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CN111566222A - 在重组宿主中产生甜菊醇糖苷 - Google Patents

在重组宿主中产生甜菊醇糖苷 Download PDF

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CN111566222A
CN111566222A CN201880073337.1A CN201880073337A CN111566222A CN 111566222 A CN111566222 A CN 111566222A CN 201880073337 A CN201880073337 A CN 201880073337A CN 111566222 A CN111566222 A CN 111566222A
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CN
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glucose
seq
polypeptide
steviol
amino acid
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Application number
CN201880073337.1A
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韦罗尼克·杜尚
水·川·利姆·哈尔维尔
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Evolva AG
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Evolva AG
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
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Abstract

本发明涉及用于产生甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体的重组微生物和方法。

Description

在重组宿主中产生甜菊醇糖苷
发明背景
发明领域
本公开涉及在重组宿主中重组产生甜菊醇糖苷、甜菊醇前体糖苷和甜菊醇糖苷前体。具体来说，本公开涉及在重组宿主中产生甜菊醇糖苷，包括甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A、单糖基化对映-贝壳杉烯酸、二糖基化对映-贝壳杉烯酸、三糖基化对映-贝壳杉烯酸、单糖基化对映-贝壳杉烯醇、二糖基化对映-贝壳杉烯醇、三糖基化对映-贝壳杉烯醇、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷或其异构体。
相关技术描述
众所周知，甜味剂为食品、饮料或糖果产业中最常使用的成分。甜味剂可在生产期间掺入到最终食物产品中，或者在适当稀释后作为餐桌用甜味剂或烘焙中糖的家用替代物单独使用。甜味剂包括天然甜味剂(诸如蔗糖、高果糖玉米糖浆、糖蜜、枫糖浆和蜂蜜)以及人造甜味剂(诸如阿斯巴甜、糖精和三氯蔗糖)。甜叶菊提取物是可从多年生灌木甜叶菊(Stevia rebaudiana)中分离和提取的天然甜味剂。甜叶菊通常生长在南美洲和亚洲，供用于商业生产甜叶菊提取物。纯化至各种程度的甜叶菊提取物在商业上用作食物和掺合物中的高强度甜味剂或单独用作餐桌用甜味剂。
若干种甜菊醇糖苷的化学结构示出在图2中，包括二萜甜菊醇和各种甜菊醇糖苷。甜叶菊植物的提取物一般包含带来甜味的甜菊醇糖苷，但每一种甜菊醇糖苷的量往往不同，尤其在不同的生产批次间。
从甜叶菊植物回收和纯化甜菊醇糖苷已经被证明是劳动密集型并且低效的。此外，从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物一般含有可能带来异味的甜叶菊植物来源的组分。因此，仍然需要一种可以积累高产率的所需甜菊醇糖苷诸如Reb A、RebD和/或RebM并且产生甜菊醇糖苷组合物的重组产生系统，所述甜菊醇糖苷组合物相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含一种或多种所需甜菊醇糖苷，相对于从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。还需要改进在重组宿主中产生甜菊醇糖苷以用于商业用途。同样，仍然需要增加重组宿主中的尿苷二磷酸酯葡萄糖(UDP-葡萄糖)形成，以产生更高产率的甜菊醇糖苷，包括Reb A、RebD和/或RebM。
发明概述
针对以上背景，本发明提供了相对于现有技术的某些优点。
尽管如本文公开的本发明不限于特定的优点或功能(诸如扩大规模产生一种或多种甜菊醇糖苷或者甜菊醇前体糖苷、纯化所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇前体糖苷以及产生甜菊醇糖苷组合物的能力，其中不同比例的各种甜菊醇糖苷提供了相对于从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分的优点)，但本发明提供了一种能够在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因；和/或
(b)编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述能够使糖原脱支的多肽能够具有4-α-葡聚糖转移酶活性和α-1，6-淀粉葡糖苷酶活性。
在一个方面，本文公开的重组宿主细胞还包含：
(c)编码能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5′-三磷酸酯(UTP)的多肽的基因；
(d)编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因；和/或
(e)编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成尿苷二磷酸酯葡萄糖(UDP-葡萄糖)的多肽的基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，
(a)所述能够使糖原脱支的多肽包括与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(b)所述能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(c)所述能够由UDP合成UTP的多肽包括与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(d)所述能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ IDNO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或者与以SEQID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(e)所述能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括与以SEQ IDNO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽、与以SEQ IDNO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
在一个方面，本文公开的重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；
(d)编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；
(e)编码能够由法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽的基因；
(f)编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；
(g)编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；
(h)编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(i)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；和/或
(j)编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，
(a)所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(b)所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(c)所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(d)所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；
(e)所述能够合成GGPP的多肽包括与以SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32或116中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)所述能够合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：34、36、38、40、42或120中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(g)所述能够合成对映-贝壳杉烯的多肽包括与以SEQ ID NO：44、46、48、50或52中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(h)所述能够合成对映-贝壳杉烯酸的多肽包括与以SEQ ID NO：60、62、66、68、70、72、74、76或117中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(i)所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽包括与以SEQ ID NO：78、80、82、84、86、88、90、92中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；和/或
(j)所述能够合成甜菊醇的多肽包括与以SEQ ID NO：94、97、100、101、102、103、104、106、108、110、112或114中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
在一个方面，本文公开的重组宿主细胞包含：
(a)所述编码能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；
(b)所述编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(c)所述编码能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5′-三磷酸酯(UTP)且与以SEQID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；
(d)所述编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：2或119中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；和
(e)所述编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且与以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；以及
以下中的一个或多个：
(f)所述编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化且与以SEQ IDNO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(g)所述编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化且与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽的基因；
(h)所述编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化且与以SEQ IDNO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(i)所述编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因包含与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
在一个方面，本文公开的重组宿主细胞包含：
(a)所述编码能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的重组基因；和/或
(b)所述编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的重组基因；
其中所述编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因和/或所述编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞被过度表达。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述编码能够使糖原脱支的多肽的基因和/或所述编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞过度表达了至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷之一或者所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少5％、或至少10％、至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉属(Aspergillus genus)的真菌细胞或者来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbyagossypii)、贾丁拟威尔酵母(Cyberlindnera jadinii)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、解腺嘌呤阿氏酵母(Arxulaadeninivorans)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)或白假丝酵母属(Candida albicans species)的酵母细胞、藻类细胞或者来自大肠杆菌属(Escherichiacoli species)或芽孢杆菌属(Bacillus genus)的细菌细胞。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞是酿酒酵母细胞。
在本文公开的重组宿主细胞的一个方面，所述重组宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。
本发明还提供了一种在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括在表达所述基因的条件下在细胞培养物中培养本文公开的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物由所述重组宿主细胞产生。
在本文公开的方法的一个方面，组成性地表达所述基因。
在本文公开的方法的一个方面，诱导所述基因的表达。
在本文公开的方法的一个方面，由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的方法的一个方面，由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少10％、至少25％或至少50％。
在本文公开的方法的一个方面，由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在本文公开的方法的一个方面，由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％。
在本文公开的方法的一个方面，使所述重组宿主细胞在发酵罐中在一定温度下生长一定时间段，其中所述温度和时间段促进所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的产生。
在本文公开的方法的一个方面，由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％。
在一个方面，本文公开的方法还包括从所述细胞培养物分离所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一个方面，所述分离步骤包括分离所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相，以获得包含所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的上清液，以及：
(a)使所述上清液与一种或多种吸附树脂接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；或者
(b)使所述上清液与一个或多个离子交换或逆相色谱柱接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；或者
(c)使所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物结晶，或者提取所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
从而分离所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在一个方面，本文公开的方法还包括从所述细胞培养物回收所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一个方面，所回收的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷，并且相对于从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
本发明还提供了一种产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括在重组宿主细胞的细胞培养物中使用以下各物对植物来源或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化：
(a)能够使糖原脱支的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；和/或
(b)能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；以及
任选地，以下中的一种或多种：
(c)能够由UDP合成UTP的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(d)能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；或者与以SEQ ID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％的序列同一性的多肽；和/或
(e)能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽，所述多肽包括与以SEQID NO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；与以SEQ ID NO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽，以及
以下中的一种或多种：
(f)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；
(g)能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽；
(h)能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或
(i)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽；
其中所述多肽中至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在本文公开的方法的一个方面，
(f)所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(g)所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(h)所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(i)所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
在本文公开的方法的一个方面，所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉属的真菌细胞或者来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、贾丁拟威尔酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红法夫酵母或白假丝酵母属的酵母细胞、藻类细胞或者来自大肠杆菌属或芽孢杆菌属的细菌细胞。
在本文公开的方法的一个方面，所述重组宿主细胞是酿酒酵母细胞。
在本文公开的方法的一个方面，所述重组宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。
在本文公开的方法的一个方面，所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
本发明还提供了一种细胞培养物，所述细胞培养物包含本文公开的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；以及
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸；
其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物以至少1mg/L所述细胞培养物的浓度存在；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
本发明还提供了一种细胞培养物，所述细胞培养物包含本文公开的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；以及
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸；
其中UDP-葡萄糖以至少100μM的浓度存在于所述细胞培养物中；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含UGP-葡萄糖，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
本发明还提供了一种来自在所述细胞培养物中生长的本文公开的重组宿主细胞的细胞溶解物，所述细胞溶解物包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；和/或
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、酵母氮源、YNB和/或氨基酸；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物以至少1mg/L所述细胞培养物的浓度存在。
本发明还提供了由本文公开的重组宿主细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
本发明还提供了通过本文公开的方法产生的一种或多种甜菊醇糖苷；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
本发明还提供了一种甜味剂组合物，所述甜味剂组合物包含本文公开的一种或多种甜菊醇糖苷。
本发明还提供了一种食物产品，所述食物产品包含本文公开的甜味剂组合物。
本发明还提供了一种饮料或饮料浓缩物，所述饮料或饮料浓缩物包含本文公开的甜味剂组合物。
根据以下详细描述，结合所附权利要求书，将更充分地理解本发明的这些和其他特征和优点。应注意，权利要求书的范围由其中的表述限定，而非由本描述中列出的特征和优点的具体讨论限定。
附图简单描述
当结合以下附图阅读时，可以最好地理解以下本发明的实施方案的详细描述，其中类似的结构用类似的参考数字指示，并且其中：
图1示出了使用香叶基香叶基二磷酸酯合酶(GGPPS)、对映-柯巴基二磷酸酯合酶(CDPS)、对映-贝壳杉烯合酶(KS)、对映-贝壳杉烯氧化酶(KO)和对映-贝壳杉烯酸羟化酶(KAH)多肽由香叶基香叶基二磷酸酯产生甜菊醇的生物化学途径。
图2示出了通过合适的UGT酶催化的代表性主要甜菊醇糖苷糖基化反应和甜叶菊提取物中发现的若干种化合物的化学结构。
图3示出了由UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的酶催化的代表性反应，所述酶包括尿嘧啶通透酶(FUR4)、尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(FUR1)、乳清酸磷酸核糖基转移酶1(URA5)、乳清酸磷酸核糖基转移酶2(URA10)、乳清苷5′-磷酸酯脱羧酶(URA3)、尿苷酸激酶(URA6)、核苷二磷酸酯激酶(YNK1)、磷酸葡萄糖突变酶1(PGM1)、磷酸葡萄糖突变酶2(PGM2)、UTP-葡萄糖-1-磷酸酯尿嘧啶转移酶(UGP1)、糖原蛋白葡糖基转移酶-1(GLG1)、糖原蛋白葡糖基转移酶2(GLG-2)、糖原合酶1(GSY1)、糖原合酶2(GSY2)、糖原分支酶(GLC3)、糖原脱支酶(GDB1)和糖原磷酸化酶(GPH1)。参见例如Daran等，1995，Eur.J.Biochem.233(2)：520-30；
Figure BPA0000288615750000181
和Parrou，2001，FEMS Microbiol.Rev.25(1)：125-45。
本领域技术人员应了解，附图中的元件是出于简洁和清楚目的而示出，并且未必按比例绘制。举例来说，附图中一些元件的尺寸可能相对于其他元件加以扩大，以有助于改善对本发明的一个或多个实施方案的理解。
发明详述
本文引用的所有公布、专利和专利申请均出于所有目的以引用的方式明确并入本文。
在详细描述本发明之前，将定义许多术语。除非上下文另外明确指出，否则如本文所使用，单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指代物。举例来说，提及一个“核酸”意指一个或多个核酸。
应注意，术语如“优选地”、“通常地”和“典型地”在本文中并非用于限制要求保护的发明的范围或者暗示某些特征对要求保护的发明的结构或功能是关键的、必要的或甚至重要的。相反，这些术语仅旨在突出能或不能用于本发明的具体实施方案中的替代的或额外的特征。
出于描述和限定本发明的目的，应注意，术语“基本上”在本文中用于表示可归因于任何定量比较、值、测量或其他表示的固有不确定程度。术语“基本上”在本文中还用于表示定量表示可以与规定参考不同而不导致讨论的主题的基本功能发生变化的程度。
可使用本领域技术人员熟知的方法来构建根据本发明的基因表达构建体和重组细胞。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、体内重组技术和聚合酶链反应(PCR)技术。参见例如Green和Sambrook，2012，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第四版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York；Ausubel等，1989，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NewYork；以及PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Innis等，1990，Academic Press，San Diego，CA)所描述的技术。
如本文所使用，在单链或双链实施方案中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可以互换用于指代包括DNA、RNA、其衍生物或其组合的核酸，取决于如技术人员所理解的上下文。
如本文所使用，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”可以互换使用。如本文所使用，术语“重组宿主”和“重组宿主细胞”可以互换使用。本领域普通技术人员应理解，术语“微生物”、“微生物宿主”和“微生物宿主细胞”在用于描述包含重组基因的细胞时可以理解为“重组宿主”或“重组宿主细胞”。如本文所使用，术语“重组宿主”旨在指代其基因组已被至少一个DNA序列扩充的宿主。此类DNA序列包括但不限于非天然存在的基因、未正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“被表达”)的DNA序列以及希望引入到宿主中的其他基因或DNA序列。应了解，典型地，本文描述的重组宿主的基因组通过稳定引入一个或多个重组基因来进行扩充。一般来说，引入的DNA最初并未驻留在作为DNA受体的宿主中，但从指定宿主分离DNA区段并且随后将该DNA的一个或多个额外的拷贝引入相同宿主中，例如以增强基因产物的产生或者改变基因的表达模式在本公开的范围内。在一些情况下，引入的DNA将通过例如同源重组或定点诱变来修饰或甚至替换内源基因或DNA序列。在一些方面，引入的DNA被引入基因组中不同于相应内源DNA片段最初驻留的位置。合适的重组宿主包括微生物。
如本文所使用，术语“重组基因”是指引入到受体宿主中的基因或DNA序列，无论此类宿主中是否已经存在相同或类似的基因或DNA序列。本领域中已知“引入”或“扩充”在此情况下意指通过人工手动引入或扩充。因此，重组基因可以是来自另一物种的DNA序列，或者可以是来源于或存在于相同物种中但已经通过重组方法并入至宿主中以形成重组宿主的DNA序列。应了解，引入到宿主中的重组基因可以与正在转化的宿主中通常存在的DNA序列相同，并且被引入以提供DNA的一个或多个额外拷贝，从而允许该DNA的基因产物的过度表达或修饰的表达。在一些方面，所述重组基因由cDNA编码。在其他实施方案中，重组基因为合成的和/或经密码子优化以便在酿酒酵母中表达。
如本文所使用，术语“工程化生物合成途径”是指重组宿主中存在的生物合成途径，如本文所描述。在一些方面，生物合成途径的一个或多个步骤并不天然发生在未修饰的宿主中。在一些实施方案中，将基因的异源版本引入到包含所述基因的内源版本的宿主中。
如本文所使用，术语“内源”基因是指来源于具体生物体、组织或细胞或者在具体生物体、组织或细胞内产生或合成的基因。在一些实施方案中，内源基因是酵母基因。在一些实施方案中，所述基因对酿酒酵母，包括但不限于酿酒酵母菌株S288C是内源的。在一些实施方案中，内源酵母基因被过度表达。如本文所使用，术语“过度表达”用于指代生物体中的基因表达水平高于野生型生物体中的基因表达水平。参见例如Prelich，2012，Genetics190：841-54。参见例如Giaever和Nislow，2014，Genetics 197(2)：451-65。在一些方面，可以通过使用USER克隆系统进行整合来执行过度表达；参见例如Nour-Eldin等，2010，Methods Mol Biol.643：185-200。如本文所使用，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可以互换用于指代已被操纵从而不再在生物体，包括但不限于酿酒酵母中表达的内源基因。在一些方面，术语“缺失”、“缺失的”、“敲除”和“敲除的”可以互换用于指代已被突变的内源基因，使得所述内源基因具有降低的活性或没有活性。
如本文所使用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来源于除重组宿主以外的物种的序列。在一些实施方案中，所述重组宿主是酿酒酵母细胞，并且异源序列来源于除酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或者与表达所述异源序列的重组宿主不同的真菌。在一些实施方案中，编码序列是对宿主为天然的序列。
