CN111537736A - 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡毒支原体抗体的间接ELISA检测试剂盒及检测方法。本发明公开的鸡毒支原体抗体的间接ELISA检测试剂盒包括PVPA蛋白与2.5％脱脂奶粉、5％BSA、包被稳定剂、MG阳性血清、MG阴性血清、0.01M PBS(PH7.2‑7.4)、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY、微孔板、洗涤液、显色底物和终止液，PVPA蛋白为氨基酸序列是序列2的第35‑408位或序列2的蛋白质。利用本发明的试剂盒可以检测待测动物血清中是否含有鸡毒支原体抗体，并判断待测动物是否感染了鸡毒支原体，为鉴定MG感染提供了可靠的检测方法，也为MG疫情防控提供科学指导。

Description

一种鸡毒支原体抗体的间接ELISA检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种鸡毒支原体抗体的间接ELISA检测试剂盒及检测方法。

背景技术

鸡毒支原体(MG)是鸡慢性呼吸道病(CRD)的病原，可引起鸡呼吸道、气囊和眶下窦损伤，蛋鸡产蛋率下降，肉鸡品质下降，废弃率增高，是养禽业危害严重的传染病之一。MG能经卵垂直传播，从而导致孵化率、受精率降低，雏鸡死亡率升高和生长发育障碍，并使种鸡后代成为MG感染阳性鸡群，这是该病非常普遍的重要原因，同时对该病原的控制和净化带来极大困难，因此检测种蛋内是否存在MG，对切断经卵垂直传播和使鸡群得到净化，提高后代鸡群的生产效益具有重要意义。目前，开展MG血清学监测通常使用IDEXX等公司的检测试剂盒，检测成本高、推广范围窄。因此，研究开发具有自主知识产权的MG检测试剂盒，降低MG检测成本，扩大鸡群检测范围，对MG的防控有重要的实际意义。

PVPA蛋白是存在于MG细胞膜表面，能够被鸡的免疫系统识别的种特异性蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何检测待测动物血清是否含有MG抗体。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括PVPA蛋白与P1，所述PVPA蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的第35-408位的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A3)将序列表中序列2或序列2的第35-408位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述P1为2.5％脱脂奶粉和/或5％BSA和/或包被稳定剂；

所述2.5％脱脂奶粉由0.01M PBS(PH7.2-7.4)与脱脂奶粉组成，所述脱脂奶粉在所述2.5％脱脂奶粉中的浓度为2.5g/100mL；

所述5％BSA由0.01M PBS(PH7.2-7.4)与牛血清白蛋白组成，所述牛血清白蛋白在所述5％BSA中的浓度为5g/100mL；

所述包被稳定剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，溶质及其在所述包被稳定剂中的浓度分别为HEPES 20mM、NaCl 120mM、KCl 5mM、CaCl₂ 1mM、MgCl₂ 1mM、吐温-20 0.05％(体积百分比)、蔗糖3g/100mL、PEG4000 0.1g/100mL和Proclin3000.05％(体积百分比)。

所述0.01M PBS(Ph7.2-7.4)为北京索莱宝科技有限公司产品。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2或序列2的第35-408位所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的PVPA蛋白，为与序列2或序列2的第35-408位所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的PVPA蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的PVPA蛋白的编码基因可通过将序列1的第9-1133位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1的第9-1133位所示的DNA分子编码序列2的第35-408位所示的PVPA蛋白。

上述成套试剂还可包括MG阳性血清和/或MG阴性血清。

所述MG阳性血清可为感染MG的鸡血清；所述MG可为未感染MG的鸡血清。

上述成套试剂还可包括所述0.01M PBS(PH7.2-7.4)、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY、微孔板、洗涤液、显色底物和/或终止液。

所述洗涤液可为PBST。所述PBST可由向0.01M PBS中添加吐温-20得到，吐温-20的浓度为0.05％(体积百分含量)。

所述显色底物可为TMB。

所述终止液可为2mol H₂SO₄水溶液。

所述成套试剂可由所述PVPA蛋白与所述P1组成，也可由所述PVPA蛋白、所述P1与所述MG阳性血清和所述MG阴性血清中的至少一种组成，还可由所述PVPA蛋白、所述P1、所述MG阳性血清、所述MG阴性血清与下述物质中的至少一种组成：所述0.01M PBS(PH7.2-7.4)、所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY、所述微孔板、所述洗涤液、所述显色底物和所述终止液。

所述成套试剂可具有如下任一用途：

(c1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(c2)制备用于检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的试剂盒；

(c3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(c4)制备用于检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量的试剂盒；

(c5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体；

(c6)制备用于待测动物是否感染了鸡毒支原体的试剂盒。

所述成套试剂的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

(c1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(c2)制备用于检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的试剂盒；

(c3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(c4)制备用于检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量的试剂盒；

(c5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体；

(c6)制备用于待测动物是否感染了鸡毒支原体的试剂盒。

上述应用中，所述动物可为家禽。进一步，所述家禽可为鸡。

本发明还提供了一种酶联免疫试剂盒，所述试剂盒含有所述成套试剂。

所述试剂盒可具有如下任一用途：

(a1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(a3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(a5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体。

上述试剂盒中，所述动物可为家禽。进一步，所述家禽可为鸡。

所述试剂盒的下述任一应用，也属于本发明的保护范围：

(c1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(c2)制备用于检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的产品；

(c3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(c4)制备用于检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量的产品；

(c5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体；

(c6)制备用于待测动物是否感染了鸡毒支原体的产品。

上述应用中，所述动物可为家禽。进一步，所述家禽可为鸡。

所述产品可为试剂盒。

本发明还提供了检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的方法，所述方法通过采用所述成套试剂进行间接ELISA实现，所述方法包括：以所述PVPA蛋白作为抗原，以所述2.5％脱脂奶粉作为封闭液，以所述5％BSA作为样品稀释液稀释待测动物血清，并以所述MG阳性血清和所述MG阴性血清分别作为阳性标准品和阴性标准品，依次进行抗原的包被、封闭、与待测样品的结合、与所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY的结合、显色、终止和读反应体系的OD450nm值，获得待测样品、阳性标准品和阴性标准品的OD450nm值，依次记为S值、P值和N值，根据如下方法确定所述待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体：

当P值＞1.0，N值＜0.2时，判定实验成立，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)；

当S/P≥0.67时，所述待测动物血清含有或候选含有鸡毒支原体抗体；当S/P＜0.67时，所述待测动物血清不含有或候选不含有鸡毒支原体抗体。

本发明还提供了检测待测动物是否感染鸡毒支原体的方法，所述方法通过采用权利要求1-3中任一所述成套试剂进行间接ELISA实现，所述方法包括：以所述PVPA蛋白作为抗原，以所述2.5％脱脂奶粉作为封闭液，以所述5％BSA作为样品稀释液稀释待测动物血清，并以所述MG阳性血清和所述MG阴性血清分别作为阳性标准品和阴性标准品，依次进行抗原的包被、封闭、与待测样品的结合、与所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY的结合、显色、终止和读反应体系的OD450nm值，获得待测样品、阳性标准品和阴性标准品的OD450nm值，依次记为S值、P值和N值，根据如下方法确定所述待测动物是否感染鸡毒支原体：

当P值＞1.0，N值＜0.2时，判定实验成立，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)；

当S/P≥0.67时，所述待测动物感染了或候选感染了鸡毒支原体；当S/P＜0.67时，所述待测动物未感染或候选未感染鸡毒支原体。

上述方法还可包括在封闭后利用所述包被稳定剂进行处理的步骤。

上述方法中，所述抗原的包被中所用抗原的浓度为1μg/mL。所述抗原可利用所述0.01M PBS(PH7.9)稀释或溶解。

所述封闭的时间可为1小时。

所述MG阳性血清和所述MG阴性血清均可采用所述5％BSA稀释。所述MG阳性血清和所述MG阴性血清的稀释倍数可为500倍。

所述待测动物血清可采用所述5％BSA稀释。所述待测动物血清的稀释倍数可为500倍。

与待测样品的结合时间可为60分钟。

所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY可稀释后加入反应体系中，所述稀释的倍数可为10000倍。与所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY的结合时间可为60分钟。

所述间接ELISA具体可包括：

A.抗原的包被：用所述0.01M(Ph7.9)PBS将所述PVPA蛋白稀释，得到蛋白浓度为1μg/mL的蛋白稀释液，利用所得蛋白稀释液分别包被微孔板，每孔100μl/孔，用封口贴密封微孔板，4℃包被10-12h；包被结束后甩去孔内液体，每孔加入PBST，洗涤三次，弃尽微孔内液体；

B.封闭：步骤A完成后，向微孔板每孔加入200μl的2.5％脱脂奶粉，用封口贴密封微孔板，37℃作用1h；封闭结束后甩去孔内液体，每孔加入PBST洗涤三次，弃尽微孔内液体；

C.加样：步骤B完成后，用5％BSA分别将所述MG阳性血清和所述MG阴性血清分别作以1:500稀释后添加至微孔板中，然后将所述待测动物血清利用5％BSA稀释后加至微孔板中，每孔100μl；加样完成后，用封口贴密封微孔板，使用微量振荡器震动30s或者手工在实验操作台上向左右轻轻平行摇晃60s混匀，然后将微孔板置于37℃孵育60min；孵育结束后甩去孔内液体，每孔加入PBST洗涤三次，弃尽微孔内液体；

D.加二抗：步骤C完成后，将所述辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY利用0.01M PBS(Ph7.2-7.4)以1:10000倍稀释后添加至微孔板中，每孔100μl；加样完成后，用封口贴密封微孔板，37℃作用60分钟；孵育结束后甩去孔内液体，每孔加入PBST洗涤三次，弃尽微孔内液体；

E.TMB显色：步骤D完成后，微孔板每孔加入显色底物，37℃避光静置10min显色，然后每孔加入50μl的2mol/L的H₂SO₄终止反应。

F.检测OD450nm值：将已终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm测量读取各孔的吸光度值；在10min内完成数据读取，获得S值、P值与N值。

上述方法中，所述动物可为家禽。进一步，所述家禽可为鸡。

利用本发明的成套试剂和试剂盒可以检测待测动物血清中是否含有鸡毒支原体抗体，并判断待测动物是否感染了鸡毒支原体，同时与同类商品化产品比较，具有较高的符合率，并具有很好的敏感性、特异性和稳定性，且对其他病毒也具有很好的特异性，操作方便快速，能对田间大量样品进行鸡毒支原体抗体的快速检测。本发明可有效检测MG感染后抗体的产生，为鉴定MG感染提供了可靠的检测方法，也为MG疫情防控提供科学指导。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测PVPA重组蛋白的表达。泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为未诱导对照菌体的检测结果，泳道2为IPTG诱导菌体的检测结果。右侧箭头所示为PVPA重组蛋白。

图2为SDS-PAGE检测IPTG诱导菌体中PVPA重组蛋白的表达。泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为IPTG诱导菌体沉淀，泳道2为IPTG诱导菌体上清。长箭头所示为PVPA重组蛋白。

图3为SDS-PAGE检测PVPA重组蛋白的纯化。泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为纯化重组蛋白。

图4为以鼠抗His抗体作为第一抗体对纯化重组蛋白的Western Blot检测结果。

图5为262份田间血清ROC拟合结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的MG菌种，为鸡毒支原体BG44T株，为中国兽医药品监察所(也称中国兽医微生物菌种保藏管理中心)产品，菌株号为CVCC350。

实施例1、利用PVPA重组蛋白检测鸡毒支原体抗体

1.PVPA重组蛋白的制备

1.1基因制备

利用Mqpvpa-F和Mqpvpa-R组成的引物对对MG菌种的基因组DNA进行PCR扩增，Mqpvpa-F和Mqpvpa-R分别为序列表中序列3和4所示的两条单链DNA，对得到的PCR产物进行测序，结果显示其序列为序列表中序列1，序列1的第9-1133位为该MG菌种的PVPA基因序列，编码序列表中序列2的第35-408位所示的PVPA蛋白质。

1.2重组载体的构建

将步骤1.1得到的PCR产物利用限制性内切酶BamHI-HF和XhoI酶切，得到PCR产物酶切产物；将PET-28a(+)载体利用限制性内切酶BamHI-HF和XhoI酶切，回收载体大片段，连接PCR产物酶切产物与载体大片段，得到重组载体，将序列正确的重组载体命名为PET-PVPA。PET-PVPA为将PET-28a(+)载体的BamHI和XhoI识别序列间的DNA片段替换为序列表中序列1的第9-1133位所示的PVPA基因得到的重组载体，该重组载体能表达序列表中序列2所示的融合蛋白质，记为PVPA重组蛋白，PVPA重组蛋白的表达由T7启动子驱动。

其中，序列表中序列2的第1-34位为PET-28a(+)载体上DNA序列所编码氨基酸序列，第5-10位为His标签，第35-408位为PVPA蛋白质序列。

1.3 PVPA重组蛋白表达、纯化和鉴定

1.3.1.重组蛋白原核表达：

将步骤1.2得到的重组载体PET-PVPA导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到重组菌，将该重组菌记为BL21-PET-PVPA。

将BL21-PET-PVPA接种到5mL LB液体培养中，220r/min，37℃，8-12h振荡培养得到种子液；将种子液分别按照1:100的比例接到4个含有50ml新的LB液体培养基的三角瓶中，220r/min，37℃，培养约3h至OD600nm≈0.5～0.6，在其中的2个三角瓶中加入IPTG，至IPTG的终浓度为1mmol/L，剩余2个三角瓶作为未诱导对照，在25℃摇床中，200r/min振荡继续培养12h，诱导培养结束后，12000rpm，离心2min，收获菌体，分别得到IPTG诱导菌体和未诱导对照菌体，每种菌体两个重复。

1.3.2.SDS-PAGE鉴定：

将步骤1.3.1.所得各菌体分别按照如下步骤操作：

向菌体中加入1mL pH7.2的PBS缓冲液重悬，然后超声破碎菌体，得到超声产物，将超声产物于10000r/min离心15min，收集上清液和沉淀。将所得上清液进行SDS-PAGE电泳。

IPTG诱导菌体和未诱导对照菌体上清液的结果如图1所示，与对照比较，25℃条件下诱导的菌样品沉淀中出现明显大小与预期大小相符的、约为40kDa的蛋白，表明PVPA重组蛋白得到表达。

IPTG诱导菌体的上清液和沉淀的结果如图2所示，IPTG诱导后的PVPA重组蛋白为包涵体表达。

1.3.3.重组蛋白纯化：

向步骤1.3.2.得到的IPTG诱导菌体的沉淀中依次加入洗涤液Ⅰ、Ⅱ，将洗涤液Ⅰ、Ⅱ用His标签蛋白纯化树脂(QIAGEN公司，货号：30210)按操作说明进行目的蛋白纯化，得到纯化重组蛋白；将得到的纯化重组蛋白利用SDS-PAGE检测，结果显示，所得纯化重组蛋白大小与预期相符，且蛋白条带单一，表明重组蛋白PVPA得到了纯化，如图3所示。

洗涤液Ⅰ(pH7.9)：100mM NaCl，50mM Tris，10mM EDTA，0.5％Triton X-100，HCl调节pH至7.9，余量为水。洗涤液Ⅱ(pH7.9)：2M尿素，100mM NaCl，50mM Tris，10mM EDTA，0.5％Triton X-100，HCl调节pH至7.9，余量为水。

1.3.4.Western Blot鉴定：

将步骤1.3.3.得到的纯化重组蛋白利用Western Blot鉴定，利用MG阳性鸡血清作为第一抗体，以HRP标记的兔抗鸡(ABclonal，货号：AS030)为第二抗体以验证蛋白的免疫原性；同时以鼠抗His抗体(ABclonal公司，货号：AE003)作为第一抗体，以山羊抗鼠IgG(ABclonal公司，货号：AS003)作为第二抗体以验证蛋白的正确表达。

结果均出现与目的蛋白大小相符的目的条带，表明PVPA重组蛋白表达正确且可以被MG阳性鸡血清识别，具有抗体结合活性。鼠抗His抗体的结果如图4所示。

其中，MG阳性鸡血清的制备见步骤2。

2.MG阳性鸡血清的制备

1)饲养4周龄SPF白来航鸡(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，采血分离血清，经IDEXX禽败血支原体抗体检测试剂盒(北京罗曼赛亚科技有限公司，货号：99-06729)检测，确定未有MG感染。

2)取步骤1)经过鉴定未有MG感染的鸡，采血分离血清，得到标准阴性对照血清。

3)取步骤1)经过鉴定未有MG感染的鸡，采用MG菌种鸡毒支原体BG44T株(中国兽医药品监察所(也称中国兽医微生物菌种保藏管理中心)，CVCC350)免疫，具体步骤如下：

(1)将浓度为1x10⁸CCU/ml的MG菌种鸡毒支原体BG44T株浓缩20倍后，与弗氏完全佐剂按照体积比1:1混匀后经颈部皮下和腿部肌肉注射免疫(0.4ml/只)；

(2)完成步骤(1)的两周后，将浓度为1x10⁸CCU/ml的MG菌种鸡毒支原体BG44T株浓缩20倍后，与弗氏不完全佐剂按照体积比1:1混匀后经颈部皮下和腿部肌肉注射免疫(0.8ml/只)；

(3)完成步骤(2)的两周后，将浓度为1x10⁸CCU/ml的MG菌种鸡毒支原体BG44T株浓缩66倍后，与弗氏不完全佐剂按照体积比1:1混匀后经颈部皮下和腿部肌肉注射免疫(0.5ml/只)；

(4)完成步骤(3)的两周后，将浓度为1x10⁸CCU/ml的MG菌种鸡毒支原体BG44T株浓缩30倍后，经颈部皮下和腿部肌肉注射免疫(0.5ml/只)；

(5)完成步骤(4)的10天后，翅根静脉釆血并分离血清，经IDEXX公司的禽败血支原体抗体检测试剂盒检测S/P(S/P＝(S值-N值)/(P值-N值))达到2.0以上为合格，方可采血，采血后制备得到MG阳性鸡血清。

3.一种检测MG抗体的间接ELISA方法的建立

3.1 PVPA抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数的选择

使用棋盘法优化PVPA重组蛋白的包被浓度和血清最佳稀释倍数，步骤如下：

3.1.1抗原的包被：用0.01M PBS(pH7.9，北京索莱宝科技有限公司产品，P1010)将纯化的PVPA重组蛋白稀释，得到蛋白浓度分别为0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL的蛋白稀释液，利用各蛋白稀释液分别包被微孔板，每孔100μl/孔，4℃包被10-12h。包被结束后甩去孔内液体，每孔加入300μl PBST，洗涤三次。

PBST：向0.01M PBS(ph7.2-7.4)(北京索莱宝科技有限公司，货号：P1020)中添加吐温-20得到，吐温-20的浓度为0.05％(体积百分含量)。

3.1.2封闭：洗涤后的微孔板每孔加入200μl的封闭液(5％SBA，由BSA(牛血清白蛋白，VWR公司)溶解至0.01M PBS中得到，BSA的浓度为5g/100mL)，37℃作用2h，弃去孔内液体，PBST洗涤3次。

3.1.3加样：用样品稀释液分别将步骤2的MG阳性鸡血清和标准阴性对照血清分别作以1:125、1:250、1:500、1:1000和1:2000倍比稀释后添加至微孔板中，每孔100μl，每种蛋白稀释液的相应血清稀释度均设置三个重复。加样完成后，用封口贴密封微孔板，然后将微孔板置于37℃孵育60min(即血清作用时间)。孵育结束后弃去孔内液体，PBST洗涤三次。

其中，样品稀释液：0.01M PBS(ph7.2-7.4)(北京索莱宝科技有限公司，货号：P1020)。

3.1.4加二抗：将二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY(ABclonal，货号：AS030)利用0.01M PBS(ph7.2-7.4)以1:10000倍稀释后添加至洗涤后的微孔板中，37℃作用60分钟。孵育结束后弃去孔内液体，PBST洗涤三次。

3.1.5TMB显色：每孔加入100μl的底物反应液(现配现用，避光)置37℃，10min，然后取出，每孔加入50μl的2mol/L的H₂SO₄终止反应。

其中，底物反应液：即TMB底物：北京索莱宝科技有限公司，货号：PR1210。使用时，吸取A液和B液，1:1混匀后使用。

3.1.6检测OD450nm值：检测各孔OD450nm值。计算各组P/N值，即MG阳性鸡血清孔OD450nm值(P值)与标准阴性对照血清孔OD450nm值(N值)的比值。

以P值为1.0左右，P/N值最大且N值较低者，作为最适抗原包被浓度和血清最佳稀释倍数。结果显示，当抗原包被浓度为1μg/ml时，1:500倍稀释的MG阳性鸡血清孔OD450nm值为0.85，1:500倍稀释的标准阴性对照血清孔OD450nm值为0.1，P/N值最大，为8.30。因此该条件作为最优条件。结果见表1。

表1、间接ELISA抗原包被浓度、血清稀释倍数的确定

3.2优化封闭液

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将封闭液由5％BSA分别替换为5％BSA、2.5％BSA、5％马血清、10％马血清、5％猪血清、10％猪血清、5％脱脂奶粉和2.5％脱脂奶粉，在上述最优条件下检测各封闭液对结果的影响，选择最优封闭液，其他步骤均不变。

5％BSA：由BSA溶解至0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到，BSA的浓度为5g/100mL。

2.5％BSA：由BSA溶解至0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到，BSA的浓度为2.5g/100mL。

5％马血清：将5ml马血清(北京索莱宝科技有限公司)加入至95ml 0.01M PBS中得到。

10％马血清：将10ml马血清加入至90ml 0.01M PBS中得到。

5％猪血清：将5ml猪血清(Biotopped Life sciences公司)加入至95ml 0.01MPBS中得到。

10％猪血清：将10ml猪血清加入至90ml 0.01M PBS中得到。

5％脱脂奶粉：由脱脂奶粉(美国BD公司，货号232100)溶解至0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到，脱脂奶粉的浓度为5g/100mL。

2.5％脱脂奶粉：由脱脂奶粉溶解至0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到，脱脂奶粉的浓度为2.5g/100mL。

结果显示，当用2.5％脱脂奶粉封闭时，P/N值最大，为20.79，且N值较低。因此2.5％脱脂奶粉作为最佳封闭液。结果见表2。

表2、间接ELISA封闭液的确定

3.3优化封闭时间

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将封闭时间由2h分别替换为1h、2h、3h，在上述最优条件下检测各封闭时间对结果的影响，其他步骤均不变。

结果显示，在37℃封闭1小时和2小时后，P/N值的差别不大，节约时间考虑，选择1h为最佳封闭时间。结果见表3。

表3、间接ELISA封闭时间的确定

3.4优化一抗稀释液

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将样品稀释液分别替换为0.01M(ph7.2-7.4)PBS、5％BSA、2.5％BSA、5％马血清、2.5％马血清、5％兔血清、2.5％兔血清、2.5％脱脂奶粉，在上述最优条件下检测各样品稀释液对结果的影响，其他步骤均不变。

2.5％马血清：将2.5ml马血清加入至97.5ml 0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到。

5％兔血清：将5ml兔血清(北京索莱宝科技有限公司)加入至95ml 0.01M

(ph7.2-7.4)PBS中得到。

2.5％兔血清：将2.5ml兔血清加入至97.5ml 0.01M(ph7.2-7.4)PBS中得到。

结果显示，当以5％BSA作为样品稀释液时，N值较低，P/N值最大，为17.83。因此5％BSA为最优样品稀释液。结果见表4。

表4、间接ELISA一抗稀释液的确定

3.5优化血清作用时间

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将血清作用时间由60min分别替换为30min、60min、90min，在上述最优条件下检测各血清作用时间对结果的影响，其他步骤均不变。

结果显示，当血清作用时间为60分钟时，P/N值最大，为15.82，因此选择60min为最佳血清作用时间。结果见表5。

表5、间接ELISA血清作用时间的确定

3.6优化二抗稀释度

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将二抗稀释度由1:10000分别替换为1:5000、1:10000、1:20000、1:40000，在上述最优条件下检测各二抗稀释度对结果的影响，其他步骤均不变。

结果显示，当二抗稀释度为1:10000时，P/N值最大，为11.42。选择1:10000为最佳二抗稀释度。结果见表6。

表6、间接ELISA酶标二抗稀释度的确定

3.7优化二抗作用时间

按照上文步骤3.1.1-3.1.6，将二抗作用时间由60min分别替换为30min、60min、90min，在上述最优条件下检测各二抗作用时间对结果的影响，其他步骤均不变。

结果显示，当二抗作用时间为60min时，P/N值最大，选择60min为最佳二抗作用时间。结果见表7。

表7、间接ELISA酶标二抗作用时间的确定

3.8检测MG抗体的间接ELISA方法的确定

根据上文各条件的优化，得到检测MG抗体的间接ELISA方法的步骤如下：

A.抗原的包被：用0.01M(ph7.9)PBS将纯化的PVPA重组蛋白稀释，得到蛋白浓度为1μg/mL的蛋白稀释液，利用所得蛋白稀释液分别包被微孔板，每孔100μl/孔，用封口贴密封微孔板，4℃包被10-12h。包被结束后甩去孔内液体，每孔加入300μl PBST，洗涤三次，弃尽微孔内液体。

B.封闭：步骤A完成后，向微孔板每孔加入200μl的2.5％脱脂奶粉，用封口贴密封微孔板，37℃作用1h。封闭结束后甩去孔内液体，每孔加入300μl PBST洗涤三次，弃尽微孔内液体。

C.加样：步骤B完成后，用5％BSA分别将步骤2的MG阳性鸡血清(阳性标准品)和标准阴性对照血清(阴性标准品)分别作以1:500稀释后添加至微孔板中，每孔100μl。然后将待测血清利用5％BSA稀释后加至微孔板中，每孔100μl。加样完成后，用封口贴密封微孔板，然后将微孔板置于37℃孵育60min。孵育结束后甩去孔内液体，每孔加入300μl PBST洗涤三次，弃尽微孔内液体。

D.加二抗：步骤C完成后，将二抗(辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY)利用0.01MPBS(ph7.2-7.4)以1:10000倍稀释后添加至微孔板中，每孔100μl。用封口贴密封微孔板，37℃作用60分钟。孵育结束后甩去孔内液体，每孔加入300μlPBST洗涤三次，弃尽微孔内液体。

E.TMB显色：步骤D完成后，微孔板每孔加入100μl的底物反应液(现配现用)，37℃避光静置10min显色，然后每孔加入50μl的2mol/L的H₂SO₄终止反应。

F.检测OD450nm值：将已终止反应的微孔板置于酶标仪读数槽内，使用检测波长450nm测量读取各孔的吸光度值；在10min内完成数据读取，获得待测血清孔OD450nm值(S值)、MG阳性鸡血清孔OD450nm值(P值)与标准阴性对照血清孔OD450nm值(N值)，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)。

3.9阴阳性临界值的确定

将262份鸡血清(来自于北京市动物疫病预防控制中心)作为待测血清，分别用IDEXX公司的禽败血支原体抗体检测试剂盒和步骤3.8的检测MG抗体的间接ELISA方法进行检测，获得待测血清孔OD450nm值(S值)、MG阳性鸡血清孔OD450nm值(P值)与标准阴性对照血清孔OD450nm值(N值)，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)。

将结果输入Medcalc软件得到ROC曲线(图5)。

结果表明，当S/P为0.67时，敏感性和特异性均较好，此时，敏感性为91.6，特异性为94.7，曲线下面积(AUC)为0.971。因此将S/P＝0.67确定为临界值。结果见图5。

具体的，判断待测血清是否为阳性血清的标准如下：

当阳性标准品OD450nm(即P值)＞1.0，阴性标准品OD450nm(即N值)＜0.2时，判定实验成立，计算S/P；当S/P≥0.67时，判定待测血清为阳性血清(含有MG抗体)，即MG感染血清；当S/P＜0.67时，判定待测血清为阴性血清(不含MG抗体)，即未被MG感染血清。

3.10特异性试验

将IBV阳性血清、IBDV阳性血清、NDV阳性血清、MS阳性血清、禽流感H5、H7、H9亚型阳性血清作为待测血清，以步骤2的MG阳性鸡血清和标准阴性对照血清作为对照，利用步骤3.8的检测MG抗体的间接ELISA方法分别进行检测，利用3.9的判断标准判断待测血清是否为阳性血清，检验本发明建立的检测MG抗体的间接ELISA方法的特异性。

IBV阳性血清、IBDV阳性血清、NDV阳性血清、MS阳性血清均为中国兽医药品监察所产品，均非MG感染血清。

禽流感H5、H7、H9亚型阳性血清均为哈尔滨国生生物科技股份有限公司产品，均非MG感染血清。

结果(表8)显示，IBV阳性血清、IBDV阳性血清、NDV阳性血清、MS阳性血清、禽流感H5、H7、H9亚型阳性血清、阴性血清均检测为阴性血清，阳性血清检测为阳性血清，表明，本发明的方法具有很好的特异性。

表8、特异性试验

3.11敏感性试验

将按照步骤2的方法制备得到的HI(血凝抑制效价)为1：128的MG阳性鸡血清做1:1、1:2、1:4、1:8、1:16等倍比稀释，利用步骤3.8的检测MG抗体的间接ELISA方法分别进行检测，检验本发明建立的检测MG抗体的间接ELISA方法敏感性，阳性对照和阴性对照为步骤2的MG阳性鸡血清与标准阴性对照血清。从表9中的数据可以看出，本方法可以检出的最低限为1:16。

表9、敏感性试验结果

3.12符合率试验

将301份鸡血清(来自于北京市动物疫病预防控制中心)作为待测血清，分别用IDEXX公司的禽败血支原体抗体检测试剂盒和本发明的检测MG抗体的间接ELISA方法进行检测，并对两种方法的结果进行比较分析，结果见表10。

结果显示，两种方法的总符合率为88.04％。

表10、本试剂盒和IDEXX公司试剂盒对301份临床样本的检测结果

3.13稳定性试验

3.13.1.制备包被稳定剂

按照表11的配方制备SHMCKT溶液，然后称量一定量的蔗糖和PEG4000，加入其中，充分搅拌混匀，使得蔗糖的浓度为3g/100mL，PEG4000浓度为0.1g/100mL，最后加入一定量的Proclin300，使得其浓度(v/v)为0.05％，得到包被稳定剂。其中，Proclin300为北京索莱宝科技有限公司产品，货号为P6840。

表11 SHMCKT溶液配方

3.13.2.制备抗原包被板

将上文所得纯化的PVPA重组蛋白液利用0.01M(ph7.9)PBS稀释为1μg/ml，包被酶标板，每孔l00μL，置4℃包被10-12h小时后弃去抗原包被液。用洗涤液(PBST)重复洗涤3次。每孔加入2.5％脱脂奶粉200μL，在37℃条件下封闭1小时。然后弃去封闭液，用洗涤液(PBST)重复洗涤3次。每个孔中加入200μL的步骤3.13.1得到的包被稳定剂，在37℃条件下孵育2小时，然后弃去孔内的液体，拍干，将包被板置于超净工作台中，室温下干燥4小时，将抗原包被板装入铝箔袋中，同时放入一袋干燥剂，装袋密封。

3.13.3 37℃破坏性试验

将步骤3.13.2制备的抗原包被板分别在37℃放置0天、1天、3天和7天按照步骤3.8的C-F检测包被稳定剂的影响。所用血清为血清1-4，其中，血清1-3为按照步骤2的方法利用不同个体得到的MG阳性鸡血清，血清4为步骤2的标准阴性对照血清。利用未用包被稳定剂处理的抗原包被板作为对照。

表11 37℃破坏性试验(OD450nm值)

可以从表中数据看出，在37℃条件下，抗原包被板的7天检测结果没有太大浮动，说明本抗原包被板可以再37℃条件下稳定保存至少7天。而未用包被稳定剂处理抗原包被板仅可以保存0天。

对比中国专利申请201910226908.7和中国专利201110094758.2：

其中中国专利申请201910226908.7中需要使用核酸适配体，而核酸适配体的合成成本较高。此外该方法的操作步骤较多，反应时间长。

中国专利201110094758.2中没有提起试剂盒的稳定性试验。而本专利补充了包被稳定剂的配方，以及37℃的破坏性试验数据，可以在37℃条件下稳定保存至少7天。

因此综合来看，本方法的优势在成本较低，反应步骤简单，稳定性较好。

<110> 中国农业大学

<120> 一种鸡毒支原体抗体的间接ELISA检测试剂盒及检测方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1142

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 1

cgggatccat ggagttaaat aaattaaaaa aacataagat catatcgatc gttttaatgg 60

ctattggggc tcttatttta ttgtcaggga ttgcactaac agcagttata gcaagcccaa 120

ttaactcagt agaagttaca gagatgatga atggtcaaga agtcacaaca actaaaaaga 180

ttagtacgtt tgccttctta atcaacatgt taccaaatta ccaactaagt acacttggtt 240

acttacagat tacaggagca gctgctggac ttgtagtagg gattgtatta cttgcattag 300

gcgcaacatt ctttgttaaa actagacgta aaacaaatga aatgcttgct gcacttcaag 360

atgctgaaga agaagaagaa gtggcacaag aagaacaagc tgaagaaaat gttgaagcca 420

ctccaactca acaagctgaa gttaagactg aacaattaat tggcacacaa ttagtaacaa 480

ctgatgtagc tagcactcaa gctgtaggta ctgaagaagt tcaaggtgtt ttattacctc 540

ctagtcaaca accaacggaa atgcgtccag ctccttcacc aatgggtagt cctaagttat 600

taggtccaaa ccaagctggt catccacaac acggaccacg tccgatgaat gctcatccag 660

gtcaaccacg tcctcaacaa gctggcccac gtccaatggg agctggtgga tctaaccaac 720

caagaccaat gccaaatggt ctacaaaacc cacaaggtcc acgaccaatg aaccctcaag 780

gcgatcctcg tcctcaacca gctggtgtca gacctaacag cccacaaaat tctcaaccac 840

gcccaatgcc aaataaacca caaggtccac gaccaatggg tgctccaaat cctcaaccag 900

gccctcaaca agctggccca cgtccaatgg gagttggtgg atctaaccaa ccaagaccaa 960

tgccaaatgg tctacaaaac ccacaaggtc cacgaccaat gaaccctcaa ggcgatcctc 1020

gtcctcaacc agctggtgtc agacctaaca gcccacaagc taaccagcca ggacgacgtc 1080

caacaccaaa taatcctcaa ggcccacggc caatgggtcc aagaccaaat taactcgagc 1140

gg 1142

<210> 2

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 2

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Met Glu Leu Asn Lys Leu Lys Lys His Lys Ile Ile Ser Ile

35 40 45

Val Leu Met Ala Ile Gly Ala Leu Ile Leu Leu Ser Gly Ile Ala Leu

50 55 60

Thr Ala Val Ile Ala Ser Pro Ile Asn Ser Val Glu Val Thr Glu Met

65 70 75 80

Met Asn Gly Gln Glu Val Thr Thr Thr Lys Lys Ile Ser Thr Phe Ala

85 90 95

Phe Leu Ile Asn Met Leu Pro Asn Tyr Gln Leu Ser Thr Leu Gly Tyr

100 105 110

Leu Gln Ile Thr Gly Ala Ala Ala Gly Leu Val Val Gly Ile Val Leu

115 120 125

Leu Ala Leu Gly Ala Thr Phe Phe Val Lys Thr Arg Arg Lys Thr Asn

130 135 140

Glu Met Leu Ala Ala Leu Gln Asp Ala Glu Glu Glu Glu Glu Val Ala

145 150 155 160

Gln Glu Glu Gln Ala Glu Glu Asn Val Glu Ala Thr Pro Thr Gln Gln

165 170 175

Ala Glu Val Lys Thr Glu Gln Leu Ile Gly Thr Gln Leu Val Thr Thr

180 185 190

Asp Val Ala Ser Thr Gln Ala Val Gly Thr Glu Glu Val Gln Gly Val

195 200 205

Leu Leu Pro Pro Ser Gln Gln Pro Thr Glu Met Arg Pro Ala Pro Ser

210 215 220

Pro Met Gly Ser Pro Lys Leu Leu Gly Pro Asn Gln Ala Gly His Pro

225 230 235 240

Gln His Gly Pro Arg Pro Met Asn Ala His Pro Gly Gln Pro Arg Pro

245 250 255

Gln Gln Ala Gly Pro Arg Pro Met Gly Ala Gly Gly Ser Asn Gln Pro

260 265 270

Arg Pro Met Pro Asn Gly Leu Gln Asn Pro Gln Gly Pro Arg Pro Met

275 280 285

Asn Pro Gln Gly Asp Pro Arg Pro Gln Pro Ala Gly Val Arg Pro Asn

290 295 300

Ser Pro Gln Asn Ser Gln Pro Arg Pro Met Pro Asn Lys Pro Gln Gly

305 310 315 320

Pro Arg Pro Met Gly Ala Pro Asn Pro Gln Pro Gly Pro Gln Gln Ala

325 330 335

Gly Pro Arg Pro Met Gly Val Gly Gly Ser Asn Gln Pro Arg Pro Met

340 345 350

Pro Asn Gly Leu Gln Asn Pro Gln Gly Pro Arg Pro Met Asn Pro Gln

355 360 365

Gly Asp Pro Arg Pro Gln Pro Ala Gly Val Arg Pro Asn Ser Pro Gln

370 375 380

Ala Asn Gln Pro Gly Arg Arg Pro Thr Pro Asn Asn Pro Gln Gly Pro

385 390 395 400

Arg Pro Met Gly Pro Arg Pro Asn

405

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

cgggatccat ggagttaaat aaattaaaaa aacataa 37

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

ccgctcgagt taatttggtc ttggacccat tg 32

Claims (10)

1.成套试剂，包括PVPA蛋白与P1，所述PVPA蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的第35-408位的蛋白质；

A2)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A3)将序列表中序列2或序列2的第35-408位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A4)在A1)或A2)或A3)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述P1为2.5％脱脂奶粉和/或5％BSA和/或包被稳定剂；

所述2.5％脱脂奶粉由0.01M PBS(PH7.2-7.4)与脱脂奶粉组成，所述脱脂奶粉在所述2.5％脱脂奶粉中的浓度为2.5g/100mL；

所述5％BSA由0.01M PBS(PH7.2-7.4)与牛血清白蛋白组成，所述牛血清白蛋白在所述5％BSA中的浓度为5g/100mL；

所述包被稳定剂由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，溶质及其在所述包被稳定剂中的浓度分别为HEPES 20mM、NaCl 120mM、KCl 5mM、CaCl₂ 1mM、MgCl₂ 1mM、吐温-20 0.05％(体积百分比)、蔗糖3g/100mL、PEG4000 0.1g/100mL和Proclin3000.05％(体积百分比)。

2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括MG阳性血清和/或MG阴性血清。

3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括0.01M PBS(PH7.2-7.4)、辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY、微孔板、洗涤液、显色底物和/或终止液。

4.权利要求1-3中任一所述成套试剂的下述任一应用：

(c1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(c2)制备用于检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的试剂盒；

(c3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(c4)制备用于检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量的试剂盒；

(c5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体；

(c6)制备用于待测动物是否感染了鸡毒支原体的试剂盒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述动物为家禽；

进一步，所述家禽为鸡。

6.一种酶联免疫试剂盒，含有权利要求1-3中任一所述成套试剂。

7.权利要求6所述试剂盒的下述任一应用：

(c1)检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体；

(c2)制备用于检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的产品；

(c3)检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量；

(c4)制备用于检测待测动物血清中鸡毒支原体抗体含量的产品；

(c5)判断待测动物是否感染了鸡毒支原体；

(c6)制备用于待测动物是否感染了鸡毒支原体的产品。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述动物为家禽；

进一步，所述家禽为鸡。

9.检测待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体的方法，所述方法通过采用权利要求1-3中任一所述成套试剂进行间接ELISA实现，所述方法包括：以权利要求1中所述PVPA蛋白作为抗原，以权利要求1中所述2.5％脱脂奶粉作为封闭液，以权利要求1中所述5％BSA作为样品稀释液稀释待测动物血清，并以权利要求2中所述MG阳性血清和所述MG阴性血清分别作为阳性标准品和阴性标准品，依次进行抗原的包被、封闭、与待测样品的结合、与辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY的结合、显色、终止和读反应体系的OD450nm值，获得待测样品、阳性标准品和阴性标准品的OD450nm值，依次记为S值、P值和N值，根据如下方法确定所述待测动物血清是否含有鸡毒支原体抗体：

当P值＞1.0，N值＜0.2时，判定实验成立，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)；

当S/P≥0.67时，所述待测动物血清含有或候选含有鸡毒支原体抗体；当S/P＜0.67时，所述待测动物血清不含有或候选不含有鸡毒支原体抗体。

10.检测待测动物是否感染鸡毒支原体的方法，所述方法通过采用权利要求1-3中任一所述成套试剂进行间接ELISA实现，所述方法包括：以权利要求1中所述PVPA蛋白作为抗原，以权利要求1中所述2.5％脱脂奶粉作为封闭液，以权利要求1中所述5％BSA作为样品稀释液稀释待测动物血清，并以权利要求2中所述MG阳性血清和所述MG阴性血清分别作为阳性标准品和阴性标准品，依次进行抗原的包被、封闭、与待测样品的结合、与辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgY的结合、显色、终止和读反应体系的OD450nm值，获得待测样品、阳性标准品和阴性标准品的OD450nm值，依次记为S值、P值和N值，根据如下方法确定所述待测动物是否感染鸡毒支原体：

当P值＞1.0，N值＜0.2时，判定实验成立，计算S/P，S/P＝(S值-N值)/(P值-N值)；

当S/P≥0.67时，所述待测动物感染了或候选感染了鸡毒支原体；当S/P＜0.67时，所述待测动物未感染或候选未感染鸡毒支原体。

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