CN111549002B - 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 - Google Patents
一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111549002B CN111549002B CN202010485933.XA CN202010485933A CN111549002B CN 111549002 B CN111549002 B CN 111549002B CN 202010485933 A CN202010485933 A CN 202010485933A CN 111549002 B CN111549002 B CN 111549002B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- liquid storage
- reaction
- tank
- fixedly connected
- wall
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 title claims abstract description 39
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 212
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 121
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims abstract description 118
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 84
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims abstract description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 61
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 claims description 45
- 239000007789 gas Substances 0.000 claims description 43
- 239000003570 air Substances 0.000 claims description 31
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 26
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 17
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 17
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 claims description 11
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 claims description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 9
- 229910001285 shape-memory alloy Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 10
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 abstract description 9
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 32
- 230000008569 process Effects 0.000 description 22
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 9
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 8
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 3
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000012514 monoclonal antibody product Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 208000009525 Myocarditis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 208000027503 bloody stool Diseases 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 208000035861 hematochezia Diseases 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/34—Internal compartments or partitions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/48—Holding appliances; Racks; Supports
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
- C12M29/08—Air lift
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/14—Pressurized fluid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2511/00—Cells for large scale production
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明属于犬细小病毒单克隆抗体技术领域，具体的说是一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法；所述生物反应器包括储流仓和反应仓；所述反应仓上表面通过斜板固连有储流仓；所述储流仓包括储液箱和集液箱；所述储流仓内壁中设有支撑板，且支撑板为弧形设计；所述储液箱上方套接有储液盖；所述储液箱外表面固连有集液箱；所述储液箱内壁中开设有均匀布置的第一通孔；每个所述第一通孔内壁中均固连有控制阀；本发明主要用于解决现有的生物反应器培养杂交瘤细胞生产犬细小病毒单克隆抗体的技术培养的细胞密度较低，培养的抗体效价较低，产品需要进行浓缩并且培养中需要添加血清，使下游工艺变得复杂，增加了副反应风险的问题。
Description
技术领域
本发明属于犬细小病毒单克隆抗体技术领域，具体的说是一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法。
背景技术
犬细小病毒病（canine parvovirus disease，CPVD）是由犬细小病毒（canineparvovirus，CPV）感染引起的病毒性传染病，该病主要有两种临床表现性，一种是出血性肠炎型，表现为剧烈呕吐、血便、白细胞大量减少；一种是非化脓性心肌炎型，病犬会突然死亡。该病传播速度快，发病率高，幼犬的死亡率高达70%，成年犬死亡率相对较低但是隐性带毒的现象普遍存在。1978年，Kelly等首次从患出血性肠炎的病犬体内分离到CPV，随后，世界上很多国家和地区陆续报道本病的流行。1982年，梁士哲等最早报道中国出现类似CPV所致的犬出血性肠炎；1983年，徐汉坤等人正是分离到CPV。自此，CPVD迅速在我国东北、华北、南方等地区犬群中发生和蔓延，给养犬业的健康发展带来了具大的危害。
目前犬细小病毒病的治疗方法主要有对症疗法、补液疗法、禁饮禁食疗法和特异性疗法等。近年来，单克隆抗体技术也被广泛的应用于动物传染病研究的各个领域。与高免血清相比，单克隆抗体具有特异性强、质地均一、效价高、可以快速、大量、无限地生产等优点。但是目前生产的单抗大多是鼠源性的，在临床应用方面还存在着很大的弊端。主要是因为鼠源单抗与 NK 等免疫细胞表面 Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)较弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥 ADCC 作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主过敏反应。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病患带来严重的后果，因此鼠源性单克隆抗体还应改善才能应用于临床。这促使人们继续努力，探索更为理想的抗体生产技术。关于犬细小病毒单克隆抗体的介绍，可参见刊期：周灵，犬细小病毒抗原及抗体检测方法的建立，吉林农业大学，2017（12），但是，目前的犬细小病毒单克隆抗体的培养方法仍存在一定的问题，具体包括以下方面：
现有的生物反应器培养杂交瘤细胞生产犬细小病毒单克隆抗体的技术培养的细胞密度较低，培养的抗体效价较低，产品需要进行浓缩并且培养中需要添加血清，使下游工艺变得复杂，增加了副反应风险。
本发明中发现，可以采用生物反应器流加培养的方式高密度培养杂交瘤细胞来生产高效价治疗性犬细小病毒单克隆抗体。通过这样的方法生产的治疗性犬细小病毒单克隆抗体效价高，无血清培养使副反应风险降低，简化了下游工艺，显著提高治疗性单克隆抗体的质量。
鉴于此，为了克服上述技术问题，本公司设计研发了一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，其中包括在生物反应器中高密度培养分泌抗犬细小病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞，以及收获所述抗犬细小病毒单克隆抗体，解决了上述技术问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提出的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，本发明主要用于解决现有的生物反应器培养杂交瘤细胞生产犬细小病毒单克隆抗体的技术培养的细胞密度较低，培养的抗体效价较低，产品需要进行浓缩并且培养中需要添加血清，使下游工艺变得复杂，增加了副反应风险的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：
S1：从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以无血清杂交瘤细胞培养液在125ml摇瓶中进行细胞扩大培养；通过使用无血清杂交瘤细胞培养液对细胞进行培养可以提高杂交瘤细胞的繁殖速度，从而加快犬培养细小病毒单克隆抗体的效率；
S2：将生物反应器彻底清洗、高温高压灭菌后安装调试，校正pH电极与溶氧电极，分别开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的供气装置，设定生物反应器培养条件：温度36～37℃、pH值6.75～6.95、溶氧20～50%、搅拌桨转速60～100转/分钟；通过对生物反应器进行清洗和高温灭菌可以使生物反应器处于无菌状态，从而防止生物反应器内含有细菌和杂质影响细胞繁殖速度，通过将生物反应器进行调整，可以为细胞提高最为适宜的生存和繁殖条件，从而可以进一步提高细胞的繁殖效率；
S3:当生产细胞种子增殖达到合适总量，细胞终浓度在8×105～1×106cell/ml范围内时，此时将细胞种子接种到生物反应器中的储液箱内，并启动生物反应器；
S4：待细胞增殖进入对数中期24小时时，取样计数并留样做效价检测，按总体积4%加入无血清流加培养基，之后每24小时取样计数并留样做效价检测，按总体积4%加入无血清流加培养基，直到样品血凝抑制效价达到1:2560以上时收获培养液；通过每24小时内向生物反应器内流加无血清培养基，可以提高细胞种子的密度，同时获得更高效价的犬细小病毒单克隆抗体产品，产品血凝抑制效价可达1:2560以上，是现有技术的10～20倍；
S5：当培养液培养完成后对培养液进行收集，对收集后的培养液经过除菌过滤，无菌配制、定量分装到灭菌容器中即得到犬细小病毒单克隆抗体；
