CN111549132A - 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒用于检测以下基因突变：BIRC3基因第2‑9号外显子，BTK基因第15号外显子，MYD88基因第5号外显子，NOTCH1基因第26‑28、34号外显子，PLCG2基因第19‑20、24号外显子，SF3B1基因第14‑15号外显子，TP53基因第5‑9号外显子，WT1基因第7‑10号外显子；所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系，PCR扩增体系包括PCR扩增引物，测序体系包括测序引物。本发明还提供了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测方法。本发明的试剂盒及检测方法高效快速且易于操作，并且经济、简便，具有广泛的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，特别是涉及一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法。
背景技术
白血病是由于造血干或前体细胞基因异常，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，是一类具有高度异质性的恶性血疾病。血液病的治疗现在已经进入到一个精准治疗时代了，通过检测基因的变异状态对疾病进行鉴别诊断、预后分层、靶向治疗，已经成为一个共识，目前专家的共识是应采用MICM的整合诊断方法，也就是联合形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学来诊断与分型，以达到更全面准确的诊断、指导精确治疗的目的。一些恶性血液病的基因突变包括点突变、插入/缺失、拷贝数变异等。
慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种进展缓慢的B淋巴细胞增殖性肿瘤。患者体内出现了过多异常淋巴细胞，聚集在骨髓、外周血、淋巴组织及身体其他器官，进而影响到这些器官的功能。一旦CLL诊断明确，首先应判断是否需要治疗。一般来说，1/3患者无需治疗，1/3患者需要即刻治疗，另外1/3患者诊断时无需治疗、但随着病情进展后续需要治疗。对于CLL患者来说，其病程中治疗的起始点也是重要的转折点，既不应该太早开始，也不应该过度等待，选择适当的时间点开始治疗，同时选择适当的治疗方法至关重要。2018年的《中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南》中指出基因突变检测TP53、NOTCH1(含非编码区)、SF3B1、BIRC3等基因，其中del(17p)和(或)TP53基因突变的患者预后最差，TP53基因缺失或突变已经纳入了CLL患者危险分层中。2020v4版NCCN指南提出，无论TP53是否缺失和/或突变，患者的体能状态如何，都优先推荐靶向药物一线治疗CLL患者，对于在某些极高危的年轻慢淋患者可能需要在前期治疗获得疗效后进行异基因造血干细胞移植做根治性的治疗以提高生存率。
目前，分子生物学中基因突变检测的方法主要有一代测序(Sanger)、高通量测序技术(NGS)、实时荧光PCR(RQ-PCR)、数字PCR等，高通量测序技术(NGS)检测低通量的高昂成本让很多患者望而却步；实时荧光PCR(RQ-PCR)及数字PCR仅仅针对已知的基因突变设计引物探针进行检测。而一代测序具有高准确性、简单、快捷、测序读长长的优势可以真正满足临床诊断检测的需求。
本发明专利中基于2016WHO、NCCN指南、ELN指南以及文献报道，专门开发CLL密切相关的8种基因进行检测，具有明确临床意义的8种基因按功能分类，可以分为信号传导通路的基因，如BIRC3、BTK、MYD88、PLCG2；抑癌基因，如TP53、WT1；RNA剪切复合体，如SF3B1。近年来越来越多与CLL相关基因研究报道，以上8个基因已成为CLL中的热点基因，因此进行系统性的检测有助于CLL血液肿瘤微小残留病灶(MRD)监测和预后治疗指导。
根据查阅以上指南及权威数据库中的文献来选取每种套餐里面需要检测的基因及检测区域，所选取的基因都是在CLL中具体明确临床意义的。再根据GenBank数据库中的基因序列，根据目标区域设计特异性的PCR引物及测序引物，将合成好的特异性PCR引物稀释分别稀释至工作液5pmol/ul，测序引物稀释分别稀释至工作液3.2pmol/ul，并进行大量样本的实验验证及优化，利用该技术对血液肿瘤相关基因的突变检测在临床上已经得到越来越广泛的应用。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的技术中存在的缺陷，提供一种慢性淋巴细胞白血病基因的突变检测试剂盒及方法。本发明的试剂盒和检测方法高效快速且易于操作。
本发明是基于GenBank数据库设计了用于检测慢性淋巴细胞白血病(CLL)8种基因多个外显子的引物序列。
本发明所涉及的慢性淋巴细胞白血病(CLL)相关的8种基因及其经典转录本如下：BIRC3(NM_001165.4)、BTK(NM_000061.2)、MYD88(NM_002468.4)、NOTCH1(NM_017617.3)、PLCG2(NM_002261)、SF3B1(NM_012433.2)、TP53(NM_000546.5)、WT1(NM_024426.4)。所设计的PCR引物及测序引物Tm值基本在60±2℃，对所合成的引物母液进行稀释优化，保证引物的特异性以实现目标区域的扩增，并降低非目标片段的比例。
本发明所设计的与慢性淋巴细胞白血病(CLL)相关的8种基因外显子相关的PCR引物及测序引物，主要是针对已知致病基因的突变位点进行扩增测序，将重点关注以下目标区域(扩增子)整理如下：
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提供了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒用于检测以下基因突变：BIRC3基因第2-9号外显子，BTK基因第15号外显子，MYD88基因第5号外显子，NOTCH1基因第26-28、34号外显子，PLCG2基因第19-20、24号外显子，SF3B1基因第14-15号外显子，TP53基因第5-9号外显子，WT1基因第7-10号外显子；
所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系，所述PCR扩增体系至少包括以下引物序列：
所述测序体系至少包括以下引物序列：
在本发明的一些实施方案中，所述PCR扩增体系还包括2×TransTaq HighFidelityPCR Supermix 1及RNase-Free ddH2O，用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，且各物质含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1 10μl，PCR引物工作液2μl，RNase-Free ddH2O 6μl。
在本发明的一些实施方案中，所述PCR扩增体系还包括2×GC buffer I，dNTPs，TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O，用于扩增NOTCH1基因，且各物质含量为：2×GCbuffer I 10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，RNase-FreeddH2O 4.2μl。
在本发明的一些实施方案中，所述测序体系还包括Bigdye
且各物质含量为：Bigdye
