CN111557932A - Opaganib在制备治疗瑞戈非尼耐受性肝癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及耐药肿瘤的治疗领域，具体涉及小分子化合物在制备治疗瑞戈非尼耐受性肝癌药物中的应用。本发明公开了SphK2抑制剂OPAGANIB能够逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药性。我们在瑞戈非尼的肝癌耐药细胞株和体内肝癌耐药模型上我们发现OPAGANIB处理的耐药细胞株对瑞戈非尼的敏感性显著提高。而过表达SphK2之后，耐药细胞株对瑞戈非尼的敏感性显著降低。结果显示，抑制SphK2的活性能够有效的提高肝癌细胞对瑞戈非尼的敏感性，从而能够解决肝癌对瑞戈非尼的耐药问题。本发明用OPAGANIB抑制SphK2的活性，进而达到逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药。

Description

OPAGANIB在制备治疗瑞戈非尼耐受性肝癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗尤其是肿瘤耐药的逆转治疗领域，具体来说是指小分子化合物OPAGANIB在制备治疗瑞戈非尼耐受性肝癌药物中的应用。

背景技术

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是威胁我国人民生命和健康的重大疾病，瑞戈非尼(Regorafenib)是治疗中晚期HCC的标准二线药物，能够在一线药物索拉非尼(Sorafenib)治疗失败后继续生效，体内外研究中均展现出良好的抗HCC效果。然而获得性耐药的发生不仅限制了HCC患者从瑞戈非尼治疗中长久获益，还使疾病恶化，病程加速；且更为严重的是，患者对瑞戈非尼耐药后尚无其他可选药物。因此寻找可能的逆转HCC瑞戈非尼获得性耐药的潜在药物具有非常重要的临床意义。目前针对HCC瑞戈非尼获得性耐药问题的研究非常少，至今还未有成熟的解决方案。公开报道的在体内外具有确切的逆转HCC瑞戈非尼获得性耐药的潜在药物也几乎没有。

近年来肿瘤中的异常鞘磷脂代谢受到广泛关注，鞘氨醇激酶2(sphingosinekinase，SphK2)通过催化鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)的生成在鞘磷脂代谢中发挥关键作用。研究显示SphK2由于存在BH3类似结构域，能够诱导多种细胞凋亡并抑制细胞增殖；后来的部分研究认为SphK2通过其具有促癌作用的催化产物S1P促进肿瘤的发生发展。然而，目前为止SphK2在肝癌的发生发展和耐药等生物学过程中的作用和机制尚不清楚。

目前已有多种SphK2特异性抑制剂投入研究，Opaganib，代号为ABC294640(3-(4-氯苯基)-金刚烷-1-羧酸(吡啶-4-基甲基)酰胺，CAS号为915385-81-8)是其中对SphK2抑制效力相对较强的一种。目前的研究来看，OPAGANIB的体内外抗肿瘤活性研究集中在结肠癌、胆管癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、前列腺癌、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤，而且主要涉及的活性为抑制增殖。另外，OPAGANIB与其他药物或者治疗方案联用时还能产生协同肿瘤抑制作用，但目前为止还没有与瑞戈非尼联用的报道，更加没有OPAGANIB与瑞戈非尼联用在体内外逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的报道。

由于肿瘤的获得性耐药是一个特殊的肿瘤生物学过程，对肿瘤具有抑制作用的药物不一定具有逆转肿瘤获得性耐药的功能。而且，药物之间具有联合之后的协调效应，也不意味着其中的一个药物可以逆转肿瘤对另外一个药物的耐药。更进一步的SphK2在肿瘤发生发展中的作用尚存在争议，且肿瘤耐药与肿瘤的其他生物学行为不同、有其特殊之处，因此其在耐药中的作用和机制尚不清楚。肝癌对瑞戈非尼的获得性耐药也是一个刚刚出现研究命题，其过程和机制尚不清楚，因此，抑制SphK2能否对肝癌的瑞戈非尼获得性耐药产生逆转作用尚存争议。

因此，目前OPAGANIB能否逆转HCC对瑞戈非尼的耐药也处于迷茫之中。本发明将通过体内外HCC瑞戈非尼获得性耐药模型评估OPAGANIB对获得性耐药的逆转作用。

发明内容

本发明的目的是通过体外研究揭示SphK2在肝癌细胞对瑞戈非尼获得性耐药中的作用，并且用小分子化合物OPAGANIB抑制SphK2活性的方法来逆转了肝癌细胞对瑞戈非尼的耐药。因此，本发明的主要内容概括为：采用小分子化合物OPAGANIB抑制SphK2活性的方法能够逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药，小分子化合物OPAGANIB能够用于制备逆转肝癌对瑞戈非尼耐药的药物。

