CN111549160A

CN111549160A - 一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用

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Publication number: CN111549160A
Application number: CN202010382952.XA
Authority: CN
Inventors: 刘东立
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-05-08
Filing date: 2020-05-08
Publication date: 2020-08-18

Abstract

本发明公开了一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用，属于生物技术领域。该用于检测利什曼原虫的引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。通过使用含有上述引物组以及含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示的TaqMan探针的试剂盒，可以检测人或动物骨髓标本中是否存在利什曼原虫DNA，从而可以提高黑热病病原学的实验室确诊效率。

Description

一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

黑热病(又称内脏利什曼病)是一种由利什曼原虫引起的以发热、进行性脾肿大、三系细胞减少为主要症状的人兽共患病。是危害我国人民健康的五大寄生虫病之一。

黑热病实验诊断可通过血清学检测利曼原虫抗体，骨髓穿刺涂片，显微镜下查找“利杜体”。但目前原虫抗体检测试剂需要进口，国内无生产，显微镜检查需要一定的经验，有较高的误诊及漏诊率。

基因诊断可以检测痕量的病原体核酸片段，具有快速、敏感及特异性高的特点，越来越多应用于病原体的检测。利什曼原虫感染位于巨噬细胞，在患者骨髓或血液DNA中检测利什曼原虫基因片段，可迅速获得病原学的确诊。利什曼原虫基因诊断的方法目前有普通聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)方法，但其需要进行凝胶电泳、紫外显像拍照等步骤，耗时较长。，此外，还有SYBG染料法荧光定量PCR方法，但该方法检测荧光信号为非特异性，需要用熔解曲线进行判定，不同仪器的熔解曲线有一定的差异，难以标准化，有一定的缺陷，且临床标本gDNA成份复杂，容易出现非特异扩增导致假阳性出现。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测利什曼原虫的引物组，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种用于检测利什曼原虫的引物组，包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种包含上述引物组的试剂盒。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述试剂盒还包括TaqMan探针；所述TaqMan探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述TaqMan探针的两端分别连接有报告基团和淬灭基团；所述报告基团为FAM(6-羧基荧光素)基团，所述淬灭基团为小沟结合(Minor Groove Binder，MGB)基团。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述试剂盒还包括阳性质粒标准品；所述阳性质粒标准品的制备方法包括以下步骤：

使用所述引物组对利什曼原虫阳性标本进行PCR扩增，得到PCR产物；

将所述PCR产物进行切胶回收纯化后，再连接至载体，并克隆至大肠杆菌中，提取质粒，得到所述阳性质粒标准品。

作为本发明实施例的另一个优选方案，所述阳性质粒标准品的核苷酸序列如序列表SE Q ID NO:4所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述试剂盒在制备用于检测黑热病的试剂盒中的应用。

与现有技术相比，本发明实施例的有益效果是：

本发明实施例提供的一种用于检测利什曼原虫的引物组，通过使用含有该引物组以及含有核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示的TaqMan探针的试剂盒，可以检测人或动物骨髓标本中是否存在利什曼原虫DNA，从而可以提高黑热病病原学的实验室确诊效率。

具体的，本发明实施例提供的试剂盒可以通过以利什曼原虫特有的动基体小环为靶基因，建立了TaqMan探针法的荧光定量PCR检测利什曼原虫的方法。整个检测时间可在30～40分钟内完成，比普通PCR方法时间显著减少；该方法上下游引物及探针的总长度为55bp，扩增产物长度为83bp，相比SYBG染料法荧光定量PCR方法，可有效保证检测的特异性；本方案还可通过建立标准曲线及回归方程，对标本中目的核酸片段进行绝对定量检测，其检测下限可达到26.98copies/μL，可检出1条原虫/mL。该方法克服了普通PCR方法检测时间长，需要开管电泳易造成产物污染的缺点，也避免了镜下寻找原虫主观因素影响，检出利什曼原虫核酸片段等同于病原体的存在，为黑热病临床诊断及流行病学调查提供了一种简便、敏感、迅速的检测方法。另外，该试剂盒对黑热病发热期病例血液检测也可出现阳性结果。

附图说明

图1为不同浓度的阳性质粒标准品的PCR扩增曲线。

图2为本发明实施例提供的试剂盒在检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR标准回归曲线。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

该实施例提供了一种用于检测利什曼原虫的试剂盒，其包括PCR预混液、无菌无核酸酶双蒸水(ddH₂O)、引物组、探针以及阳性质粒标准品。其中，PCR预混液可以采用生工生物(上海)股份有限公司市售的2×TaqMan Fast qPCR Master Mix产品；上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，具体为：5’-GCAGAAATCCCGTTCAAA-3’；下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，具体为：5’-GCCCTATTTTACACC AACC-3’；TaqMan探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，其两端分别连接有报告基团和淬灭基团；其中，报告基团为FAM基团，淬灭基团为MGB基团，TaqMan探针的核苷酸序列具体为：5’-6FAM-CGCCCCGGAGCCGATTTT-MGB-3’。

另外，阳性质粒标准品的制备方法包括以下步骤：

(1)使用上述引物组对利什曼原虫阳性标本进行PCR扩增，得到PCR产物。其中，阳性质粒标准品的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，具体为：GCAGAAATCCCGTTCAAAAATCGGCCAAAAATGCCAAAAATCGGCTCCGGGGCGGGAAACTG GGGGTTG GTGTAAAATAGGGC。