3μl，测序引物工作液1μl。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。
在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照是体积为4.2μl的RNase-Free ddH2O。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。
本发明还提供了一种慢性淋巴细胞白血病基因突变的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用The
Blood DNAKit，购于北京全式金生物技术有限公司，检测DNA的浓度和完整性，将提取的DNA稀释，使得其浓度在10ng/ul以上；
(2)PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增，并收集扩增产物；
PCR扩增体系分为两种，一种用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，具体的各个物质及含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10μl，PCR引物工作液2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 6μl，使得体系总体积为20μl；另一种用于扩增NOTCH1基因，具体的各个物质及含量为：2×GC buffer I10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 4.2μl，使得体系总体积为20μl；
PCR的反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃30s，58℃30s，72℃60s共35个循环，72℃10min，4℃暂存，得PCR扩增产物；
(3)PCR扩增产物的检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性，然后对PCR扩增产物进行消化反应，向PCR扩增产物中加入1.2μl的消化液(外切酶：虾碱酶＝1:1)；
消化反应条件为：37℃，60min；80℃，15min，4℃暂存，得消化产物；
(4)消化产物的测序：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(3)中获取的消化产物为模板，进行一代测序；
一代测序体系为：Bigdye
3μl、消化产物1μl、测序引物1μl；
测序反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃20s，60℃15s，72℃60s共25个循环，72℃5min；
(5)测序结果分析。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤(1)中所述DNA的浓度通过NANO300检测，其中合格样本DNA的A260/A280值在1.8～2.0之间；所述DNA的完整性通过采用琼脂糖凝胶电泳检测。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤(3)中所述琼脂糖凝胶电泳过程为：配制一定体积的1.5％的琼脂糖凝胶，取2μl 3x loading buffer与4μL PCR产物混匀，1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样，进行电泳(电压140V，时间35min)，琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察，电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功。
在本发明的一些实施方案中，所述步骤(5)中利用Variant Reporter软件，并导入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。
借由上述技术方案，本发明的试剂盒及检测方法至少具有下列优点：
(1)本发明提供了一种基于一代测序技术的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，该试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系，能够同时对样本DNA进行扩增和测序。本发明的试剂盒能够高效快速的对慢性淋巴细胞白血病(CLL)中具有明确临床意义的8种基因突变BIRC3、BTK、MYD88、NOTCH1、PLCG2、SF3B1、TP53、WT1进行检测，并且操作简单。
(2)从时间及经济角度而言，作为基因突变检测金标准的一代测序技术在一天内从实验操作到结果的解读，对于通量不高的基因检测，运用此方法更加经济实惠，总而言之，运用一代测序技术检测慢性淋巴细胞白血病中8种基因突变(点突变、插入/缺失)更经济、快速、简便，因此本发明具有广泛的临床应用价值。
(3)本发明试剂盒进行一代测序操作流程的时，会同时做Nuclease-Free Water的阴性对照及阳性对照，监测实验过程不被污染，试剂盒所包含试剂组分可对基因突变定性检测，确保数据结果的准确可靠。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
本发明的具体实施方式及其结果分析由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
图1示出了本发明的一代测序检测流程；
图2示出了本发明的MYD88基因突变位点一代测序验证峰图，具体的基因位点为：MYD88 c.794T>C；p.L265P(杂合)；
图3示出了本发明中TP53基因突变位点一代测序验证峰图，具体的基因位点为：TP53 c.856G>A；p.E286K(杂合)。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方案仅仅用以解释本发明，并不限制本发明。
本发明的实施例提供了慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒用于检测以下基因突变：BIRC3基因第2-9号外显子，BTK基因第15号外显子，MYD88基因第5号外显子，NOTCH1基因第26-28、34号外显子，PLCG2基因第19-20、24号外显子，SF3B1基因第14-15号外显子，TP53基因第5-9号外显子，WT1基因第7-10号外显子；
所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系，所述PCR扩增体系至少包括以下引物序列：
所述测序体系至少包括以下引物序列：
具体地，上述PCR扩增引物可与其他组分构成PCR反应体系，也可自身包含有PCR反应所必须的组分以进行PCR扩增程序。在上述PCR扩增引物各自单独作为PCR反应体系时，该体系中除了各自包含其对应的引物序列之外，还包含2×TransTaq High FidelityPCRSupermix 1及RNase-Free ddH2O，用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，且各物质含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1 10μl，PCR引物工作液2μl，并可通过加RNase-Free ddH2O补充体积。该PCR引物工作液是正向引物和反向引物的混合工作液，其中，PCR正向引物和反向引物比例为1:1。
