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CN111527196A - 具有增甜特性的新型乳酸细菌及其用途 - Google Patents

具有增甜特性的新型乳酸细菌及其用途 Download PDF

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CN111527196A
CN111527196A CN201880083188.7A CN201880083188A CN111527196A CN 111527196 A CN111527196 A CN 111527196A CN 201880083188 A CN201880083188 A CN 201880083188A CN 111527196 A CN111527196 A CN 111527196A
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strain
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glucokinase
seq
streptococcus thermophilus
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CN201880083188.7A
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A.科许-布拉谢尔
C.弗雷莫
T.德斯福格雷斯
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Original Assignee
DuPont Nutrition Biosciences ApS
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Abstract

本发明涉及在奶发酵期间释放葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株。此嗜热链球菌菌株在glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和/或ptsH基因中，并且任选地在编码甘露糖‑葡萄糖特异性PTS的蛋白质的一个或多个基因、特别是一个基因中携带突变。本发明还涉及包含本发明的至少一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的组合物，以及此菌株或组合物用以制造发酵乳产品的用途。

Description

具有增甜特性的新型乳酸细菌及其用途
技术领域
本发明涉及在奶发酵期间释放葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株。此嗜热链球菌菌株在如下基因中携带突变：编码葡萄糖激酶的glcK基因，在所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零，并且任选地其中在所述菌株中其葡萄糖激酶的最大正向速度(maximum forwardvelocity，Vmax)被显著降低但不为零；ccpA基因；lacZ基因和/或ptsH基因。此菌株还可以在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。本发明还涉及一种包含本发明的至少一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的组合物，以及此菌株或组合物用以制造发酵乳产品的用途。
背景技术
食品行业使用细菌来改进食物或饲料产品的口味和质地。在乳行业的情况下，常使用乳酸细菌来例如引起奶的酸化(通过乳糖发酵)，并且改变所述乳酸细菌所掺入的产品的质地。例如，嗜热链球菌(S.thermophilus)的乳酸细菌单独或与其他细菌组合地广泛用于制造新鲜发酵乳产品，诸如酸奶。术语“酸奶”根据法国和欧洲法规定义，即通过用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus；Lb.bulgaricus)进行乳酸发酵获得的凝结乳产品。
考虑到消费者的口味，新鲜发酵乳产品通常通过添加水果、糖或甜味剂来增甜。因此，通常添加人工或天然甜味剂以增强最终新鲜发酵乳产品的甜味特性。然而，同时，对更健康产品的需求不断增长，在更这些健康产品中不向最终产品添加添加剂。
因此，需要使用很少或不使用添加剂制造甜新鲜发酵乳产品的方法。最近已经讨论或提出了基于天然产生葡萄糖的菌株的解决方案。
Pool等人(2006.Metabolic Engineering[代谢工程]8(5)；456-464)讨论了通过对乳酸乳球菌(Lactococcus lactis；L.lactis)进行工程改造以产生葡萄糖来进行食品的天然增甜。因此，Pool等人披露了一种乳酸乳球菌菌株，其中葡萄糖代谢通过缺失编码葡萄糖激酶的glcK基因(即没有葡萄糖激酶活性)、编码甘露糖/葡萄糖-PTS的ptnABCD基因和编码葡萄糖-PTS Ellcel的蛋白质复合物EIIBAcel的ptcB-ptcA基因被完全破坏。因此，获得的菌株可以仅发酵乳糖的半乳糖部分(由于乳酸乳球菌菌株是半乳糖发酵菌株)，而葡萄糖部分在细胞外积聚。但是，乳酸乳球菌物种不一定适合制造所有新鲜发酵乳产品，并且特别是酸奶(其需要嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株)。
WO 2013/160413、WO 2017/103051和
Figure BDA0002550677360000021
等人(2016；Appl EnvironMicrobiol[应用环境微生物]82(12)：3683-3692)披露了嗜热链球菌菌株，所述菌株具有增强的用于天然增甜食品的特性。这些嗜热链球菌菌株发酵半乳糖，并且其glcK基因中携带突变，从而敲除了磷酸化葡萄糖的能力(即，这些发酵半乳糖的嗜热链球菌菌株没有显示可检测的GlcK活性)。半乳糖发酵表型通过已知编码GalK、GalT、GalE和GalM酶的半乳糖操纵子(galK基因上游)启动子区域的突变获得。产生具有不可检测的葡萄糖激酶活性的G1cK蛋白的氨基酸变化是S72P、T141I和G249R。但是，这些菌株的酸化动力学显著延迟。
Van den Bogaard等人(Journal of Bacteriology[细菌学杂志]；2000.182：5982-5989)披露了嗜热链球菌中ccpA基因的敲除(完全破坏)。然而，此种突变体尽管在补充有乳糖(20mM)的M17上生长期间释放葡萄糖(13mM)，但其酸化动力学显著延迟(延长的延滞时间和降低的生长速率)，使其不能以工业规模使用。
WO 2015/0149940(Tine SA)披露了一种通过大规模进行随机诱变并通过酶促手段对乳糖阳性突变体检测葡萄糖来鉴定分泌葡萄糖的乳酸细菌的方法。但是，Tine未描述该方法影响的一个或多个突变和/或基因的性质和数量。在实例部分中，获得的突变体是半乳糖阳性菌株，如实例1所报告(在补充有半乳糖的M17琼脂平板上选择嗜热链球菌菌株)。
因此，仍然需要能够天然产生葡萄糖并且可以以工业规模用于制造包括酸奶的新鲜发酵乳产品的菌株。
附图说明
图1：DGCC7710(DSM28255)、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的GlcK蛋白序列的比对。将与DGCC7710的GlcK蛋白(SEQ ID NO：2)的差异框出。
图2：用DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株获得的奶酸化曲线(pH随时间的变化)。
图3：用(A)ST1.1菌株及其E275K(ST1.1m-glcK)突变体和(B)ST1.2菌株及其E275K突变体(ST1.2m-glcK)获得的奶酸化曲线(pH随时间的变化)。
图4：在本发明的各种嗜热链球菌菌株及其亲本菌株(对照)中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率。
具体实施方式
本发明已经证明，除了完全消除参与糖代谢的蛋白质的功能的突变(诸如ccpA破坏，没有可检测的葡萄糖激酶活性的GlcK蛋白)以外，还可以使用对糖代谢严格去调节(而非抑制)的突变来设计在乳发酵期间释放高浓度葡萄糖的嗜热链球菌菌株。本发明人已经很好地显示，此类嗜热链球菌菌株可以通过其β-半乳糖苷酶活性相对于其葡萄糖激酶活性的比率来表征。此比率说明了本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在其生长期间，特别是在奶发酵期间使用时使用乳糖和葡萄糖两者的行为。实际上，β-半乳糖苷酶负责将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，而葡萄糖激酶使葡萄糖可通过糖酵解路径使用。因此，本发明人已经显示，由于乳糖的过度水解，增加β-半乳糖苷酶活性而不对葡萄糖激酶活性水平进行任何改变[在本文提及的比率内]使游离葡萄糖增加。另一方面，降低葡萄糖激酶活性而不对β-半乳糖苷酶活性进行任何改变[在本文提及的比率内]具有相同的代谢影响。有趣的是，本发明的菌株不必是半乳糖阳性的(已经显示在乳糖中不稳定的表型)。
因此，本发明涉及乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6。
通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述 菌株中的葡萄糖激酶活性的比率
本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株表现出(或具有)至少4.10-6的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率。在一个实施例中，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6组成的组。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少5.10-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少6.10-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少7.10-6。在一个实施例中，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶的比率为至少8.10-6。
无论本文中定义的比率的最小值是多少，通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率均小于8.10-3。
值得注意的是，在如下嗜热链球菌菌株中不能测量本文定义的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，该菌株的葡萄糖激酶活性为零或不能通过本文所述的测试(诸如表1中披露的菌株)检测。还值得注意的是，在如下嗜热链球菌菌株中，本文定义的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率大于8.10-3，所述菌株的葡萄糖激酶活性显著降低。为了避免疑问，这些嗜热链球菌菌株不是本发明的一部分。
根据本发明，通过测试D测定本发明嗜热链球菌菌株中的β-半乳糖苷酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试D]：
测试D：
获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在42℃下在M17+30g/L乳糖上生长3小时后，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在1.5ml冷裂解缓冲液(KPO40.1M)中洗涤，并再悬浮于300μl冷裂解缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmpleteTM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到裂解缓冲液中。通过向250μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch，Haan，Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKAProtein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白含量。通过分光光度法监测O-硝基-苯酚-β-半乳糖苷(ONPG)向半乳糖和O-硝基-苯酚(ONP)的水解来确定细胞提取物中的β-半乳糖苷酶活性。将20μL细菌提取物与135μL反应缓冲液(NaPO4 0.1M+KCl 0.01M+MgSO4 0.001M+ONPG 3mM+β巯基乙醇60mM，pH＝6)混合。ONP的产生使管中呈黄色。当出现此颜色时，通过添加250μL终止缓冲液(Na2CO3 1M)来阻断反应。使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司(BIO-TEK))测量420nm下的光密度。一单位的半乳糖苷酶对应于在测定条件下每分钟催化产生1微摩尔ONP的酶的量。β-半乳糖苷酶的活性如下计算：
β-半乳糖苷酶活性(U/g总蛋白提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：
-dOD是空白样品与测试样品之间在420nm下的光密度(OD)的变化