本发明内容详细情况如下：

1.我们首次揭示HCC瑞戈非尼获得性耐药细胞增殖、迁移、抗凋亡能力显著上升，细胞向更恶性表型进展。

2.我们首次揭示SphK2在耐药细胞中的表达比在非耐药细胞中高，且SphK2的表达量与HCC细胞对瑞戈非尼的敏感度具有负相关关系。

3.我们首次揭示过表达SphK2可以降低非耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性，促进耐药发生。

4.我们首次揭示SphK2的催化产物S1P刺激非耐药细胞也可以促进细胞对瑞戈非尼产生抵抗。

5.我们首次使用SphK2的特异性抑制剂OPAGANIB抑制SphK2活性后，耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性升高，联合应用OPAGANIB与瑞戈非尼具有显著体外逆转对瑞戈非尼耐药的逆转效果。由此可见，SphK2的特异性抑制剂OPAGANIB可以用于肿瘤对瑞戈非尼获得性耐药的逆转，尤其是SphK2的特异性抑制剂OPAGANIB可以用于肝癌对瑞戈非尼获得性耐药的逆转。

6.体内研究发现OPAGANIB能够逆转肝癌对瑞戈非尼的耐药，联合应用OPAGANIB与瑞戈非尼能够抑制裸鼠瑞戈非尼耐药肿瘤模型中肿瘤的的生长，具有显著体内抗肿瘤效果。由此可见，SphK2的特异性抑制剂OPAGANIB可以用于肿瘤对瑞戈非尼获得性耐药的逆转，尤其是SphK2的特异性抑制剂OPAGANIB可以用于肝癌对瑞戈非尼获得性耐药的逆转。

附图说明

图1.瑞戈非尼获得性耐药细胞的构建：(A)瑞戈非尼耐药细胞和非耐药母系细胞用不同浓度瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理48h后，CCK-8检测细胞活力，并计算相应的IC₅₀值。(B)10μmol/l瑞戈非尼处理瑞戈非尼获得性耐药细胞97H-R、7721-R和非耐药母系细胞48h后，分别检测两种细胞的凋亡比例。(C)10μmol/l瑞戈非尼处理耐药细胞和母系细胞48h后，分别检测凋亡细胞的比例。(D)在克隆形成实验中，用5μmol/l瑞戈非尼抑制耐药细胞和母系细胞的增殖，7721和7721-R连续培养14天，97H和97H-R连续培养10天，检测瑞戈非尼对细胞增殖的影响。(E)10μmol/l瑞戈非尼处理耐药细胞和母系细胞48h后，western blot检测不同组细胞中Bcl2、cleaved-PARP、CDK2、CKD4、cyclin D1的蛋白表达水平，根据实验结果分析各条带灰度值。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图2.SphK2而非SphK1在与HCC瑞戈非尼耐药相关：(A)Western blot检测瑞戈非尼获得性耐药细胞97H-R、7721-R与对应的非耐药母系细胞MHCC97H、SMMC-7721中SphK1蛋白表达量的差异。(B)瑞戈非尼获得性耐药细胞与非耐药母系细胞SphK2蛋白表达量的差异。(C)Western blot检测BEL-7402、HuH-7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、MHCC97H五株HCC细胞SphK2的蛋白表达水平，并分析各株细胞SphK2条带灰度值与瑞戈非尼IC₅₀值的关系。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS：没有显著统计学差异。

图3.升高非耐药HCC细胞SphK2蛋白表达水平后，细胞对瑞戈非尼的敏感性降低：(A)Western blot检测过表达SphK2细胞和对照细胞中SphK2蛋白表达水平，根据结果分析各条带灰度值。(B)成功升高HCC细胞SphK2表达后，用不同浓度的瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理细胞48h，CCK-8实验检测细胞活力并计算相应的瑞戈非尼IC₅₀值。(C)用10μmol/l处理SphK2慢病毒过表达成功的HCC细胞和对照细胞48h后，Annexin V-FITC/PI检测凋亡细胞的比例。(D)10μmol/l处理SphK2慢病毒过表达成功的HCC细胞和对照细胞48h后，流式细胞周期实验检测细胞周期的分布。(E)在克隆形成实验中瑞戈非尼的浓度为5μmol/l，处理时间分别为：7721-R 14天，97H-R 10天，检测过表达SphK2后瑞戈非尼对细胞增殖的影响。(F)10μmol/l瑞戈非尼处理SphK2慢病毒过表达成功的HCC细胞和对照细胞48h后，Western blot检测不同组细胞中Bcl2、cleaved-PARP、CDK2、CKD4、cyclin D1的蛋白表达水平，根据结果分析各条带灰度值。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，NS：没有显著统计学差异。