或者，还包含2×GC buffer I，dNTPs，TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O，用于扩增NOTCH1基因，且各物质含量为：2×GC buffer I 10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，并可通过加RNase-Free ddH2O补充体积。该PCR引物工作液是正向引物和反向引物的混合工作液，其中，PCR正向引物和反向引物比例为1:1。
具体地，上述试剂盒的测序引物可与其他组分构成一代测序反应体系，也可自身包含有测序反应所必须的组分以进行测序过程。在上述测序引物各自单独作为测序体系时，该体系中除了各自包含其对应的引物序列之外，还包含Bigdye
且各物质含量为：Bigdye
3μl，测序引物工作液1μl。测序引物中的正向和反向是分开的，每个测序反应里面只有1条测序引物。
具体地，上述基因外显子的全部PCR引物工作液浓度为5pmol/ul、测序引物工作液浓度为3.2pmol/ul。
具体地，上述试剂盒可添加空白对照，组成为4.2μl RNase-Free ddH2O；和阳性对照，组成为含有上述CLL 8种基因突变类型质粒的混合液，用于试剂的质量控制。
具体地，上述PCR扩增引物和测序反应引物序列分别如表1和表2所示：
表1用于PCR扩增程序中的引物序列
表2用于一代测序程序中的引物序列
本发明的实施例提供的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，检测周期短，操作简便，实现了对于样品的准确、快速检测。
本发明的实施例还提供一种慢性淋巴细胞白血病基因突变的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用The 
Blood DNAKit，购于北京全式金生物技术有限公司，通过NANO300质检确保DNA所测的OD值A260/A280值在1.8～2.0之间，Qubit定量浓度达10ng/ul以上，电泳条带无明显拖尾以确保DNA的完整性，碎片化的样本会导致扩增失败影响实验结果，故合格的样本质量是结果准确可靠的前提。对提取的高浓度DNA样本进行适当的浓度稀释，待测样本、阳性对照样本浓度均在25-50ng/ul左右。
(2)PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的基因组DNA浓度稀释至30ng/ul为模板，进行PCR扩增，并收集扩增产物；
PCR扩增体系分为两种，一种用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，具体的各个物质及含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10μl，PCR引物工作液2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 6μl，使得体系总体积为20μl；另一种用于扩增NOTCH1基因，具体的各个物质及含量为：2×GC buffer I10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 4.2μl，使得体系总体积为20μl；
PCR的反应条件为：根据20μl扩增体系加样结束后，在BIO-RAD T100 PCR仪上运行程序：预变性95℃2min，再进行95℃30s，58℃30s，72℃60s共35个循环，72℃10min，4℃暂存，得PCR扩增产物。
(3)PCR扩增产物的检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性，具体过程为：根据当次实验量配制一定体积的1.5％的琼脂糖凝胶，取2μl 3x loading buffer与4μL PCR产物混匀，1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样，进行电泳(电压140V，时间35min)，琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察。电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功；然后对PCR扩增产物进行消化反应，向PCR扩增产物中加入1.2μl的消化液(外切酶：虾碱酶＝1:1)；
消化反应条件为：T100上进行程序：37℃，60min；80℃，15min，4℃暂存，得消化产物。
(4)消化产物的测序：目的是引入测序Bigdye利用双脱氧链末端终止法原理进行测序：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(3)中获取的消化产物为模板，进行一代测序；
一代测序体系为：Bigdye
3μl、消化产物1μl、测序引物1μl；
测序反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃20s，60℃15s，72℃60s共25个循环，72℃5min；对测序反应后的产物进行除目标单链核酸片段之外的杂质，并上机ABI3730XL。
(5)测序结果分析--基因变异结果分析：将峰图导入Variant Reporter软件，并导入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。
以下通过具体实施例对本发明进行详细阐述。
实施例1
实验所用器材包括：购自北京全式金生物技术有限公司的血液DNA提取试剂盒、2.5MmdNTP、MgCl2、琼脂糖、2×GC buffer I、TaKaRa LA Taq、2×TransTaq HighFidelityPCR Supermix 1、Exonuclease I外切酶、Alkaline Phosphatase(Shrimp)虾碱酶、测序Bigdye、Bigdye Buffer。
阴性对照为体积为4.2μl的RNase-Free ddH2O。
阳性对照为含有上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。
制备慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，具体包括以下步骤：
1.合成引物及探针序列
合成PCR引物序列如上述表1所示，将上述引物序列配制成浓度为5pmol/ul。
合成测序引物序列如上述表2所示，将上述引物序列配制成浓度为3.2pmol/ul。
2.PCR反应体系的制备
分别制备含有上述PCR引物和测序引物的基因突变检测反应体系，各组分按照以下表3-5所示进行配比：
表3用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因的反应体系
表4用于扩增NOTCH1基因的反应体系
表5用于测序反应体系
实施例2
用实施例1制备的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒对待测样品进行检测。
其中，加入基因组DNA后的PCR扩增过程中具有如下组分含量，见表6和7：
表6用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因的组分含量
表7用于扩增NOTCH1基因的组分含量
加入消化产物后的一代测序过程中具有如下组分含量，见表8。
表8测序体系中各组分含量
本实施例中采集20例(编号C1～C20)疑似、初诊或复发的CLL骨髓血或外周血样本并从中提取基因组DNA，用实施例1中得到的基因突变检测试剂盒检测待测样品中是否存在相应的基因突变，具体操作步骤为：
(1)样品基因组DNA的提取
使用DNA提取试剂盒(The