其中，所述生物反应器包括储流仓和反应仓；所述反应仓上表面通过斜板固连有储流仓；所述储流仓包括储液箱和集液箱；所述储流仓内壁中设有支撑板，且支撑板为弧形设计；所述储液箱上方套接有储液盖，且储液盖下表面安装有压力阀；所述储液箱外表面固连有集液箱；所述储液箱内壁中开设有均匀布置的第一通孔，且第一通孔均与集液箱连通；每个所述第一通孔内壁中均固连有控制阀，且控制阀在初始状态下为关闭设置；所述反应仓包括反应箱，且反应箱为”工”字形设计；所述反应箱底部端面固连有反应池,且反应池为圆弧形设计；所述反应箱上表面固连有电机，且电机通过导线与控制器电连接；所述电机驱动轴上固连有圆杆，且圆杆穿过反应箱延伸至反应池内；所述圆杆伸入反应箱内的一侧外表面固连有第一搅拌桨；所述圆杆伸入反应池内的一侧外表面固连有第二搅拌桨；所述第一搅拌桨周围与反应箱内壁中通过转轴转动连接有均匀布置的第一转叶；所述反应箱内壁中安装有均匀布置的第一导管，且第一导管均为弹性设计；每个所述第一导管另一端均延伸至储液箱内并置于支撑板上方；所述反应池底部中心位置安装有进气管，且进气管用于通入空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体；
工作时，现有的生物反应器培养杂交瘤细胞生产犬细小病毒单克隆抗体的技术培养的细胞密度较低，培养的抗体效价较低，产品需要进行浓缩并且培养中需要添加血清，使下游工艺变得复杂，增加了副反应风险的问题，本发明制作的生物反应器与本发明的制作犬细小病毒单克隆抗体的方法进行结合可以使细胞种子进行高细胞密度培养，细胞密度可达2～3×107cell/ml，是现有生物反应器培养杂交瘤细胞密度的2～3倍，从而可以获得更高效价的产品，同时本产品的血凝抑制效价可达1:2560以上，是现有技术的10～20倍，产品无需浓缩即可配制分装，使下游工艺极大的简化，通过使用无血清培养基可以大大降低外源病毒与支原体污染、内毒素超标等风险，显著降低副反应，在使用本发明制作的生物反应器时，首先将储液箱上方的储液盖打开并将无血清杂交瘤细胞培养液和营养液注入储液箱内，同时向集液槽内注入占总体积百分之四的无血清培养基，然后关闭储液盖，此时控制器控制启动生物反应器，并向生物反应器内通过进气管通入空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体，此时储液槽内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液在重力的作用下通过第一导管流入反应箱内，由于第一导管均第一搅拌桨相互对应，通过第一导管流入反应箱内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液可以被第一搅拌桨冲散，在此过程中可以使细胞种子扩散均匀，从而可以提高细胞种子的繁殖密度，同时防止细胞种子之间过于密集，从而降低细胞种子的繁殖速度，由于反应箱内壁中固连有均匀布置的第一转叶，当无血清杂交瘤细胞培养液和营养液流经第一转叶时，可以进一步扩散无血清杂交瘤细胞培养液，从而可以为细胞种子提供较为适宜的繁殖环境，当反应箱内的液体过多时，可以流入反应池内，由于反应池内设有第二搅拌桨，从而可以再次对无血清杂交瘤细胞培养液进行搅动，在此过程中可以进一步扩散细胞种子，从而间接提高细胞种子的密度，当反应仓内的气体膨胀时，气体可以通过第一导管流入储液箱内，当气体流入储液箱内时，可以将储液箱内的无血清杂交瘤细胞培养液完全压入反应仓内，此时将储液盖打开，当细胞种子在反应池内繁殖到对数中期时，将储液盖关闭后，此时控制器控制第一通孔内的控制阀打开，当控制阀打开后，集液箱内的无血清培养基会通过第一通孔流入储液箱内，此时储液箱内的气体会通过第一通孔流入集液箱内，当气体流入集液箱内时，可以将集液箱内的无血清培养基匀速的压入储液箱内，此时反应仓内的气体在通过第一导管流入储液箱内时，可以将储液箱内的无血清培养基通过第一导管压入反应箱内，当无血清培养基流入反应箱内时，第一搅拌桨可以对无血清培养基进行初次搅动，从而可以使无血清培养基扩散在无血清杂交瘤细胞培养液内，在此过程中可以为培养液内的细胞种子提供营养物质，从而可以提高细胞种子的繁殖速度，当无血清培养基流入反应池内时，第二搅拌桨可以再次对无血清培养基进行搅动，从而可以进一步提高细胞种子与培养液的接触程度，同时还可以提高细胞种子的血凝抑制效价，当集液箱内的液体流加完成后，此时控制器关闭控制阀，并向集液箱内再次加入无血清培养基，每隔小时向反应仓内流加，以此循环，由于储液盖底部安装有压力阀，从而可以将反应器内的气体压力排出反应器，在此过程中可以防止反应器内的气体压力过大，影响细胞种子的繁殖过程。
优选的，所述圆杆上端延伸至储液箱内，并与支撑板固连；所述支撑板与储液箱为转动连接；所述圆杆内壁中开设有圆槽，且圆槽贯穿圆杆设计；所述第一搅拌桨的桨叶内壁中均开设有长槽，且长槽均与圆槽连通，所述长槽内壁中开设有均匀布置的圆孔；所述第一搅拌桨与第二搅拌桨的内部结构完全相同；
工作时，由于圆杆延伸至储液箱内，在电机带动圆杆转动的过程中，圆杆会带动支撑板转动，在此过程中可以带动储液箱内的培养基转动，在此过程中可以防止储液箱内的培养基发生沉淀，从而降低培养基的扩散程度，由于圆杆内壁中开设有圆槽，储液箱内的培养基可以流入圆槽内，由于圆弧槽与搅拌桨内壁中开设的长槽连通，圆槽内的培养基可以流入长槽内，流入长槽内的培养基在通过均匀布置的圆孔流出外界，在此过程中可以提高培养基的扩散程度，从而提高细胞种子与培养基的接触程度，使细胞种子快速繁殖。
优选的，所述支撑板上表面固连有均匀布置的搅拌杆；每个所述搅拌杆外表面均固连有螺旋叶；
工作时，由于支撑板上表面固连有均匀布置的搅拌杆，在支撑板转动的过程中可以带动搅拌杆转动，在此过程中搅拌杆可以对储液箱内的培养基进行搅动，从而可以进一步提高培养基的扩散程度，使培养基内的营养物质分布均匀，由于搅拌杆外表面固连有螺旋叶，在搅拌杆转动的过程中可以带动螺旋叶在培养基内移动，在此过程中可以进一步提高培养基的扩散程度，从而防止培养基内的营养物质分布不均匀。
优选的，每个所述第一导管空腔内与反应箱内壁中均安装有第二导管，且第二导管另一端均延伸至集液箱上方空腔内；所述第二导管伸入集液箱内的管头处安装有单向阀；所述储液箱内壁为橡胶材料制成；所述储液箱内壁中固连有厚度为一到两厘米的锯齿状记忆合金；每个所述第二导管内壁中均开设有均匀布置的小孔；所述集液箱上方内壁中固连有注液阀；
工作时，由于第二导管延伸至集液箱上方空腔内，反应仓内的气体可以通过第二导管流入集液箱内，当气体流入集液箱内时，由于集液箱内的压力增大，从而挤压储液箱，当储液箱受到挤压后储液箱的内壁会向相对一侧弯曲，此时将控制阀打开，当控制阀打开后集液箱内的无血清培养基会迅速压入储液箱内，当无血清培养基压入储液箱内后，储液箱和集液箱内的气压逐渐平衡，由于储液箱内壁中为橡胶材料制成且内壁中固连有记忆合金，从而可以使弯曲的储液箱缓慢的恢复到初始状态，在储液箱恢复的过程中可以通过第一导管将反应池内的培养液抽入储液箱内，当培养液流入储液箱内时，可以与无血清培养基进行初步混合，从而可以提高细胞种子与无血清培养基的相融程度，当储液箱内的气压达到平衡后，此时储液箱内的无血清培养基通过第一导管流入反应池内，由于第二导管内壁中开设有均匀布置的小孔，第二导管内的气体可以通过小孔喷出外界，当第一导管在流液时，喷出的气体可以对第一导管内的培养基进行吹动，在此过程中可以提高培养基的扩散程度，同时还可以提高培养基的活性，从而提高细胞种子的繁殖效率。