图4.S1P刺激促进HCC细胞对瑞戈非尼的耐受：(A)用不同浓度S1P刺激非HCC细胞48h，CCK-8检测细胞活力。(B)1μmol/l S1P刺激HCC细胞，同时用不同浓度的瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理细胞48h，CCK-8实验检测细胞活力并计算相应的瑞戈非尼IC₅₀值。(C)用10μmol/l瑞戈非尼分别处理S1P或DMSO刺激的HCC细胞和对照细胞48h后，Annexin V-FITC/PI检测各实验组中凋亡细胞的比例。(D)10μmol/l瑞戈非尼分别处理S1P或DMSO刺激的HCC细胞和对照细胞48h后，流式细胞周期实验检测各实验组中细胞周期的分布。(E)在克隆形成实验中瑞戈非尼的浓度为5μmol/l，处理时间分别为：7721-R 14天，97H-R 10天，检测S1P或DMSO刺激后瑞戈非尼对细胞增殖的影响。(F)10μmol/l瑞戈非尼处理S1P或DMSO刺激的HCC细胞48h后，Western blot检测不同实验组细胞中Bcl2、cleaved-PARP、CDK2、CKD4、cyclin D1的蛋白表达水平，并根据检测结果分析各条带灰度值。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图5.ABC294640(Opaganib)抑制SphK2活性后，耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性升高：(A)用不同浓度的ABC294640(0、10、20、30、40、50、60、80、100、120(μmol/l))处理97H-R、7721-R两株耐药细胞48h后，CCK-8法检测这两株细胞的细胞活力。(B)将97H-R、7721-R分为四组，分别给予对照处理、单独10μmol/l瑞戈非尼处理、单独20μmol/l ABC294640处理、10μmol/l瑞戈非尼和20μmol/l ABC294640共同处理48h后，显微镜高倍镜下直接观察两株耐药细胞的状态，并拍摄具有代表性的照片。(C)20μmol/l ABC294640抑制SphK2活性后，用不同浓度的瑞戈非尼(0、0.5、1、5、10、20、40(μmol/l))处理细胞48h，CCK-8实验检测细胞活力并计算相应的瑞戈非尼IC₅₀值。(D)将97H-R、7721-R分为四组，分别给予对照处理、单独10μmol/l瑞戈非尼处理、单独20μmol/l ABC294640处理、10μmol/l瑞戈非尼和20μmol/lABC294640共同处理48h后，Annexin V-FITC/PI检测凋亡细胞的比例，(E)流式细胞周期实验检测细胞周期的分布，(F)克隆形成实验检测细胞增殖能力(在克隆形成实验中瑞戈非尼的浓度为5μmol/l，ABC294640的浓度为10μmol/l，处理时间分别为：7721-R 14天，97H-R 10天)，(G)Western blot检测不同组细胞中Bcl2、cleaved-PARP、CDK2、CKD4、cyclin D1的蛋白表达水平，并根据结果分析各条带灰度值。图中所示结果为三次独立实验中具有代表性的实验结果，结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6.ABC294640(Opaganib)抑制SphK2活性体内逆转瑞戈非尼获得性耐药：利用97H-R构建裸鼠HCC瑞戈非尼获得性耐药细胞皮下瘤模型，当裸鼠皮下瘤长径达到5mm时，随机将裸鼠分为4组，每组6只，分别给予药物载体处理、单独瑞戈非尼处理、单独ABC294640处理、瑞戈非尼与ABC294640联合处理。在药物处理的28天内，(A)每周测量裸鼠体重3次并记录，(B)每周用电子游标卡册测量裸鼠皮下瘤长短径三次，计算体积并记录。当28天处理结束后，异氟烷麻醉断颈处死裸鼠，取出各组裸鼠皮下瘤，(C)拍摄具有代表性的照片，(D)测量皮下瘤体积及重量。结果用平均值±标准差(mean±SD)表示；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

具体实施方式

实施例部分所涉到的所有实验材料和方法

1.细胞培养

人HCC细胞株BEL-7402、HuH-7、PLC/PRF/5、SMMC-7721均购于上海中国科学院细胞库。细胞株MHCC97H由复旦大学附属中山医院贾凡教授赠送。这五种HCC细胞的培养基均为添加了10％胎牛血清、100U/ml盘尼西林和100μg/ml链霉素的DMEM完全培养基。细胞在温度为37℃、CO₂浓度为5％的恒温培养箱中持续培养。

2.细胞活力检测(CCK-8法)

用含10％胎牛血清的完全培养基制备细胞混悬液，以每孔5000个细胞/100μl的浓度接种于96孔板内，接种好的细胞培养24h使之贴壁后用不同药物处理细胞相应时间后，每孔加入CCK-8试剂10μl，37℃恒温培养箱内继续孵育1～2h，酶标仪检测波长为450nm处各孔吸光度值并记录，并做相关分析，每次实验重复三次。