Blood DNA Kit，购自北京全式金生物技术有限公司)提取上述CLL骨髓血或外周血样本的基因组DNA。通过NANO300质检确保DNA所测的OD值A260/A280值在1.8～2.0之间，Qubit定量浓度达10ng/ul以上，电泳条带无明显拖尾以确保DNA的完整性，碎片化的样本会导致扩增失败影响实验结果，故合格的样本质量是结果准确可靠的前提。对提取的高浓度DNA样本进行适当的浓度稀释，待测样本、阳性对照样本浓度均在25-50ng/ul左右。
(2)PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的基因组DNA浓度稀释至30ng/ul为模板，进行PCR扩增，并收集扩增产物；
PCR扩增体系分为两种，一种用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，具体的各个物质及含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10μl，PCR引物工作液2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 6μl，使得体系总体积为20μl；PCR引物工作液是正向引物和反向引物的混合工作液，PCR正向引物和反向引物比例为1:1；
另一种用于扩增NOTCH1基因，具体的各个物质及含量为：2×GC buffer I 10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，基因组DNA 2μl，RNase-FreeddH2O 4.2μl，使得体系总体积为20μl；PCR引物工作液是正向引物和反向引物的混合工作液，PCR正向引物和反向引物比例为1:1；
PCR的反应条件为：根据20μl扩增体系加样结束后，在BIO-RAD T100 PCR仪上运行程序：预变性95℃2min，再进行95℃30s，58℃30s，72℃60s共35个循环，72℃10min，4℃暂存，得PCR扩增产物。
(3)PCR扩增产物的检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性，具体过程为：根据当次实验量配制一定体积的1.5％的琼脂糖凝胶，取2μl 3x loading buffer与4μL PCR产物混匀，1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样，进行电泳(电压140V，时间35min)，琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察。电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功；然后对PCR扩增产物进行消化反应，向PCR扩增产物中加入1.2μl的消化液(外切酶：虾碱酶＝1:1)；
消化反应条件为：T100上进行程序：37℃，60min；80℃，15min，4℃暂存，得消化产物。
(4)消化产物的测序：目的是引入测序Bigdye利用双脱氧链末端终止法原理进行测序：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(3)中获取的消化产物为模板，进行一代测序；
一代测序体系为：Bigdye
3μl、消化产物1μl、测序引物1μl；
测序反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃20s，60℃15s，72℃60s共25个循环，72℃5min；对测序反应后的产物进行除目标单链核酸片段之外的杂质，并上机ABI3730XL。
(5)测序结果分析--基因变异结果分析：将峰图导入Variant Reporter软件，并导入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。
具体的检测结果如表9和表10所示：
表9.编号C1～C10的患者一代测序的PCR检测方法结果汇总表
表10编号C11～C20的患者一代测序的PCR检测方法结果汇总表
对20例(编号C1～C20)初诊、难治或复发的慢性淋巴细胞白血患者用金标准测序技术检测8个基因目标区域，经过COSMIC数据库、ClinVar数据库、NCCN指南及血液肿瘤国内专家共识等查询各基因突变位点总结如表11所示：
表11各基因突变位点总结汇总
综上结果可以看出，从时间及经济角度而言，作为基因突变检测金标准的一代测序技术在一天内从实验操作到结果的解读，对于通量不高的基因检测，运用此方法更加经济实惠，总而言之，运用一代测序技术检测慢性淋巴细胞白血病中8种基因突变(点突变、插入/缺失)更经济、快速、简便，因此本发明具有广泛的临床应用价值。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 南京实践医学检验有限公司
<120> 一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒及方法
<160> 92
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<400> 28
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<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcagtgatct gatggcattc tt 22
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gacctccagg gtcgcaatt 19
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gatgaaatac tgtgcttagg aggct 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gatgaaatac tgtgcttagg aggct 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
aactggctac tgctttggca tgt 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggtcgtggct gtagactggt t 21
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaacattca acttgcaatt ttcaggg 27
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
taaggtacgc atgcagttaa aacc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gtgccatctc tcagctccag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
tccaaaagag cccctgtcac 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gctcgctcac cttagacttc a 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
aaatccgacg tggaagatga g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tctctcacca ttaccattcc aa 22
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<400> 43
tgtgctttga ggcagactga 20