-V是光密度经测量的反应的体积(在本文中为250μL)
-dt＝表示添加20μL细菌提取物至添加250μL终止缓冲液的持续分钟数
-l＝光路长度(在本文中为0.73cm)
-ε＝ONP的摩尔衰减系数(在本文中为4500cm2/μmol)
-Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)
对于每个样品至少测量三次，并且本文中根据测试D给出的β-半乳糖苷酶比活性值是三次独立实验的平均值。
根据本发明，为了确定本文中定义的比率，通过测试E测定本发明嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试E]。
测试E：
获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在42℃下在M17+30g/L乳糖上生长3小时后，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在1.5ml冷GLCK缓冲液(5mM MgCl2，10mM K2HPO4/KH2PO4[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于300μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmplereTM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向250μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch，Haan，Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白含量。通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH偶联测定(Porter等人，1982)，基本上如Pool等人(2006)所述用分光光度法确定细胞提取物中的葡萄糖激酶活性。将每种样品(5、10和20μL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mM K2HPO4/KH2PO4[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：
葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：
-dOD是340nm下光密度(OD)的变化
-V是反应体积(本文中为250μL)
dt＝测量时间(以分钟计)
l＝光路长度(在本文中为0.73cm)
ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H+(本文中为6220cm2/μmol)
Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)
对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试E给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。
在奶发酵期间，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株释放葡萄糖。
如本文所述，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株可以进一步用其在用于发酵奶时释放葡萄糖的能力表征。在本文中，当本发明的菌株用于发酵奶时，此能力用释放到奶中的葡萄糖的浓度定义。在一个实施例中，发酵条件根据以下定义的测试B，并且通过所述测试B确定释放的葡萄糖的浓度：
测试B：
以1％(v/v，约107CFU/ml)用待测定的嗜热链球菌菌株的培养物(来自在补充有3％蔗糖的M17中生长的过夜培养物的无碳水化合物M17再悬浮细胞)接种预先在90℃下巴氏灭菌10min的含有3％(w/v)奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司(Lactalis))的UHT半脱脂奶“LePetit Vendéen”(“酸奶”)。发现此奶含有约175mM乳糖。将接种的奶瓶在43℃的水浴中静置孵育24h，获得发酵奶。将T0样品和发酵奶(T24h)样品(5g)在25g 0.025N H2SO4中稀释，随后在4℃下以4600rpm离心10分钟。将上清液通过0.2μn尼龙滤膜(德国阿沙芬堡的菲罗门公司(Phenomenex，Germany，Aschaffenburg))直接过滤到2ml HPLC小瓶中。将样品储存在-20℃下直至进一步分析。在35℃下，通过配备有折射率检测器的高效液相色谱(安捷伦(Agilent)1200HPLC)，使用Aminex HPX-87H阴离子交换柱(伯乐实验室公司(Bio-RadLaboratories Inc.))，使用12.5mM H2SO4作为洗脱液和0.6ml min-1的流速对碳水化合物进行定量。用Chemstation再处理软件(安捷伦公司(Agilent))进行结果的开发。
为了避免疑问，嗜热链球菌物种应理解为是唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcussalivarius subsp.thermophilus)菌株。
表述“乳糖阳性”是指嗜热链球菌菌株能够在作为碳水化合物来源的唯一来源的乳糖上，特别是在补充有2％乳糖的M17培养基上生长。在一个具体的实施例中，通过以下方法来测定“乳糖阳性”表型：以1％的比率在含有2％乳糖的M17肉汤中接种待测试的嗜热链球菌菌株的过夜培养物，并在37℃下孵育20小时，并且其中在孵育结束时5.5或更低的pH指示乳糖阳性表型。
表述“半乳糖阴性”是指嗜热链球菌菌株不能在作为碳水化合物来源的唯一来源的乳糖上，特别是在补充有2％乳糖的M17培养基上生长。在一个具体的实施例中，通过以下方法来测定“乳糖阴性”表型：以1％在含有2％乳糖的M17肉汤中接种待测试的嗜热链球菌菌株的过夜培养物，并在37℃下孵育20小时，并且其中在孵育结束时6或更高的pH指示乳糖阴性表型。
关于原始菌株的表述“衍生物”(例如，DGCC7710衍生物)是指从原始菌株(例如从DGCC7710菌株)通过将其基因中的一个(诸如glcK、ccpA……)用相同基因的另一个等位基因(特别是突变的等位基因)置换而获得的菌株。在一个实施例中，通过将原始菌株的完整基因(编码序列和启动子)用相同基因的另一个等位基因(编码序列和启动子)置换来获得衍生物。在一个实施例中，通过将原始菌株基因的编码序列用相同基因的另一个等位基因(编码序列)置换来获得衍生物。
本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在一个或多个选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因、ptsH基因和编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因组成的组的基因中携带突变，其中通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，为至少5.10-6，为至少6.10-6，为至少7.10-6或为至少8.10-6。在一个实施例中，并且无论如本文中所定义的比率的最小值是多少，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率均小于8.10-3。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在一个或多个选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的基因中携带一个或多个突变，并且任选地在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在一个或多个选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的基因中携带一个或多个突变，并且在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株1)在选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的基因中携带突变，或在glcK基因和ccpA基因中携带突变，以及2)在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的基因中携带第一突变，并且在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中携带第二突变。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在一个或多个选自由glcK基因、ccpA基因和编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因组成的组的基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因和/或ccpA基因中并且任选地在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。
在以上实施例中的任一个中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因选自由manL基因、manM基因、manN基因和manO基因组成的组。在以上实施例中的任一个中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在一个或两个选自由glcK基因和ccpA基因组成的组的基因中携带一个或多个突变，并且在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因和/或ccpA基因中并且任选地在manL基因、manM基因和manN基因中携带突变。
下文详细描述了本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的一些实施例，所述实施例表现出通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6：
I.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其glcK基因中携带突变。
II.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ccpA基因中携带突变。
III.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其glcK中携带突变并且其ccpA基因中携带突变。
IV.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其lacZ基因中携带突变。
V.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ptsH基因中携带突变。
VI.根据实施例I至V中任一项所述的本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其还在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变。
I.glcK基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株
本发明已经证明可以使用如下嗜热链球菌菌株在发酵奶中分泌葡萄糖，所述菌株为半乳糖阴性的，并且在编码葡萄糖激酶(GlcK)的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。
本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
表述“编码葡萄糖激酶的glcK基因”是指嗜热链球菌菌株中编码葡萄糖激酶的任何DNA序列，所述葡萄糖激酶催化葡萄糖和ATP向葡萄糖-6-磷酸(G6P)和ADP的转化。嗜热链球菌葡萄糖激酶序列的非限制性实例如SEQ ID No：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20所披露。
在本发明中，嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性由于所述菌株的glcK基因突变而被显著降低但不为零。换句话说，由所述菌株携带的glcK基因的等位基因使得所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。
表述“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”是指菌株的葡萄糖激酶活性符合以下两者：
-所述菌株中的葡萄糖激酶活性显著降低，特别是与携带非突变的glcK基因的菌株中的葡萄糖激酶活性相比；并且
-不为零，即，活性可通过如本文中所定义的测试A检测。
根据本发明，特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”可以通过本领域熟知的方法来确定。因此，用于测量嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性的方法是已知的，并且包括使用市售反应物的酶测定。本文参考Pool等人(2006.MetabolicEngineering[代谢工程]8(5)；456-464)的第2.4段(通过引用并入本文中)。在一个具体的实施例中，为了确定此特征，通过测试A测定本发明嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试A]。
测试A：
获得了待测定的嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在0.8+/-0.2的600nm光密度(OD600)时，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在5ml冷GLCK缓冲液(5mMMgCl2，10mM K2HPO4/KH2PO4[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于500μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmpleteTM”(罗氏公司(Roche)，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向200μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch，Haan，Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid，参考号51254)确定总蛋白含量。通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH偶联测定(Porter等人，1982)，基本上如Pool等人(2006)所述用分光光度法确定细胞提取物中的葡萄糖激酶活性。将每种样品(5、10和20uL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mMK2HPO4/KH2PO4[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：
葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白提取物)＝dOD x V/[dt x1xεx Qprot]，其中：
-dOD是340nm下光密度(OD)的变化
-V是反应体积(本文中为250μL)
dt＝测量时间(以分钟计)
l＝光路长度(在本文中为0.73cm)
ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H+(本文中为6220cm2/μmol)
Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)
对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试A给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。
在特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第一具体实施例中，如通过测试A所测定，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为200至1500U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为300至1200U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为400至1000U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。值得注意的是，如测试A所提及，本文披露的葡萄糖激酶活性值是三个独立实验(一式三份)的平均值。
在特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第二具体实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％的活性。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性”是指DGCC7710菌株中通过测试A测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQID NO：2)的活性[即，使用DGCC7710菌株进行测试A]。百分比值是根据本发明菌株中的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性计算的，两个葡萄糖激酶活性均通过测试A测定。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为菌株DGCC7710的葡萄糖激酶活性的15％至40％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。在一个具体的实施例中，并且无论百分比范围如何，均通过本文所述的测试A来测定葡萄糖激酶活性的活性。值得注意的是，本文披露的百分比值是根据葡萄糖激酶活性值计算的，所述葡萄糖激酶活性值是通过测试A测定的三个独立实验(一式三份)的平均值。
在第一和第二具体实施例中，以下菌株可用作测试A中的对照：
-作为阳性对照(即嗜热链球菌菌株，其代表携带非突变的glcK基因的菌株)：2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的菌株DGCC7710；
-作为阴性对照(即具有不可检测的葡萄糖激酶活性的嗜热链球菌菌株)：glcK基因被敲除的嗜热链球菌或glcK基因携带WO 2013/160413、WO 2017/103051或
Figure BDA0002550677360000151
等人(2016)中披露并总结于下表1中的突变之一的嗜热链球菌：
Figure BDA0002550677360000161
表1：产生葡萄糖激酶活性不可检测的菌株的glcK突变
在奶发酵期间，奶中含有的乳糖(作为奶中的主要碳水化合物来源)被输入到嗜热链球菌菌株中。然后通过β-半乳糖苷酶将细胞内乳糖裂解成葡萄糖和半乳糖(使得1摩尔乳糖产生1摩尔葡萄糖和1摩尔半乳糖)。
特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还可以用葡萄糖激酶的最大正向速度(在本文中称为Vmax，并定义为葡萄糖+ATP转化为G6P+ADP的速度)或用葡萄糖激酶对其底物即葡萄糖和ATP中的一种或两种的亲和力(称为Km)的倒数来表征。在一个实施例中，本发明菌株的特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还用所述菌株中的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)表征。
因此，与本文中定义的特征“所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的第一或第二具体实施例组合，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零。可以通过以下这些参数中的一个或两个来定义特征“所述菌株中的葡萄糖激酶Vmax被显著降低但不为零”：
-如通过测试C所测定，Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物。
-在均通过测试C测定时，Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。
在一个具体的实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，其中所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且其中所述菌株中其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零，并由以下这些参数中的一个或两个定义：
-如通过测试C所测定，Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物。
-在均通过测试C测定时，Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。
通过测试C测定本发明的嗜热链球菌中的葡萄糖激酶最大正向速度(Vmax)[即使用本发明的嗜热链球菌菌株进行测试C]。
测试C：
通过对如测试A中所述制备的粗提取物使用各种葡萄糖浓度(0、5、10、15、20mM)来确定最大正向速度(Vmax)。对于每个样品测量三次，并且根据测试C给出的Vmax值是三次独立实验的平均值。呈现出比速度倒数随葡萄糖浓度倒数的变化的线性回归给出了与图形Y轴相交处的最大正向速度的倒数。
在本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度的一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，Vmax为300至1200U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，Vmax为400至1000U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的Vmax为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。
在本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度的一个具体的实施例中，Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax”是指DGCC7710菌株中通过测试C测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQID NO：2)的Vmax[即，使用DGCC7710菌株进行测试C]。百分比值是根据本发明菌株中的葡萄糖激酶的Vmax和DGCC7710菌株的Vmax计算的，两种Vmax均通过测试C测定。在一个具体的实施例中，在均通过测试C测定时，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶的Vmax为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。
本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。
本发明中的“glck基因中的突变”是指glcK基因内的任何核苷酸变化，其中所述核苷酸层面的变化使携带此突变的glcK基因(作为唯一的glcK基因)的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地使所述菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明中的“glck基因中的突变”是指glcK基因的开放阅读框内的任何核苷酸变化，其中所述核苷酸层面的变化使携带此突变的glcK基因(作为唯一的glcK基因)的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地使所述菌株中的葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。
因此，尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的glcK基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个glcK基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是突变：
-不会引起蛋白质层面的任何改变(沉默变化)并且不会影响glcK RNA的翻译的核苷酸层面的变化；以及
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不影响如本文中所定义的所得GlcK蛋白的葡萄糖激酶活性和任选地所得GlcK蛋白的最大正向速度。实际上，可以在本发明的嗜热链球菌的glcK基因的层面上观察到此类变化，而不影响保护范围。
在本发明的意义上不被认为是突变的glcK基因的非限制性实例是：
-编码如SEQ ID NO：2中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：1中所定义的多核苷酸；此GlcK类型是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株之一；
-编码如SEQ ID NO：4中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST2)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：3中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：6中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST3)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：5中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：8中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST4)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：7中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：10中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST5)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：9中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：12中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST6)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：11中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：14中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST7)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：13中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：16中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST8)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：15中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：18中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST9)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：17中所定义的多核苷酸；
-编码如SEQ ID NO：20中所定义的葡萄糖激酶(GlcK类型ST10)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：19中所定义的多核苷酸。
表3中总结了葡萄糖激酶层面的氨基酸差异以及每种GlcK类型与SEQ ID NO：2的同一性百分比(实例2)。表4中总结了GlcK类型ST2至ST10的菌株中的葡萄糖激酶活性(实例3)。
此外，glcK基因内的一些核苷酸突变被认为不适用于本发明的目的，因为所述突变会产生如通过测试A所测定活性为零或低于本文定义的最小值的葡萄糖激酶。表1中描述了不合适突变的非限制性实例。在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌不携带选自由引起glcK基因敲除和glcK基因内大缺失的突变组成的组的突变。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因的开放阅读框中携带突变，使得GlcK蛋白中的氨基酸被取代，携带所述突变的glcK基因的所述菌株中所述GlcK蛋白的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因中携带突变，使得GlcK蛋白中的氨基酸被取代，携带所述突变的glcK基因的所述菌株中所述GlcK蛋白的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在glcK基因中携带突变，使得GlcK蛋白的长度为322个氨基酸，并且其中所述菌株中葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地其中所述菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度如本文中所定义被显著降低但不为零。
如上所述，在本发明嗜热链球菌的glcK基因层面上可以观察到一些DNA修饰，这些修饰不影响菌株的葡萄糖激酶活性。基于本文中定义的测试A以及本文中定义的对照菌株，本领域技术人员应知道如何鉴定1)编码葡萄糖激酶的glcK基因，携带此glcK基因的菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且任选地其中携带此突变的glcK基因的菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度被显著降低但不为零(如本文中所定义)；2)带有如下修饰的glcK基因，所述修饰对携带此修饰的菌株中的葡萄糖激酶活性没有影响，或3)编码如下葡萄糖激酶的glcK基因，携带此glcK基因的菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为零(如本文中所定义)。
可以通过以下方法将DGCC7710菌株用作对照：用待测定的glcK基因置换其glcK基因以获得DGCC7710的衍生物，并通过测试A(葡萄糖激酶活性)或测试C(Vmax)测定所述DGCC7710衍生物。
本发明人已经鉴定了葡萄糖激酶内的两个位置，所述位置的氨基酸性质已经显示影响葡萄糖激酶的活性，使得葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且影响葡萄糖激酶的Vmax，使得Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零：葡萄糖激酶的第144位和第275位(即，glcK基因的第144个和第275个密码子)。值得注意的是，基于本文定义的测试A和C以及对照菌株，本领域技术人员应知道如何鉴定葡萄糖激酶内的其他位置和适当氨基酸，以获得被显著降低但不为零(如本文中所定义)的葡萄糖激酶活性和任选地被显著降低但不为零的最大正向速度，以及因此相应的glcK基因。
在一个实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸(由本发明的嗜热链球菌菌株的glcK基因编码)不是谷氨酸(即，是除谷氨酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子既不是GAA也不是GAG。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸不是酸性氨基酸(即，是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码非酸性氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第275位的氨基酸选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶275位的氨基酸是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是AAA或AAG。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的核苷酸823-825是AAA或AAG。
在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：25中所定义的序列，其中第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；以及
b)与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。
在另一个实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸(由本发明的嗜热链球菌菌株的glcK基因编码)不是甘氨酸(即，是除甘氨酸以外的任何氨基酸)；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子不是GGT、GGC、GGA或GGG。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸不是脂族氨基酸(即，是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶第144位的氨基酸选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子。在一个具体的实施例中，葡萄糖激酶144位的氨基酸是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的核苷酸430-432是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。
在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：46中所定义的序列，其中第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；以及
b)与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。
为了定义与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO：25中所定义的第275位不被考虑用于相似性或同一性的计算。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氮基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。
在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸(第275位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：25的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。
为了定义与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO：46中所定义的第144位不被考虑用于相似性或同一性的计算。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。
在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸(第144位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：46的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中所述变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中葡萄糖激酶第275位的氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地分别是赖氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子既不是GAA也不是GAG；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：25和本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是不编码酸性氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：25和本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ IDNO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子是编码选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：25和本文所定义的与SEQID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸及其任何保守氨基酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第275个密码子分别是编码赖氨酸的密码子，特别地分别是AAA或AAG；因此，在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由SEQID NO：22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组；在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因如SEQ ID NO：21中所定义。
在另一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中所述变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中葡萄糖激酶第144位的氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子不是GGT、GGC、GGA或GGG；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：46和本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是不编码脂族氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：46和本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ IDNO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何G1cK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸的密码子；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：46和本文所定义的与SEQID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)组成的组，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸及其任何保守氨基酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸；因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因的第144个密码子是编码丝氨酸的密码子，特别是AAA或AAG；因此，在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组：因此，在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因编码GlcK蛋白，所述GlcK蛋白的序列选自由SEQ ID NO：45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组；在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的glcK基因如SEQ ID NO：44中所定义。
在定义本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白的序列时，根据本申请的教导，表达此GlcK蛋白的菌株中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地此菌株中葡萄糖激酶的Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零。
在用于发酵奶时，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除用如本文中所定义的被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地用如本文中所定义的被显著降低但不为零的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)表征以外，还可以用其行为(释放葡萄糖的能力)表征。在用于发酵奶时，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除用本文所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率(其至少为4.10-6)来表征以外，还可以用其行为(释放葡萄糖的能力)表征。在用于发酵奶时，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除用本文所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率(其至少为4.10-6)，并且用如本文中所定义的被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地用如本文中所定义的被显著降低但不为零的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)来表征以外，还可以用其行为(释放葡萄糖的能力)表征。
因此，在用于发酵奶时，本发明的在glcK基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株还用以下这些特征中的至少一个表征，特别是用这些特征之一或用这2个特征的组合表征：
1)在使用所述菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于20％；
2)在使用所述菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中葡萄糖的浓度为至少10mM；
尽管上文已提及，下文还将分别描述这些特征中的每一个，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株具有如本文中所定义的被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地具有如本文中所定义的被显著降低但不为零的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)，还可以用这些特征之一或这两个特征的组合来进一步表征。
1)在一个具体的实施例中(单独或与特征2组合)，在glcK基因中携带突变的本发明的嗜热链球菌菌株的特征还在于在使用所述菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于20％
实际上，由于本发明菌株中“显著降低但不为零”的葡萄糖激酶活性，并且任选地由于所述菌株中葡萄糖激酶的“显著降低但不为零”的Vmax，此菌株使用来自消耗的乳糖(由葡萄糖和半乳糖制成的二糖)的葡萄糖的摩尔量的少于80％，使得来自消耗的乳糖的摩尔量的至少20％在发酵期间释放到奶中。在使用本文所述的测试B发酵奶后，通过计算发酵前奶中乳糖的摩尔数减去发酵后发酵奶中剩余的乳糖的摩尔数来确定消耗的乳糖的摩尔数。使用本文所述的测试B发酵奶后，确定发酵后发酵奶中发现的葡萄糖的摩尔数减去发酵前奶中可能已经存在的葡萄糖的摩尔数(如果有)(积聚的葡萄糖)。然后，计算积聚的葡萄糖相对于消耗的乳糖的比率，并且所述比率表示消耗的乳糖中在所述发酵奶中释放和积聚的葡萄糖部分的百分比。在一个具体的实施例中，在使用本发明的菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于30％。在一个具体的实施例中，在使用本发明的菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于40％。在一个具体的实施例中，在使用本发明的菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于50％。在一个具体的实施例中，在使用本发明的菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率大于60％。在一个具体的实施例中，在使用本发明的菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率选自由大于30％、大于40％、大于50和大于60％组成的组。
2)在一个具体的实施例中(单独或与特征1组合)，在glcK基因中携带突变的本发明的嗜热链球菌菌株的特征还在于如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少10mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少15mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少20mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少25mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度选自由以下浓度组成的组：至少10mM、至少15mM、至少20mM和至少25mM。
因此，在一个具体的实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株具有如本文中所定义的被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地具有如本文中所定义的被显著降低但不为零的其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)，还可以用这些特征之一或这两个特征的组合来进一步表征：
1)在使用所述菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中积聚/释放的葡萄糖的量(mM)相对于所述菌株消耗的乳糖的量(mM)的比率选自由大于30％、40％、50和60％组成的组；
2)在使用所述菌株如通过测试B所测定发酵奶时，所述发酵奶中葡萄糖的浓度选自由以下浓度组成的组：至少10mM、至少15mM、至少20mM和至少25mM；
II.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ccpA基因中携带突 变。
本发明涉及一种在ccpA基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
可以将任何突变引入嗜热链球菌菌株的ccpA基因中，只要能获得带有此突变的ccpA基因的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的上文所提及的比率即可。
在一个实施例中，ccpA基因突变不是使所述基因敲除(即，完全破坏)的突变。
在一个实施例中，ccpA基因突变是ccpA基因的编码序列中，特别是ccpA基因的编码序列的前270个核苷酸中的突变。在一个实施例中，所述突变是选自由以下组成的组的突变：
a)位于ccpA基因编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变(即，产生终止密码子)；以及
b)位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处(即，在第1个核苷酸与第250个核苷酸之间)引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变。
在一个实施例中，引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第50个核苷酸与第200个核苷酸之间。在一个实施例中，引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第100个核苷酸与第150个核苷酸之间。无论引起移框的突变位置是哪个，所述突变均选自由缺失、插入或缺失/插入(均不是3的倍数)组成的组。
尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的ccpA基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个ccpA基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是ccpA基因的突变：
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不能获得至少为4.10-6的编码此经修饰蛋白的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率
在本发明的意义上不被认为是突变的ccpA基因的非限制性实例是：
-如SEQ ID NO：65中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST1)；此ccpA类型是DGCC7710菌株之一；
-如SEQ ID NO：66中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST2)，所述多核苷酸与SEQ IDNO：65具有99.8％同一性；
-如SEQ ID NO：67中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST3)，所述多核苷酸与SEQ IDNO：65具有99.8％同一性；
-如SEQ ID NO：68中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST4)，所述多核苷酸与SEQ IDNO：65具有99.7％同一性；
-如SEQ ID NO：69中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST5)，所述多核苷酸与SEQ IDNO：65具有99.8％同一性；以及
-如SEQ ID NO：70中所定义的多核苷酸(ccpA类型ST6)，所述多核苷酸与SEQ IDNO：65具有99.7％同一性。
本发明人已经鉴定至少一种突变，在存在于乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因中时，该突变使得此菌株能够表现出如本文中所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。因此，本发明涉及一种在ccpA基因中携带选自由以下组成的组的突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：位于ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于ccpA基因的编码序列的前四分之一中导致ccpA基因的开放阅读框移框的突变，其中如本文中所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
在一个实施例中，ccpA基因的突变是在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失(引起ccpA基因的开放阅读框移框)。嗜热链球菌的此种突变的ccpA基因在本文中被称为ccpAΔ1A114-120。在一个实施例中，所述突变的ccpA基因的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：71中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性的ccpA变体序列。如本文中所定义的ccpA变体携带如上文所定义的突变，即选自由以下组成的组：位于ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于ccpA的编码序列的前四分之一中导致ccpA基因的开放阅读框移框的突变。
为了定义与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性的ccpA变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相同核苷酸的数量]。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性。在一个实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71的差异在于1至30个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71的差异在于1至20个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71的差异在于1至15个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71的差异在于1至10个核苷酸取代。在一个具体的实施例中，ccpA变体序列与SEQ ID NO：71的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因的序列选自由SEQ ID NO：71、72、73、74、75和76组成的组。
在用于发酵奶时，本发明的携带突变的ccpA基因的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除用本文所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6来表征以外，还可以用其释放葡萄糖的能力表征。
因此，本发明的在ccpA基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的特征还在于如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少8mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少9mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少10mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少12mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度选自由以下浓度组成的组：至少8mM、至少9mM、至少10mM和至少12mM。
在本申请的此部分中，本领域技术人员获得了关于如何获得并鉴定除特别披露的突变以外的ccpA基因突变的指导。基于上文所定义的比率[通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性]以及本文中所定义的参考菌株，本领域技术人员将知道如何鉴定根据本发明的突变的ccpA基因和获得本发明的嗜热链球菌菌株。
因此，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供嗜热链球菌菌株，其ccpA基因如SEQ ID NO：65中所定义，诸如DGCC7710菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对ccpA基因进行诱变，以获得序列与a)中菌株的ccpA基因的序列不同的ccpA基因；
c)插入b)中获得的ccpA基因来代替DGCC7710菌株的ccpA基因，以获得DGCC7710衍生物；
d)确定所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其中至少4.10-6的比率意味着插入的ccpA基因是根据本发明的突变的ccpA基因。在一个具体的实施例中，在所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，所述比率小于8.10-3。
另外，本领域技术人员还可以通过以下方法进行操作，以获得并鉴定根据本发明的突变的ccpA基因，并获得本发明的嗜热链球菌：
a)提供嗜热链球菌菌株，其ccpA基因如SEQ ID NO：65中所定义，诸如DGCC7710菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对ccpA基因进行诱变，以获得序列与a)中菌株的ccpA基因的序列不同的ccpA基因；
c)插入b)中获得的ccpA基因来代替DGCC7710菌株的ccpA基因，以获得DGCC7710衍生物；
d)确定所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择本文定义的呈现至少4.10-6的比率的DGCC7710衍生物；以及
e)通过测试B确定用在d)中选择的所述DGCC7710衍生物发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中至少8mM的葡萄糖浓度意味着插入的ccpA基因是根据本发明的突变的ccpA基因。在一个具体的实施例中，当在步骤e)中测量的葡萄糖浓度为至少9mM、至少10mM或至少12mM时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的。
替代性地，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供2017年8月15日保藏在DSMZ的DSM32587菌株(其glcK基因突变)；
b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的ccpA基因进行诱变，以获得序列与DSM32587的ccpA基因的序列不同的ccpA基因，从而获得ccpA突变的DSM32587菌株；
c)确定b)中获得的ccpA突变的DSM32587菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择呈现至少4.10-6的比率的ccpA突变的DSM32587菌株；以及
d)通过测试B确定用在c)中选择的所述ccpA突变的DSM32587菌株发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中
d1)至少50mM的葡萄糖浓度意味着突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，当在步骤d)中测量的葡萄糖浓度为至少60mM、至少70mM或至少80mM时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的，或
d2)在均通过测试B测定时，与用DSM32587菌株获得的葡萄糖浓度相比，用c)中选择的所述ccpA突变的DSM32587菌株获得的葡萄糖浓度增加至少150％意味着突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，当步骤d)中的葡萄糖增加为DSM32587菌株葡萄糖浓度的至少200％或至少300％时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的。
鉴定后，可以引入本文所鉴定的突变的ccpA基因来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ccpA基因，从而获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
III.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其glcK基因中携带突 变并且其ccpA基因中携带突变。
本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且在其ccpA基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
在一个实施例中，可以使用产生葡萄糖激酶的glcK基因的任何突变与任何ccpA突变的组合，其中在所述菌株中所述葡萄糖激酶的活性如本文中(特别是在以上I中)所述被显著降低但不为零，只要如本文中所定义通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6即可。换句话说，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在glcK基因中携带如本文中(特别是在以上I中)所定义的突变，并且还在ccpA基因中携带突变。
在一个实施例中，如下任何ccpA突变可以与任何glcK突变一起使用，所述ccpA突变使得具有此突变的ccpA基因的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，特别是DGCC7710菌株中，如本文(特别是在以上II中)所述通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，只要如本文中所定义通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6即可。换句话说，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在ccpA基因中携带突变，其中如本文中(特别是在以上II中)所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，并且还在glcK基因中携带突变。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株携带：
-产生葡萄糖激酶的突变的glcK基因，在所述菌株中所述葡萄糖激酶的活性如在本文中(特别是在以上I中)所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中所定义，被显著降低但不为零；以及
-突变的ccpA基因，其如本文中所定义，特别是以上II中的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中所定义，使通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
因此，可以将上文对于突变的glcK基因所披露的任何实施例与本文对于突变的ccpA基因所披露的任何实施例组合，其中所述glcK基因产生葡萄糖激酶，在所述菌株中所述葡萄糖激酶的活性被显著降低但不为零，所述突变的ccpA基因使通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，只要所获得的携带两个突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株表现出如本文中所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6即可。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带：
-开放阅读框中突变，特别是引起GlcK蛋白中的氨基酸取代的编码葡萄糖激酶的glcK基因，其中在所述菌株中葡萄糖激酶的活性被显著降低但不为零；以及
-携带选自由以下组成的组的突变的ccpA基因：a)位于ccpA基因编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变(即，产生终止密码子)；以及b)位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处(即，在第1个核苷酸与第250个核苷酸之间)引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带：
-编码如下葡萄糖激酶的突变的glcK基因，所述葡萄糖激酶的第144位不是甘氨酸，特别是丝氨酸，或第275位不是谷氨酸，特别是赖氨酸；以及
-携带引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变的ccpA基因，所述突变位于ccpA基因编码序列的第50个核苷酸与第200个核苷酸之间。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带：
-编码如下葡萄糖激酶的突变的glcK基因，所述葡萄糖激酶的第144位是丝氨酸，或所述葡萄糖激酶的第275位是赖氨酸；以及
-携带引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变的ccpA基因，所述突变位于ccpA基因编码序列的第100个核苷酸与第150个核苷酸之间。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带：
-编码如下葡萄糖激酶的突变的glcK基因，所述葡萄糖激酶的序列选自由SEQ IDNO：22、35、36、37、38、39、40、41、42、43、45、56、57、58、59、60、61、62、63和64(特别是SEQ IDNO：22和45)组成的组；以及
-突变的ccpA基因，所述基因的序列选自由SEQ ID NO：71、72、73、74、75和76(特别是SEQ ID NO：71)组成的组。
在用于发酵奶时，本发明的携带突变的glcK基因和突变的ccpA基因的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除用本文所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6来表征以外，还可以用其释放葡萄糖的能力表征。
因此，本发明的在glcK基因中携带突变并且在ccpA基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的特征还在于如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少50mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少60mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少70mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少80mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度选自由以下浓度组成的组：至少50mM、至少60mM、至少70mM和至少80mM。
在本文中类似地施加上文详述的用于如下目的的方法来获得在glcK基因和在ccpA基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述方法一方面用于获得并鉴定本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中突变的glcK基因，并且另一方面用于鉴定本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中的ccpA突变基因。
例如，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作，以获得并鉴定根据本发明的突变的ccpA基因：
a)提供DSM32587菌株(其glcK基因突变)；
b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的ccpA基因进行诱变，以获得序列与DSM32587的ccpA基因的序列不同的ccpA基因，从而获得ccpA突变的DSM32587菌株；
c)确定b)中获得的ccpA突变的DSM32587菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择呈现至少4.10-6的比率的ccpA突变的DSM32587菌株；以及
d)通过测试B确定用在c)中选择的所述ccpA突变的DSM32587菌株发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中
d1)至少50mM的葡萄糖浓度意味着突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，当在步骤d)中测量的葡萄糖浓度为至少60mM、至少70mM或至少80mM时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的，或
d2)在均通过测试B测定时，与用DSM32587菌株获得的葡萄糖浓度相比，用c)中选择的所述ccpA突变的DSM32587菌株获得的葡萄糖浓度增加至少150％意味着突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，当步骤d)中的葡萄糖增加为DSM32587菌株葡萄糖浓度的至少200％或至少300％时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的。
在另一个实例中，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作，以获得并鉴定根据本发明的突变的glcK基因：
a)提供DGCC7710菌株，其中所述菌株的ccpA基因已用如SEQ ID NO：71中所定义的突变的ccpA基因(ccpAΔ1A114-120)置换，所述菌株在本文中称为DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对a)中DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的glcK基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的glcK基因的序列不同的glcK基因，从而获得glcK突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；
c)确定b)中获得的glcK突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择呈现至少4.10-6的比率的glcK突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；以及
d)通过测试B确定用在c)中选择的所述glcK突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中
d1)至少50mM的葡萄糖浓度意味着突变的glck基因是根据本发明的。在一个实施例中，当在步骤d)中测量的葡萄糖浓度为至少60mM、至少70mM或至少80mM时，认为突变的glck基因是根据本发明的，或
d2)在均通过测试B测定时，与用DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株获得的葡萄糖浓度相比，用c)中选择的所述glcK突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株获得的葡萄糖浓度增加至少150％意味着突变的ccpA基因是根据本发明的。在一个实施例中，当步骤d)中的葡萄糖增加为DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株葡萄糖浓度的至少200％或至少300％时，认为突变的ccpA基因是根据本发明的。
在本上下文中，DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株是ccpA基因用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换的DGCC7710菌株。
鉴定后，可以引入本文所鉴定的突变的glcK基因和/或突变的ccpA基因来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因，从而获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
IV.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其lacZ基因中携带突 变。
本发明涉及一种在编码β-半乳糖苷酶(将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖)的lacZ基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
任何突变都是适当的，特别是与lacZ基因中未突变的相应菌株相比，增加所述β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性(即，β-半乳糖苷酶活性)的任何突变。还可以通过以下来鉴定lacZ基因的突变：使DGCC7710菌株的lacZ基因突变以获得lacZ突变的DGCC7710菌株，并且将所述lacZ突变的DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性与DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性比较，特别是在两个菌株均通过测试D测定时。因此，可以通过以下方法获得并鉴定根据本发明的lacZ突变：
a)提供DGCC7710菌株；
b)对lacZ基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710的lacZ序列不同的lacZ基因，从而获得lacZ突变的DGCC7710菌株；
c)确定b)中获得的lacZ突变的DGCC7710菌株中并且独立地确定DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性，两者均通过测试D，其中lacZ突变的DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性高于DGCC7710菌株中β-半乳糖苷酶活性意味着lacZ基因是根据本发明突变的。“较高的β-半乳糖苷酶活性”是指在均通过测试D检测时，b)中获得的lacZ突变的DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性比DGCC7710菌株中的β-半乳糖苷酶活性高至少150％、至少200％或至少300％。
鉴定后，可以引入根据本发明的突变的lacZ基因来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的lacZ基因，以设计本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
因此，尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的lacZ基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个lacZ基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是突变：
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不影响如本文中所定义的所得β-半乳糖苷酶的β-半乳糖苷酶活性。实际上，可以在本发明的嗜热链球菌的lacZ基因的层面上观察到此类变化，而不影响保护范围。
在本发明的意义上不被认为是突变的lacZ基因的非限制性实例是：
-编码如SEQ ID NO：78中所定义的β-半乳糖苷酶(β-Gal类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：77中所定义的多核苷酸；此β-Gal类型是DGCC7710菌株之一；
-编码如SEQ ID NO：80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110中所定义的β-半乳糖苷酶(β-Gal类型ST2至ST13)的lacZ多核苷酸，特别是如SEQ IDNO：79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所定义的lacZ多核苷酸。如SEQ ID NO：80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108和110中所定义的β-半乳糖苷酶的序列与SEQ ID NO：78具有98.9％至99.9％同一性。
在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌不携带选自由引起lacZ基因敲除和lacZ基因内大缺失的突变组成的组的突变。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在lacZ基因的调控序列中，特别是在启动子中携带突变，从而引起lacZ基因的转录过表达。本发明中可以突变的启动子序列的非限制性实例如在SEQ ID NO：77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所定义的lacZ基因的第1个核苷酸至第126个核苷酸中所披露。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在lacZ基因的编码序列中携带突变，从而引起β-半乳糖苷酶中的氨基酸取代，诸如如本文中所定义使β-半乳糖苷酶活性增加。在一个实施例中，所述取代不产生截短的β-半乳糖苷酶。本发明中可以突变的lacZ编码序列的非限制性实例如在SEQ ID NO：77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107和109中所定义的lacZ基因的第127个核苷酸至第3231个核苷酸中所披露。
在本申请的此部分中，本领域技术人员获得了关于如何获得并鉴定lacZ基因的突变的进一步指导。基于上文所定义的比率[通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性]以及本文中所定义的参考菌株，本领域技术人员将知道如何鉴定根据本发明的突变的lacZ基因和获得本发明的嗜热链球菌。
因此，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供嗜热链球菌菌株，其lacZ基因如SEQ ID NO：77中所定义，诸如DGCC7710菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对lacZ基因进行诱变，以获得序列与a)中菌株的lacZ基因的序列不同的lacZ基因；
c)插入b)中获得的lacZ基因来代替DGCC7710菌株的lacZ基因，以获得DGCC7710衍生物；