3.瑞戈非尼获得性耐药细胞建立

我们使用浓度梯度递增法建立瑞戈非尼获得性耐药HCC细胞株。首先利用CCK-8实验检测5个HCC细胞株对瑞戈非尼的敏感性，根据CCK-8检测结果计算各株细胞对应的瑞戈非尼IC₅₀值，选择对瑞戈非尼相对敏感(瑞戈非尼IC₅₀值较低)的两株HCC细胞进行耐药细胞的建立。初始瑞戈非尼的处理浓度略低于细胞瑞戈非尼IC₅₀(SMMC-7721、MHCC-97H初始瑞戈非尼处理浓度均为5μmol/l)，每隔两天去除陈旧培养基，PBS清洗细胞后更换为新鲜培养基。之后每周缓慢增加瑞戈非尼的浓度0.5μmol/l，并用PBS洗涤去除死亡细胞，剩余存活HCC细胞继续培养传代。在用瑞戈非尼连续刺激HCC细胞6个月后，再用不同浓度的瑞戈非尼处理细胞48h(瑞戈非尼浓度设置为0、0.5、1、5、10、20、30(μmol/l))，利用CCK-8实验检测细胞活力，根据CCK-8结果的计算这些细胞对瑞戈拉非尼IC₅₀值，并与母系非耐药细胞的瑞戈非尼IC₅₀值比较，计算耐药指数(resistance index，RI)(RI＝耐药细胞瑞戈非尼IC₅₀值/母系细胞瑞戈非尼IC₅₀值)，确定瑞戈非尼获得性耐药HCC细胞株是否建立成功。构建成功的瑞戈非尼耐药细胞继续用含4μmol/l瑞戈非尼的完全培养基持续培养以维持其耐药性。

4.细胞凋亡流式检测(Annexin V-FITC/PI双染法)

HCC细胞在经过不同处理后，胰酶消化收集约1×10⁶个细胞。1000rpm离心5min，去除上清；加入5μl Annexin V-FITC染料和5μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料，轻轻混匀，室温避光孵育染色30min，孵育过程中轻轻重悬细胞2～3次使得染色更均匀充分。染色结束后用筛网过滤细胞制备成单细胞悬液，使用BD FACSCalibur流式仪对凋亡细胞进行检测，FlowJo软件分析结果。所获取的结果图中，Q1(左上象限)、Q2(右上象限)、Q3(右下象限)和Q4(左下象限)分别代表死亡细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞和存活细胞。每次实验独立重复三次。

5.细胞周期流式检测

HCC细胞在经过不同处理后，胰酶消化收集约1×10⁶个细胞。1000rpm离心5min，去除上清；4℃、70％的酒精2ml固定细胞30min，1000rpm离心5min，去除上清；RNase A的PBS溶液处理细胞30min，加入5μl PI染料，对细胞进行室温避光孵育染色30min，孵育过程中轻轻重悬细胞2～3次使得染色更均匀充分。染色结束后筛网过滤细胞制备成单细胞悬液，BDFACSCalibur流式仪进行检测，FlowJo软件分析结果。细胞周期分布图中的蓝色、绿色和红色部分分别代表处于G1期、S期和G2/M期的细胞。每次实验独立重复三次。

6.细胞克隆形成实验

取对数生长期的HCC细胞，胰酶消化，完全培养基终止并用PBS制备细胞悬液。以每孔1×10³个细胞的密度接种于六孔板中，恒温培养箱孵育过夜使细胞贴壁，之后将培养基更换为含5μmol/l瑞戈非尼或DMSO对照的完全培养基。每天在显微镜下观察细胞生长情况，每三天更换一次新鲜细胞培养基。连续培养10～14天后(SMCC-7721和7721-R培养14天，MHCC-97H和97H-R培养10天)，去除细胞培养基，PBS清洗细胞；用4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS清洗；0.4％结晶紫溶液对细胞染色30min，PBS洗涤去除染色液并干燥，拍照计数。在显微镜(低倍镜)下人工计数≥30个细胞的克隆数。每次实验独立重复三次。

7.慢病毒转染

纯化的高滴度慢病毒悬液购自上海吉玛公司。慢病毒载体构建、慢病毒的扩增和纯化以及滴度测定均由该公司完成，所使用的慢病毒载体为GV492，元件顺序为Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，将目的片段插入MCS区后调控SphK2表达。

将适量HCC细胞种植在六孔板中，每孔培养基体积为2ml，恒温培养箱孵育过夜使细胞贴壁，保证转染时细胞汇合度在30～50％左右为宜。根据细胞的感染复数(multiplicity of infection，MOI)在培养基中加入相应比例1×10⁸TU/ml的病毒悬液，继续培养细胞72～96h后荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况确认慢病毒是否转染成功，同时在细胞培养基中加入适量的嘌呤霉素筛选细胞，以获得稳定过表达SphK2的HCC细胞株。之后Western blot检测SphK2的蛋白表达水平，确认是否过表达成功。