如本文所使用，术语“异源序列”和“异源编码序列”用于描述来源于除重组宿主以外的物种的序列。在一些实施方案中，所述重组宿主是酿酒酵母细胞，并且异源序列来源于除酿酒酵母以外的生物体。异源编码序列例如可以来自原核微生物、真核微生物、植物、动物、昆虫或者与表达所述异源序列的重组宿主不同的真菌。在一些实施方案中，编码序列是对宿主为天然的序列。
如本文所使用，术语“组成性”、“组成性表达”或“组成性地表达”是指基因的连续转录引起蛋白质的连续表达。
如本文所使用，术语“诱导性”、“诱导性表达”或“诱导性地表达”是指响应于刺激的基因表达。刺激包括但不限于化学品、应力或生物刺激。
“可选择标记物”可以是补充宿主细胞营养缺陷、提供抗生素抗性或引起颜色变化的众多基因之一。然后使用本领域熟知的方法将基因替换载体的线性化DNA片段引入到细胞中(参见下文)。线性片段向基因组中的整合和基因的破坏可以基于选择的标记物来确定，并且可以通过例如PCR或DNA印迹(Southern blot)分析来验证。继其用于选择之后，可以通过例如Cre-LoxP系统从宿主细胞的基因组中去除可选择标记物(参见例如Gossen等，2002，Ann.Rev.Genetics 36：153-173和U.S.2006/0014264)。替代地，可以用包括欲破坏的基因的一部分的方式构建基因替换载体，其中所述部分缺乏任何内源基因启动子序列并且不编码基因编码序列或编码所述基因编码序列的非活性片段。
如本文所使用，术语“变体”和“突变体”用于描述与具体蛋白质的野生型序列相比已经在一个或多个氨基酸处经过修饰的蛋白质序列。
如本文所使用，术语“非活性片段”是编码具有例如由基因的全长编码序列产生的蛋白质的活性的不到10％(例如不到9％、不到8％、不到7％、不到6％、不到5％、不到4％、不到3％、不到2％、不到1％或0％)的蛋白质的基因片段。基因的此部分以使得没有已知启动子序列可操作地连接至所述基因序列，但终止密码子和转录终止序列可操作地连接至所述基因序列的所述部分的方式插入在载体中。此载体可以随后在所述基因序列的所述部分中被线性化并转化至细胞中。然后通过单同源重组将此线性化载体整合至所述基因的内源对应物中，使其失活。
如本文所使用，术语“甜菊醇糖苷”是指甜叶菊苷A(RebA)(CAS号58543-16-1)、甜叶菊苷B(RebB)(CAS号58543-17-2)、甜叶菊苷C(RebC)(CAS号63550-99-2)、甜叶菊苷D(RebD)(CAS号63279-13-0)、甜叶菊苷E(RebE)(CAS号63279-14-1)、甜叶菊苷F(RebF)(CAS号438045-89-7)、甜叶菊苷M(RebM)(CAS号1220616-44-3)、甜茶苷(CAS号63849-39-4)、杜克苷A(CAS号64432-06-0)、甜叶菊苷I(RebI)(MassBank记录：FU000332)、甜叶菊苷Q(RebQ)、1，2-甜菊苷(CAS号57817-89-7)、1，3-甜菊苷(RebG)、甜菊醇-1，2-二糖苷(MassBank记录：FU000299)、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、三糖基化甜菊醇糖苷、四糖基化甜菊醇糖苷、五糖基化甜菊醇糖苷、六糖基化甜菊醇糖苷、七糖基化甜菊醇糖苷和其异构体。参见图2；还参见Steviol GlycosidesChemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin编制，FoodAgric.Org。
如本文所使用，术语“甜菊醇糖苷前体”和“甜菊醇糖苷前体化合物”用于指代甜菊醇糖苷生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇糖苷前体包括但不限于香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)、对映-柯巴基-二磷酸酯、对映-贝壳杉烯、对映-贝壳杉烯醇、对映-贝壳杉烯醛、对映-贝壳杉烯酸和甜菊醇。参见图1。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷前体本身是甜菊醇糖苷化合物。举例来说，19-SMG、甜茶苷、1，2-甜菊苷和RebE是RebM的甜菊醇糖苷前体。参见图2。另外如本文所使用，术语“甜菊醇前体”和“甜菊醇前体化合物”用于指代甜菊醇生物合成途径中的中间化合物。甜菊醇前体还可以是甜菊醇糖苷前体，并且包括但不限于香叶基香叶基二磷酸酯(GGPP)、对映-柯巴基-二磷酸酯、对映-贝壳杉烯、对映-贝壳杉烯醇、对映-贝壳杉烯醛和对映-贝壳杉烯酸。
如本文所使用，术语“接触”用于指代两个对象之间的任何物理相互作用。举例来说，术语“接触”可以指代酶与底物之间的相互作用。在另一实例中，术语“接触”可以指代液体(例如，上清液)与吸附树脂之间的相互作用。
甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体可以在体内(即，在重组宿主中)、体外(即，以酶促方式)或通过全细胞生物转化来产生。如本文所使用，术语“产生”和“积累”可以互换用于描述在体内、在体外或通过全细胞生物转化合成甜菊醇糖苷和甜菊醇糖苷前体。
如本文所使用，术语“培养液”、“培养基”和“生长培养基”可以互换用于指代支持细胞生长的液体或固体。培养液可以包含葡萄糖、果糖、蔗糖、微量金属、维生素、盐、酵母氮源(YNB)和/或氨基酸。微量金属可以是二价阳离子，包括但不限于Mn2+和/或Mg2+。在一些实施方案中，Mn2+可以呈MnCl2二水合物形式并且在约0.01g/L至100g/L的范围内。在一些实施方案中，Mg2+可以呈MgSO4七水合物形式并且在约0.01g/L至100g/L的范围内。举例来说，培养液可以包含i)大约0.02至0.03g/L MnCl2二水合物和大约0.5至3.8g/L MgSO4七水合物，ii)大约0.03至0.06g/L MnCl2二水合物和大约0.5至3.8g/L MgSO4七水合物，和/或iii)大约0.03至0.17g/L MnCl2二水合物和大约0.5至7.3g/L MgSO4七水合物。另外，培养液可以包含一种或多种由重组宿主产生的甜菊醇糖苷，如本文所描述。
重组产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO2014/122227和WO 2014/122328中，所述专利各自以引用的方式整体并入。在重组宿主中通过全细胞生物转化以及在体外产生甜菊醇糖苷的方法也描述于WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中。
在一些实施方案中，包含以下基因的重组宿主可以在体内产生甜菊醇：编码能够由法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽(例如，香叶基香叶基二磷酸酯合酶(GGPPS)多肽)的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽(例如，对映-柯巴基二磷酸酯合酶(CDPS)多肽)的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，贝壳杉烯合酶(KS)多肽)的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，贝壳杉烯氧化酶(KO)多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，细胞色素P450还原酶(CPR)多肽或P450氧化还原酶(POR)多肽；例如但不限于能够在NADPH向NADP+转化期间从NADPH电子转移至细胞色素P450复合物的多肽，其用作萜类化合物生物合成的辅因子)的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，甜菊醇合酶(KAH)多肽)的基因；和/或编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成根-贝壳杉烯的双功能多肽(例如，对映-柯巴基二磷酸酯合酶(CDPS)-对映-贝壳杉烯合酶(KS)多肽)的基因。参见例如图1。技术人员应了解，这些基因中的一个或多个对宿主可能是内源的，条件是这些基因中至少一个(并且在一些实施方案中，全部)是引入到重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，包含以下基因的重组宿主可以在体内产生甜菊醇糖苷：编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如，UGT85C2多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′发生β1，3糖基化的多肽(例如，UGT76G1多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如，UGT74G1多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′发生β1，2糖基化的多肽(例如，UGT91D2或EUGT11多肽)的基因。技术人员应了解，这些基因中的一个或多个对宿主可能是内源的，条件是这些基因中至少一个(并且在一些实施方案中，全部)是引入到重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体通过在重组宿主中表达甜菊醇糖苷生物合成途径中所涉及的一种或多种酶而在体内产生。举例来说，包含以下基因的重组宿主可以体内在体内产生甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体：编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′发生β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′发生β1，2糖基化的多肽的基因。参见例如图1和图2。技术人员应了解，这些基因中的一个或多个对宿主可能是内源的，条件是这些基因中至少一个(并且在一些实施方案中，全部)是引入到重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的异源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′发生β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；以及能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′发生β1，2糖基化的多肽。
在一些实施方案中，产生甜菊醇的重组微生物包含编码以下多肽的异源核酸：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′发生β1，3糖基化的多肽；以及能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′发生β1，2糖基化的多肽。
在一些方面，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′发生β1，3糖基化的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′发生β1，2糖基化的多肽使葡萄糖分子从尿苷二磷酸酯葡萄糖(UDP-葡萄糖)转移至甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
在一些方面，UDP-葡萄糖通过在重组宿主中表达UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种酶而在体内产生。举例来说，包含以下基因的重组宿主可以在体内产生UDP-葡萄糖：编码能够将尿嘧啶转运至宿主细胞中的多肽(例如，尿嘧啶通透酶(FUR4))的基因；编码能够由尿嘧啶合成尿苷单磷酸酯(UMP)的多肽(例如，尿嘧啶磷酸核糖基转移酶(FUR1))的基因；编码能够由乳清酸酯或乳清酸合成乳清苷单磷酸酯(OMP)的多肽(例如乳清酸酯磷酸核糖基转移酶1(URA5)和乳清酸酯磷酸核糖基转移酶2(URA10))的基因；编码能够由OMP合成UMP的多肽(例如乳清苷5′-磷酸脱羧酶(URA3))的基因；编码能够由UMP合成尿苷二磷酸酯(UDP)的多肽(例如，尿苷酸激酶(URA6))的基因；编码能够由UDP合成尿苷5′-三磷酸酯(UTP)的多肽(即，能够催化γ磷酸酯从核苷三磷酸酯转移的多肽，例如核苷二磷酸酯激酶(YNK1))的基因；编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，磷酸葡萄糖突变酶-1(PGM1)和磷酸葡萄糖突变酶-2(PGM2))的基因；编码能够使糖原脱支的多肽(例如糖原脱支酶(GDB1))的基因；编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，糖原磷酸化酶(GPH1))的基因；和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽(例如，UTP-葡萄糖-1-磷酸酯尿嘧啶转移酶(UGP1))的基因。参见例如图3。技术人员应理解，这些基因中的一个或多个对宿主可能是内源的。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因。在一些方面，所述编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因是重组基因。在一些方面，所述重组基因包含对宿主为天然的核苷酸序列。在其他方面，所述重组基因包含异源核苷酸序列。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至启动子。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至终止子，例如但不限于tCYC1(SEQ ID NO：154)或tADH1(SEQ ID NO：155)。在一些方面，所述启动子和终止子驱动所述重组基因的高表达。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至强启动子，例如但不限于pTEF1(SEQ ID NO：148)、pPGK1(SEQ ID NO：149)、pTDH3(SEQ ID NO：150)、pTEF2(SEQ ID NO：151)、pTPI1(SEQ ID NO：152)或pPDC1(SEQ ID NO：153)。在一些方面，所述重组基因包含来源于或存在于与所述重组宿主相同的物种中的核苷酸序列。在一些方面，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因的表达引起了编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因的总表达水平高于编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的表达水平，即能够由UDP合成UTP的多肽的过度表达。
在一些方面，所述编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因是与所述重组宿主相同的物种中存在的基因，即内源基因。在一些实施方案中，可以将编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的野生型启动子交换为强启动子。在一些方面，所述强启动子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在其他实施方案中，可以将编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的野生型增强子交换为强增强子。在一些实施方案中，所述强增强子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在一些实施方案中，所述内源基因的野生型增强子(即，可操作地连接至启动子)与野生型启动子(即，可操作地连接至内源基因)二者可以分别交换为强增强子和强启动子，从而引起能够由UDP合成UTP的多肽的过度表达(即，相对于可操作地连接至野生型增强子和/或启动子的内源基因的表达水平)。可操作地连接至强增强子和/或启动子的内源基因可以位于天然基因座，和/或可以位于基因组中其他处。
举例来说，在一些实施方案中，包含编码能够由UDP合成UTP的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的多肽、包含对宿主为天然的核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，包含编码能够由UDP合成UTP的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的多肽、包含异源核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UDP合成UTP的多肽、可操作地连接至例如对宿主为天然的强启动子、或者异源启动子的内源基因。
本领域普通技术人员应理解，例如，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因的表达、编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因和内源基因的表达，以及编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的表达(其中所述内源基因的野生型启动子和/或增强子交换为强启动子和/或增强子)各自引起能够由UDP合成UTP的多肽相对于不表达编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因的相应宿主和/或仅表达编码能够由UDP合成UTP的多肽、可操作地连接至野生型启动子和增强子的天然基因的相应宿主的过度表达，即，如本文所使用，术语“表达”可以包括“过度表达”。
在一些实施方案中，能够由UDP合成UTP的多肽被过度表达，使得编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因的总表达水平比编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的表达水平高出至少5％。在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因的总表达水平比编码能够由UDP合成UTP的多肽的内源基因的表达水平高出至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因。在一些方面，所述编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因是重组基因。在一些方面，所述重组基因包含对宿主为天然的核苷酸序列。在其他方面，所述重组基因包含异源核苷酸序列。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至启动子。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至终止子，例如但不限于tCYC1(SEQ ID NO：154)或tADH1(SEQ ID NO：155)。在一些方面，所述启动子和终止子驱动所述重组基因的高表达。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至强启动子，例如但不限于pTEF1(SEQ ID NO：148)、pPGK1(SEQ ID NO：149)、pTDH3(SEQ ID NO：150)、pTEF2(SEQ IDNO：151)、pTPI1(SEQ ID NO：152)或pPDC1(SEQ ID NO：153)。在一些方面，所述重组基因包含来源于或存在于与所述重组宿主相同的物种中的核苷酸序列。在一些方面，编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因的表达引起了编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平高于编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平，即能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的过度表达。
在一些方面，所述编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因是与所述重组宿主相同的物种中存在的基因，即内源基因。在一些实施方案中，可以将编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的野生型启动子交换为强启动子。在一些方面，所述强启动子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在其他实施方案中，可以将编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的野生型增强子交换为强增强子。在一些实施方案中，所述强增强子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在一些实施方案中，所述内源基因的野生型增强子(即，可操作地连接至启动子)与野生型启动子(即，可操作地连接至内源基因)二者可以分别交换为强增强子和强启动子，从而引起能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的过度表达(即，相对于可操作地连接至野生型增强子和/或启动子的内源基因的表达水平)。可操作地连接至强增强子和/或启动子的内源基因可以位于天然基因座，和/或可以位于基因组中其他处。
举例来说，在一些实施方案中，包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、包含对宿主为天然的核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实施例中，在一些实施方案中，包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、包含异源核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至例如对宿主为天然的强启动子、或者异源启动子的内源基因。
在一些实施方案中，能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽被过度表达，使得编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平比编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平高出至少5％。在一些实施方案中，编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平比编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平高出至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的基因。在一些方面，使糖原脱支包括糖原分解和/或葡萄糖动员。在一些方面，使糖原脱支包括使糖原分解成葡萄糖-1-磷酸酯。在一些方面，能够使糖原脱支的多肽包括能够将糖原的α-1，4-连接的葡萄糖和/或α-1，4-连接的葡聚糖在分子内转移至新位置(即，4-α-葡聚糖转移酶活性)和/或能够使糖原的α-1，6键联水解(即，α-1，6-淀粉葡糖苷酶活性)的多肽。在一些方面，能够使糖原脱支的多肽包括能够具有4-α-葡聚糖转移酶活性并且能够具有α-1，6-淀粉葡糖苷酶活性的双功能多肽。在一些方面，所述重组宿主可以包含能够具有4-α-葡聚糖转移酶活性的第一多肽和能够具有α-1，6-淀粉葡糖苷酶活性的第二肽。在一些方面，所述编码能够使糖原脱支的多肽的基因是重组基因。在一些方面，所述重组基因包含对宿主为天然的核苷酸序列。在其他方面，所述重组基因包含异源核苷酸序列。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至启动子。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至终止子，例如但不限于tCYC1(SEQ ID NO：154)或tADH1(SEQ ID NO：155)。在一些方面，所述启动子和终止子驱动所述重组基因的高表达。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至强启动子，例如但不限于pTEF1(SEQ ID NO：148)、pPGK1(SEQ ID NO：149)、pTDH3(SEQ ID NO：150)、pTEF2(SEQ IDNO：151)、pTPI1(SEQ ID NO：152)或pPDC1(SEQ ID NO：153)。在一些方面，所述重组基因包含来源于或存在于与所述重组宿主相同的物种中的核苷酸序列。在一些方面，编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因的表达引起了编码能够使糖原脱支的多肽的基因的总表达水平高于编码能够使糖原脱支的多肽的内源基因的表达水平，即能够使糖原脱支的多肽的过度表达。
在一些方面，所述编码能够使糖原脱支的多肽的基因是与所述重组宿主相同的物种中存在的基因，即内源基因。在一些实施方案中，可以将编码能够使糖原脱支的多肽的内源基因的野生型启动子交换为强启动子。在一些方面，所述强启动子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在其他实施方案中，可以将编码能够使糖原脱支的多肽的内源基因的野生型增强子交换为强增强子。在一些实施方案中，所述强增强子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在一些实施方案中，所述内源基因的野生型增强子(即，可操作地连接至启动子)与野生型启动子(即，可操作地连接至内源基因)二者可以分别交换为强增强子和强启动子，从而引起能够使糖原脱支的多肽的过度表达(即，相对于可操作地连接至野生型增强子和/或启动子的内源基因的表达水平)。可操作地连接至强增强子和/或启动子的内源基因可以位于天然基因座，和/或可以位于基因组中其他处。
举例来说，在一些实施方案中，包含编码能够使糖原脱支的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够使糖原脱支的多肽、包含宿主天然核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，包含编码能够使糖原脱支的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够使糖原脱支的多肽、包含异源核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽、可操作地连接至例如对宿主为天然的强启动子、或者异源启动子的内源基因。
在一些实施方案中，能够使糖原脱支的多肽被过度表达，使得编码能够使糖原脱支的多肽的基因的总表达水平比编码能够使糖原脱支的多肽的内源基因的表达水平高出至少5％。在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支的多肽的基因的总表达水平比编码能够使糖原脱支的多肽的内源基因的表达水平高出至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因。在一些方面，所述编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因包含能够由磷酸酯和糖原的α-1，4连接的葡萄糖合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽。在一些方面，所述编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因是重组基因。在一些方面，所述重组基因包含对宿主为天然的核苷酸序列。在其他方面，所述重组基因包含异源核苷酸序列。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至启动子。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至终止子，例如但不限于tCYC1(SEQ ID NO：154)或tADH1(SEQ ID NO：155)。在一些方面，所述启动子和终止子驱动所述重组基因的高表达。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至强启动子，例如但不限于pTEF1(SEQ ID NO：148)、pPGK1(SEQ IDNO：149)、pTDH3(SEQ ID NO：150)、pTEF2(SEQ ID NO：151)、pTPI1(SEQ ID NO：152)或pPDC1(SEQ ID NO：153)。在一些方面，所述重组基因包含来源于或存在于与所述重组宿主相同的物种中的核苷酸序列。在一些方面，编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因的表达引起了编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平高于编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平，即能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的过度表达。
在一些方面，所述编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因是与所述重组宿主相同的物种中存在的基因，即内源基因。在一些实施方案中，可以将编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的野生型启动子交换为强启动子。在一些方面，所述强启动子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在其他实施方案中，可以将编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的野生型增强子交换为强增强子。在一些实施方案中，所述强增强子驱动所述内源基因的表达(即，所述基因的过度表达)。在一些实施方案中，所述内源基因的野生型增强子(即，可操作地连接至启动子)与野生型启动子(即，可操作地连接至内源基因)二者可以分别交换为强增强子和强启动子，从而引起能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的过度表达(即，相对于可操作地连接至野生型增强子和/或启动子的内源基因的表达水平)。可操作地连接至强增强子和/或启动子的内源基因可以位于天然基因座，和/或可以位于基因组中其他处。
举例来说，在一些实施方案中，包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、包含宿主天然核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、包含异源核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、可操作地连接至例如对宿主为天然的强启动子、或者异源启动子的内源基因。
在一些实施方案中，能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽被过度表达，使得编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平比编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平高出至少5％。在一些实施方案中，编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因的总表达水平比编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的内源基因的表达水平高出至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因。在一些方面，所述编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因是重组基因。在一些方面，所述重组基因包含对宿主为天然的核苷酸序列。在其他方面，所述重组基因包含异源核苷酸序列。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至启动子。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至终止子，例如但不限于tCYC1(SEQ IDNO：154)或tADH1(SEQ ID NO：155)。在一些方面，所述启动子和终止子驱动所述重组基因的高表达。在一些方面，所述重组基因可操作地连接至强启动子，例如但不限于pTEF1(SEQ IDNO：148)、pPGK1(SEQ ID NO：149)、pTDH3(SEQ ID NO：150)、pTEF2(SEQ ID NO：151)、pTPI1(SEQ ID NO：152)或pPDC1(SEQ ID NO：153)。在一些方面，所述重组基因包含来源于或存在于与所述重组宿主相同的物种中的核苷酸序列。在一些方面，编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因的表达引起了编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因的总表达水平高于编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的内源基因的表达水平，即能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的过度表达。