优选的，所述反应池内壁中开设有弧形槽，且弧形槽均与进气管连通；所述弧形槽内壁中开设有均匀布置的第二通孔，且第二通孔均与反应池连通；
工作时，由于进气管与弧形槽连通，流入弧形槽内的气体可以通过均匀布置的第二通孔流入反应池内，在此过程中，可以使通入的空气、氧气、氮气和二氧化碳与培养液充分接触，从而可以为细胞种子提供所需的物质，同时还可以为细胞种子提高较为适宜的生存和繁殖的环境。
优选的，每个所述第二通孔上方与反应池294内表面位置均固连有橡胶层，且橡胶层均包裹第二通孔设计；每个所述橡胶层内壁中开设有均匀布置的微孔；
工作时，由于第二通孔外部均固连有橡胶层，从而第二通孔流出的气体可以通过均匀布置的微孔流入反应池内，在此过程中可以进一步细化气体，可以使气体更好的与培养液相融，从而可以更全面的为细胞种子提供所需物质和提供适宜的生存环境，同时还可以防止反应池内的培养液流入弧形槽内。
本发明的有益效果如下：
1.本发明通过流加无血清培养基，可以使细胞种子进行高细胞密度培养，细胞密度可达2～3×107cell/ml，是现有生物反应器培养杂交瘤细胞密度的2～3倍，从而可以获得更高效价的产品，同时本产品的血凝抑制效价可达1:2560以上，是现有技术的10～20倍，产品无需浓缩即可配制分装，使下游工艺极大的简化，通过使用无血清培养基可以大大降低外源病毒与支原体污染、内毒素超标等风险，显著降低副反应。
2.本发明通过设置支撑板，由于圆杆与支撑板固连，在圆杆转动的过程中，圆杆会带动支撑板转动，在此过程中可以带动储液箱内的培养基转动，在此过程中可以防止储液箱内的培养基发生沉淀，从而降低培养基的扩散程度，由于圆杆内壁中开设有圆槽，储液箱内的培养基可以流入圆槽内，由于圆弧槽与搅拌桨内壁中开设的长槽连通，圆槽内的培养基可以流入长槽内，流入长槽内的培养基在通过均匀布置的圆孔流出外界，在此过程中可以提高培养基的扩散程度，从而提高细胞种子与培养基的接触程度，使细胞种子快速繁殖。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1是本发明的方法流程图；
图2是本发明生物反应器的主体图；
图3是本发明生物反应器的剖视图；
图4是图3中A处局部放大图；
图5是图3中B处局部放大图；
图6是图3中C处局部放大图；
图中：储流仓1、斜板11、储液箱12、支撑板13、搅拌杆14、螺旋叶15、储液盖16、第一通孔17、集液箱19、气阀191、反应仓2、反应箱21、电机22、圆杆23、第一搅拌桨24、第二搅拌桨25、第一转叶26、圆槽27、长槽28、圆孔29、第一导管291、第二导管292、小孔293、反应池294、进气管295、弧形槽296、第二通孔297、橡胶层298、微孔299、压力阀211，记忆合金221。
具体实施方式
使用图1-图6对本发明一实施方式的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法进行如下说明。
如图1-图6所示，本发明所述的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，该方法包括以下步骤：
S1：从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以无血清杂交瘤细胞培养液在125ml摇瓶中进行细胞扩大培养；通过使用无血清杂交瘤细胞培养液对细胞进行培养可以提高杂交瘤细胞的繁殖速度，从而加快犬培养细小病毒单克隆抗体的效率；
S2：将生物反应器彻底清洗、高温高压灭菌后安装调试，校正pH电极与溶氧电极，分别开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的供气装置，设定生物反应器培养条件：温度36～37℃、pH值6.75～6.95、溶氧20～50%、搅拌桨转速60～100转/分钟；通过对生物反应器进行清洗和高温灭菌可以使生物反应器处于无菌状态，从而防止生物反应器内含有细菌和杂质影响细胞繁殖速度，通过将生物反应器进行调整，可以为细胞提高最为适宜的生存和繁殖条件，从而可以进一步提高细胞的繁殖效率；
S3:当生产细胞种子增殖达到合适总量，细胞终浓度在8×105～1×106cell/ml范围内时，此时将细胞种子接种到生物反应器中的储液箱12内，并启动生物反应器；
S4：待细胞增殖进入对数中期24小时时，取样计数并留样做效价检测，按总体积4%加入无血清流加培养基，之后每24小时取样计数并留样做效价检测，按总体积4%加入无血清流加培养基，直到样品血凝抑制效价达到1:2560以上时收获培养液；通过每24小时内向生物反应器内流加无血清培养基，可以提高细胞种子的密度，同时获得更高效价的犬细小病毒单克隆抗体产品，产品血凝抑制效价可达1:2560以上，是现有技术的10～20倍；
S5：当培养液培养完成后对培养液进行收集，对收集后的培养液经过除菌过滤，无菌配制、定量分装到灭菌容器中即得到犬细小病毒单克隆抗体；
其中，所述生物反应器包括储流仓1和反应仓2；所述反应仓2上表面通过斜板11固连有储流仓1；所述储流仓1包括储液箱12和集液箱19；所述储流仓1内壁中设有支撑板13，且支撑板13为弧形设计；所述储液箱12上方套接有储液盖16，且储液盖16下表面安装有压力阀211；所述储液箱12外表面固连有集液箱19；所述储液箱12内壁中开设有均匀布置的第一通孔17，且第一通孔17均与集液箱19连通；每个所述第一通孔17内壁中均固连有控制阀，且控制阀在初始状态下为关闭设置；所述反应仓2包括反应箱21，且反应箱21为”工”字形设计；所述反应箱21底部端面固连有反应池294,且反应池294为圆弧形设计；所述反应箱21上表面固连有电机22，且电机22通过导线与控制器电连接；所述电机22驱动轴上固连有圆杆23，且圆杆23穿过反应箱21延伸至反应池294内；所述圆杆23伸入反应箱21内的一侧外表面固连有第一搅拌桨24；所述圆杆23伸入反应池294内的一侧外表面固连有第二搅拌桨25；所述第一搅拌桨24周围与反应箱21内壁中通过转轴转动连接有均匀布置的第一转叶26；所述反应箱21内壁中安装有均匀布置的第一导管291，且第一导管291均为弹性设计；每个所述第一导管291另一端均延伸至储液箱12内并置于支撑板13上方；所述反应池294底部中心位置安装有进气管295，且进气管295用于通入空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体；