8.HCC瑞戈非尼耐药肿瘤动物模型

本研究中所用动物模型为6周龄雄性BALB/C裸鼠，体重约20g，购于南京大学模型动物研究中心。所用肿瘤细胞为97H-R瑞戈非尼获得性耐药细胞，为本实验室自主构建，培养于含10％FBS的DMEM中，贴壁生长。实验裸鼠饲养于无特定病原体(specific-pathogenfree，SPF)级环境中，饲养环境温度控制在18℃～26℃，相对湿度为40％～70％，12:12小时昼夜光循环以保持裸鼠昼夜节律。

本研究方案经南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准。裸鼠皮下注射瑞戈非尼获得性耐药MHCC-97H(97H-R)细胞悬液(1×10⁷个细胞混悬于100μl PBS中)。当肿瘤长径达到5mm时，将小鼠随机分为4组(每组6只)：瑞戈非尼组(仅给予瑞戈非尼治疗处理)、ABC294640(Opaganib)组(仅给予ABC294640治疗处理)、瑞戈非尼和ABC294640(Opaganib)联合应用组(给予瑞戈非尼和ABC294640共同处理)、对照组(给予药物溶剂处理)。雷戈拉非尼和ABC294640(Opaganib)被溶于含有2％DMSO+30％PEG300+5％Tween80+ddH₂O的口服载体中。基于瑞戈非尼的临床推荐给药方案：裸鼠瑞戈非尼给药剂量为20mg/kg体重，每天灌胃给药一次，连续给药21天，停药7天为一个周期。参考既往研究，ABC294640(Opaganib)裸鼠给药方案为：40mg/kg体重，每周3次，连续给药4周。每周用数字卡尺测量3次肿瘤的长和宽，肿瘤体积计算公式为：长×宽²×0.5。裸鼠的体重也每周测量3次并观察小鼠的状态。当药物治疗4周之后到达研究终点，在异氟烷麻醉下断颈处死小鼠，立即取出皮下肿瘤，拍摄具有代表性的照片。

9.数据分析

所获的实验数据用SPSS 19.0统计软件进行分析，具有代表性的独立实验的结果用平均值±标准差表征。两组之间的比较采用独立t检验方法，P值低于0.05(P<0.05)认为具有统计学上的显著差异。

实施例1肝癌瑞戈非尼获得性耐药细胞的成功构建

我们通过CCK-8实验检测了BEL-7402、HuH-7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、MHCC-97H五株HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性，根据检测结果计算得到各细胞对应的瑞戈非尼IC₅₀值。可以发现，SMMC-7721、MHCC-97H的瑞戈非尼的IC₅₀在五株细胞中处于较低水平(表1)，证明这两株细胞对瑞戈非尼相对敏感。由此我们选取这两株细胞利用浓度梯度递增法构建瑞戈非尼获得性耐药HCC细胞株。瑞戈非尼持续刺激SMMC-7721、MHCC-97H六个月后，我们再次检测了这两株细胞对瑞戈非尼的敏感性，发现这两株细胞瑞戈非尼的IC₅₀值显著升高，耐药指数RI分别为3.133(97H-R/97H)、2.26(7721-R/7721)(图1.A，表2)，说明对瑞戈非尼的敏感性降低，确认瑞戈非尼获得性耐药细胞构建成功，由此获得的耐药HCC细胞分别命名为7721-R和97H-R。此外，我们还通过细胞周期实验以及克隆形成实验检测瑞戈非尼对耐药细胞的生长抑制作用。结果显示10μmol/l瑞戈非尼处理细胞48h后，阻滞在G1期的耐药细胞比阻滞在G1期的非耐药母系细胞少；5μmol/l瑞戈非尼在耐药细胞中抑制克隆形成的效力也要比在非耐药母系细胞中差(图1.C-D)，说明瑞戈非尼抑制耐药细胞增殖的效力显著下降。同时10μmol/l瑞戈非尼处理HCC细胞48h后，耐药细胞中凋亡细胞的比例比非耐药细胞中低(图1.B)，说明瑞戈非尼诱导耐药细胞凋亡的能力也明显下降。并且Western blot结果显示与细胞周期相关的蛋白：G1/S特异性周期蛋白-D1(cyclin D1)和周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)、CDK4的表达水平以及细胞凋亡的标志性蛋白：剪切形式的腺苷二磷酸核糖聚合酶(cleaved-poly ADP-ribose polymerase，cleaved-PARP)和抑制细胞凋亡的蛋白B细胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)的蛋白水平变化与现象相符(图1.F)。综合以上各项实验结果，我们确认HCC瑞戈非尼获得性耐药细胞构建成功，瑞戈非尼抑制耐药细胞增殖、促进耐药细胞凋亡的能力均显著下降。