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<211> 20
<212> DNA
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<400> 44
ttcagagatt tggaccaggc 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgggaaggtt agaaacac 18
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtgtttctaa ccttcccaaa 20
<210> 47
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtgtttctaa ccttcccaaa 20
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gataatctat attgatcag 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttgctacact gacatgga 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gggaacatga ttatgtaat 19
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtcttctact tctcacccaa ac 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cgcaatggaa acacaatctg 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caaaaggcta atggagaaag acgta 25
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ccgctgttat ccaggtttct 20
<210> 57
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tgaaggaagc tgaggaacct gt 22
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctcatcctgc ccttccttct 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgttcaggt tccagcagca 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gcaagcacag caatcagaac 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tcacccccaa agcaacaatg a 21
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<212> DNA
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ggtcctgctg tgtggttaga 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
tcacaagaca caagcatcgg t 21
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<212> DNA
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<400> 66
gcaaagccct ccggtatttc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agcccttaat gtgtagttgg gg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gcaagtatag aaaaaggtgg 20
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<400> 69
ctctattctg ccaaggccta 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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aggatagcca agttcagcaa a 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaatgatatc caatcacagg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cccaagtctg agaatgaaag t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
ggatttaagc ctgattgaac 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ccgtgccatt gtgcttg 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
acagctccaa gtgccaccat 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caggcaccga atctctaga 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cggcattcca ggataggg 18
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cacttcggag ggtgtgatct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctcgctgtag aagctgccct 20
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<212> DNA
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ttgtaaccgg tcacaaaggc 20
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<212> DNA
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gaagaaggca tgggtgggaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
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<212> DNA
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<400> 85
ttgggcagga taaaatcgcg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
agatccagca agtgccagca t 21
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
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acggtgtttg agcccgaggt 20