工作时，现有的生物反应器培养杂交瘤细胞生产犬细小病毒单克隆抗体的技术培养的细胞密度较低，培养的抗体效价较低，产品需要进行浓缩并且培养中需要添加血清，使下游工艺变得复杂，增加了副反应风险的问题，本发明制作的生物反应器与本发明的制作犬细小病毒单克隆抗体的方法进行结合可以使细胞种子进行高细胞密度培养，细胞密度可达2～3×107cell/ml，是现有生物反应器培养杂交瘤细胞密度的2～3倍，从而可以获得更高效价的产品，同时本产品的血凝抑制效价可达1:2560以上，是现有技术的10～20倍，产品无需浓缩即可配制分装，使下游工艺极大的简化，通过使用无血清培养基可以大大降低外源病毒与支原体污染、内毒素超标等风险，显著降低副反应，在使用本发明制作的生物反应器时，首先将储液箱12上方的储液盖16打开并将无血清杂交瘤细胞培养液和营养液注入储液箱12内，同时向集液槽内注入占总体积百分之四的无血清培养基，然后关闭储液盖16，此时控制器控制启动生物反应器，并向生物反应器内通过进气管295通入氧气、氮气和二氧化碳四种气体，此时储液槽内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液在重力的作用下通过第一导管291流入反应箱21内，由于第一导管291均第一搅拌桨24相互对应，通过第一导管291流入反应箱21内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液可以被第一搅拌桨24冲散，在此过程中可以使细胞种子扩散均匀，从而可以提高细胞种子的繁殖密度，同时防止细胞种子之间过于密集，从而降低细胞种子的繁殖速度，由于反应箱21内壁中固连有均匀布置的第一转叶26，当无血清杂交瘤细胞培养液和营养液流经第一转叶26时，可以进一步扩散无血清杂交瘤细胞培养液，从而可以为细胞种子提供较为适宜的繁殖环境，当反应箱21内的液体过多时，可以流入反应池294内，由于反应池294内设有第二搅拌桨25，从而可以再次对无血清杂交瘤细胞培养液进行搅动，在此过程中可以进一步扩散细胞种子，从而间接提高细胞种子的密度，当反应仓2内的气体膨胀时，气体可以通过第一导管291流入储液箱12内，当气体流入储液箱12内时，可以将储液箱12内的无血清杂交瘤细胞培养液完全压入反应仓2内，当细胞种子在反应池294内繁殖到对数中期时，此时控制器控制第一通孔17内的控制阀打开，当控制阀打开后，集液箱19内的无血清培养基会通过第一通孔17流入储液箱12内，此时储液箱12内的气体会通过第一通孔17流入集液箱19内，当气体流入集液箱19内时，可以将集液箱19内的无血清培养基匀速的压入储液箱12内，此时反应仓2内的气体在通过第一导管291流入储液箱12内时，可以将储液箱12内的无血清培养基通过第一导管291压入反应箱21内，当无血清培养基流入反应箱21内时，第一搅拌桨24可以对无血清培养基进行初次搅动，从而可以使无血清培养基扩散在无血清杂交瘤细胞培养液内，在此过程中可以为培养液内的细胞种子提供营养物质，从而可以提高细胞种子的繁殖速度，当无血清培养基流入反应池294内时，第二搅拌桨25可以再次对无血清培养基进行搅动，从而可以进一步提高细胞种子与培养液的接触程度，同时还可以提高细胞种子的血凝抑制效价，当集液箱19内的液体流加完成后，此时控制器关闭控制阀，并向集液箱19内再次加入无血清培养基，每隔24小时向反应仓2内流加，以此循环，由于储液盖16底部安装有压力阀211，从而可以将反应器内的气体压力排出反应器，在此过程中可以防止反应器内的气体压力过大，影响细胞种子的繁殖过程。
作为本发明的一种实施方式，所述圆杆23上端延伸至储液箱12内，并与支撑板13固连；所述支撑板13与储液箱12为转动连接；所述圆杆23内壁中开设有圆槽27，且圆槽27贯穿圆杆23设计；所述第一搅拌桨24的桨叶内壁中均开设有长槽28，且长槽28均与圆槽27连通，所述长槽28内壁中开设有均匀布置的圆孔29；所述第一搅拌桨24与第二搅拌桨25的内部结构完全相同；
工作时，由于圆杆23延伸至储液箱12内，在电机22带动圆杆23转动的过程中，圆杆23会带动支撑板13转动，在此过程中可以带动储液箱12内的培养基转动，在此过程中可以防止储液箱12内的培养基发生沉淀，从而降低培养基的扩散程度，由于圆杆23内壁中开设有圆槽27，储液箱12内的培养基可以流入圆槽27内，由于圆弧槽与搅拌桨内壁中开设的长槽28连通，圆槽27内的培养基可以流入长槽28内，流入长槽28内的培养基在通过均匀布置的圆孔29流出外界，在此过程中可以提高培养基的扩散程度，从而提高细胞种子与培养基的接触程度，使细胞种子快速繁殖。
作为本发明的一种实施方式，所述支撑板13上表面固连有均匀布置的搅拌杆14；每个所述搅拌杆14外表面均固连有螺旋叶15；
工作时，由于支撑板13上表面固连有均匀布置的搅拌杆14，在支撑板13转动的过程中可以带动搅拌杆14转动，在此过程中搅拌杆14可以对储液箱12内的培养基进行搅动，从而可以进一步提高培养基的扩散程度，使培养基内的营养物质分布均匀，由于搅拌杆14外表面固连有螺旋叶15，在搅拌杆14转动的过程中可以带动螺旋叶15在培养基内移动，在此过程中可以进一步提高培养基的扩散程度，从而防止培养基内的营养物质分布不均匀。
作为本发明的一种实施方式，每个所述第一导管291空腔内与反应箱21内壁中均安装有第二导管292，且第二导管292另一端均延伸至集液箱19上方空腔内；所述第二导管292伸入集液箱19内的管头处安装有单向阀；所述储液箱12内壁为橡胶材料制成；所述储液箱12内壁中固连有厚度为一到两厘米的锯齿状记忆合金221；每个所述第二导管292内壁中均开设有均匀布置的小孔293；所述集液箱19上方内壁中固连有注液阀191；
工作时，由于第二导管292延伸至集液箱19上方空腔内，反应仓2内的气体可以通过第二导管292流入集液箱19内，当气体流入集液箱19内时，由于集液箱19内的压力增大，从而挤压储液箱12，当储液箱12受到挤压后储液箱12的内壁会向相对一侧弯曲，此时将控制阀打开，当控制阀打开后集液箱19内的无血清培养基会迅速压入储液箱12内，当无血清培养基压入储液箱12内后，储液箱12和集液箱19内的气压逐渐平衡，由于储液箱12内壁中为橡胶材料制成且内壁中固连有记忆合金221，从而可以使弯曲的储液箱12缓慢的恢复到初始状态，在储液箱12恢复的过程中可以通过第一导管291将反应池294内的培养液抽入储液箱12内，当培养液流入储液箱12内时，可以与无血清培养基进行初步混合，从而可以提高细胞种子与无血清培养基的相融程度，当储液箱12内的气压达到平衡后，此时储液箱12内的无血清培养基通过第一导管流入反应池内，由于第二导管292内壁中开设有均匀布置的小孔293，第二导管292内的气体可以通过小孔293喷出外界，当第一导管291在流液时，喷出的气体可以对第一导管291内的培养基进行吹动，在此过程中可以提高培养基的扩散程度，同时还可以提高培养基的活性，从而提高细胞种子的繁殖效率。