表1.五株HCC细胞的瑞戈非尼IC₅₀值(μmol/l)

表2.非耐药细胞和耐药细胞的瑞戈非尼IC₅₀值(μmol/l)

实施例2 SphK2表达水平与瑞戈非尼获得性耐药相关

为了验证SphKs是否参与HCC瑞戈非尼获得性耐药的调控，我们首先比较了耐药细胞与非耐药母系细胞之间SphK1、SphK2蛋白表达水平差异。Western blot实验结果显示，MHCC97H和97H-R、SMMC-7721和7721-R的SphK1蛋白表达没有显著差异，而SphK2在耐药细胞97H-R和7721-R中表达水平显著升高(图2.A-B)，说明SphK2而非SphK1可能介导了HCC瑞戈非尼获得性耐药。此外我们还发现：在五株HCC细胞BEL-7402、HuH-7、PLC/PRF/5、SMMC-7721、MHCC97H中，细胞SphK2的Western blot条带灰度值越高，对应的瑞戈非尼IC₅₀值也越高。进一步数据分析显示：细胞的SphK2表达水平与瑞戈非尼IC₅₀值的皮尔逊相关系数R²＝0.8889(图2.C)，存在显著的正相关关系，说明HCC细胞SphK2的表达量越高，细胞对瑞戈非尼敏感性越低。综合以上结果，我们发现SphK2在HCC的瑞戈非尼耐药过程中扮演着重要角色。

实施例3过表达SphK2降低HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性

鉴于降低SphK2蛋白表达水平可以升高耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性，我们进一步检测升高SphK2蛋白表达水平是否能够降低非耐药细胞对瑞戈非尼的敏感，正向验证SphK2在HCC瑞戈非尼获得性耐药中的重要作用。

我们利用慢病毒转染技术升高非耐药细胞MHCC97H、SMMC-7721中SphK2的蛋白表达水平，并通过Western blot实验进行了验证，结果显示非耐药HCC细胞SphK2过表达成功(图3.A)。用不同浓度瑞戈非尼刺激成功过表达SphK2的HCC细胞和对照HCC细胞48h后，CCK-8检测发现过表达SphK2的HCC细胞活力要比对照细胞高(图3.B)，根据细胞活力计算得到的瑞戈非尼IC₅₀值也更高(表5)，说明过表达SphK2后HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性降低。此外，将成功过表达SphK2的耐药细胞和对照细胞分别置于含有相同浓度瑞戈非尼的完全培养基中培养相同时间后，过表达SphK2的HCC细胞所形成的克隆数要比对照细胞多(图3.E)，阻滞在G1期的细胞也相对较少(图3.D)。同时过表达SphK2的HCC细胞中细胞周期相关蛋白cyclinD1、CDK2、CDK4的表达水平在经过瑞戈非尼刺激后没有明显降低，而对照细胞中这些蛋白表达水平在瑞戈非尼刺激后明显降低(图3.F)。说明，在升高HCC细胞SphK2的蛋白水平后，瑞戈非尼无法有效将细胞阻滞在G1/S期也无法抑制细胞生长、增殖。Annexin V-FITC/PI凋亡检测发现成功过表达SphK2的HCC细胞在经过10μmol/l瑞戈非尼刺激后凋亡细胞的比例比对照组低(图3.C)，Western blot结果显示对照细胞的细胞凋亡标志性蛋白cleaved-PARP表达水平更高，抑制细胞凋亡的蛋白Bcl2则在过表达SphK2的HCC细胞中水平更高(图3.F)，说明瑞戈非尼诱导凋亡的作用在SphK2过表达的HCC中减弱。综合以上各项实验结果，我们证明了升高SphK2蛋白表达水平可以降低HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性，促进HCC细胞瑞戈非尼耐药的产生。

表3.过表达SphK2的非耐药细胞在与对照细胞瑞戈非尼的IC₅₀值

实施例4外源性S1P刺激降低HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性

鉴于SphK2的主要功能是催化S1P的生成，我们推测SphK2促进HCC瑞戈非尼获得性耐药是通过S1P介导的。首先我们检测了不同浓度的S1P对HCC细胞活力的影响，CCK-8结果显示1μmol/l的S1P对MHCC97H和SMMC-7721两株HCC细胞均可产生一定程度的生长促进作用。且由于人外周血中检测到的S1P浓度约为0.1～1μmol/l，研究鞘脂代谢的文章中多用1μmol/l的S1P刺激细胞，于是我们选择1μmol/l的S1P对HCC细胞进行刺激。