(2)将所述PCR产物利用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(生工生物(上海)股份有限公司生产)进行回收纯化，取1uL回收产物，加入1uL pESI-T vector载体及1uL 10×Enhancer(上海翊圣生物科技有限公司提供)，ddH₂O补齐至10uL，室温反应5min。加入100μL感受态细胞DH5α，加入500μL LB培养基(不含抗生素)，37℃180rpm振荡培养10min。取200μL菌液涂布含氨苄抗性的LB培养基37℃培养过夜，挑取单克隆菌落，以QIAprep Spi nMiniprep Kit质粒小提试剂盒(Qiagen公司生产)提取质粒，以通用引物(M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGACC)测序，测序结果Blast比对为利什曼原虫动基体小环特异性序列的克隆子，作为阳性克隆。对阳性质粒以NanoDrop分光光度计测定OD值，以阿伏加德罗常数公式计算拷贝数，并换算稀释至10⁸copies/ul，即可得阳性质粒标准品。

需要说明的是，上述的上游引物、下游引物和探针可以溶液的形成存在，其对应的浓度均可设为10μM。

实施例2

该实施例提供了一种利用上述实施例1提供的试剂盒来检测利什曼原虫的方法，其包括以下步骤：

(1)取200μL骨髓或血液样本(骨髓涂片标本可用无菌湿棉拭子涂擦的载玻片表面，振荡混悬于300μL无菌水中，然后取200μL)，使用Qiagen公司生产的DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat No.69504)DNA提取试剂盒，按照血液组织或细菌基组提取程序提取骨髓样本的DNA，得到DNA模板。

(2)分别从上述实施例1提供的试剂盒中取10μL的PCR预混液、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的TaqMan探针与1μL上述得到的DNA模板进行混合后，再用dd H₂O补齐至20μL，得到反应液。

(3)将上述得到的反应液置于荧光PCR仪中进行扩增反应，并收集荧光信号；同时，在相同条件下，以试剂盒中的阳性质粒标准品作为阳性对照，以无菌双蒸水作为空白对照，若在阳性对照CT值<30，空白对照CT值≥35的情况下，骨髓样本的CT值<35，且有明显扩增曲线，则可判断该骨髓样本为阳性，即证明骨髓样本中有利什曼原虫动基体基因片段的存在；若骨髓样本的CT值≥35，则可判断该骨髓样本为阴性，排除骨髓样本中利什曼原虫动基体基因的存在。其中，荧光PCR仪设置如下：报告基团为FAM，淬灭基团为MGB，在ABi系列荧光PCR仪上，淬灭基因选择None，校正荧光None；PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃延伸20s，此步收集荧光信号，共40个循环。

实施例3

该实施例提供了一种利用上述实施例1提供的试剂盒对不同浓度的阳性质粒标准品进行的PCR扩增实验，其包括以下步骤：

(1)将阳性质粒标准品分别稀释成10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴co pies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL，备用。

(2)取1μL不同浓度(10²～10⁸copies/μL)的阳性质粒标准品分别与10μL的PCR预混液、1μL的上游引物、1μL的下游引物、1μL的TaqMan探针进行混合后，再分别用dd H₂O补齐至20μL，得到7组反应液。

(3)将上述得到的7组反应液分别置于荧光PCR仪中进行扩增反应，并收集荧光信号，得到7组PCR扩增曲线，如图1所示。其中，荧光PCR仪设置如下：报告基团为FAM，淬灭基团为MGB，在ABi系列荧光PCR仪上，淬灭基因选择None，校正荧光None；PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性5s，60℃延伸20s，此步收集荧光信号，共40个循环。另外，图1中，从左至右的A～H依依次为10⁸copies/μL、10⁷copies/μL、10⁶copies/μL、10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL阳性质粒标准品所对应的PCR扩增曲线，从中可以看出，本发明实施例提供的试剂盒的检测下限较低。

另外，根据上述不同浓度的阳性质粒标准品的扩增实验，可以计算得到该试剂盒在检测利什曼原虫的实时荧光定量PCR标准回归曲线，如附图2所示，其标准回归曲线方程为Y＝41.926-3.086X，扩增效果(EF)为110.894％，相关系数R²为0.988。根据该标准回归曲线方程可以定量地分析待检测样品中利什曼原虫的存在。

综上所述，本发明实施例提供的试剂盒可应用于黑热病病原学检测，其可以极大地提高黑热病病原学的实验室确诊效率。其中，现有黑热病例骨髓镜检阳性率一般为70％左右，而用利用本发明实施例提供的试剂盒，可使黑热病例骨髓镜检阳性率提高至100％，以及使检测时间缩短至1小时以内。该试剂盒对黑热病发热期病例血液也可检出阳性结果。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

序列表

<110> 刘东立

<120> 一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagaaatcc cgttcaaa 18

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccctatttt acaccaacc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgccccggag ccgatttt 18

<210> 4

<211> 83

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcagaaatcc cgttcaaaaa tcggccaaaa atgccaaaaa tcggctccgg ggcgggaaac 60

tgggggttgg tgtaaaatag ggc 83

Claims

1.一种用于检测利什曼原虫的引物组，其特征在于，所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；所述下游引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

2.一种包含如权利要求1所述引物组的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括TaqMan探针；所述TaqMan探针的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述TaqMan探针的两端分别连接有报告基团和淬灭基团；所述报告基团为FAM基团，所述淬灭基团为MGB基团。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质粒标准品；所述阳性质粒标准品的制备方法包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒标准品的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

7.一种如权利要求2~6中任一项所述试剂盒在制备用于检测黑热病的试剂盒中的应用。