作为本发明的一种实施方式，所述反应池294内壁中开设有弧形槽296，且弧形槽296均与进气管295连通；所述弧形槽296内壁中开设有均匀布置的第二通孔297，且第二通孔297均与反应池294连通；
工作时，由于进气管295与弧形槽296连通，流入弧形槽296内的气体可以通过均匀布置的第二通孔297流入反应池294内，在此过程中，可以使通入的空气、氧气、氮气和二氧化碳与培养液充分接触，从而可以为细胞种子提供所需的物质，同时还可以为细胞种子提高较为适宜的生存和繁殖的环境。
作为本发明的一种实施方式，每个所述第二通孔297上方与反应池294内表面位置均固连有橡胶层298，且橡胶层298均包裹第二通孔297设计；每个所述橡胶层298内壁中开设有均匀布置的微孔299；
工作时，由于第二通孔297外部均固连有橡胶层298，从而第二通孔297流出的气体可以通过均匀布置的微孔299流入反应池294内，在此过程中可以进一步细化气体，可以使气体更好的与培养液相融，从而可以更全面的为细胞种子提供所需物质和提供适宜的生存环境，同时还可以防止反应池294内的培养液流入弧形槽296内。
具体工作流程如下：
工作时，在使用本发明制作的生物反应器时，首先将储液箱12上方的储液盖16打开并将无血清杂交瘤细胞培养液和营养液注入储液箱12内，同时向集液槽内注入占总体积百分之四的无血清培养基，然后关闭储液盖16，此时控制器控制启动生物反应器，并向生物反应器内通过进气管295通入空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体，此时储液槽内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液在重力的作用下通过第一导管291流入反应箱21内，由于第一导管291均第一搅拌桨24相互对应，通过第一导管291流入反应箱21内的无血清杂交瘤细胞培养液和营养液可以被第一搅拌桨24冲散，由于反应箱21内壁中固连有均匀布置的第一转叶26，当无血清杂交瘤细胞培养液和营养液流经第一转叶26时，可以进一步扩散无血清杂交瘤细胞培养液，当反应箱21内的液体过多时，可以流入反应池294内，由于反应池294内设有第二搅拌桨25，从而可以再次对无血清杂交瘤细胞培养液进行搅动，在此过程中可以进一步扩散细胞种子，从而间接提高细胞种子的密度，当反应仓2内的气体膨胀时，气体可以通过第一导管291流入储液箱12内，当气体流入储液箱12内时，可以将储液箱12内的无血清杂交瘤细胞培养液完全压入反应仓2内，此时将储液盖16打开，当细胞种子在反应池294内繁殖到对数中期时，将储液盖16关闭后，此时控制器控制第一通孔17内的控制阀打开，当控制阀打开后，集液箱19内的无血清培养基会通过第一通孔17流入储液箱12内，此时储液箱12内的气体会通过第一通孔17流入集液箱19内，当气体流入集液箱19内时，可以将集液箱19内的无血清培养基匀速的压入储液箱12内，此时反应仓2内的气体在通过第一导管291流入储液箱12内时，可以将储液箱12内的无血清培养基通过第一导管291压入反应箱21内，当无血清培养基流入反应箱21内时，第一搅拌桨24可以对无血清培养基进行初次搅动，当无血清培养基流入反应池294内时，第二搅拌桨25可以再次对无血清培养基进行搅动，从而可以进一步提高细胞种子与培养液的接触程度，当集液箱19内的液体流加完成后，此时控制器关闭控制阀，并向集液箱19内再次加入无血清培养基，每隔24小时向反应仓2内流加，以此循环，由于第二导管292延伸至集液箱19上方空腔内，反应仓2内的气体可以通过第二导管292流入集液箱19内，当气体流入集液箱19内时，由于集液箱19内的压力增大，从而挤压储液箱12，当储液箱12受到挤压后储液箱12的内壁会向相对一侧弯曲，此时将控制阀打开，当控制阀打开后集液箱19内的无血清培养基会迅速压入储液箱12内，当无血清培养基压入储液箱12内后，储液箱12和集液箱19内的气压逐渐平衡，由于储液箱12内壁中为橡胶材料制成且内壁中固连有记忆合金221，从而可以使弯曲的储液箱12缓慢的恢复到初始状态，在储液箱12恢复的过程中可以通过第一导管291将反应池294内的培养液抽入储液箱12内，当培养液流入储液箱12内时，可以与无血清培养基进行初步混合，从而可以提高细胞种子与无血清培养基的相融程度，当储液箱12内的气压达到平衡后，此时储液箱12内的无血清培养基通过第一导管流入反应池内。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1：从工作细胞库中取出杂交瘤细胞，采用快速融化法将种子细胞由液氮迅速转入到37℃水浴复苏，以无血清杂交瘤细胞培养液在125ml摇瓶中进行细胞扩大培养；
S2：将生物反应器彻底清洗、高温高压灭菌后安装调试，校正pH电极与溶氧电极，分别开启空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体的供气装置，设定生物反应器培养条件：温度36～37℃、pH值6.75～6.95、溶氧20～50%、搅拌桨转速60～100转/分钟；
S3:当生产细胞种子增殖达到合适总量，细胞终浓度在8×105～1×106cell/ml范围内时，此时将细胞种子接种到生物反应器中的储液箱(12)内，并启动生物反应器；
S4：待细胞增殖进入对数中期24小时时，取样计数并留样做效价检测，按总体积4%流加无血清培养基，之后每24小时取样计数并留样做效价检测，按总体积4%流加无血清培养基，直到样品血凝抑制效价达到1:2560以上时收获培养液；
S5：当培养液培养完成后对培养液进行收集，对收集后的培养液经过除菌过滤、无菌配制、定量分装到灭菌容器中即得到犬细小病毒单克隆抗体；