当用不同浓度的瑞戈非尼处理1μmol/l的外源性S1P或DMSO刺激的HCC细胞48h后，CCK-8检测发现S1P刺激的HCC细胞活力要比DMSO刺激的细胞高(图4.A)，其对应的瑞戈非尼IC₅₀值也更高(表4)，说明HCC细胞在1μmol/l S1P作用后对瑞戈非尼的敏感性降低。此外，将HCC细胞分别置于含有1μmol/l S1P或DMSO的完全培养基中，再加入同等浓度的瑞戈非尼分别培养相同时间后，S1P刺激的HCC细胞所形成的克隆数要比DMSO处理的细胞多(图4.D)，细胞周期结果显示阻滞在G1期的细胞也相对较少(图4.C)。同时S1P刺激的HCC细胞中细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK2、CDK4的表达水平在经过瑞戈非尼处理后没有明显降低，而DMSO刺激的HCC细胞中这些蛋白表达水平在瑞戈非尼处理后明显降低(图4.F)。说明HCC在经过适量S1P刺激后，瑞戈非尼无法有效将细胞阻滞在G1/S期以及无法抑制细胞生长、增殖。此外，Annexin V-FITC/PI凋亡检测发现S1P刺激的HCC细胞在经过10μmol/l瑞戈非尼作用后凋亡细胞的比例比对照组低(图4.B)，细胞凋亡的标志性蛋白cleaved-PARP表达水平更低，抑制细胞凋亡的蛋白Bcl2表达水平更高(图4.F)，说明瑞戈非尼诱导凋亡的作用在S1P刺激的HCC细胞中减弱。综合以上各项实验结果，我们证明了适量S1P刺激同样也可以降低HCC细胞对瑞戈非尼的敏感性，促进HCC细胞瑞戈非尼耐药的产生，SphK2的粗瑞戈非尼耐药作用可能由S1P介导。

表4.非耐药细胞在S1P刺激后与对照细胞瑞戈非尼的IC₅₀值

实施例5ABC294640(Opaganib)抑制SphK2活性升高耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性

基于ABC294640(OPAGANIB)对SphK2活性抑制的专一性和高效性，我们选择该抑制剂来探究靶向SphK2逆转HCC瑞戈非尼获得性耐药的可能性。我们发现当ABC294640(OPAGANIB)浓度不超过20μmol/l时，两株细胞的活力均在85％以上(图5.A)，说明细胞生长未受到明显影响。而ABC294640(OPAGANIB)体外抑制SphK2活性的IC₅₀值为25μmol/l，当其浓度20μmol/l时ABC294640(OPAGANIB)对SphK2催化活性也具有较好的抑制作用，因此我们选用20μmol/l的ABC294640(OPAGANIB)来抑制SphK2的活力进行逆转耐药探究。

首先，我们直接在显微镜下观察了20μmol/l的ABC294640(OPAGANIB)与10μmol/l的瑞戈非尼联合作用于两株HCC瑞戈非尼耐药细胞48h后，细胞的生长情况。如图5.B所示，当ABC294640(OPAGANIB)或瑞戈非尼单独作用于细胞时，与对照组没有相比细胞的生长没有明显差别；而当两种药物同时作用时，存活耐药细胞数量肉眼可见的减少，且细胞状态变差，细胞圆缩，折光度增加，这一现象在7721-R细胞中尤为明显。ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合作用时产生了较强的细胞毒性。随后，我们还利用CCK-8实验检测ABC294640(OPAGANIB)抑制SphK2活性后，瑞戈非尼耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性。结果显示：在20μmol/l的ABC294640(OPAGANIB)作用下，耐药细胞经过不同浓度瑞戈非尼刺激48h后细胞活力比阴性对照低且其瑞戈非尼IC₅₀值也明显降低(图5.C，表5)，说明SphK2活性抑制后耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性增加。此外，我们将耐药细胞分为四组，分别给予对照处理；单独10μmol/l瑞戈非尼处理；单独20μmol/l ABC294640(OPAGANIB)处理；10μmol/l瑞戈非尼和20μmol/l ABC294640(OPAGANIB)共同处理48h后，Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测各实验组凋亡细胞比例。可以发现，瑞戈非尼耐药细胞在单独瑞戈非尼或ABC294640(OPAGANIB)作用下，凋亡细胞比例仅轻度增加，再次说明耐药细胞对10μmol/l瑞戈非尼产生了抵抗且20μmol/l ABC294640(OPAGANIB)对耐药细胞没有毒性作用。而当两种药物联合应用时，耐药细胞凋亡的比例显著上升(p<0.001)(图5.D)。同时，联合用药组的细胞凋亡标志性蛋白：cleaved-PARP表达升高，抑制细胞凋亡的蛋白Bcl2表达降低(图5.G)，说明ABC294640(OPAGANIB)和瑞戈非尼联用可以显著诱导耐药细胞凋亡。细胞周期实验结果显示瑞戈非尼或ABC294640(OPAGANIB)单独使用时对耐药细胞的周期分布没有明显影响，而当两药联合应用时，阻滞在G1期的耐药细胞增加(图5.E)。细胞克隆形成实验结果也显示两药联合应用组所形成的细胞克隆数比两个单独用药组以及对照组均要少(图5.F)。同时cyclin D1、CDK2、CDK4的表达水平在联合用药的耐药细胞中的水平也是最低(图5.G)。这些结果共同提示ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合应用能够将耐药细胞成功阻滞在G1期，抑制其生长、增殖。

综合以上各项实验结果，我们一方面证明了利用ABC294640(OPAGANIB)抑制SphK2活性后，耐药细胞对瑞戈非尼的敏感性增加、抵抗性减弱、瑞戈非尼获得性耐药得以逆转；另一方面ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合应用还具有显著的体外抑制耐药细胞生长、增殖以及促进凋亡的作用。

表5.ABC294640(OPAGANIB)抑制SphK2活性后，耐药细胞与对照细胞瑞戈非尼的IC₅₀值

实施例6ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合应用抑制HCC瑞戈非尼获得性耐药细胞在裸鼠体内的生长

为了探究利用ABC294640(OPAGANIB)抑制SphK2活性以治疗瑞戈非尼获得性耐药HCC的可能性，本研究进一步评估了ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合应用的体内抗耐药肿瘤效力。我们选用由MHCC-97H细胞构建所得的瑞戈非尼获得性耐药细胞株97H-R构建裸鼠HCC瑞戈非尼耐药皮下瘤模型。当裸鼠皮下瘤长径达到5mm时，随机将裸鼠分为4组，每组6只，分别给予药物载体处理、单独瑞戈非尼处理、单独ABC294640(OPAGANIB)处理、瑞戈非尼与ABC294640(OPAGANIB)联合处理，并观测裸鼠的体重及皮下瘤体积。在28天的处理过程中，我们发现四组裸鼠的体重没有显著的差异，也没有裸鼠死亡(图6.A)，说明20mg/kg的瑞戈非尼和40mg/kg的ABC294640(OPAGANIB)对裸鼠没有明显的毒性。裸鼠皮下瘤体积检测结果显示：单独应用瑞戈非尼或ABC294640(OPAGANIB)对瑞戈非尼耐药细胞的体内生长具有一定的抑制作用，两种药物联合应用时展现出强大的生长抑制作用：联合用药组裸鼠皮下瘤在28天内几乎没有生长(图6.B)。当28天药物处理结束后，我们在异氟烷气体麻醉下断颈处死了裸鼠，取出皮下瘤拍摄了具有代表性的照片。通过直接观察，我们发现三个药物处理组裸鼠皮下瘤均小于对照组，其中ABC294640(OPAGANIB)与瑞戈非尼联合用药组皮下瘤体积更是显著小于对照组(图6.C)，说明两种药物联合应用时确实具有强大的HCC瑞戈非尼获得性耐药细胞体内生长抑制作用。肿瘤体积和重量的测量结果再次证实了这一结果(图6.D)。

发明小结

综合以上研究结果，我们首次揭示了鞘磷脂代谢的限速酶SphK2在HCC瑞戈非尼获得性耐药中的关键作用，由于本领域之前对SphK2在HCC进展以及HCC的耐药中的作用和相应的机制都不清楚，我们的发现对于本领域具有重要意义。更加重要的是我们首次将SphK2的抑制剂用于肝癌对瑞戈非尼的获得性耐药，体内外HCC的瑞戈非尼获得性耐药模型都揭示SphK2的抑制剂ABC294640(OPAGANIB)具有明确的逆转HCC的瑞戈非尼获得性耐药的作用。综上所述，SphK2的抑制剂以及本发明提供的SphK2的抑制剂ABC294640(OPAGANIB)能够用于制备逆转肿瘤的瑞戈非尼获得性耐药，尤其是逆转HCC的瑞戈非尼获得性耐药的药物。

Claims (5)

1.OPAGANIB与瑞戈非尼的组合物在制备治疗肝癌药物中的应用。

2.OPAGANIB在制备逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的OPAGANIB在制备逆转肿瘤对瑞戈非尼耐药的药物中的应用，其特征为所述肿瘤为肝癌。

4.OPAGANIB与瑞戈非尼的组合物在制备治疗瑞戈非尼耐药性肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求4所述的OPAGANIB与瑞戈非尼的组合物在制备治疗瑞戈非尼耐药性肿瘤药物中的应用，其特征为所述肿瘤为肝癌。

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