在一些方面，所述编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因是与所述重组宿主相同的物种中存在的基因，即内源基因。在一些实施方案中，可以将编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的内源基因的野生型启动子交换为强启动子。在一些方面，所述强启动子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在其他实施方案中，可以将编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的内源基因的野生型增强子交换为强增强子。在一些实施方案中，所述强增强子驱动所述内源基因的高度表达(即，所述基因的过度表达)。在一些实施方案中，所述内源基因的野生型增强子(即，可操作地连接至启动子)与野生型启动子(即，可操作地连接至内源基因)二者可以分别交换为强增强子和强启动子，从而引起能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的过度表达(即，相对于可操作地连接至野生型增强子和/或启动子的内源基因的表达水平)。可操作地连接至强增强子和/或启动子的内源基因可以位于天然基因座，和/或可以位于基因组中其他处。
举例来说，在一些实施方案中，包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽、包含宿主天然核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽、可操作地连接至野生型启动子的内源基因的重组宿主还包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽、包含异源核苷酸序列、可操作地连接至例如野生型启动子、对宿主为天然的启动子、或者异源启动子的重组基因。在另一实例中，在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽、可操作地连接至例如对宿主为天然的强启动子、或者异源启动子的内源基因。
在一些实施方案中，包含能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组宿主被过度表达，使得编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因的总表达水平比编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的内源基因的表达水平高出至少5％。在一些实施方案中，编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因的总表达水平比编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的内源基因的表达水平高出至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在一些方面，包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽的一个或多个基因的重组宿主还可能包含编码能够将尿嘧啶转运到宿主细胞中的多肽的重组基因；编码能够由尿嘧啶合成尿苷单磷酸酯(UMP)的多肽的重组基因；编码能够由乳清酸酯或乳清酸合成乳清苷单磷酸酯(OMP)的多肽的重组基因；编码能够由OMP合成UMP的多肽的重组基因；和/或编码能够由UMP合成尿苷二磷酸酯(UDP)的多肽的重组基因。在一些实施方案中，包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽的一个或多个基因的重组宿主可能过度表达编码能够将尿嘧啶转运到宿主细胞中的多肽的基因；编码能够由尿嘧啶合成尿苷单磷酸酯(UMP)的多肽的基因；编码能够由乳清酸酯或乳清酸合成乳清苷单磷酸酯(OMP)的多肽的基因；编码能够由OMP合成UMP的多肽的基因；和/或编码能够由UMP合成尿苷二磷酸酯(UDP)的多肽的基因。
在一些方面，所述能够由UDP合成UTP的多肽包括具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽(其可以由以SEQ ID NO：122示出的核苷酸序列编码)。
在一些方面，所述能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括具有以SEQ ID NO：2(其可以由以SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：119(其可以由以SEQ ID NO：118示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：141(其可以由以SEQ ID NO：140示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：143(其可以由以SEQ ID NO：142示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：145(其可以由以SEQ ID NO：144示出的核苷酸序列编码)或SEQ IDNO：147(其可以由以SEQ ID NO：146示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。
在一些方面，所述能够使糖原脱支的多肽包括具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽(其可以由以SEQ ID NO：156示出的核苷酸序列编码)。
在一些方面，所述能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽(其可以由以SEQ ID NO：158示出的核苷酸序列编码)。
在一些方面，所述能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括具有以SEQ ID NO：121(其可以由以SEQ ID NO：120示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：125(其可以由以SEQ ID NO：124示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：127(其可以由以SEQ ID NO：126示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：129(其可以由以SEQ ID NO：128示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：131(其可以由以SEQ ID NO：130示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：133(其可以由以SEQ ID NO：132示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：135(其可以由以SEQID NO：134示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：137(其可以由以SEQ ID NO：136示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：139(其可以由以SEQ ID NO：138示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因和编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因和编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因和编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因，以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因和编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因，以及编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因，以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因，以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因，以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的多肽的两个或更多个重组基因，例如，编码具有第一氨基酸序列的能够转化葡萄糖-6-磷酸酯的多肽的基因以及编码具有不同于所述第一氨基酸序列的第二氨基酸序列的能够转化葡萄糖-6-磷酸酯的多肽的基因。举例来说，在一些实施方案中，重组宿主包含编码具有PGM1的氨基酸序列的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽)的基因和编码具有PGM2的氨基酸序列的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些此类实施方案中，编码UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的多肽的两个或更多个基因包含对重组宿主细胞为天然的核苷酸序列(例如，重组酿酒酵母宿主细胞，其包含编码具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的基因)。在其他此类实施方案中，编码UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的多肽的两个或更多个基因中的一个包含对所述重组宿主细胞为天然的核苷酸序列，同时编码UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及多肽的两个或更多个基因中的一个或多个包含异源核苷酸序列。举例来说，在一些实施方案中，表达编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的重组酿酒酵母宿主细胞(即，过度表达所述多肽的重组宿主)还表达编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有例如以SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽的重组基因。在另一个实例中，在一些实施方案中，重组酿酒酵母宿主细胞表达编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因(即，过度表达所述多肽的重组宿主)还表达编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有例如SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽的重组基因。因此，如本文所使用，术语“重组基因”可以包括“一个或多个重组基因”。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径或所述甜菊醇糖苷生物合成途径中所涉及的多肽的重组基因的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，重组宿主优选用例如编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径或所述甜菊醇糖苷生物合成途径所涉及的多肽的重组基因的两个拷贝、三个拷贝、四个拷贝或五个拷贝进行转化。举例来说，在一些实施方案中，重组宿主用编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQ IDNO：123示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的两个拷贝、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的两个拷贝、或编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的两个拷贝进行转化。本领域普通技术人员应理解，在一些实施方案中，重组基因可独立于细胞复制而在宿主细胞中复制；因此，重组宿主细胞可包含例如比用来转化所述细胞的拷贝数更多的重组基因拷贝。因此，如本文所使用，术语“重组基因”可以包括“重组基因的一个或多个拷贝”。
在一些方面，重组宿主细胞中能够由UDP合成UTP的多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、能够使糖原脱支的多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的表达增高了由所述细胞产生的UDP-葡萄糖的量。在一些方面，重组宿主细胞中能够由UDP合成UTP的多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、能够使糖原脱支的多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的表达维持或甚至增高可用于例如甜菊醇或甜菊醇糖苷的糖基化的UDP-葡萄糖库。在一些方面，能够由UDP合成UTP的多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、能够使糖原脱支的多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的表达在重组宿主细胞中增加了UDP-葡萄糖再生的速度，因此维持或甚至增加可用于合成一种或多种甜菊醇糖苷的UDP-葡萄糖库。
在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的表达在重组宿主细胞中使由所述细胞产生的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述重组基因的相应宿主增高了至少10％，例如至少25％、或至少50％、或至少75％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％、或至少225％、或至少250％、或至少275％、或至少300％，计算为细胞内UDP-葡萄糖浓度的增高。
在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的表达在重组宿主细胞中使由所述细胞产生的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述重组基因的相应宿主增高了至少10％，例如至少25％、或至少50％、或至少75％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％、或至少225％、或至少250％、或至少275％、或至少300％，计算为细胞内UDP-葡萄糖浓度的增高。
在某些此类实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因中的一个或多个包含对所述宿主细胞为天然的核苷酸序列。举例来说，在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷酿酒酵母宿主细胞(即，提供过度表达所述多肽的重组宿主)中使由所述细胞产生的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述重组基因的相应宿主增高了至少10％，例如至少25％、或至少50％、或至少75％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％、或至少225％、或至少250％、或至少275％、或至少300％，计算为细胞内UDP-葡萄糖浓度的增高。
在另一个实例中，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP且具有以SEQ IDNO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷酿酒酵母宿主细胞(即，提供过度表达所述多肽的重组宿主)中使由所述细胞产生的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述重组基因的相应宿主增高了至少10％，例如至少25％、或至少50％、或至少75％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％、或至少225％、或至少250％、或至少275％、或至少300％，计算为细胞内UDP-葡萄糖浓度的增高。
在一些方面，能够由UDP合成UTP的多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽、能够使糖原脱支的多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的表达在还表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因、编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因的产甜菊醇糖苷重组宿主细胞中增高了由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷的量和/或降低了由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷的量。在一些实施方案中，所述产甜菊醇糖苷宿主还表达编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；以及编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。
在一些方面，能够由法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽包括具有以SEQ ID NO：20(其可由以SEQ ID NO：19示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：22(由以SEQ ID NO：21示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：24(由以SEQ ID NO：23示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：26(由以SEQ ID NO：25示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：28(由以SEQ ID NO：27示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：30(由以SEQ ID NO：29示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：32(由以SEQ ID NO：31示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：116(由以SEQ ID NO：115示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够由法呢基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ IDNO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽包括具有以SEQ IDNO：34(其可由以SEQ ID NO：33示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：36(由以SEQ ID NO：35示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：38(由以SEQ ID NO：37示出的核苷酸序列编码)、SEQID NO：40(由以SEQ ID NO：39示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：42(由以SEQ ID NO：41示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，所述能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽缺乏叶绿体转运肽。在一些实施方案中，包含编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽包括具有以SEQ ID NO：44(其可由以SEQ ID NO：43示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：46(由以SEQID NO：45示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：48(由以SEQ ID NO：47示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：50(由以SEQ ID NO：49示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：52(由以SEQID NO：51示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQID NO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。在一些方面，所述双功能多肽包括具有以SEQ ID NO：54(其可由以SEQ ID NO：53示出的核苷酸序列编码)、SEQID NO：56(由以SEQ ID NO：55示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：58(由以SEQ ID NO：57示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，所述能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽包括具有以SEQ ID NO：60(其可由以SEQ ID NO：59示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：62(由以SEQ ID NO：61示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：117(由以SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：64示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：66(由以SEQID NO：65示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：68(由以SEQ ID NO：67示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：70(由以SEQ ID NO：69示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：72(由以SEQID NO：71示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：74(由以SEQ ID NO：73示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：76(由以SEQ ID NO：75示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽包括具有以SEQ ID NO：78(其可由以SEQ ID NO：77示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：80(由以SEQ ID NO：79示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：82(由以SEQ ID NO：81示出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：84(由以SEQ ID NO：83示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：86(由以SEQ ID NO：85示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：88(由以SEQ ID NO：87示出的核苷酸序列编码)、SEQ IDNO：90(由以SEQ ID NO：89示出的核苷酸序列编码)或SEQ ID NO：92(由以SEQ ID NO：91示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ IDNO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQ IDNO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，所述能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽包括具有以SEQ IDNO：94(其可由以SEQ ID NO：93示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：97(由以SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：100(由以SEQ ID NO：98或SEQ IDNO：99示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ IDNO：104、SEQ ID NO：106(由以SEQ ID NO：105示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：108(由以SEQ ID NO：107示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：110(由以SEQ ID NO：109示出的核苷酸序列编码)、SEQ ID NO：112(由以SEQ ID NO：111示出的核苷酸序列编码)或SEQ IDNO：114(由以SEQ ID NO：113示出的核苷酸序列编码)示出的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，包含编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ IDNO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如UGT85C2多肽)(SEQ ID NO：7)的核酸、编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽(例如UGT76G1多肽)(SEQ ID NO：9)的核酸、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如UGT74G1多肽)(SEQ ID NO：4)的核酸、编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如EUGT11多肽)(SEQ ID NO：16)的核酸。在一些方面，所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如UGT91D2多肽)可以是UGT91D2e多肽(SEQ ID NO：11)或UGT91D2e-b多肽(SEQ ID NO：13)。在一些实施方案中，包含编码能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷糖基化的多肽的基因的重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，所述重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQID NO：123、SEQ ID NO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞。
在一些方面，所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽由以SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6示出的核苷酸序列编码，所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽由以SEQID NO：8示出的核苷酸序列编码，所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽由以SEQ ID NO：3示出的核苷酸序列编码，所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽由以SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15示出的核苷酸序列编码。技术人员应理解，这些基因的表达对于产生特定的甜菊醇糖苷可能是必需的，但这些基因中的一个或多个对宿主可能是内源的，条件是这些基因中至少一个(并且在一些实施方案中，全部)是引入到重组宿主中的重组基因。
在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如RebA、RebD和/或RebM)的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如RebA、RebD和/或RebM)的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如甜茶苷、RebB、RebA、RebD和/或RebM)的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ IDNO：143、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如甜茶苷、RebB、RebA、RebD和/或RebM)的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如13-SMG)的量相对于缺乏所述重组基因的相应产甜菊醇糖苷宿主降低了至少5％，例如至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的降低。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少5％，例如至少7.5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少50％，计算为细胞内13-SMG浓度的降低。
在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷(例如13-SMG和RebD)的量相对于缺乏所述重组基因的相应产甜菊醇糖苷宿主降低了至少5％，例如至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、或至少35％、或至少40％、或至少45％、或至少50％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的降低。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP且具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有例如以SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：125、SEQID NO：139或SEQ ID NO：135示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述细胞产生的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少5％，例如至少7.5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少25％、或至少30％、至少35％、或至少50％，计算为细胞内13-SMG浓度的降低。