其中，所述生物反应器包括储流仓(1)和反应仓(2)；所述反应仓(2)上表面通过斜板(11)固连有储流仓(1)；所述储流仓(1)包括储液箱(12)和集液箱(19)；所述储流仓(1)内壁中设有支撑板(13)，且支撑板(13)为弧形设计；所述储液箱(12)上方套接有储液盖(16)，且储液盖(16)下表面安装有压力阀(211)；所述储液箱(12)外表面固连有集液箱(19)；所述储液箱(12)内壁中开设有均匀布置的第一通孔(17)，且第一通孔(17)均与集液箱(19)连通；每个所述第一通孔(17)内壁中均固连有控制阀，且控制阀在初始状态下为关闭设置；所述反应仓(2)包括反应箱(21)，且反应箱(21)为“工”字形设计；所述反应箱(21)底部端面固连有反应池(294),且反应池(294)为圆弧形设计；所述反应箱(21)上表面固连有电机(22)，且电机(22)通过导线与控制器电连接；所述电机(22)驱动轴上固连有圆杆(23)，且圆杆(23)穿过反应箱(21)延伸至反应池(294)内；所述圆杆(23)伸入反应箱(21)内的一侧外表面固连有第一搅拌桨(24)；所述圆杆(23)伸入反应池(294)内的一侧外表面固连有第二搅拌桨(25)；所述第一搅拌桨(24)周围与反应箱(21)内壁中通过转轴转动连接有均匀布置的第一转叶(26)；所述反应箱(21)内壁中安装有均匀布置的第一导管(291)，且第一导管(291)均为弹性设计；每个所述第一导管(291)另一端均延伸至储液箱(12)内并置于支撑板(13)上方，第一导管(291)均与第一搅拌桨(24)相互对应，所述反应池(294)底部中心位置安装有进气管(295)，且进气管(295)用于通入空气、氧气、氮气和二氧化碳四种气体；
所述圆杆(23)上端延伸至储液箱(12)内，并与支撑板(13)固连；所述支撑板(13)与储液箱(12)为转动连接；所述圆杆(23)内壁中开设有圆槽(27)，且圆槽(27)贯穿圆杆(23)设计；所述第一搅拌桨(24)的桨叶内壁中均开设有长槽(28)，且长槽(28)均与圆槽(27)连通，所述长槽(28)内壁中开设有均匀布置的圆孔(29)；所述第一搅拌桨(24)与第二搅拌桨(25)的内部结构完全相同；
每个所述第一导管(291)空腔内与反应箱(21)内壁中均安装有第二导管(292)，且第二导管(292)另一端均延伸至集液箱(19)上方空腔内；所述第二导管(292)伸入集液箱(19)内的管头处安装有单向阀；所述储液箱(12)内壁为橡胶材料制成；所述储液箱(12)内壁中固连有厚度为一到两厘米的锯齿状记忆合金(221)；每个所述第二导管(292)内壁中均开设有均匀布置的小孔(293)；所述集液箱(19)上方内壁中固连有注液阀(191)。
2.根据权利要求1所述的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：所述支撑板(13)上表面固连有均匀布置的搅拌杆(14)；每个所述搅拌杆(14)外表面均固连有螺旋叶(15)。
3.根据权利要求1所述的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：所述反应池(294)内壁中开设有弧形槽(296)，且弧形槽(296)均与进气管(295)连通；所述弧形槽(296)内壁中开设有均匀布置的第二通孔(297)，且第二通孔(297)均与反应池(294)连通。
4.根据权利要求3所述的一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法，其特征在于：每个所述第二通孔(297)上方与反应池(294)内表面位置均固连有橡胶层(298)，且橡胶层(298)均包裹第二通孔(297)设计；每个所述橡胶层(298)内壁中开设有均匀布置的微孔(299)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010485933.XA CN111549002B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010485933.XA CN111549002B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111549002A CN111549002A (zh) | 2020-08-18 |
| CN111549002B true CN111549002B (zh) | 2021-03-02 |
Family
ID=71999123
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010485933.XA Active CN111549002B (zh) | 2020-06-01 | 2020-06-01 | 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111549002B (zh) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111979125A (zh) * | 2020-08-28 | 2020-11-24 | 安徽惠恩生物科技股份有限公司 | 一种无血清细胞培养基 |
| CN112877297A (zh) * | 2021-03-27 | 2021-06-01 | 哈尔滨元亨生物药业有限公司 | 一种利用生物反应器制备猫瘟热病毒单克隆抗体的方法 |
| CN112852749A (zh) * | 2021-03-27 | 2021-05-28 | 哈尔滨元亨生物药业有限公司 | 高效分泌犬细小病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株c68及利用生物反应器对其进行生产的方法 |
| CN114561270B (zh) * | 2022-03-21 | 2023-04-28 | 广州齐志生物工程设备有限公司 | 一种高致病性病毒培养集装系统 |
| CN118703332B (zh) * | 2024-08-26 | 2024-12-13 | 山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心) | 一种猪流感病毒灭活疫苗用生物反应器 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104307455A (zh) * | 2014-10-28 | 2015-01-28 | 成都冠禹科技有限公司 | 一种适用于化工及医药料液的工业反应釜 |
| CN207210296U (zh) * | 2017-08-05 | 2018-04-10 | 宗建成 | 一种化工用山梨酸高效型制备装置 |