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<212> DNA
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ggtccataag tcaatgactg ag 22
<210> 89
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tgtgtcacgc cgttctctag 20
<210> 90
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<212> DNA
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<400> 90
tccactgcca gctctgcctt 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
atgtagtagg aacgcgggag 20
<210> 92
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gtcatggaca gatgagcaga g 21
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gccccttccc tttcatccaa 20
Claims (10)
1.一种慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，所述试剂盒用于检测以下基因突变：BIRC3基因第2-9号外显子，BTK基因第15号外显子，MYD88基因第5号外显子，NOTCH1基因第26-28、34号外显子，PLCG2基因第19-20、24号外显子，SF3B1基因第14-15号外显子，TP53基因第5-9号外显子，WT1基因第7-10号外显子；
所述试剂盒包括PCR扩增体系和测序体系，所述PCR扩增体系至少包括以下引物序列：
所述测序体系至少包括以下引物序列：
2.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，其中，所述PCR扩增体系还包括2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix 1及RNase-Free ddH2O，用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，且各物质含量为：2×TransTaq HighFidelity PCR Supermix 1 10μl，PCR引物工作液2μl，RNase-Free ddH2O 6μl。
3.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，其中，所述PCR扩增体系还包括2×GC buffer I，dNTPs，TaKaRa LA Taq酶及RNase-Free ddH2O，用于扩增NOTCH1基因，且各物质含量为：2×GC buffer I 10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，RNase-Free ddH2O 4.2μl。
4.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，其中，所述测序体系还包括
mix，且各物质含量为：
mix 3μl，测序引物工作液1μl。
5.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为含有上述CLL 8种基因热点突变类型质粒的混合液。
6.根据权利要求1所述的慢性淋巴细胞白血病基因突变检测试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照是体积为4.2μl的RNase-Free ddH2O。
7.一种慢性淋巴细胞白血病基因突变的检测方法，所述的方法包括以下步骤：
(1)DNA提取：获取待测样品的DNA，DNA的提取采用The 
Blood DNA Kit，购于北京全式金生物技术有限公司，检测DNA的浓度和完整性，将提取的DNA稀释，使得其浓度在10ng/ul以上；
(2)PCR扩增：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行PCR扩增，并收集扩增产物；
PCR扩增体系分为两种，一种用于扩增BIRC3，BTK，MYD88，PLCG2，SF3B1，TP53以及WT1基因，具体的各个物质及含量为：2×TransTaq High Fidelity PCR Supermix1 10μl，PCR引物工作液2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 6μl，使得体系总体积为20μl；另一种用于扩增NOTCH1基因，具体的各个物质及含量为：2×GC buffer I 10μl，PCR引物工作液2μl，dNTPs 1.6μl，TaKaRa LA Taq酶0.2μl，基因组DNA 2μl，RNase-Free ddH2O 4.2μl，使得体系总体积为20μl；
PCR的反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃30s，58℃30s，72℃60s共35个循环，72℃10min，4℃暂存，得PCR扩增产物；
(3)PCR扩增产物的检测：利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的完整性，然后对PCR扩增产物进行消化反应，向PCR扩增产物中加入1.2μl的消化液(外切酶：虾碱酶＝1:1)；
消化反应条件为：37℃，60min；80℃，15min，4℃暂存，得消化产物；
(4)消化产物的测序：采用本发明所述的试剂盒，以步骤(3)中获取的消化产物为模板，进行一代测序；
一代测序体系为：
mix 3μl、消化产物1μl、测序引物1μl；
测序反应条件为：预变性95℃2min，再进行95℃20s，60℃15s，72℃60s共25个循环，72℃5min；
(5)测序结果分析。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述步骤(1)中所述DNA的浓度通过NANO300检测，其中合格样本DNA的A260/A280值在1.8～2.0之间；所述DNA的完整性通过采用琼脂糖凝胶电泳检测。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述步骤(3)中所述琼脂糖凝胶电泳过程为：配制一定体积的1.5％的琼脂糖凝胶，取2μl 3x loading buffer与4μL PCR产物混匀，1x的EDTA缓冲液中用移液器点胶上样，进行电泳(电压140V，时间35min)，琼脂糖凝胶电泳电泳结束后使用天能成像系统观察，电泳条带明亮且在800bp-1500bp则为扩增成功。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其中，所述步骤(5)中利用Variant Reporter软件，并导入该峰图对应的基因参考序列和引物进行基因突变分析。
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- 2020-05-07 CN CN202010377069.1A patent/CN111549132A/zh active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20200818 |