在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使甜菊醇糖苷的总量(即，单糖基化甜菊醇化合物、二糖基化甜菊醇化合物、三糖基化甜菊醇化合物、四糖基化甜菊醇化合物、五糖基化甜菊醇化合物、六糖基化甜菊醇化合物和七糖基化甜菊醇化合物的总量)相对于缺乏所述重组基因的相应产甜菊醇糖苷宿主增高了至少5％，例如至少7.5％、或至少10％、或至少12.5％、或至少15％、或至少17.5％、或至少20％、或至少25％、或至少27.5％、或至少30％、或至少35％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP且具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达，还有编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有例如以SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ IDNO：125、SEQ ID NO：139或SEQ ID NO：135示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使甜菊醇糖苷的总量(即，单糖基化甜菊醇化合物、二糖基化甜菊醇化合物、三糖基化甜菊醇化合物、四糖基化甜菊醇化合物、五糖基化甜菊醇化合物、六糖基化甜菊醇化合物和七糖基化甜菊醇化合物的总量)相对于缺乏所述重组基因的相应产甜菊醇糖苷宿主增高了至少5％，例如至少7.5％、或至少10％、或至少12.5％、或至少15％、或至少17.5％、或至少20％、或至少25％、或至少27.5％、或至少30％、或至少35％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高。
在一些其他实施方案中，通过在宿主中表达编码能够由UDP合成UTP的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的重组基因，由产甜菊醇糖苷重组宿主细胞产生的甜菊醇糖苷的总量不变(即，增高或降低不到5％、或不到4％、或不到3％、或不到2％、或不到1％)。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因在产甜菊醇糖苷重组宿主中的表达使由所述宿主产生的甜菊醇糖苷的总量增高了不到5％，例如不到4％、或不到3％、或不到2％。
在另一个实例中，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP且具有以SEQ IDNO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因在产生甜菊醇糖苷的宿主细胞中的表达使由所述宿主产生的甜菊醇糖苷的总量增高了不到5％，例如不到4％、或不到3％、或不到2％。
本领域普通技术人员应理解，在此类实施方案中，编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的多肽的一个或多个基因的表达可能影响由所述重组宿主产生的甜菊醇糖苷的相对水平，例如，通过增高可用作使甜菊醇或甜菊醇糖苷糖基化的多肽的底物的UDP-葡萄糖的水平。
举例来说，在一些实施方案中，编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的表达在产甜菊醇糖苷重组宿主中使由所述宿主产生的甜菊醇糖苷的总量增高不到5％，例如不到4％、或不到3％、或不到2％；使由所述宿主产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高至少10％、至少25％或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内甜菊醇糖苷浓度的增高；并且使由所述宿主细胞产生的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低至少5％，例如至少10％、至少20％、至少25％、或至少50％，计算为细胞内13-SMG浓度的降低。
在另一个实例中，在一些实施方案中，编码能够由UDP合成UTP且具有以SEQ IDNO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够使糖原脱支且具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因以及编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因在产生甜菊醇糖苷的重组宿主中的表达使由所述宿主产生的甜菊醇糖苷的总量增高了不到5％，例如不到4％、或不到3％、或不到2％；使由所述宿主产生的RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，计算为细胞内RebM浓度的增高；并且使由所述宿主产生的RebD的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少10％，例如至少20％、或至少30％、至少40％、或至少50％，计算为细胞内RebD浓度的降低。
在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因和/或编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。在一些实施方案中，重组宿主细胞包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。
在某些实施方案中，重组宿主包含具有对所述宿主为天然的核苷酸序列的一个或多个重组基因，所述一个或多个重组基因编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽、能够使糖原脱支的一种或多种多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽，和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽，即，重组宿主过度表达能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽、能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽、能够使糖原脱支的一种或多种多肽、能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽，和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽。
在某些此类实施方案中，重组宿主细胞过度表达编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽的一个或多个基因(例如，表达编码具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的酿酒酵母宿主细胞)、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因(例如，表达编码具有以SEQ ID NO：2和/或SEQ IDNO：119示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的酿酒酵母宿主细胞)、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽的一个或多个基因(例如，表达编码具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的酿酒酵母宿主细胞)、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽的一个或多个基因(例如，表达编码具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的酿酒酵母宿主细胞)，和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽的一个或多个基因(例如，表达编码具有以SEQ IDNO：121示出的氨基酸序列的多肽的重组基因的酿酒酵母宿主细胞)。
在一个实例中，重组酿酒酵母宿主细胞过度表达编码具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组酿酒酵母宿主细胞过度表达编码具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽的基因、编码具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽的基因、编码具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的基因、编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的基因、编码具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽的基因以及编码具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽的基因。
在某些实施方案中，包含编码能够由UDP合成UTP的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够使糖原脱支的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ IDNO：157示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列)的一个或多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因的重组宿主细胞还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如具有以SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些此类实施方案中，所述重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有以SEQID NO：20示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：40示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：52示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：78、SEQID NO：86或SEQ ID NO：92示出的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：94示出的氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，重组宿主包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因，和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因。
在某些此类实施方案中，重组宿主包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的两种或更多种多肽的两个或更多个基因，例如编码具有以SEQ ID NO：2、SEQID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽的两个或更多个基因。在一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：2示出的氨基酸序列的多肽、具有以SEQ ID NO：119示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：145示出的氨基酸序列的多肽的基因。在一些实施方案中，所述重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的基因，和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的多肽)的一个或多个基因。
在某些此类实施方案中，重组宿主包含编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的两种或更多种多肽的两个或更多个基因，例如，编码具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ IDNO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽的两个或更多个基因。在一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：125示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：127示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：129示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽和具有以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ ID NO：133示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ ID NO：135示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ ID NO：137示出的氨基酸序列的多肽的基因。在另一个实例中，重组宿主包含编码具有以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列的多肽的基因和编码具有以SEQ IDNO：139示出的氨基酸序列的多肽的基因。在一些实施方案中，所述重组宿主还包含编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的基因，和/或编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的一种或多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ IDNO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的一种或多种多肽)的一个或多个基因。
在某些此类实施方案中，包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQID NO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因的重组宿主是过度表达编码所述UDP-葡萄糖生物合成途径中所涉及的一种或多种多肽的一个或多个基因的宿主细胞(例如，表达编码具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：123、SEQ IDNO：157和/或SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的一种或多种多肽的一个或多个基因的酿酒酵母宿主细胞)。
在某些实施方案中，包含编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：141、SEQ IDNO：143、SEQ ID NO：145和/或SEQ ID NO：147示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的两种或更多种多肽(例如，具有以SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：129、SEQID NO：131、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：137和/或SEQ ID NO：139示出的氨基酸序列的两种或更多种多肽)的两个或更多个基因的重组宿主细胞还包含编码能够由UDP合成UTP的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够使糖原脱支的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽)的基因、编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽(例如具有以SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQID NO：16示出的氨基酸序列的多肽)的基因。在某些此类实施方案中，所述重组宿主细胞还包含编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：20示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽(例如，具有以SEQ IDNO：40示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：52示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：117示出的氨基酸序列的多肽)的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：86或SEQ ID NO：92示出的氨基酸序列的多肽)的基因；和/或编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽(例如，具有以SEQ ID NO：94示出的氨基酸序列的多肽)的基因。
在一些实施方案中，以体外方法产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物，所述体外方法包括向反应混合物中加入：能够使糖原脱支的多肽包括与以SEQ IDNO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，和/或能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；以及，任选地，以下中的一种或多种：能够由UDP合成UTP的多肽包括与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或者与以SEQ ID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％的序列同一性的多肽；和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括与以SEQ ID NO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，与以SEQ ID NO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；以及以下中的一种或多种：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；以及植物来源的或合成的甜菊醇、甜菊醇前体和/或甜菊醇糖苷；其中所述多肽中至少一种是重组多肽；以及由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在本文中公开的体外方法的一个方面，所述反应混合物包含：(a)一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物；(b)能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽和/或能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ IDNO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；以及，任选地，以下中的一种或多种：能够由UDP合成UTP的多肽包括与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQID NO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或者与以SEQ ID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％的序列同一性的多肽；和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括与以SEQ ID NO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽，与以SEQ ID NO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；以及以下中的一种或多种：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ IDNO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；(c)尿苷二磷酸酯(UDP)-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；和/或(d)反应缓冲液和/或盐。
在本文公开的体外方法的一个方面，所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
在一些实施方案中，通过全细胞生物转化产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物。为了发生全细胞生物转化，表达甜菊醇糖苷途径中所涉及的一种或多种酶的宿主细胞摄取并修饰细胞中的甜菊醇糖苷前体；在体内修饰后，甜菊醇糖苷保留在细胞中和/或分泌至培养基中。举例来说，表达编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因、编码能够使糖原脱支的多肽的基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因；并且还表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因的宿主细胞可以摄取细胞中的甜菊醇并且使甜菊醇糖基化；在体内糖基化后，甜菊醇糖苷可以分泌至培养基中。在某些此类实施方案中，所述宿主细胞可能还表达编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯并且由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的双功能多肽的基因。
在一些实施方案中，本文公开的产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法包括在重组宿主细胞的细胞培养基中使用以下各物对植物来源的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化：(a)能够使糖原脱支的多肽，和/或(b)能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽；任选地，以下中的一种或多种：(c)能够由UDP合成UTP的多肽，(d)能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，和/或(e)能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽；以及以下中的一种或多种：(f)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；(g)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽；(h)能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或(i)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽；其中所述多肽中至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在一些实施方案中，本文公开的用于产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法包括在本文公开的重组宿主细胞的细胞培养基中对植物来源的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化，所述能够使糖原脱支的多肽包括具有以SEQID NO：157示出的氨基酸序列的多肽；和/或所述能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括具有以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列的多肽。
在一些实施方案中，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽可通过使它与锚定基序融合而呈现在本文公开的重组宿主细胞的表面上。
在一些实施方案中，使细胞透化以摄取欲修饰的底物或分泌经修饰的产物。在一些实施方案中，可以加入透化剂以帮助原料进入宿主中以及帮助产物离开。在一些实施方案中，用溶剂(如甲苯)或用清洁剂(如Triton-X或Tween)使细胞透化。在一些实施方案中，用表面活性剂(例如阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵(CTAB))使细胞透化。在一些实施方案中，用周期性机械冲击(如电穿孔或轻微渗透压冲击)使细胞透化。举例来说，可以对所培养的微生物的粗溶解物进行离心以获得上清液。然后可以将所得上清液施加至色谱柱(例如，C18柱)，并且用水洗涤以去除亲水性化合物，然后用溶剂(如甲醇)洗脱一种或多种目标化合物。然后可以通过制备型HPLC进一步纯化所述一种或多种化合物。也参见WO 2009/140394。
在一些实施方案中，通过共培养两种或更多种宿主来产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体、一种或多种甜菊醇糖苷、或甜菊醇糖苷组合物。在一些实施方案中，各自表达甜菊醇糖苷途径所涉及的一种或多种酶的一种或多种宿主产生甜菊醇、一种或多种甜菊醇糖苷前体和/或一种或多种甜菊醇糖苷。举例来说，表达编码能够由FPP和IPP合成GGPP的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸、对映-贝壳杉烯醇和/或对映-贝壳杉烯醛的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；和/或编码能够由GGPP合成对映柯巴基二磷酸酯并且由对映柯巴基二磷酸酯合成对映贝壳杉烯的双功能多肽的基因的宿主，以及表达编码能够由UDP合成UTP的多肽的基因、编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因、编码能够使糖原脱支的多肽的基因、编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽的基因；并且还表达编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因的宿主产生一种或多种甜菊醇糖苷。
在一些实施方案中，所述甜菊醇糖苷包括例如但不限于13-SMG、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、19-SMG、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、RebA、RebB、RebC、RebD、RebE、RebF、RebM、RebQ、RebI、杜克苷A、二糖基化甜菊醇、三糖基化甜菊醇、四糖基化甜菊醇、五糖基化甜菊醇、六糖基化甜菊醇、七糖基化甜菊醇或其异构体。
在一些实施方案中，在体内、在体外或通过全细胞生物转化产生的甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物与尤其是来自甜叶菊植物的甜叶菊提取物相比不包含植物来源的组分或者包含减少量或降低水平的植物来源的组分。植物来源的组分可能会带来异味，并且包括色素、脂质、蛋白质、酚类、糖类、桉油烯醇和其他倍半萜烯、半日花烷二萜、单萜、癸酸、8，11，14-二十碳三烯酸、2-甲基十八烷、二十五烷、二十八烷、二十四烷、十八烷醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-香树脂醇和β-香树脂醇、羽扇豆醇、β-香树脂醇乙酸酯、五环三萜、矢车菊黄素、槲皮素、表-α-杜松醇、丁香烯和衍生物、β-蒎烯、β-谷甾醇和赤霉素。在一些实施方案中，本文提及的植物来源的组分是非糖苷化合物。
如本文所使用，术语“可检测量”、“可检测浓度”、“可测量量”和“可测量浓度”是指以AUC、μM/OD600、mg/L、μM或mM测量的甜菊醇糖苷水平。可以通过本领域技术人员一般可利用的技术，例如但不限于液相色谱-质谱法(LC-MS)、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、紫外-可见光谱/分光光度法(UV-Vis)、质谱法(MS)和核磁共振光谱法(NMR)来检测和/或分析甜菊醇糖苷产量(即，总甜菊醇糖苷水平、上清液甜菊醇糖苷水平和/或细胞内甜菊醇糖苷水平)。
如本文所使用，术语“不可检测浓度”是指化合物水平太低而不能通过如TLC、HPLC、UV-Vis、MS或NMR等技术进行测量和/或分析。在一些实施方案中，甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷前体组合物中不存在“不可检测浓度”的化合物。
重组微生物已在培养物中生长一定时间段后，其中所述温度和时间段促进甜菊醇糖苷的产生，随后可以使用本领域已知的各种技术从培养物回收甜菊醇和/或一种或多种甜菊醇糖苷。可以使用本文描述的方法分离甜菊醇糖苷。举例来说，在发酵后，可以在4℃下以7000rpm将培养液离心30min以去除细胞，或者可以通过过滤去除细胞。可以例如通过宿主细胞的机械破坏或酶促破坏和额外的离心去除细胞碎片来获得无细胞溶解物。还可以对干燥过的培养液材料进行机械破坏，如通过超声波处理。在如通过制备型色谱法进行进一步纯化前，可以使用微米或亚微米过滤溶解或悬浮的培养液材料。可以任选地处理发酵培养基或无细胞溶解物以去除低分子量化合物，如盐；并且可以任选地在纯化前进行干燥并再溶解于水和溶剂的混合物中。
可以如下对上清液或无细胞溶解物进行纯化：可以用例如HP20 Diaion树脂(芳香型合成吸附剂；Supelco)或其他合适的非极性吸附剂或逆相色谱树脂对柱进行填充，并且可以将上清液或无细胞溶解物的等分试样加载到柱上，并用水洗涤以去除亲水性组分。可以通过逐步递增地增加水中的溶剂浓度或通过例如0％→100％甲醇的梯度来洗脱甜菊醇糖苷产物。然后可以通过LC-MS分析各级分(包括流过物(flow-through))中甜菊醇糖苷、糖基化对映贝壳杉烯醇和/或糖基化对映贝壳杉烯酸的水平。然后可以将级分合并，并使用真空蒸发器减少体积。需要时可以利用额外的纯化步骤，如额外的色谱步骤和结晶。举例来说，可以通过不限于离子交换色谱法、逆相色谱法(即，使用C18柱)、萃取、结晶和碳柱和/或脱色步骤的方法来分离甜菊醇糖苷。
在一个实施方案中，能够在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷或甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞包含编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因；和/或编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因，其中所述能够使糖原脱支的多肽能够具有4-α-葡聚糖转移酶活性和α-1，6-淀粉葡糖苷酶活性，其中所述重组宿主细胞还包含编码能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5′-三磷酸酯(UTP)的多肽的基因；编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因；和/或编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成尿苷二磷酸酯葡萄糖(UDP-葡萄糖)的多肽的基因，其中：所述能够使糖原脱支的多肽包括与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；所述能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；所述能够由UDP合成UTP的多肽包括与以SEQ IDNO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；所述能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或者与以SEQ ID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或所述能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括与以SEQ ID NO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽、与以SEQ ID NO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
在另一个实施方案中，上文讨论的重组宿主细胞还包含编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽的基因；编码能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；和/或编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽的基因；并且还包含编码能够由法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽的基因；编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；和/或编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因，其中所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；所述能够合成GGPP的多肽包括与以SEQ ID NO：20、22、24、26、28、30、32或116中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；所述能够合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO：34、36、38、40、42或120中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；所述能够合成对映-贝壳杉烯的多肽包括与以SEQ IDNO：44、46、48、50或52中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；所述能够合成对映-贝壳杉烯酸的多肽包括与以SEQ ID NO：60、62、117、SEQ ID NO：66、68、70、72、74或76中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽包括与以SEQ ID NO：78、80、82、84、86、88、90、92中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；和/或所述能够合成甜菊醇的多肽包括与以SEQID NO：94、97、100、101、102、103、104、106、108、110、112或114中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
在另一个实施方案中，上文讨论的重组宿主细胞包含编码能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；编码能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5′-三磷酸酯(UTP)且与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：2或119中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；和编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且与以SEQ ID NO：121示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；以及以下中的一个或多个：编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化且与以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化且与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽的基因；编码能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化且与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；编码能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化且与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽的基因；与以SEQ ID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
在另一个实施方案中，上文讨论的重组宿主细胞包含编码能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；和/或编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；其中所述编码能够使糖原脱支的多肽的基因和/或所述编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞被过度表达，其中所述编码能够使糖原脱支的多肽的基因和/或所述编码能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞被过度表达至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
在另一个实施方案中，重组宿主细胞包含的一个或多个重组基因的表达使由所述重组宿主细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的一种或多种甜菊醇糖苷之一或所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少5％、或至少10％、至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％，和/或其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％。
在上文讨论的重组宿主细胞的一个实施方案中，所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
在上文讨论的重组宿主细胞的一个实施方案中，所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
在一个实施方案中，在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊糖苷组合物的方法包括在表达所述基因的条件下，在细胞培养物中培养上文讨论的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物由所述重组宿主细胞产生，其中组成性地表达所述基因或其中诱导所述基因的表达，其中由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％，其中由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少10％、至少25％或至少50％，其中由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％，其中由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％，其中使所述重组宿主细胞在发酵罐中在一定温度下生长一定时间段，其中所述温度和时间段促进所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的产生，和/或其中由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％。
在一个实施方案中，所述在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法还包括从所述细胞培养物中分离所产生的一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊糖苷组合物，其中所述分离步骤包括：分离所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相，以获得包含所产生的一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的上清液，以及使所述上清液与一种或多种吸附树脂接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；使所述上清液与一个或多个离子交换或逆相色谱柱接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；或者使所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物结晶，或者提取所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；从而分离所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
在一个实施方案中，所述在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或甜菊醇糖苷组合物的方法还包括从所述细胞培养物回收所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物，其中所产生的一种或多种甜菊醇糖苷、或甜菊醇糖苷组合物相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷，并且相对于从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
在一个实施方案中，所述产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法包括在重组宿主细胞的细胞培养物中使用以下各物对植物来源的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化：能够使糖原脱支的多肽，所述多肽包括与以SEQ IDNO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；和/或能够由磷酸酯和糖原合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；以及任选地，以下中的一种或多种：能够由UDP合成UTP的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；或者与以SEQ ID NO：141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％的序列同一性的多肽；和/或能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO：121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；与以SEQ ID NO：125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；或者与以SEQ ID NO：131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽，以及以下中的一种或多种：能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽；能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽；其中所述多肽中至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物，其中所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3′进行β1，3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；所述能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2′进行β1，2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO：11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQID NO：13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO：16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
在一个实施方案中，所述在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或甜菊醇糖苷组合物的方法中使用的重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1，2-二糖苷、甜菊醇-1，3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1，2-甜菊苷、1，3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
如本文所使用，术语“或”和“和/或”用于描述组合或互不相干的多种组分。举例来说，“x、y和/或z”可以指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”或者“x或y或z”。在一些实施方案中，“和/或”用于指重组细胞包含的外源核酸，其中重组细胞包含选自一组的一种或多种外源核酸。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷和/或甜菊醇糖苷前体的产生。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中产生一种或多种甜菊醇糖苷。在一些实施方案中，“和/或”用于指甜菊醇糖苷的产生，其中通过以下步骤中的一个或多个产生一种或多种甜菊醇糖苷：培养重组微生物，在重组微生物中合成一种或多种甜菊醇糖苷，和/或分离一种或多种甜菊醇糖苷。
功能同源物
上文描述的多肽的功能同源物还适用于在重组宿主中产生甜菊醇糖苷。功能同源物是与参考多肽具有序列相似性，且执行参考多肽的一种或多种生物化学或生理学功能的多肽。功能同源物和参考多肽可以是天然存在的多肽，并且序列相似性可以归因于收敛或发散的进化事件。因此，功能同源物在文献中有时被命名为同源物、或直系同源物、或旁系同源物。天然存在的功能同源物的变体(如由野生型编码序列的突变体编码的多肽)本身可以是功能同源物。功能同源物还可以经由多肽的编码序列的定点诱变产生，或者通过组合来自不同的天然存在的多肽的编码序列的结构域(“结构域交换”)产生。用于修饰编码本文描述的功能多肽的基因的技术是已知的，并且尤其包括定向进化技术、定点诱变技术和随机诱变技术，并且可用于增加多肽的比活性，改变底物特异性，改变表达水平，改变亚细胞位置，或以所需方式修饰多肽-多肽相互作用。此类经修饰的多肽被视为功能同源物。术语“功能同源物”有时应用于编码功能上同源的多肽的核酸。
可以通过分析核苷酸和多肽序列比对来鉴定功能同源物。举例来说，对核苷酸或多肽序列的数据库进行查询可以鉴定甜菊醇糖苷生物合成多肽的同源物。序列分析可以涉及使用UGT氨基酸序列作为参考序列对非冗余数据库进行BLAST、Reciprocal BLAST或PSI-BLAST分析。在一些情况下，氨基酸序列是由核苷酸序列推导出的。数据库中具有大于40％序列同一性的那些多肽是用于进一步评估作为甜菊醇糖苷生物合成多肽的适合性的候选物。氨基酸序列相似性允许保守氨基酸取代，如将一个疏水性残基取代为另一个疏水性残基或将一个极性残基取代为另一个极性残基。如果需要，可以对此类候选物进行人工检查，以减少有待进一步评估的候选物的数量。可以通过选择看似具有甜菊醇糖苷生物合成多肽中存在的结构域(例如保守的功能结构域)的那些候选物来进行人工检查。在一些实施方案中，基于表达水平而不是通过使用BLAST分析从转录组数据鉴定核酸和多肽。
可以通过定位甜菊醇糖苷生物合成多肽的一级氨基酸序列内的区域来鉴定保守区域，所述一级氨基酸序列是重复序列，形成某种二级结构(例如，螺旋和β片层)，建立带正电或带负电的结构域，或者代表蛋白质基序或结构域。参见例如万维网上描述各种蛋白质基序和结构域的共有序列的Pfam网址sanger.ac.uk/Software/Pfam/和pfam.janelia.org/。Pfam数据库包括的信息描述于Sonnhammer等，Nucl.Acids Res.，26：320-322(1998)；Sonnhammer等，Proteins，28：405-420(1997)；以及Bateman等，Nucl.AcidsRes.，27：260-262(1999)。保守区域还可以通过比对来自密切相关物种的相同或相关多肽的序列来确定。密切相关物种优选来自同一科。在一些实施方案中，对来自两个不同物种的序列的比对足以鉴定此类同源物。
典型地，表现出至少约40％氨基酸序列同一性的多肽可用于鉴定保守区域。相关多肽的保守区域表现出至少45％氨基酸序列同一性(例如，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％氨基酸序列同一性)。在一些实施方案中，保守区域表现出至少92％、94％、96％、98％或99％氨基酸序列同一性。
举例来说，适合在重组宿主中产生甜菊醇的多肽包括UGT的功能同源物。
修饰例如UGT的底物特异性的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于定点/合理诱变方法、随机定向进化方法以及在酶的活性位点附近进行随机诱变/饱和技术的组合。举例来说，参见Osmani等，2009，Phytochemistry 70：325-347。
候选序列的长度典型地为参考序列的长度的80％至200％，例如参考序列的长度的82％、85％、87％、89％、90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％或200％。功能同源多肽的长度典型地为参考序列的长度的95％至105％，例如参考序列的长度的90％、93％、95％、97％、99％、100％、105％、110％、115％或120％，或之间的任何范围。任何候选核酸或多肽相对于参考核酸或多肽的同一性％都可以如下测定。使用计算机程序Clustal Omega(1.2.1版，默认参数)将参考序列(例如，本文描述的核酸序列或氨基酸序列)与一个或多个候选序列比对，所述计算机程序允许在核酸或多肽序列的整个长度上对它们进行比对(全局比对)。Chenna等，2003，Nucleic Acids Res.31(13)：3497-500。
Clustal Omega计算参考序列与一个或多个候选序列之间的最佳匹配，并且对它们进行比对，从而可以确定同一性、相似性和差异。可以将一个或多个残基的空位插入参考序列、候选序列或二者中，以最大化序列比对。对于核酸序列的快速成对比对，使用以下默认参数：字长：2；窗口大小：4；评分方法：％age；顶部对角线数：4；以及空位罚分：5。对于核酸序列的多重比对，使用以下参数：空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：5.0；以及权重转换：是。对于蛋白质序列的快速成对比对，使用以下参数：字长：1；窗口大小：5；评分方法：％age；顶部对角线数：5；空位罚分：3。对于蛋白质序列的多重比对，使用以下参数：权重矩阵：blosum；空位开放罚分：10.0；空位延伸罚分：0.05；亲水性空位：开；亲水性残基：Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg和Lys；残基特异性空位罚分：开。Clustal Omega输出是反映序列之间的关系的序列比对。Clustal Omega可以在例如万维网上的Baylor College ofMedicine Search Launcher网站(searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html)和European Bioinformatics Institute网站(http：//www.ebi.ac.uk/ Tools/msa/clustalo/)上运行。
为了测定候选核酸或氨基酸序列与参考序列的同一性％，使用Clustal Omega比对序列，将比对中的相同匹配数除以参考序列的长度，并且将结果乘以100。应注意，同一性％值可以四舍五入到最接近的十分位。举例来说，78.11、78.12、78.13和78.14向下四舍五入为78.1，而78.15、78.16、78.17、78.18和78.19向上四舍五入为78.2。
应当理解，功能UGT蛋白(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽)可以包括不参与由酶执行的酶活性的额外氨基酸。在一些实施方案中，UGT蛋白是融合蛋白。术语“嵌合体”、“融合多肽”、“融合蛋白”、“融合酶”、“融合构建体”、“嵌合蛋白”、“嵌合多肽”、“嵌合构建体”和“嵌合酶”可在本文互换用于指通过连接编码不同蛋白质的两个或更多个基因而工程化的蛋白质。
在一些实施方案中，编码UGT多肽(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽)的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，所述标签被设计为有助于对编码的多肽进行后续操作(例如，有助于纯化或检测)、分泌或定位。标签序列可以插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、人流感血凝素(HA)、谷胱甘肽S转移酶(GST)、多组氨酸标签(HIS标签)和FlagTM标签(Kodak，纽黑文市，康涅狄格州)。标签的其他实例包括叶绿体转运肽、线粒体转运肽、淀粉体肽、信号肽或分泌标签。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过结构域交换而改变的蛋白质。如本文所使用，术语“结构域交换”用于描述用第二蛋白质的结构域替换第一蛋白质的结构域的过程。在一些实施方案中，第一蛋白质的结构域和第二蛋白质的结构域在功能上相同或在功能上相似。在一些实施方案中，所述第二蛋白质的结构域的结构和/或序列与所述第一蛋白质的结构域的结构和/或序列不同。在一些实施方案中，通过结构域交换来改变UGT多肽(例如，能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽)。
在一些实施方案中，融合蛋白是通过环状排列改变的蛋白质，所述环状排列在于蛋白质末端的共价附接之后将在其他处打开。因此，在不引起蛋白质的氨基酸的改变的情况下改变序列的顺序。在一些实施方案中，可以产生靶向性环状排列，例如但不限于通过设计间隔子来连接原始蛋白质的末端。一旦已定义间隔子，就有若干种可能通过公认的分子生物学技术来产生排列，例如但不限于通过借助于PCR产生串联体并且随后扩增所述串联体内的特定排列或通过扩增蛋白质的离散片段来进行交换以便以不同的顺序将它们连接。产生排列的步骤之后可以通过结合片段末端并随机截短来产生环状基因，因此形成来自独特构建体的排列的集合。
甜菊醇和甜菊醇糖苷生物合成核酸
编码本文描述的多肽的重组基因包含该多肽的编码序列，所述编码序列在有义方向上可操作地连接至一个或多个适合表达所述多肽的调控区。因为许多微生物能够从多顺反子mRNA表达多种基因产物，所以如果需要，则可以在那些微生物的单个调控区的控制下表达多种多肽。当调控区和编码序列被定位使得调控区对调控序列的转录或翻译有效时，编码序列和调控区被视为可操作地连接。典型地，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点位于单顺反子基因的调控区下游的一至约五十个核苷酸之间。
在许多情况下，在除重组宿主以外的物种中鉴定出本文描述的多肽的编码序列，即，本文描述的多肽的编码序列是异源核酸。因此，如果重组宿主是微生物，则编码序列可以来自其他原核或真核微生物、来自植物或来自动物。然而，在一些情况下，编码序列是对宿主为天然的且正重新引入该生物体中的序列。天然序列通常可以通过存在连接至外源核酸的非天然序列(例如，重组核酸构建体中侧接天然序列的非天然调控序列)而区别于天然存在的序列。另外，典型地将稳定转化的外源核酸整合在除了发现天然序列的位置以外的位置。“调控区”是指具有影响转录或翻译起始和速率以及转录或翻译产物的稳定性和/或活动性的核苷酸序列的核酸。调控区包括但不限于启动子序列、增强子序列、反应元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5′和3′非翻译区(UTR)、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、内含子及其组合。调控区典型地包含至少一个核心(基础)启动子。调控区还可以包括至少一个控制元件，如增强子序列、上游元件或上游激活区(UAR)。通过定位调控区和编码序列将调控区可操作地连接至编码序列，使得调控区对调控序列的转录或翻译有效。举例来说，为了可操作地连接编码序列和启动子序列，编码序列的翻译阅读框的翻译起始位点典型地位于启动子下游的一至约五十个核苷酸之间。然而，调控区可以位于翻译起始位点上游多达约5,000个核苷酸处，或转录起始位点上游约2,000个核苷酸处。
欲包括的调控区的选择取决于若干因素，包括但不限于在某些培养阶段期间的效率、可选择性、诱导性、所期望的表达水平和优先表达。对于本领域技术人员而言，通过适当地选择和相对于编码序列定位调控区来调节编码序列的表达是常规事项。应当理解，可能存在超过一个调控区，例如内含子、增强子、上游激活区、转录终止子和诱导型元件。
一个或多个基因可以呈可用于甜菊醇和/或甜菊醇糖苷生产的离散方面的“模块”形式组合在重组核酸构建体中。呈模块(特别是多顺反子模块)形式组合多个基因有助于在多种物种中使用所述模块。举例来说，甜菊醇生物合成基因簇或UGT基因簇可以呈多顺反子模块形式组合，使得在插入合适的调控区后，模块可以引入至多种物种中。作为另一个实例，可以组合UGT基因簇，使得每一个UGT编码序列可操作地连接至单独的调控区，以形成UGT模块。此类模块可用于必需或需要单顺反子表达的那些物种。除了可用于甜菊醇或甜菊醇糖苷产生的基因以外，重组构建体典型地还含有复制起点和一种或多种可选择标记物，用于在适当的物种中维持所述构建体。
应当理解，由于遗传密码的简并性，许多核酸可以编码特定的多肽；即，对于许多氨基酸，存在超过一个用作氨基酸密码子的核苷酸三联体。因此，可以修饰指定多肽的编码序列中的密码子，以便使用特定宿主(例如，微生物)的适当密码子偏移表来获得该宿主中的最佳表达。作为分离的核酸，这些经修饰的序列可以呈纯化的分子形式存在，并且可以并入载体或病毒中，以用于构建重组核酸构建体的模块。
在一些情况下，期望抑制内源多肽的一种或多种功能以便使代谢中间物转向甜菊醇或甜菊醇糖苷生物合成。举例来说，可能期望下调酵母菌株中甾醇的合成，以便例如通过下调角鲨烯环氧酶来进一步增加甜菊醇或甜菊醇糖苷产生。作为另一个实例，可能期望抑制某些内源基因产物(例如，从次级代谢物中去除葡萄糖部分的糖水解酶或如本文所讨论的磷酸酶)的降解功能。在此类情况下，过度表达多肽或基因产物的核酸可以包括在转化至菌株中的重组构建体中。可选地，可以使用诱变来产生希望增加或增强功能的基因的突变体。
宿主微生物
重组宿主可以用于表达用于产生甜菊醇糖苷的多肽，包括但不限于植物细胞(包括在植物中生长的植物细胞)、哺乳动物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、藻类细胞或细菌细胞。
许多原核生物和真核生物也适用于构建本文描述的重组微生物，例如革兰氏阴性细菌、酵母和真菌。首先分析被选择用作甜菊醇糖苷生产菌株的物种和菌株，以确定哪些生产基因对所述菌株是内源的以及哪些基因不存在。将菌株中不存在内源对应物的基因有利地组装在一个或多个重组构建体中，然后将所述一个或多个重组构建体转化至菌株中以提供一种或多种丧失的功能。
通常，重组微生物在发酵罐中在一定温度(多个)下生长一定时间段，其中所述温度和时间段有助于甜菊醇糖苷的产生。本发明提供的构建的和基因工程化的微生物可以使用常规发酵方法培养，尤其包括恒化器培养、分批培养、补料分批培养、半连续发酵如抽吸和填充、连续灌注发酵以及连续灌注细胞培养。取决于所述方法中使用的特定微生物，还可能存在和表达其他重组基因，如异戊烯基生物合成基因以及萜烯合酶和环化酶基因。底物和中间物(例如，异戊烯基二磷酸酯、二甲基烯丙基二磷酸酯、GGPP、对映贝壳杉烯和对映贝壳杉烯酸)的水平可以通过从培养基中提取样品以根据公开的方法进行分析来测定。
在一些方面，使重组微生物在深孔板中生长。应当理解，尽管关于由深孔培养物中生长的重组微生物产生甜菊醇糖苷的数据在一些方面可能比发酵培养物中更容易收集，但深孔的小培养体积(例如1ml或0.5ml)可以影响微生物环境的差异，并且因此影响它在产生甜菊醇糖苷方面的效率和有效性。举例来说，发酵培养物与深孔培养物之间的养分利用率、细胞废产物积聚、pH、温度、搅动和通气可能存在显著差异。因此，营养物或其他酶底物的摄取可能变化，从而影响细胞代谢(例如，改变由重组微生物积累的产物的量和/或分布)。参见例如Duetz，Trends Microbiol 15(10)：469-75(2007)。
本发明方法中使用的碳源包括可以被重组宿主细胞代谢以促进甜菊醇糖苷的生长和/或产生的任何分子。合适的碳源的实例包括但不限于蔗糖(例如，如在糖蜜中发现的)、果糖、木糖、乙醇、甘油、葡萄糖、纤维素、淀粉、纤维二糖或其他含葡萄糖的聚合物。举例来说，在采用酵母作为宿主的实施方案中，如蔗糖、果糖、木糖、乙醇、甘油和葡萄糖等碳源是合适的。可以在整个培养期向宿主生物体提供碳源，或者可选地，可以使生物体在另一种能源(例如蛋白质)的存在下生长一定时间段，然后在补料分批阶段期间仅提供碳源。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可以存在于两个或更多个重组宿主中，而不是单个宿主中。当使用多个重组宿主时，可以使它们在混合培养物中生长以积累甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。
可选地，可以使两个或更多个宿主各自在单独的培养基中生长，并且可以将第一培养基的产物(例如甜菊醇)引入第二培养基中以转化为随后的中间物，或者最终产物，诸如像RebA。然后回收由第二或最终宿主产生的产物。还应当理解，在一些实施方案中，使用除培养基以外的营养源并利用除发酵罐以外的系统使重组宿主生长。
下面更详细地描述了示例性原核和真核物种。然而，应当理解其他物种可能是合适的。然而，应当理解，其他物种可能适合表达用于产生甜菊醇糖苷的多肽。
举例来说，合适的物种可以属于以下属，如伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、假丝酵母属(Candida)、棒杆菌属(Corynebacterium)、假囊酵母属(Eremothecium)、埃希氏菌属(Escherichia)、镰刀菌属(Fusariuml)/赤霉菌属(Gibberella)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、硫磺菌属(Laetiporus)、香菇属(Lentinus)、法夫酵母属(Phaffia)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、毕赤酵母属(Pichia)(正式称为Hansuela)、斯舍弗氏菌属(Scheffersomyces)、小立碗藓属(Physcomitrella)、红酵母属(Rhodoturula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、痂圆孢属(Sphaceloma)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces)、地霉属(Geotrichum)、布拉霉属(Blakeslea)、杜氏藻属(Dunaliella)、红球藻属(Haematococcus)、小球藻属(Chlorella)、裙带菜属(Undaria)、马尾藻属(Sargassum)、海带属(Laminaria)、栅列藻属(Scenedesmus)、管囊酵母属(Pachysolen)、毛孢子菌属(Trichosporon)、枝顶孢属(Acremonium)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、棒囊壳属(Corynascus)、金孢子菌属(Chrysosporium)、线黑粉菌属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、巨座壳属(Magnaporthe)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、被孢霉属(Mortierella)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、管囊酵母属、原毛平革菌属、柄孢壳菌属(Podospora)、密孔菌属(Pycnoporus)、酒曲菌属(Rhizopus)、裂殖菌属(Schizophyllum)、粪壳菌属(Sordaria)、塔拉木霉属(Talaromyces)、篮状菌属(Rasmsonia)、热曲霉属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、克勒克酵母属(Kloeckera)、管囊酵母属(Pachysolen)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、栓菌属(Trametes)、木霉属(Trichoderma)、不动杆菌属(Acinetobacter)、诺卡氏菌属(Nocardia)、黄杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属(Streptomyces)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、绿弯菌属(Chloroflexus)、绿线菌属(Chloronema)、绿菌属(Chlorobium)、暗网菌属(Pelodictyon)、着色菌属(Chromatium)、红螺菌属(Rhode-spirillum)、红杆菌属(Rhodobacter)、红微菌属(Rhodomicrobium)或亚罗酵母属(Yarrowia)。
来自这些属的示例性物种包括虎皮香菇(Lentinus tigrinus)、朱红硫磺菌(Laetiporus sulphureus)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德毕赤酵母、贾丁拟威尔酵母、小立碗藓(Physcomitrella patens)、粘红酵母(Rhodoturulaglutinis)、海洋红酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、酿酒酵母、贝酵母(Saecharomyces bayanus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、多形汉逊酵母、异酒香酵母(Brettanomyces anomalus)、嗜土粉状毕赤酵母(Yamadazymaphilogaea)、藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)/藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)、产朊假丝酵母、光滑假丝酵母、克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)、拉可夫氏假丝酵母(Candidarevkaufi)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉(Penicillium citrihum)、顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、埃默森篮状菌(Rasamsonia emersonii)(以前称为Talaromyces emersonii)、酱油曲霉(Aspergillussojae)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、嗜热毁丝霉(Myceliophtorathermophyla)、白假丝酵母(Candida albicans)、纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacilliuslicheniformis)、潘蒂芽孢杆菌(Bacillus puntis)、巨大芽胞杆菌(Bacilliusmegaterium)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillius halofurans)、短小芽孢杆菌(Baciiliuspunilus)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcessans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、盐生杜氏藻(Dunaliella salina)、雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻属(Chlorella sp.)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、马尾藻属(Sargassum)、海带(Laminaria japonica)、阿尔默瑞栅藻(Scenedesmus almeriensis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、橙色绿弯菌(Choroflexus aurantiacus)、巨大绿线菌(Chloronemagigateum)、泥生绿菌(Chlorobium limicola)、微黄暗网菌(Pelodictyon luteolum)、奥氏着色菌(Chromatium okenii)、深红红螺菌(Rhode-spirillum rubrum)、类球红假单胞菌(Rhodobacter spaeroides)、荚膜红假单胞菌(Rhodobacter capsulatus)、万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vanellii)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、白吉利丝孢酵母(Trichosporon beigelii)和解脂耶氏酵母。
在一些实施方案中，微生物可以是原核生物，如埃希氏菌属细菌细胞(例如大肠杆菌细胞)、乳杆菌属细菌细胞、乳球菌属细菌细胞、棒杆菌属细菌细胞、醋杆菌属细菌细胞、不动杆菌属细菌细胞或假单胞菌属细菌细胞。
在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，如三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻属、裙带菜、马尾藻属、海带、阿尔默瑞栅藻物种。
在一些实施方案中，微生物可以是来自包括但不限于以下属的真菌：枝顶孢属、阿氏菌属(Arxula)、伞菌属、曲霉属、伞菌属、短梗霉属、酒香酵母属、假丝酵母属、隐球菌属、棒囊壳属、金孢子菌属、德巴利酵母属(Debaromyces)、线黑粉菌属、镰刀菌属、赤霉属、腐质霉属、巨座壳属、红曲霉属、毛霉属、毁丝霉属、被孢霉属、新美鞭菌属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、梨囊鞭菌属、原毛平革菌属柄孢壳菌属、密孔菌属、酒曲菌属、裂褶菌属、裂殖酵母属、粪壳菌属、毕赤酵母属、塔拉木霉属、红酵母属、红冬孢酵母属、篮状菌属、接合酵母属、热曲霉属、梭孢壳属、毛孢子菌属、弯颈霉属、栓菌属和木霉属。真菌物种包括但不限于黑曲霉、米曲霉、烟曲霉、产黄青霉、桔青霉、顶头孢霉、里氏木霉、埃默森篮状菌(以前称为Talaromyces emersonii)、酱油曲霉、拉克淖金孢子菌、嗜热毁丝霉。
在一些实施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)，诸如藤仓赤霉、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、地霉、黑曲霉、解脂耶氏酵母、棉阿舒囊霉、嗜土粉状毕赤酵母、克鲁维拉钱斯酵母(Lachancea kluyveri)、奥默柯达酵母(Kodamaea ohmeri)或酿酒酵母。
伞菌属、赤霉属和原毛平革菌属
伞菌属、赤霉属和原毛平革菌属可能有用，因为已知它们在培养物中产生大量的类异戊二烯。因此，已经通过内源基因产生了用于产生大量甜菊醇糖苷的萜烯前体。因此，可以将包含甜菊醇糖苷生物合成多肽的重组基因的模块引入到来自此类属的物种中，而不必需引入甲羟戊酸或MEP途径基因。
解腺嘌呤阿氏酵母(食腺嘌呤节孢酵母(Blastobotrvs adeninivorans))
解腺嘌呤阿氏酵母是具有特殊生物化学特征的二态酵母(它如同出芽酵母(如面包酵母)在高达42℃的温度下生长，在超过此阈值时它以丝状形式生长)。它可以在广泛范围的底物上生长并且可以吸收硝酸盐。它已成功应用于产生可以产生天然塑料的菌株或者开发针对环境样品中的雌激素的生物传感器。
红酵母属物种
红酵母属是单细胞的有色酵母。油性红色酵母粘红酵母已经显示出由粗甘油产生脂质和类胡萝卜素(Saenge等，2011，Process Biochemistry 46(1)：210-8)。圆红酵母菌株已经被证明是用于提高生物质和脂质生产率的有效分批补料发酵系统(Li等，2007，Enzymeand Microbial Technology 41：312-7)。
裂殖酵母属物种
裂殖酵母属是分裂酵母的一个属。与酿酒酵母类似，裂殖酵母属是真核细胞生物学研究中的模型生物体。它提供了与酿酒酵母的进化远距离比较。物种包括但不限于嗜冷裂殖酵母(S.cryophilius)和粟酒裂殖酵母(S.pombe)。(参见Hoffman等，2015，Genetics.201(2)：403-23)。
腐质霉属物种
腐质霉属是丝状真菌的一个属。物种包括但不限于H.alopallonella和暹罗腐质霉(H.siamensis)。
酒香酵母属物种
酒香酵母属是非孢子形成酵母属。它来自酵母科(Saccharomycetaceae)并且通常用于酿造和制酒产业。酒香酵母属产生若干种有助于酒、具体来说红酒的复杂性的感官化合物。酒香酵母属物种包括但不限于布鲁塞尔酒香酵母(B.bruxellensis)和克劳森酒香酵母(B.claussenii)。参见例如Fugelsang等，1997，Wine Microbiology。
毛孢子菌属物种
毛孢子菌属是真菌科的一个属。毛孢子菌属物种是通常从土壤分离的酵母，但也可能见于人和动物的皮肤微生物群中。物种包括例如但不限于水生毛孢子菌(T.aquatile)、白吉利毛孢子菌(T.beigelii)和真皮毛孢子菌(T.dermatis)。
德巴利酵母属物种
德巴利酵母属是子囊菌酵母科的一个属，该属中的物种的特征为耐盐海生物种。物种包括但不限于汉逊德巴利酵母(D.hansenii)和汉森德巴利酵母(D.hansenius)。
小立碗藓属物种
小立碗藓(Physcomitrella mosses)当在悬浮培养物中生长时具有类似于酵母或其他真菌培养物的特征。这个属可以用于产生植物次要代谢物，所述代谢物可能难以在其他类型的细胞中产生。
酵母属物种
酵母属是合成生物学中广泛使用的基础生物体，并且可以用作重组微生物平台。举例来说，存在可用于酿酒酵母的突变体库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以提高产物产率。已知用于制造重组微生物的方法。酵母属物种的实例包括卡斯泰利酵母(S.castellii)，也称为卡斯泰利诺莫夫酵母(Naumovozymacastelli)。
接合酵母属物种
接合酵母属是酵母的一个属。它最初被分类在酵母属下，此后被重新分类。它在食品产业中广为人知，因为若干物种对商业上使用的食品防腐技术具有极强的抗性。物种包括但不限于二孢接合酵母(Z.bisporus)和苹果酒接合酵母(Z.cidri)。(参见Barnett等，Yeasts：Characteristics and Identification，1983)。
地霉属物种
地霉属是通常见于全世界的土壤、水和污水中的真菌。它通常在植物、谷物和乳制品中被鉴定出来。物种包括但不限于例如白地霉(G.candidum)和克氏地霉(G.klebahnii)(参见Carmichael等，Mycologica，1957，49(6)：820-830)。
哈萨克斯坦酵母属物种
哈萨克斯坦酵母属是糖酵母科中的一个酵母属。
有孢圆酵母属物种
有孢圆酵母属是酵母的一个属，并且物种包括但不限于弗朗西斯有孢圆酵母和球形有孢圆酵母。
曲霉属物种
曲霉属物种诸如米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉是食品生产中广泛使用的微生物，而且还可以用作重组微生物平台。核苷酸序列可用于构巢曲霉(A.nidulans)、烟曲霉、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黄曲霉(A.flavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)的基因组中，从而允许合理设计和修饰内源途径，以提高通量并增加产物产量。已经开发用于曲霉属的代谢模型以及转录组学研究和蛋白质组学研究。培养黑曲霉以用于许多食品成分诸如柠檬酸和葡糖酸的工业生产，并且因此诸如黑曲霉等物种通常适用于生产甜菊醇糖苷。
解脂耶氏酵母
解脂耶氏酵母为二态酵母(参见解腺嘌呤阿氏酵母)并且属于半子囊菌科(Hemiascomycetes)。解脂耶氏酵母的整个基因组都是已知的。耶氏酵母属物种是需氧的并且被认为是非病原性的。耶氏酵母属在使用疏水性底物(例如，烷烃、脂肪酸和油)方面有效并且可以在糖上生长。它具有用于工业应用的高可能性并且是油性微生物。解脂耶氏酵母可以累积脂质含量至其细胞干重的大约40％并且是脂质累积和再活化的模型生物体。参见例如Nicaud，2012，Yeast 29(10)：409-18；Beopoulos等，2009，Biochimie91(6)：692-6；Bankar等，2009，Appl Microbiol Biotechnol.84(5)：847-65。
圆红冬孢酵母
圆红冬孢酵母是油性酵母并且可用于对脂质产生途径进行工程化(参见例如Zhu等，2013，Nature Commun.3：1112；Ageitos等，2011，Applied Microbiology andBiotechnology 90(4)：1219-27)。
博伊丁假丝酵母
博伊丁假丝酵母是甲基营养性酵母(它可以在甲醇上生长)。像其他甲基营养性物种诸如多形汉逊酵母和巴斯德毕赤酵母一样，它提供了生产异源蛋白的优良平台。已经报告了分泌外来蛋白质的产量在多克范围内。计算方法IPRO最近预测了通过实验使博伊丁假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH转向NADH的突变。参见例如Mattanovich等，2012，Methods Mol Biol.824：329-58；Khoury等，2009，Protein Sci.18(10)：2125-38。
多形汉逊酵母(安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))
多形汉逊酵母是甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母)。它还可以在广泛范围的其他底物上生长；它耐热并且可以吸收硝酸盐(还参见乳酸克鲁维酵母)。它已应用于产生B型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗C型肝炎的干扰素α-2a，另外还应用于多种技术性酶。参见例如Xu等，2014，Virol Sin.29(6)：403-9。
克鲁斯假丝酵母(东方伊萨酵母)
克鲁斯假丝酵母(学名东方伊萨酵母)被广泛用于巧克力生产中。使用克鲁斯假丝酵母去除可可豆的苦味并且分解可可豆。这个物种除了参与巧克力生产以外，克鲁斯假丝酵母通常还作为真菌医院病原体见于免疫受损人群中(参见Mastromarino等，NewMicrobiolgica，36：229-238；2013)
乳酸克鲁维酵母
乳酸克鲁维酵母是经常应用于生产开菲尔(kefir)的酵母。它可以在若干种糖上，最重要地在乳和乳清中存在的乳糖上生长。除其他以外，它已成功应用于生产凝乳酶(通常存在于牛胃中的酶)，以用于生产奶酪。以40,000L规模在发酵罐中进行生产。参见例如vanOoyen等，2006，FEMS Yeast Res.6(3)：381-92。
巴斯德毕赤酵母
巴斯德毕赤酵母是甲基营养性酵母(参见博伊丁假丝酵母和多形汉逊酵母)。它还常被称为Komagataella pastoris。它提供了用于生产外来蛋白质的有效平台。平台元件可呈试剂盒形式获得并且它在学术界广泛用于生产蛋白质。已经对菌株进行工程化，从而可以产生复杂的人类N-聚糖(酵母聚糖与在人类中发现的那些聚糖类似但并不相同)。参见例如Piirainen等，2014，N Biotechnol.31(6)：532-7。
树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)
树干毕赤酵母还被称为Pichia stipitis，它是以单倍体形式存在的同宗配合酵母。通常由于其由替代呼吸系统引起的增强的呼吸容量而代替酿酒酵母使用。(参见Papini等，Microbial Cell Factories，11：136(2012))。
在一些实施方案中，微生物可以是昆虫细胞，诸如果蝇属(Drosophilia)，具体来说，黑腹果蝇(Drosophilia melanogaster)。
在一些实施方案中，微生物可以是藻类细胞，诸如像但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻属。
在一些实施方案中，微生物可以是蓝细菌细胞，诸如像但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻属、裙带菜、马尾藻属、海带和阿尔默瑞栅藻。
在一些实施方案中，微生物可以是细菌细胞。细菌的实例包括但不限于芽孢杆菌属(例如，纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、潘蒂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、短小芽孢杆菌)、不动杆菌属、诺卡氏菌属、黄色杆菌属、埃希氏菌属(例如大肠杆菌)、链霉菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌)。细菌细胞还可以包括但不限于光合细菌(例如，绿色非硫细菌(例如，绿弯菌属细菌(例如，橙色绿弯菌)、绿线菌属(例如，巨大绿线菌)、绿色硫细菌(例如，绿菌属细菌(例如，泥生绿菌)、暗网菌属(例如，微黄暗网菌)、紫色硫细菌(例如，着色菌属(例如，奥氏着色菌))和紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(例如，深红红螺菌)、红细菌属(例如，球形红细菌、荚膜红细菌)和红微菌属细菌(例如，万尼氏红微菌))。
大肠杆菌
大肠杆菌是合成生物学中广泛使用的平台生物体，还可以用作重组微生物平台。与酵母属类似，存在可用于大肠杆菌的突变体库、质粒、详细计算机代谢模型和其他信息，从而允许合理设计各种模块以提高产物产率。可以使用与上文针对酵母属描述的那些方法类似的方法来制造重组大肠杆菌微生物。
可以理解，本文公开的重组宿主细胞可以包括：植物细胞，包括在植物中生长的植物细胞；哺乳动物细胞；昆虫细胞；来自曲霉属的真菌细胞；来自以下各属的酵母细胞：酵母属(例如，酿酒酵母、贝酵母、巴斯德酵母和卡尔斯伯酵母)；裂殖酵母属(例如，粟酒裂殖酵母)、耶氏酵母属(例如，解脂耶氏酵母)、假丝酵母属(例如，光滑假丝酵母、白色假丝酵母、克鲁斯假丝酵母、拉可夫氏假丝酵母、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母和博伊丁假丝酵母)、阿舒囊霉属(例如，棉安舒囊霉)、拟威尔酵母属(例如，贾丁拟威尔酵母)、毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母和库德毕赤酵母)、克鲁维酵母属(例如，乳酸克鲁维酵母)、汉逊酵母属(例如，多形汉逊酵母)、阿氏酵母属(例如，解腺嘌呤阿氏酵母)、法夫酵母属(例如，红法夫酵母)、伊萨酵母属(例如，东方伊萨酵母)、有孢圆酵母属(例如，弗朗西斯有孢圆酵和球形有孢圆酵母)、地霉属(例如，白地霉和克氏地霉)、接合酵母属(例如，二孢接合酵母和苹果酒接合酵母)、粉状毕赤酵母属(例如，嗜土粉状毕赤酵母)、拉钱斯酵母属(例如，克鲁维拉钱斯酵母)、柯达酵母属(例如，奥默柯达酵母)、酒香酵母属(例如，异酒香酵母)、毛孢子菌属(例如，水生毛孢子菌、白吉利毛孢子菌和真皮毛孢子菌)、德巴利酵母属(例如，汉森德巴利酵母和汉逊德巴利酵母)、毕赤酵母属(例如，树干毕赤酵母)、红冬孢酵母属(例如，圆红冬孢酵母)、管囊酵母属(例如，嗜鞣管囊酵母)和小立碗藓属、红酵母属、哈萨克斯坦酵母属、赤霉属、伞菌属和原毛平革菌属；昆虫细胞，包括但不限于黑腹果蝇；藻类细胞，包括但不限于三孢布拉霉、盐生杜氏藻、雨生红球藻、小球藻属、裙带菜、马尾藻、海带和阿尔默瑞栅藻物种；或来自以下各属的细菌细胞：芽孢杆菌属(例如，纳豆芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、潘蒂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌和短小芽孢杆菌)、不动杆菌属、诺卡氏菌属、黄色杆菌属、埃希氏菌属(例如，大肠杆菌)、链霉菌属、欧文氏菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属(例如，粘质沙雷氏菌)、假单胞菌属(例如，铜绿假单胞菌)、沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌和伤寒沙门氏菌)，并且还包括绿弯菌属细菌(例如，橙色绿弯菌)、绿线菌属(例如，巨大绿线菌)、绿色硫细菌(例如，绿菌属细菌(例如，泥生绿菌)、暗网菌属(例如，微黄暗网菌))、紫色硫细菌(例如，着色菌属(例如，奥氏着色菌))和紫色非硫细菌(例如，红螺菌属(例如，深红红螺菌)、红细菌属(例如，球形红细菌和荚膜红细菌)和红微菌属细菌(例如，万尼氏红微菌)。
甜菊醇糖苷组合物
甜菊醇糖苷在不同的食物系统中未必具有等效的性能。因此希望能够引导所选甜菊醇糖苷组合物的合成。本文描述的重组宿主可以产生选择性地富含特定甜菊醇糖苷(例如，RebD或RebM)并且具有一致味道特性的组合物。如本文所使用，术语“富含”用于描述特定甜菊醇糖苷的比例与来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物(提取物)相比有所增高的甜菊醇糖苷组合物。因此，本文描述的重组宿主可以促进产生为了满足指定食物产品所期望的甜味特性而定制并且每一种甜菊醇糖苷的比例在批次与批次间一致的组合物。在一些实施方案中，本文描述的宿主不产生或产生减少量的甜叶菊提取物中存在的不希望的植物副产物。因此，通过本文描述的重组宿主产生的甜菊醇糖苷组合物可区别于来源于甜叶菊植物的组合物。
所积累的个别甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的量可以是约1至约7,000mg/L，例如，约1至约10mg/L、约3至约10mg/L、约5至约20mg/L、约10至约50mg/L、约10至约100mg/L、约25至约500mg/L、约100至约1,500mg/L或约200至约1,000mg/L、至少1,000mg/L、至少1,200mg/L、至少至少1,400mg/L、至少1,600mg/L、至少1,800mg/L、至少2,800mg/L或至少7,000mg/L。在一些方面，个别甜菊醇糖苷的量可以超过7,000mg/L。所积累的甜菊醇糖苷(例如，RebA、RebB、RebD或RebM)的组合的量可以是约1mg/L至约7,000mg/L，例如约200至约1,500、至少2,000mg/L、至少3,000mg/L、至少4,000mg/L、至少5,000mg/L、至少6,000mg/L或至少7,000mg/L。在一些方面，甜菊醇糖苷的组合的量可以超过7,000mg/L。总体上，培养时间越长将导致产物的量越大。因此，可以将重组微生物培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天或约5天。
由重组宿主积累的化合物量可以报告为“通量”。举例来说，“总通量”可以计算为测得的RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、二糖基化甜菊醇、三糖基化甜菊醇、四糖基化甜菊醇、五糖基化甜菊醇、六糖基化甜菊醇、七糖基化甜菊醇、椰油醇、对映-贝壳杉烯酸、糖基化对映-贝壳杉烯酸、糖基化对映-贝壳杉烯醇、对映-贝壳杉烯醛、香叶基香叶醇、对映-贝壳杉烯醛和对映-贝壳杉烯水平的总和(呈g/L RebD当量形式)。单独的化合物(诸如单独的甜菊醇糖苷)或化合物组(诸如甜菊醇糖苷组)可以报告为总通量的分数。举例来说，“甜菊醇糖苷/通量”可以计算为((“总通量”-(香叶基香叶醇+椰油醇+对映-贝壳杉烯+糖基化对映-贝壳杉烯醇+对映-贝壳杉烯醇+对映-贝壳杉烯醛+对映-贝壳杉烯酸+糖基化对映-贝壳杉烯酸)/“总通量”)。
应当理解，本文讨论的各种基因和模块可以存在于两个或更多个重组微生物中，而不是单个微生物中。当使用多个重组微生物时，可以使它们在混合培养物中生长以产生甜菊醇和/或甜菊醇糖苷。举例来说，第一微生物可以包含一个或多个用于产生甜菊醇糖苷前体的生物合成基因，而第二微生物包含甜菊醇糖苷生物合成基因。然后回收由第二或最终微生物产生的产物。还应当理解，在一些实施方案中，使用除培养基以外的营养源并利用除发酵罐以外的系统使重组微生物生长。
可选地，可以使两个或更多个微生物各自在单独的培养基中生长，并且可以将第一培养基的产物(例如甜菊醇)引入第二培养基中以转化为随后的中间物，或者最终产物，诸如RebA。然后回收由第二或最终微生物产生的产物。还应当理解，在一些实施方案中，使用除培养基以外的营养源并利用除发酵罐以外的系统使重组微生物生长。
通过本文公开的方法获得的甜菊醇糖苷和组合物可以用于制作食物产品、膳食补充剂和甜味剂组合物。参见例如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO2014/122328。
举例来说，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷诸如RebM或RebD可以包括在诸如冰淇淋、碳酸饮料、果汁、酸乳、烘焙食品、口香糖、硬糖和软糖以及调味汁等食物产品中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷还可以包括在诸如药物产品、医用产品、膳食补充剂和营养补充剂等非食物产品中。基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷还可以包括在用于农业产业和伴侣动物产业的动物饲料产品中。可选地，可以通过单独培养多个重组微生物(各自产生特定的甜菊醇糖苷)、从每一个微生物回收呈基本上纯的形式的甜菊醇或甜菊醇糖苷，然后将所述化合物合并以获得包含所期望的比例的每一种化合物的混合物来制造甜菊醇和/或甜菊醇糖苷的混合物。本文描述的重组微生物允许获得与目前的甜叶菊产物相比更加精确和一致的混合物。
在另一个替代方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷可以连同其他甜味剂(例如，糖精、右旋糖、蔗糖、果糖、赤藓醇、阿斯巴甜、三氯蔗糖、莫那甜或丁磺氨钾)一起并入食物产品中。甜菊醇或甜菊醇糖苷相对于其他甜味剂的重量比可以根据需要来改变，以实现最终食物产品中令人满意的味道。参见例如U.S.2007/0128311。在一些实施方案中，甜菊醇或甜菊醇糖苷可以作为风味调节剂提供风味(例如，柑橘类)。
由本文描述的重组微生物产生的组合物可以并入食物产品中。举例来说，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以根据甜菊醇糖苷和食物产品的类型以干重计以约20mg甜菊醇糖苷/kg食物产品至约1800mg甜菊醇糖苷/kg食物产品范围内的量并入食物产品中。举例来说，由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入甜品、冷甜食(例如，冰淇淋)、乳制品(例如，酸乳)或饮料(例如，碳酸饮料)中，使得食物产品以干重计具有500mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入烘焙食品(例如，饼干)中，使得食物产品以干重计具有300mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入调味汁(例如，巧克力酱)或蔬菜产品(例如，泡菜)中，使得食物产品以干重计具有1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入面包中，使得食物产品以干重计具有160mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入硬糖果或软糖果中，使得食物产品以干重计具有1600mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。由重组微生物、植物或植物细胞产生的甜菊醇糖苷组合物可以并入经过加工的水果产品(例如，果汁、水果馅、果酱和果胶)中，使得食物产品以干重计具有1000mg甜菊醇糖苷/kg食物的最大值。在一些实施方案中，本文产生的甜菊醇糖苷组合物是药物组合物的组分。参见例如SteviolGlycosides Chemical and Technical Assessment 69th JECFA，2007，由Harriet Wallin编制，Food Agric.Org.；EFSA Panel on Food Additives and Nutrient Sources addedto Food(ANS)，“Scientific Opinion on the safety of steviol glycosides for theproposed uses as a food additive，”2010，EFSA Journal8(4)：1537；美国食品药品监督管理局GRAS公告323；美国食品药品监督管理局GRAS公告329；WO 2011/037959；WO 2010/146463；WO 2011/046423；及WO 2011/056834。
举例来说，此类甜菊醇糖苷组合物可以具有90-99重量％RebA和不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物，并且以干重计以25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg并入食物产品中。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebB的富含RebB的组合物并且并入食物产品中，使得产品中RebB的量为以干重计25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。典型地，富含RebB的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebD的富含RebD的组合物并且并入食物产品中，使得产品中RebD的量为以干重计25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。典型地，富含RebD的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebE的富含RebE的组合物并且并入食物产品中，使得产品中RebE的量为以干重计25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。典型地，富含RebE的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。
此类甜菊醇糖苷组合物可以是具有大于3重量％RebM的富含RebM的组合物并且并入食物产品中，使得产品中RebM的量为以干重计25-1600mg/kg，例如100-500mg/kg、25-100mg/kg、250-1000mg/kg、50-500mg/kg或500-1000mg/kg。典型地，富含RebM的组合物具有不可检测量的甜叶菊植物来源的污染物。
在一些实施方案中，基本上纯的甜菊醇或甜菊醇糖苷并入餐桌用甜味剂或“杯对杯(cup-for-cup)”产品中。此类产品典型地使用本领域技术人员已知的一种或多种增量剂(例如，麦芽糖糊精)稀释至适当的甜味水平。富含RebA、RebB、RebD、RebE或RebM的甜菊醇糖苷组合物可以例如以干重计以10,000至30,000mg甜菊醇糖苷/kg产品包装在小囊中以供餐桌使用。在一些实施方案中，在体外、在体内或通过全细胞生物转化来产生甜菊醇糖苷。
本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码：能够使糖原脱支的多肽或其催化活性部分，其包括与以SEQ ID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或其催化活性部分；或者能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽或其催化活性部分，其包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽或其催化活性部分。