| CN110496577A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-11-26 | 马鞍山健鼎化工有限公司 | 一种用于制备聚合硫酸铁的自动化反应釜 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0224962A1 (en) * | 1985-11-25 | 1987-06-10 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur | Apparatus for the continuous cultivation of microorganisms in a culture liquid |
| US20050009161A1 (en) * | 2002-11-01 | 2005-01-13 | Jackson Streeter | Enhancement of in vitro culture or vaccine production using electromagnetic energy treatment |
| EP2216395A1 (en) * | 2009-02-09 | 2010-08-11 | Lonza Biologics plc. | Bioreactor for the cultivation of mammalian cells |
| CN102120768B (zh) * | 2010-12-08 | 2013-07-10 | 北京世纪元亨动物防疫技术有限公司 | 利用生物反应器生产治疗性犬细小病毒单克隆抗体的方法 |
| DK2853584T3 (da) * | 2013-09-30 | 2021-03-29 | Eppendorf Ag | Engangsbioreaktor med ledeplader og en fremgangsmåde til fremstilling og drift af samme |
| CN106566771B (zh) * | 2016-11-14 | 2018-12-07 | 竺秋君 | 一种基因工程用核酸酶水解样品搅拌装置 |
| CN107619777A (zh) * | 2016-12-09 | 2018-01-23 | 济南航晨生物科技有限公司 | 一种高粘度产物专用液体发酵罐 |
| CN109679850A (zh) * | 2019-02-20 | 2019-04-26 | 美闺(长沙)医疗美容有限公司 | 一种自体活细胞培育装置 |
-
2020
- 2020-06-01 CN CN202010485933.XA patent/CN111549002B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104307455A (zh) * | 2014-10-28 | 2015-01-28 | 成都冠禹科技有限公司 | 一种适用于化工及医药料液的工业反应釜 |
| CN207210296U (zh) * | 2017-08-05 | 2018-04-10 | 宗建成 | 一种化工用山梨酸高效型制备装置 |
| CN110496577A (zh) * | 2019-09-27 | 2019-11-26 | 马鞍山健鼎化工有限公司 | 一种用于制备聚合硫酸铁的自动化反应釜 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111549002A (zh) | 2020-08-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111549002B (zh) | 一种利用高密度培养方式生产犬细小病毒单克隆抗体的方法 | |
| CN102978113B (zh) | 搅拌、通气及细胞过滤一体化生物反应器 | |
| JP2003510068A (ja) | 細胞を培養するための方法および装置 | |
| CN111363680A (zh) | 一种用于外泌体分泌、分离和收集的脉冲搅拌式生物反应器 | |
| CN101129276A (zh) | 人工肝用微囊悬浮型流化床式生物反应器 | |
| Tyo et al. | Dense cultures of animal cells at the industrial scale | |
| CN111363679B (zh) | 一种用于刺激细胞大量分泌外泌体的方法 | |
| CN100384987C (zh) | 一种三维条件下扩增造血干细胞的方法 | |
| CN114304061A (zh) | 一种nk/t淋巴瘤小鼠模型的建立方法 | |
| CN210140594U (zh) | 一种用于外泌体分泌、分离和收集的生物反应器 | |
| CN102002482A (zh) | 猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒的生产方法 | |
| CN1118563C (zh) | 中空纤维模拟骨髓造血装置 | |
| WO2024146395A1 (zh) | 一种大规模高产量细胞连续培养和收获的生产工艺 | |
| CN110241090B (zh) | 一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法 | |
| CN111635860A (zh) | 一种用于干细胞培养的系统及培养方法 | |
| CN106497881A (zh) | 稳定高效表达重组人透明质酸酶cho‑k1sp细胞株及其构建方法 | |
| CN114181287B (zh) | 一种dna病毒疫苗的制备方法 | |
| CN201119927Y (zh) | 人工肝用微囊悬浮型流化床式生物反应器 | |
| CN107287265A (zh) | 一种制备重组人凝血因子ⅷ的方法 | |
| CN1297659C (zh) | 一种造血细胞灌注培养方法和装置 | |
| Shen et al. | Calcium alginate immobilized hybridomas grown using a fluidized-bed perfusion system with a protein-free medium | |
| CN116042373A (zh) | 一种持续生产并分离纯化细胞外泌体的系统及使用方法 | |
| CN119410572B (zh) | 一种斑马鱼肠道类器官体外培养立体模型及其制备方法 | |
| CN218579989U (zh) | 一种体外定量调控气体含量的细胞培养系统 | |
| CN118812670B (zh) | 一种提高哺乳动物细胞狂犬病毒vlp蛋白表达量的生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |