，电穿孔，机械分解，化学处理，过滤器过滤，凝胶过滤色谱，自由流动电泳和毛细管电泳中的一种或多种方法，从包含普氏粪杆菌的培养液中分离囊泡。此外，可以进一步包括诸如用于去除杂质的洗涤之类的处理和浓缩所获得的囊泡。
在本发明的一个实施方案中，通过对小鼠口服施用细菌和来源于细菌的囊泡并观察该细菌和囊泡的体内吸收、分布和排泄模式，证实：尽管细菌不是通过肠粘膜吸收的，但来源于细菌的囊泡在施用后5分钟内被吸收并全身分布，且通过肾脏、肝脏等排泄(参见实施例1)。
在本发明的一实施方案中，使用从患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病的患者以及年龄和性别与患者相匹配的正常个体的粪便、血液或者尿液分离的囊泡执行宏基因组学分析。结果证实，与正常个体的样品相比，在患有胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病的患者的临床样品中的来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见实施例3至13)。
在本发明的另一个实施方案中，培养普氏粪杆菌，以评估由其分泌的囊泡是否具有免疫调节和抗炎作用，并且通过在用不同浓度的来源于普氏粪杆菌的囊泡处理巨噬细胞后处理属于炎性疾病的致病因素的大肠杆菌囊泡(E.coli EVs)来评估炎症介质的分泌证实了：通过来源于普氏粪杆菌的囊泡有效地抑制了由大肠杆菌囊泡(E.coli EVs)引起的IL-6和TNF-α分泌(参见实施例15)。
本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常用于制剂中，包括生理盐水(saline)、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但不受限于此，并且如果需要，可以进一步包括其他典型的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。此外，可通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等将组合物配制成可注射的制剂，例如水溶液、悬浮液和乳剂，丸剂，胶囊剂，颗粒剂或片剂。关于合适的药学上可接受的载体和制剂，可以优选地通过使用Remington’s literature(雷明顿文献)中公开的方法根据每种成分来配制组合物。本发明的药物组合物的制剂没有特别限制，但可以配制成注射剂、吸入剂、皮肤外用剂、口服剂等。
本发明的药物组合物可以根据期望的方法经口或胃肠外(例如静脉内、皮下、皮内、鼻内或气管内)施用，并且剂量可以根据患者的状况和体重、疾病严重程度、药物制剂、给药途径和持续时间而变化，但是可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，药学有效量是指足以以适用于医疗的合理利益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括以下的因素确定：患者的疾病类型、疾病的严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物、以及其他医学领域众所周知的因素。根据本发明的组合物可以作为单独的治疗剂施用或与其他治疗剂组合施用，可以与相关技术中的治疗剂顺序或同时施用，并且可以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以可以在没有任何副作用的情况下获得最大效果的最小量施用组合物，这可以由本领域普通技术人员容易地确定。
具体地，根据患者的年龄、性别和体重，本发明的药物组合物的有效量可以变化，并且通常，该药物组合物可以每天或每两天、或每天1至3次，以0.001至150mg，优选0.01至100mg/kg体重的量施用。但是，由于可以通过给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重或年龄来增加或减少剂量，因此上述剂量绝不以任何方式限制本发明的范围。
本发明的食品组合物包括保健功能食品组合物。根据本发明的食品组合物可以通过将活性成分原样添加到食品中来使用，或者可以与其他食品或食品成分一起使用，但是可以根据典型方法适当地使用。活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或减轻)适当地确定。通常，当制备食品或饮料时，以原料计算，本发明的组合物的添加量为15重量％以下，优选为10重量％以下。然而，出于健康和卫生目的或为了健康控制目的而长期摄入，该量可以小于上述范围。
除了本发明的食品组合物包含指定比例的活性成分作为必要成分之外，其他成分没有特别限制，并且本发明的食品组合物可包含各种调味剂、天然碳水化合物等，像典型的饮料一样，作为附加成分。上述天然碳水化合物的实例包括常规的糖，例如单糖，例如葡萄糖、果糖等；二糖，例如麦芽糖、蔗糖等；和多糖，例如糊精、环糊精等；以及糖醇，如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。作为除了上述调味剂以外的调味剂，可以有利地使用天然调味剂(甜蛋白(thaumatin)，甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
除了所述添加剂以外，本发明的食品组合物还可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂和天然调味剂)、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
在下文中，将提出有助于理解本发明的优选实施例。然而，提供以下实施例仅是为了更容易理解本发明，并且本发明的内容不受以下实施例的限制。
【发明方式】
[实施例]
实施例1.肠道细菌和来源于细菌的囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估肠道细菌和来源于细菌的囊泡是否通过胃肠道被全身吸收，用以下方法进行实验。首先，将带有荧光标记的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡中的每种的50μg剂量通过小鼠的胃肠道施用至小鼠的胃，并在0分钟、5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠的整个图像的结果，如图1A所示，细菌没有被全身吸收，但是在给药后5分钟，来源于细菌的囊泡被全身吸收，并且在给药后3小时在膀胱中观察到强烈荧光，从而可以看出囊泡排泄到泌尿道。此外，可以看出，囊泡在体内存在直至给药后12小时(参见图1A)。
为了评估其中的肠道细菌和来源于肠道细菌的囊泡被全身吸收后渗透到各个器官中的模式，以与上述相同的方式施用50μg带有荧光标记的细菌和来源于细菌的囊泡，然后在给药后12小时收集粪便、血液、心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉。作为观察到的在收集的组织中的荧光的结果，如图1B所示，可以看出来源于细菌的囊泡分布在粪便、血液、心脏、肺、肝、脾、脂肪、肌肉和肾中，但是细菌没有被吸收(参见图1B)。
实施例2.临床样品中来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在首先将临床样本(例如粪便、血液、尿液等)放入10ml试管中，并通过离心(3,500×g，10min，4℃)使悬浮物沉淀后，仅转移上清液到新的10ml试管中。在使用0.22-μm的过滤器除去细菌和杂质后，将它们转移到Centriprep试管(离心过滤器50kD)中，并在1,500×g和4℃下离心15分钟，弃去小于50kD的物质，将残余物浓缩至10ml。使用0.22-μm的过滤器再次除去细菌和杂质后，使用90Ti型转子在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，弃去上清液，并将聚集的团块(pellet)溶解在生理盐水(PBS)中。
通过将通过上述方法分离的100μl囊泡在100℃下煮沸，从脂质中提取内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。然后，为了除去残留的悬浮物，将DNA在10,000×g和4℃下离心30分钟，仅收集上清液。并且，通过使用Nanodrop定量DNA的量。此后，为了确认提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR，并证实提取的基因中存在来源于细菌的基因。
[表格1]
Figure BDA0002578622500000121
使用16S rDNA引物对通过上述方法提取的DNA进行扩增，然后进行测序(IlluminaMiSeq测序仪)，结果以标准流程图格式(SFF)文件输出，将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和使用GS FLX软件(v2.9)的核苷酸质量评分文件，然后确认读段的可靠性估计，并且其中窗口(20bps)的平均碱基检出准确性低于99％的部分(Phred分数<20)已删除。对于OTU(操作分类单元)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类，属、科、目、纲和门分别基于94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，在每个OUT的门、纲、目、科和属水平上进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes(QIIME)的16S RNA序列数据库(108,453个序列)对在该属水平上具有97％或更高的序列相似性的细菌进行分析(profiled)。
实施例3.对胃癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自66名胃癌患者和年龄和性别与其相匹配的198名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，胃癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表2和图2)。
[表2]
Figure BDA0002578622500000131
实施例4.对结直肠癌患者粪便中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从粪便中存在的囊泡中提取基因，对来自29名结直肠癌患者和年龄和性别与其相匹配的358名正常个体的粪便进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的粪便相比，结直肠癌患者的粪便中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表3和图3)。
[表3]
Figure BDA0002578622500000141
实施例5.对肝癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自86名肝癌患者和年龄和性别与其相匹配的331名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，肝癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表4和图4)。
[表4]
Figure BDA0002578622500000142
实施例6.对胰腺癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自176名胰腺癌患者和年龄和性别与其相匹配的271名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，胰腺癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表5和图5)。
[表5]
Figure BDA0002578622500000143
实施例7.对胆管癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自79名胆管癌患者和年龄和性别与其相匹配的259名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，胆管癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表6和图6)。
[表6]
Figure BDA0002578622500000151
实施例8.对卵巢癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自137名卵巢癌患者和年龄和性别与其相匹配的139名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，卵巢癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表7和图7)。
[表7]
Figure BDA0002578622500000152
实施例9.对膀胱癌患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自91名膀胱癌患者和年龄和性别与其相匹配的176名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，膀胱癌患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表8和图8)。
[表8]
Figure BDA0002578622500000161
实施例10.对淋巴瘤患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自63名淋巴瘤患者和年龄和性别与其相匹配的53名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，淋巴瘤患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表9和图9)。
[表9]
Figure BDA0002578622500000162
实施例11.对心肌梗塞患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自57名心肌梗塞患者和年龄和性别与其相匹配的163名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，心肌梗塞患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表10和图10)。
[表10]
Figure BDA0002578622500000163
Figure BDA0002578622500000171
实施例12.对心房颤动患者血液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对来自34名心房颤动患者和年龄和性别与其相匹配的62名正常个体的血液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的血液相比，心房颤动患者的血液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表11和图11)。
[表11]
Figure BDA0002578622500000172
实施例13.对帕金森氏病患者尿液中的来源于细菌的囊泡的宏基因组学分析
在使用实施例2的方法，通过从尿液中存在的囊泡中提取基因，对来自39名帕金森氏病患者和年龄和性别与其相匹配的76名正常个体的尿液进行了宏基因组学分析后，评估来源于普氏粪杆菌的囊泡的分布。结果，证实与正常个体的尿液相比，帕金森氏病患者的尿液中来源于普氏粪杆菌的囊泡显著减少(参见表12和图12)。
[表12]
Figure BDA0002578622500000173
实施例14.来源于普氏粪杆菌的囊泡的分离和诱导炎症的作用
根据以上实施例的结果，从粪便样品中分离出普氏粪杆菌并进行培养，然后分离囊泡。在脑心浸液(BHI)培养基中培养普氏粪杆菌菌株，直至在37℃的厌氧室中的吸光度(OD600)达到1.0至1.5，然后再培养。之后，收集不含菌株的培养基上清液，在10,000g和4℃下离心15分钟，然后通过0.45-μm过滤器过滤。由此获得的上清液使用QuixStand台式系统(GE Healthcare，英国)用100kDa中空滤膜，通过超滤浓缩至200mL的量。随后，将浓缩的上清液再次用0.22-μm的过滤器过滤，并在150,000g和4℃下超速离心3小时，然后将团块悬浮在Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中。然后，使用10％、40％和50％的OptiPrep溶液(Axis-Shield PoC AS，挪威)进行密度梯度离心，并且为了制备低密度溶液，在使用之前，将OptiPrep溶液用HEPES缓冲盐水(20mM HEPES，150mM NaCl，pH7.4))稀释。在200,000g和4℃的条件下离心2小时后，将以1mL的等体积从顶层分馏的每种溶液在150,000g和4℃的条件下另外超速离心3小时。之后，使用双辛可宁酸(BCA)测定法对蛋白质进行定量，并对如上所述获得的囊泡进行实验。
为了检查来源于普氏粪杆菌的囊泡对炎症细胞分泌炎症介质的作用，用来源于普氏粪杆菌的囊泡以不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/mL)处理小鼠巨噬细胞系(Raw 264.7细胞)，并测量炎症介质(IL-6和TNF-α)的分泌量。更具体地说，将Raw264.7细胞以每孔1×105的密度接种到24孔细胞培养板中，并在Dulbeco的改良Eagle培养基(DMEM)中孵育24小时。之后，将培养上清液收集在1.5mL试管中，以3000g离心5分钟，从而收集上清液。将上清液在4℃下保存，然后进行ELISA。
结果，当预处理来源于普氏粪杆菌的囊泡(FPNEV)时，证实了炎症介质的分泌显著低于大肠杆菌EV进行的IL-6和TNF-α分泌(参见图13A和13B)。
实施例15.来源于普氏粪杆菌的囊泡的抗炎作用
基于上述实施例的结果，为了研究来源于普氏粪杆菌的囊泡对由炎性细胞中的病原性囊泡分泌的炎性介质的抗炎性作用，用来源于普氏粪杆菌的囊泡以不同浓度(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/mL)处理小鼠巨噬细胞系(Raw 264.7细胞)，然后用与炎症性疾病有关的病原性囊泡(E.coli EVs)进行处理，以测量炎症介质(IL-6和TNF-α)的分泌量。更具体地说，将Raw 264.7细胞以每孔1×105的密度接种到24孔细胞培养板中，并接着在DMEM中孵育24小时。之后，将培养上清液收集在1.5ml试管中，并且以3000g离心5分钟，从而收集上清液。将上清液在4℃下保存，然后进行ELISA。
结果，当对来源于普氏粪杆菌的囊泡(FPN EV)进行预处理时，证实了由E.coliEVs引起的IL-6和TNF-α分泌被显著抑制(参见图14A和14B)。这表明由致病性致病因子(例如E.coli EVs)可由来源于普氏粪杆菌的囊泡有效地抑制。
提供本发明的上述描述是出于说明的目的，并且本发明所属领域的普通技术人员应理解，在不改变本发明的技术精神或基本特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其他特定形式。因此，应当理解，上述实施例在所有方面仅进行了说明，而不是限制性的。
[工业适用性]
由于根据本发明的来源于普氏粪杆菌的囊泡可用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的方法以及用于预防、减轻或治疗上述疾病的食品或药物组合物，预期它们将有效地用于相关的制药工业和食品工业中。
<110> MD保健株式会社
<120> 来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途
<130> MPO20-030CN
<150> KR 10-2018-0004604
<151> 2018-01-12
<150> KR 10-2019-0002607
<151> 2019-01-09
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (12)

1.一种提供用于诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的信息的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从正常个体和受试者的样品分离的囊泡中提取DNA；
(b)使用基于16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以获得每种PCR产物；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡含量低于正常个体样品的情况为胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)中的所述样品是粪便、血液或尿液。
3.一种用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的药物组合物，其包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中，所述囊泡的平均直径为10nm至200nm。
5.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述囊泡是天然或人工地从普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)分泌的。
6.一种用于预防或减轻选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的食品组合物，其包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡。
7.根据权利要求6所述的食品组合物，其中，所述囊泡的平均直径为10nm至200nm。
8.根据权利要求6所述的食品组合物，其中所述囊泡是天然或人工地从普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)分泌的。
9.一种诊断胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病的方法，该方法包括以下步骤：
(a)从正常个体和受试者的样品分离的囊泡中提取DNA；
(b)使用基于16S rDNA中存在的基因序列制备的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链反应(PCR)，以获得每种PCR产物；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定其中来源于普氏粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)的囊泡含量低于正常个体样品的情况为胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动或帕金森氏病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(a)中的所述样品是粪便、血液或尿液。
11.一种用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病的方法，所述方法包括向受试者施用药物组合物的步骤，所述药物组合物包含作为活性成分的来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡。
12.来源于普氏粪杆菌(Faecalibacterium prausnitzii)的囊泡的用途，其用于预防或治疗选自由胃癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、胆管癌、卵巢癌、膀胱癌、淋巴瘤、心肌梗塞、心房颤动和帕金森氏病组成的群组中的一种或多种疾病。
CN201980007976.2A 2018-01-12 2019-01-10 来源于普氏粪杆菌的纳米囊泡及其用途 Pending CN111587295A (zh)

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