在本文公开的分离的核酸的一个方面，所述核酸是cDNA。
本发明还提供了一种能够使糖原脱支的多肽或其催化活性部分，其包括与以SEQID NO：157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或其催化活性部分；或者能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽或其催化活性部分，其包括与以SEQ ID NO：159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽或其催化活性部分。
在本文公开的多肽或其催化活性部分的一个方面，所述多肽或其催化活性部分是经过纯化的多肽或其催化活性部分。
将在以下实施例中进一步描述本发明，所述实施例不限制权利要求书中所述的本发明范围。
实施例
以下实施例说明了本发明的具体实施方案以及其各种用途。它们仅出于解释性目的示出并且不应理解为限制本发明。
实施例1：菌株工程化
如WO 2011/153378、WO 2013/022989、WO 2014/122227和WO 2014/122328中所描述来构建产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株，各专利以引用的方式整体并入。举例来说，对包含并表达编码YNK1多肽的天然基因(SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123)、编码PGM1多肽的天然基因(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)、编码PGM2多肽的天然基因(SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119)、编码UGP1多肽的天然基因(SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121)、编码GDB1多肽的天然基因(SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157)、编码GPH1多肽的天然基因(SEQ ID NO：158、SEQ IDNO：159)、编码GGPPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20)、编码截短CDPS多肽的重组基因(SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40)、编码KS多肽的重组基因(SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：52)、编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60)、编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64)、编码ATR2多肽的重组基因(SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92)、编码KAHe1多肽的重组基因(SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94)、编码CPR8多肽的重组基因(SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86)、编码CPR1多肽的重组基因(SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78)、编码UGT76G1多肽的重组基因(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9)、编码UGT85C2多肽的重组基因(SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7)、编码UGT74G1多肽的重组基因(SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4)、编码UGT91d2e-b多肽的重组基因(SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13)、编码EUGT11多肽的重组基因(SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16)、编码KAH多肽的重组基因(SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97)、编码KO多肽的重组基因(SEQ ID NO：117、SEQ IDNO：64)和编码YNK1多肽的基因的额外拷贝(SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123)、编码PGM1多肽的基因(SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2)、编码PGM2多肽的基因(SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119)、编码UGP1多肽的基因(SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121)和编码ERC1转运多肽(即，属于MATE家族)的基因(SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161)的酵母菌株进行工程化以积累甜菊醇糖苷。
实施例2：GDB1和GPH1的过度表达
将如实施例1中描述的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株用包含可操作地连接至TPI1启动子(SEQ ID NO：152)和ADH1终止子(SEQ ID NO：155)的编码GDB1多肽的基因(SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157)以及可操作地连接至pPDC1启动子(SEQ ID NO：153)和tCYC1终止子(SEQ ID NO：154)的编码GPH1多肽的基因(SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159)的额外拷贝的载体进行转化。
在30℃下，在2L发酵罐中，有氧地进行利用转化的酿酒酵母菌株和对照酿酒酵母菌株(如实施例1中描述的产甜菊醇糖苷酿酒酵母菌株)的培养物的分批补料发酵，其中在包含葡萄糖、硫酸铵、微量金属、维生素、盐和缓冲液的基本培养基中历经约16小时的生长期，然后在含葡萄糖的确定成分补料培养基中历经约100小时的补料期。维持接近6.0的pH和葡萄糖限制条件。进行全培养物样品(没有去除细胞)的提取，并且通过LC-UV分析提取物以测定甜菊醇糖苷的水平。
利用包括可变波长检测器(VWD)、恒温柱室(TCC)、自动取样器、自动取样器冷却单元和二元泵的Agilent 1290仪器，使用SB-C18快速分辨高清晰度(RRHD)2.1mm×300mm、1.8μM分析柱(串联的两个150mm柱；柱温为65℃)进行LC-UV。通过逆相C18柱分离甜菊醇糖苷，然后通过210mm处的UV吸光度进行检测。通过比较每一种分析物的峰面积与RebA的标准值并且对不同摩尔吸收率的物质应用校正因子来进行甜菊醇糖苷的定量。对于LC-UV，对0.5mL培养物进行快速离心，去除上清液，并计算团块的湿重。利用团块湿重对LC-UV结果进行正规化。基于计算为测量的RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、二糖基化甜菊醇、三糖基化甜菊醇、四糖基化甜菊醇、五糖基化甜菊醇、六糖基化甜菊醇和七糖基化甜菊醇的总和(呈g/L RebD当量形式)的甜菊醇糖苷测量水平来计算分批补料发酵的总甜菊醇糖苷值。总通量计算为测量的RebA、RebB、RebD、RebE、RebM、13-SMG、甜茶苷、甜菊醇-1，2-二糖苷、二糖基化甜菊醇、三糖基化甜菊醇、四糖基化甜菊醇、五糖基化甜菊醇、六糖基化甜菊醇、七糖基化甜菊醇、椰油醇、对映-贝壳杉烯酸、糖基化对映-贝壳杉烯酸、糖基化对映-贝壳杉烯醇、对映-贝壳杉烯醛、香叶基香叶醇、对映-贝壳杉烯醛和对映-贝壳杉烯水平的总和(呈g/L RebD当量形式)。结果示出在表1中。
表1：转化的酿酒酵母菌株和酿酒酵母对照菌株的甜菊醇糖苷积累.
Figure BPA0000288615750001091
终点发酵效价(120小时)g/L呈RebD当量形式
如下计算甜菊醇糖苷产量变化百分比(增高％或降低％)。从由过度表达GPH1和GDB1的实验菌株产生的特定甜菊醇糖苷的量(g/L)减去由对照菌株产生的特定甜菊醇糖苷(例如RebM)的量(g/L)。然后将该结果值除以由对照菌株产生的特定甜菊醇糖苷的量(g/L)并乘以100。使用此方程式时正数表示由过度表达GPH1和GDB1的菌株产生的特定甜菊醇糖苷的增高百分比(g/L)，而使用此方程式时负数表示由过度表达GPH1和GDB1的菌株产生的特定甜菊醇糖苷(例如13-SMG)的降低百分比(g/L)。
GPH1和GDB1的过度表达引起与对照菌株相比13-SMG积累降低29％，并且RebA、RebD和RebM积累分别增高8％、29％和12％。RebD+RebM积累也增高了14％。此外，过度表达GPH1和GDB1基因的菌株积累的总通量与对照菌株相比增高了14％。积累的甜菊醇糖苷的总量的变化可忽略不计。总体来说，不受理论束缚，总甜菊醇糖苷积累缺乏显著变化和13-SMG积累降低表明，产甜菊糖苷重组宿主中GPH1和GDB1的过度表达增高了糖基化途径向更高分子量甜菊醇糖苷(例如RebD和RebM)的通量，从而改变了生产特性，而不是简单地增高甜菊醇糖苷产量。
已经通过参考本发明的具体实施方案详细地描述了本发明，应当显而易知，有可能在不脱离所附权利要求书限定的本发明范围的情况下进行修改和变化。更具体来说，尽管本文认定本发明的一些方面特别有利，但预期本发明未必限于本发明的这些特定方面。
表3.本文公开的序列.
SEQ ID NO：1
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001111
SEQ ID NO：2
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001112
SEQ ID NO：3
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001113
Figure BPA0000288615750001121
SEQ ID NO：4
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001122
SEQ ID NO：5
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001123
Figure BPA0000288615750001131
SEQ ID NO：6
人工序列
Figure BPA0000288615750001132
SEQ ID NO：7
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001133
SEQ ID NO：8
人工序列
Figure BPA0000288615750001141
SEQ ID NO：9
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001142
SEQ ID NO：10
人工序列
Figure BPA0000288615750001151
SEQ ID NO：11
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001152
SEQ ID NO：12
人工序列
Figure BPA0000288615750001161
SEQ ID NO：13
人工序列
Figure BPA0000288615750001162
SEQ ID NO：14
水稻(O.sativa)
Figure BPA0000288615750001163
Figure BPA0000288615750001171
SEQ ID NO：15
人工序列
Figure BPA0000288615750001172
SEQ ID NO：16
水稻
Figure BPA0000288615750001173
SEQ ID NO：17
人工序列
Figure BPA0000288615750001181
SEQ ID NO：18
人工序列
Figure BPA0000288615750001182
SEQ ID NO：19
人工序列
Figure BPA0000288615750001183
SEQ ID NO：20
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001191
SEQ ID NO：21
人工序列
Figure BPA0000288615750001192
SEQ ID NO：22
藤仓赤霉
Figure BPA0000288615750001193
SEQ ID NO：23
人工序列
Figure BPA0000288615750001201
SEQ ID NO：24
小鼠(M.musculus)
Figure BPA0000288615750001202
SEQ ID NO：25
人工序列
Figure BPA0000288615750001203
SEQ ID NO：26
假微型海链藻(T.pseudonana)
Figure BPA0000288615750001211
SEQ ID NO：27
人工序列
Figure BPA0000288615750001212
SEQ ID NO：28
棒状链霉菌(S.clavuligerus)
Figure BPA0000288615750001213
SEQ ID NO：29
人工序列
Figure BPA0000288615750001221
SEQ ID NO：30
嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)
Figure BPA0000288615750001222
SEQ ID NO：31
人工序列
Figure BPA0000288615750001223
SEQ ID NO：32
聚球藻属(Synechococcus sp.)
Figure BPA0000288615750001224
SEQ ID NO：33
人工序列
Figure BPA0000288615750001231
SEQ ID NO：34
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001232
SEQ ID NO：35
人工序列
Figure BPA0000288615750001241
SEQ ID NO：36
棒状链霉菌
Figure BPA0000288615750001242
SEQ ID NO：37
人工序列
Figure BPA0000288615750001251
SEQ ID NO：38
大豆慢生根瘤菌(B.japonicum)
Figure BPA0000288615750001252
SEQ ID NO：39
人工序列
Figure BPA0000288615750001261
SEQ ID NO：40
玉米(Z.mays)
Figure BPA0000288615750001262
SEQ ID NO：41
人工序列
Figure BPA0000288615750001271
SEQ ID NO：42
拟南芥(A.thaliana)
Figure BPA0000288615750001281
SEQ ID NO：43
人工序列
Figure BPA0000288615750001282
SEQ ID NO：44
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001291
SEQ ID NO：45
人工序列
Figure BPA0000288615750001292
SEQ ID NO：46
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001301
SEQ ID NO：47
人工序列
Figure BPA0000288615750001302
SEQ ID NO：48
玉米
Figure BPA0000288615750001311
SEQ ID NO：49
人工序列
Figure BPA0000288615750001312
SEQ ID NO：50
毛果杨(P.trichocarpa)
Figure BPA0000288615750001321
SEQ ID NO：51
人工序列
Figure BPA0000288615750001322
SEQ ID NO：52
拟南芥
Figure BPA0000288615750001331
SEQ ID NO：53
人工序列
Figure BPA0000288615750001332
Figure BPA0000288615750001341
SEQ ID NO：54
拟茎点霉(P.amygdali)
Figure BPA0000288615750001342
SEQ ID NO：55
人工序列
Figure BPA0000288615750001343
Figure BPA0000288615750001351
SEQ ID NO：56
小立碗藓
Figure BPA0000288615750001352
SEQ ID NO：57
人工序列
Figure BPA0000288615750001361
SEQ ID NO：58
藤仓赤霉
Figure BPA0000288615750001371
SEQ ID NO：59
人工序列
Figure BPA0000288615750001372
SEQ ID NO：60
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001373
Figure BPA0000288615750001381
SEQ ID NO：61
人工序列
Figure BPA0000288615750001382
SEQ ID NO：62
莴苣(L.sativa)
Figure BPA0000288615750001383
SEQ ID NO：63
甜茶
Figure BPA0000288615750001391
SEQ ID NO：64
人工序列
Figure BPA0000288615750001392
SEQ ID NO：65
人工序列
Figure BPA0000288615750001401
SEQ ID NO：66
板栗(C.mollissima)
Figure BPA0000288615750001402
SEQ ID NO：67
人工序列
Figure BPA0000288615750001411
SEQ ID NO：68
小盐芥(T.halophila)
Figure BPA0000288615750001412
SEQ ID NO：69
人工序列
Figure BPA0000288615750001421
SEQ ID NO：70
葡萄(V.vinifera)
Figure BPA0000288615750001422
SEQ ID NO：71
人工序列
Figure BPA0000288615750001431
SEQ ID NO：72
藤仓赤霉
Figure BPA0000288615750001432
SEQ ID NO：73
人工序列
Figure BPA0000288615750001433
Figure BPA0000288615750001441
SEQ ID NO：74
云芝(T.versicolor)
Figure BPA0000288615750001442
SEQ ID NO：75
人工序列
Figure BPA0000288615750001443
Figure BPA0000288615750001451
SEQ ID NO：76
拟南芥
Figure BPA0000288615750001452
SEQ ID NO：77
人工序列
Figure BPA0000288615750001453
SEQ ID NO：78
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001461
SEQ ID NO：79
罗汉果(S.grosvenorii)
Figure BPA0000288615750001462
SEQ ID NO：80
罗汉果
Figure BPA0000288615750001471
SEQ ID NO：81
人工序列
Figure BPA0000288615750001472
SEQ ID NO：82
藤仓赤霉
Figure BPA0000288615750001481
SEQ ID NO：83
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001482
SEQ ID NO：84
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001491
SEQ ID NO：85
人工序列
Figure BPA0000288615750001492
SEQ ID NO：86
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001501
SEQ ID NO：87
人工序列
Figure BPA0000288615750001502
SEQ ID NO：88
甜茶
Figure BPA0000288615750001511
SEQ ID NO：89
人工序列
Figure BPA0000288615750001512
SEQ ID NO：90
拟南芥
Figure BPA0000288615750001521
SEQ ID NO：91
人工序列
Figure BPA0000288615750001522
SEQ ID NO：92
拟南芥
Figure BPA0000288615750001531
SEQ ID NO：93
人工序列
Figure BPA0000288615750001532
SEQ ID NO：94
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001533
SEQ ID NO：95
甜茶
Figure BPA0000288615750001541
SEQ ID NO：96
人工序列
Figure BPA0000288615750001551
SEQ ID NO：97
甜茶
Figure BPA0000288615750001552
SEQ ID NO：98
欧洲甜樱桃(P.avium)
Figure BPA0000288615750001561
SEQ ID NO：99
人工序列
Figure BPA0000288615750001562
SEQ ID NO：100
欧洲甜樱桃
Figure BPA0000288615750001571
SEQ ID NO：101
梅(P.mume)
Figure BPA0000288615750001572
SEQ ID NO：102
梅
Figure BPA0000288615750001573
SEQ ID NO：103
梅
Figure BPA0000288615750001574
SEQ ID NO：104
桃(P.persica)
Figure BPA0000288615750001581
SEQ ID NO：105
人工序列
Figure BPA0000288615750001582
SEQ ID NO：106
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001591
SEQ ID NO：107
人工序列
Figure BPA0000288615750001592
SEQ ID NO：108
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001593
SEQ ID NO：109
人工序列
Figure BPA0000288615750001601
SEQ ID NO：110
拟南芥
Figure BPA0000288615750001602
SEQ ID NO：111
人工序列
Figure BPA0000288615750001611
SEQ ID NO：112
葡萄
Figure BPA0000288615750001612
SEQ ID NO：113
人工序列
Figure BPA0000288615750001621
SEQ ID NO：114
苜蓿(M.truncatula)
Figure BPA0000288615750001622
SEQ ID NO：115
人工序列
Figure BPA0000288615750001623
Figure BPA0000288615750001631
SEQ ID NO：116
拟南芥
Figure BPA0000288615750001632
SEQ ID NO：117
甜茶
Figure BPA0000288615750001633
SEQ ID NO：118
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001641
SEQ ID NO：119
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001642
SEQ ID NO：120
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001651
SEQ ID NO：121
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001652
SEQ ID NO：122
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001653
SEQ ID NO：123
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001661
SEQ ID NO：124
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001662
SEQ ID NO：125
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001663
SEQ ID NO：126
出芽短梗霉(A.pullulans)
Figure BPA0000288615750001671
SEQ ID NO：127
出芽短梗霉菌
Figure BPA0000288615750001672
SEQ ID NO：128
拟南芥
Figure BPA0000288615750001673
Figure BPA0000288615750001681
SEQ ID NO：129
拟南芥
Figure BPA0000288615750001682
SEQ ID NO：130
大肠杆菌
Figure BPA0000288615750001683
SEQ ID NO：131
大肠杆菌
Figure BPA0000288615750001684
SEQ ID NO：132
甜茶
Figure BPA0000288615750001691
SEQ ID NO：133
甜茶
Figure BPA0000288615750001692
SEQ ID NO：134
大麦
Figure BPA0000288615750001701
SEQ ID NO：135
大麦
Figure BPA0000288615750001702
SEQ ID NO：136
水稻
Figure BPA0000288615750001711
SEQ ID NO：137
水稻
Figure BPA0000288615750001712
SEQ ID NO：138
马铃薯
Figure BPA0000288615750001713
Figure BPA0000288615750001721
SEQ ID NO：139
马铃薯
Figure BPA0000288615750001722
SEQ ID NO：140
拟南芥
Figure BPA0000288615750001723
Figure BPA0000288615750001731
SEQ ID NO：141
拟南芥
Figure BPA0000288615750001732
SEQ ID NO：142
大肠杆菌
Figure BPA0000288615750001733
SEQ ID NO：143
大肠杆菌
Figure BPA0000288615750001741
SEQ ID NO：144
甜茶
Figure BPA0000288615750001742
SEQ ID NO：145
甜茶
Figure BPA0000288615750001751
SEQ ID NO：146
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001752
SEQ ID NO：147
灌木甜叶菊
Figure BPA0000288615750001753
SEQ ID NO：148
人工序列
Figure BPA0000288615750001761
SEQ ID NO：149
人工序列
Figure BPA0000288615750001762
SEQ ID NO：150
人工序列
Figure BPA0000288615750001763
SEQ ID NO：151
人工序列
Figure BPA0000288615750001771
SEQ ID NO：152
人工序列
Figure BPA0000288615750001772
SEQ ID NO：153
人工序列
Figure BPA0000288615750001773
SEQ ID NO：154
人工序列
Figure BPA0000288615750001774
SEQ ID NO：155
人工序列
Figure BPA0000288615750001781
SEQ ID NO：156
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001782
Figure BPA0000288615750001791
SEQ ID NO：157
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001801
SEQ ID NO：158
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001802
Figure BPA0000288615750001811
SEQ ID NO：159
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001812
SEQ ID NO：160
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001813
Figure BPA0000288615750001821
SEQ ID NO：161
酿酒酵母
Figure BPA0000288615750001822
Figure IPA0000288615690000011
Figure IPA0000288615690000021
Figure IPA0000288615690000031
Figure IPA0000288615690000041
Figure IPA0000288615690000051
Figure IPA0000288615690000061
Figure IPA0000288615690000071
Figure IPA0000288615690000081
Figure IPA0000288615690000091
Figure IPA0000288615690000101
Figure IPA0000288615690000111
Figure IPA0000288615690000121
Figure IPA0000288615690000131
Figure IPA0000288615690000141
Figure IPA0000288615690000151
Figure IPA0000288615690000161
Figure IPA0000288615690000171
Figure IPA0000288615690000181
Figure IPA0000288615690000191
Figure IPA0000288615690000201
Figure IPA0000288615690000211
Figure IPA0000288615690000221
Figure IPA0000288615690000231
Figure IPA0000288615690000241
Figure IPA0000288615690000251
Figure IPA0000288615690000261
Figure IPA0000288615690000271
Figure IPA0000288615690000281
Figure IPA0000288615690000291
Figure IPA0000288615690000301
Figure IPA0000288615690000311
Figure IPA0000288615690000321
Figure IPA0000288615690000331
Figure IPA0000288615690000341
Figure IPA0000288615690000351
Figure IPA0000288615690000361
Figure IPA0000288615690000371
Figure IPA0000288615690000381
Figure IPA0000288615690000391
Figure IPA0000288615690000401
Figure IPA0000288615690000411
Figure IPA0000288615690000421
Figure IPA0000288615690000431
Figure IPA0000288615690000441
Figure IPA0000288615690000451
Figure IPA0000288615690000461
Figure IPA0000288615690000471
Figure IPA0000288615690000481
Figure IPA0000288615690000491
Figure IPA0000288615690000501
Figure IPA0000288615690000511
Figure IPA0000288615690000521
Figure IPA0000288615690000531
Figure IPA0000288615690000541
Figure IPA0000288615690000551
Figure IPA0000288615690000561
Figure IPA0000288615690000571
Figure IPA0000288615690000581
Figure IPA0000288615690000591
Figure IPA0000288615690000601
Figure IPA0000288615690000611
Figure IPA0000288615690000621
Figure IPA0000288615690000631
Figure IPA0000288615690000641
Figure IPA0000288615690000651
Figure IPA0000288615690000661
Figure IPA0000288615690000671
Figure IPA0000288615690000681
Figure IPA0000288615690000691
Figure IPA0000288615690000701
Figure IPA0000288615690000711
Figure IPA0000288615690000721
Figure IPA0000288615690000731
Figure IPA0000288615690000741
Figure IPA0000288615690000751
Figure IPA0000288615690000761
Figure IPA0000288615690000771
Figure IPA0000288615690000781
Figure IPA0000288615690000791
Figure IPA0000288615690000801
Figure IPA0000288615690000811
Figure IPA0000288615690000821
Figure IPA0000288615690000831
Figure IPA0000288615690000841
Figure IPA0000288615690000851
Figure IPA0000288615690000861
Figure IPA0000288615690000871
Figure IPA0000288615690000881
Figure IPA0000288615690000891
Figure IPA0000288615690000901
Figure IPA0000288615690000911
Figure IPA0000288615690000921
Figure IPA0000288615690000931
Figure IPA0000288615690000941
Figure IPA0000288615690000951
Figure IPA0000288615690000961
Figure IPA0000288615690000971
Figure IPA0000288615690000981
Figure IPA0000288615690000991
Figure IPA0000288615690001001
Figure IPA0000288615690001011
Figure IPA0000288615690001021
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Claims (50)

1.一种能够在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)编码能够使糖原脱支的多肽的重组基因；和/或
(b)编码能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因。
2.如权利要求1所述的重组宿主细胞，其中所述能够使糖原脱支的多肽能够具有4-α-葡聚糖转移酶活性和α-1,6-淀粉葡萄糖苷酶活性。
3.如权利要求1或2所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞还包含：
(c)编码能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5'-三磷酸酯(UTP)的多肽的基因；
(d)编码能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的基因；和/或
(e)编码能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成尿苷二磷酸酯葡萄糖(UDP-葡萄糖)的多肽的基因。
4.如权利要求1至3中任一项所述的重组宿主细胞，其中：
(a)所述能够使糖原脱支的多肽包括与以SEQ ID NO:157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(b)所述能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO:159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(c)所述能够由UDP合成UTP的多肽包括与以SEQ ID NO:123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(d)所述能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO:2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽或者与以SEQ IDNO:141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；和/或
(e)所述能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽包括与以SEQ ID NO:121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽、与以SEQ ID NO:125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽，或者与以SEQ ID NO:131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞还包含：
(a)编码能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽的基因；
(b)编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β1,3糖基化的多肽的基因；
(c)编码能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽的基因；
(d)编码能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β1,2糖基化的多肽的基因；
(e)编码能够由法尼基二磷酸酯(FPP)和异戊烯基二磷酸酯(IPP)合成香叶基香叶基焦磷酸酯(GGPP)的多肽的基因；
(f)编码能够由GGPP合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽的基因；
(g)编码能够由对映-柯巴基二磷酸酯合成对映-贝壳杉烯的多肽的基因；
(h)编码能够由对映-贝壳杉烯合成对映-贝壳杉烯酸的多肽的基因；
(i)编码能够还原细胞色素P450复合物的多肽的基因；和/或
(j)编码能够由对映-贝壳杉烯酸合成甜菊醇的多肽的基因；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其中：
(a)所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(b)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β1,3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(c)所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(d)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β1,2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO:13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO:16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；
(e)所述能够合成GGPP的多肽包括与以SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32或116中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(f)所述能够合成对映-柯巴基二磷酸酯的多肽包括与以SEQ ID NO:34、36、38、40、42或120中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(g)所述能够合成对映-贝壳杉烯的多肽包括与以SEQ ID NO:44、46、48、50或52中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(h)所述能够合成对映-贝壳杉烯酸的多肽包括与以SEQ ID NO:60、62、66、68、70、72、74、76或117中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；
(i)所述能够还原细胞色素P450复合物的多肽包括与以SEQ ID NO:78、80、82、84、86、88、90、92中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽；和/或
(j)所述能够合成甜菊醇的多肽包括与以SEQ ID NO:94、97、100、101、102、103、104、106、108、110、112或114中任一个示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽。
7.如权利要求1至6中任一项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)所述编码所述能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO:157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；
(b)所述编码所述能够合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO:159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(c)所述编码所述能够由尿苷二磷酸酯(UDP)合成尿苷5'-三磷酸酯(UTP)且与以SEQID NO:123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；
(d)所述编码所述能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO:2或119中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；和
(e)所述编码所述能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖且与以SEQ ID NO:121示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的基因；以及
以下中的一个或多个：
(f)所述编码所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化且与以SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(g)所述编码所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β1,3糖基化且与以SEQ ID NO:9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽的基因；
(h)所述编码所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化且与以SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的基因；
(i)所述编码所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β1,2糖基化的多肽的基因包含与以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO:13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO:16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽；
其中所述基因中至少一个是重组基因。
8.如权利要求1至6中任一项所述的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含：
(a)所述编码所述能够使糖原脱支且与以SEQ ID NO:157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽的重组基因；和/或
(b)所述编码所述能够合成葡萄糖-1-磷酸酯且与以SEQ ID NO:159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽的重组基因；
其中所述编码所述能够使糖原脱支的多肽的重组基因和/或所述编码所述能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽的重组基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞被过度表达。
9.如权利要求8所述的重组宿主细胞，其中所述编码所述能够使糖原脱支的多肽的基因和/或所述编码所述能够合成葡萄糖-1-磷酸的多肽的基因相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞被过度表达了至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
10.如权利要求1至9中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高。
11.如权利要求10所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％。
12.如权利要求1至11中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所增高。
13.如权利要求12所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
14.如权利要求12或13所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
15.如权利要求1至14中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷之一或者所述甜菊醇糖苷组合物的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低。
16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的所述一种或多种甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主细胞、相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少5％、或至少10％、至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％。
17.如权利要求15或16所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主有所降低。
18.如权利要求1至17中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
19.如权利要求1至17中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一个或多个重组基因的表达使由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％。
20.如权利要求1至19中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷是或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜菊醇-1,3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1,2-甜菊苷、1,3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
21.如权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉属的真菌细胞或者来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、贾丁拟威尔酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红法夫酵母或白假丝酵母属的酵母细胞、藻类细胞或者来自大肠杆菌属或芽孢杆菌属的细菌细胞。
22.如权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母细胞。
23.如权利要求1至20中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。
24.一种在细胞培养物中产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括在表达所述基因的条件下在所述细胞培养物中培养如权利要求1至21中任一项所述的重组宿主细胞，并且其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物由所述重组宿主细胞产生。
25.如权利要求24所述的方法，其中组成性地表达所述基因。
26.如权利要求24所述的方法，其中诱导所述基因的表达。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中由所述细胞产生的RebA、RebD和/或RebM的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
28.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其中由所述细胞积累的13-SMG的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了至少10％、至少25％或至少50％。
29.如权利要求24至28中任一项所述的方法，其中由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少5％、或至少10％、或至少15％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。
30.如权利要求24至28中任一项所述的方法，其中由所述细胞产生的总甜菊醇糖苷的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主降低了不到10％、或不到5％、或不到2.5％。
31.如权利要求24至30中任一项所述的方法，其中使所述重组宿主细胞在发酵罐中在一定温度下生长一定时间段，其中所述温度和时间段促进所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的产生。
32.如权利要求24至31中任一项所述的方法，其中由所述细胞积累的UDP-葡萄糖的量相对于缺乏所述一个或多个重组基因的相应宿主增高了至少10％、至少25％、或至少50％、至少100％、至少150％、至少200％、或至少250％。
33.如权利要求24至32中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物分离所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述分离步骤包括分离所述细胞培养物的液相与所述细胞培养物的固相，以获得包含所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的上清液，以及：
(a)使所述上清液与一种或多种吸附树脂接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；或者
(b)使所述上清液与一个或多个离子交换或逆相色谱柱接触以获得所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物的至少一部分；或者
(c)使所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物结晶，或者提取所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
从而分离所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
35.如权利要求24至34中任一项所述的方法，所述方法还包括从所述细胞培养物回收所产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所回收的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物相对于甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷，并且相对于从植物来源的甜叶菊提取物获得的甜菊醇糖苷组合物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
37.一种产生一种或多种甜菊醇糖苷、或者甜菊醇糖苷组合物的方法，所述方法包括在重组宿主细胞的细胞培养物中使用以下各物对植物来源的或合成的甜菊醇和/或甜菊醇糖苷进行全细胞生物转化：
(a)能够使糖原脱支的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO:157示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；和/或
(b)能够合成葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO:159示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；以及
任选地，以下中的一种或多种：
(c)能够由UDP合成UTP的多肽，所述多肽包括与以SEQ ID NO:123示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的多肽；
(d)能够将葡萄糖-6-磷酸酯转化为葡萄糖-1-磷酸酯的多肽，所述多肽包括与以SEQID NO:2、119或143中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；或者与以SEQ IDNO:141、145或147中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％的序列同一性的多肽；和/或
(e)能够由UTP和葡萄糖-1-磷酸酯合成UDP-葡萄糖的多肽，所述多肽包括与以SEQ IDNO:121或127中任一个示出的氨基酸序列具有至少60％序列同一性；与以SEQ ID NO:125、129、133、135、137或139中任一个示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性；或者与以SEQ ID NO:131示出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的多肽，以及
以下中的一种或多种：
(f)能够使甜菊醇或甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽；
(g)能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β1,3糖基化的多肽；
(h)能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽；和/或
(i)能够使甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β1,2糖基化的多肽；
其中所述多肽中至少一种是在所述重组宿主细胞中表达的重组多肽；以及由此产生所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物。
38.如权利要求37所述的方法，其中：
(f)所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-13羟基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(g)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C3'进行β1,3糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:9示出的氨基酸序列具有至少50％序列同一性的多肽；
(h)所述能够使所述甜菊醇或所述甜菊醇糖苷在其C-19羧基处糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:4示出的氨基酸序列具有至少55％序列同一性的多肽；
(i)所述能够使所述甜菊醇糖苷的13-O-葡萄糖、19-O-葡萄糖、或13-O-葡萄糖与19-O-葡萄糖二者的C2'进行β1,2糖基化的多肽包括与以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；与以SEQ ID NO:13示出的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽；或者与以SEQ ID NO:16示出的氨基酸序列具有至少65％序列同一性的多肽。
39.如权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是植物细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、来自曲霉属的真菌细胞或者来自酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、光滑假丝酵母、棉阿舒囊霉、贾丁拟威尔酵母、巴斯德毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵母、博伊丁假丝酵母、解腺嘌呤阿氏酵母、红法夫酵母或白假丝酵母属的酵母细胞、藻类细胞或者来自大肠杆菌属或芽孢杆菌属的细菌细胞。
40.如权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是酿酒酵母细胞。
41.如权利要求24至38中任一项所述的方法，其中所述重组宿主细胞是解脂耶氏酵母细胞。
42.如权利要求24至41中任一项所述的方法，其中所述一种或多种甜菊醇糖苷是，或者所述甜菊醇糖苷组合物包含甜菊醇-13-O-糖苷(13-SMG)、甜菊醇-1,2-二糖苷、甜菊醇-1,3-二糖苷、甜菊醇-19-O-糖苷(19-SMG)、1,2-甜菊苷、1,3-甜菊苷(RebG)、甜茶苷、甜叶菊苷A(RebA)、甜叶菊苷B(RebB)、甜叶菊苷C(RebC)、甜叶菊苷D(RebD)、甜叶菊苷E(RebE)、甜叶菊苷F(RebF)、甜叶菊苷M(RebM)、甜叶菊苷Q(RebQ)、甜叶菊苷I(RebI)、杜克苷A和/或其异构体。
43.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含如权利要求1至23中任一项所述的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；以及
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸；
其中所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物以至少1mg/L所述细胞培养物的浓度存在；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
44.一种细胞培养物，所述细胞培养物包含如权利要求1至23中任一项所述的重组宿主细胞，所述细胞培养物还包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；以及
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、YNB和/或氨基酸；
其中UDP-葡萄糖以至少100μM的浓度存在于所述细胞培养物中；
其中所述细胞培养物相对于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物富含UGP-葡萄糖，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
45.一种细胞溶解物，所述细胞溶解物来自在所述细胞培养物中生长的如权利要求1至23中任一项所述的重组宿主细胞，所述细胞溶解物包含：
(a)由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物；
(b)葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、鼠李糖、UDP-葡萄糖、UDP-鼠李糖、UDP-木糖和/或N-乙酰基-氨基葡萄糖；和/或
(c)补充营养物，包括微量金属、维生素、盐、酵母氮源、YNB和/或氨基酸；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷或者所述甜菊醇糖苷组合物以至少1mg/L所述细胞培养物的浓度存在。
46.一种或多种甜菊醇糖苷，所述一种或多种甜菊醇糖苷是由如权利要求1至23中任一项所述的重组宿主细胞产生；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
47.一种或多种甜菊醇糖苷，所述一种或多种甜菊醇糖苷是通过如权利要求24至42中任一项所述的方法产生；
其中由所述重组宿主细胞产生的所述一种或多种甜菊醇糖苷以不同于来自甜叶菊植物的甜菊醇糖苷组合物的相对量存在，并且相对于植物来源的甜叶菊提取物具有降低水平的甜叶菊植物来源的组分。
48.一种甜味剂组合物，所述甜味剂组合物包含如权利要求46或47所述的一种或多种甜菊醇糖苷。
49.一种食物产品，所述食物产品包含如权利要求48所述的甜味剂组合物。
50.一种饮料或饮料浓缩物，所述饮料或饮料浓缩物包含如权利要求48所述的甜味剂组合物。
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