d)确定所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其中如本文中所定义至少4.10-6的比率意味着插入的lacZ基因是根据本发明的突变的lacZ基因。在一个具体的实施例中，在所述DGCC7710衍生菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6时，认为突变的lacZ基因是根据本发明的。在一个实施例中，所述比率小于8.10-3。
在一个实施例中，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供嗜热链球菌菌株，其lacZ基因的启动子序列如SEQ ID NO：77的第1个核苷酸至第126个核苷酸中所定义，诸如DGCC7710菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对lacZ基因进行诱变，以获得序列与a)中菌株的lacZ基因的启动子序列不同的lacZ基因的启动子序列；
c)插入b)中获得的启动子突变的lacZ基因来代替DGCC7710菌株的lacZ基因的启动子，以获得DGCC7710衍生物；
d)确定所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其中如本文中所定义至少4.10-6的比率意味着插入的lacZ基因的启动子是根据本发明的lacZ基因的突变的启动子。在一个具体的实施例中，在所述DGCC7710衍生菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6时，认为lacZ基因的突变的启动子是根据本发明的。在一个实施例中，所述比率小于8.10-3。
鉴定后，可以引入本文所鉴定的突变的lacZ基因，特别是lacZ基因的突变的启动子来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的lacZ基因，特别是代替lacZ基因的启动子，以获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
V.一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ptsH基因中携带突变
本发明涉及一种在编码HPr蛋白的ptsH基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
任何突变均是适当的，只要如本文中所定义通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性比通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性为至少4.10-6即可。
因此，尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的ptsH基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这两个ptsH基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是突变：
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不影响所得HPr的活性。实际上，可以在本发明的嗜热链球菌的ptsH基因的层面上观察到此类变化，而不影响保护范围。
在本发明的意义上不被认为是突变的ptsH基因的非限制性实例是：
-编码如SEQ ID NO：112中所定义的HPr蛋白(HPr类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：111中所定义的多核苷酸；此HPr类型是DGCC7710菌株之一；
-编码如SEQ ID NO：114、116、118和120中所定义的HPr蛋白(HPr类型ST2至ST5)的ptsH多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：113、115、117和119中所定义的多核苷酸。如SEQ IDNO：114、116、118和120中所定义的HPr蛋白的序列与SEQ ID NO：112具有96.5％至98.8％同一性。
在一个实施例中，ptsH基因突变不是使所述ptsH基因敲除(即，完全破坏)的突变。
在一个实施例中，将突变引入ptsH基因的编码序列中。
在一个实施例中，突变是产生截短的HPr蛋白的ptsH基因的编码序列中的突变。无论截短的位置如何，引入ptsH基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代，或引起开放阅读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入。在一个实施例中，引入ptsH基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代。在一个实施例中，引入ptsH基因中的突变是引起开放阅读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入
在一个实施例中，突变是使氨基酸被另一个氨基酸取代的ptsH基因的编码序列中的突变。
在本申请的此部分中，本领域技术人员获得了关于如何获得并鉴定ptsH基因的突变的进一步指导。基于上文所定义的比率[通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性]以及本文中所定义的参考菌株，本领域技术人员将知道如何鉴定根据本发明的突变的ptsH基因和获得本发明的嗜热链球菌。
因此，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供嗜热链球菌菌株，其ptsH基因如SEQ ID NO：111中所定义，诸如DGCC7710菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对ptsH基因进行诱变，以获得序列与a)中菌株的ptsH基因的序列不同的ptsH基因；
c)插入b)中获得的ptsH基因来代替DGCC7710菌株的ptsH基因，以获得DGCC7710衍生物；以及
d)确定所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其中如本文中所定义至少4.10-6的比率意味着插入的ptsH基因是根据本发明的突变的ptsH基因。在一个具体的实施例中，在所述DGCC7710衍生物的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6或至少8.10-6时，认为突变的ptsH基因是根据本发明的。在一个实施例中，所述比率小于8.10-3。
鉴定后，可以引入本文所鉴定的突变的ptsH基因来代替乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的ptsH基因，以获得本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
VI.根据实施例I至V中任一项所述的本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌 菌株，其还在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中携带突变。
除上文披露的原样或组合的任何突变以外，本发明人已经显示，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中基因的其他突变显著增加了乳发酵期间葡萄糖释放的水平。本发明人已经显示，将编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的突变基因，特别是突变的manL基因、突变的manM基因或突变的manN基因引入如在以上I至V中所定义的嗜热链球菌中，引起了关于葡萄糖释放的协同作用，即，释放的葡萄糖浓度远大于使用以上I至V中所定义的嗜热链球菌释放的葡萄糖浓度加上使用仅在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的所述基因中突变的嗜热链球菌释放的葡萄糖浓度。
因此，本发明涉及一种选自由以下组成的组的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：如I所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株、如II所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株、如III所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株、如IV所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和如V所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株还在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中突变。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是manL基因、manM基因、manN基因或manO基因。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是manL基因、manM基因、manN基因或manO基因。在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是manL基因、manM基因或manN基因。
“在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中突变”是指乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在选自由manL基因、manM基因、manN基因和manO基因组成的组的一个、两个或三个基因中携带突变。在一个实施例中，乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组的一个、两个或三个基因中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manM中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变并且在manM中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变并且在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manM中携带突变并且在manN中携带突变。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在manL中携带突变，在manM中携带突变并且在manN中携带突变。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是所述基因是manL基因、manM基因和/或manN基因。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株如本文中所定义在ccpA基因中携带突变并且在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是所述基因是manL基因、manM基因和/或manN基因。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在编码葡萄糖激酶的glcK基因中携带突变，所述菌株中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，如本文中所定义在其ccpA基因中携带突变并且在一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是一个所述基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是所述基因是manL基因、manM基因和/或manN基因。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株如本文中所定义在lacZ基因中携带突变并且在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是所述基因是manL基因、manM基因和/或manN基因。
在一个实施例中，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株如本文中所定义在ptsH基因中携带突变并且在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，一个或多个编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是所述基因是manL基因、manM基因和/或manN基因。
关于glcK基因、ccpA基因、glcK基因与ccpA基因的组合、lacZ基因或ptsH基因中的一个或多个突变，以上在I至V中披露的任何实施例均类似地适用于本发明的还在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中携带突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，只要获得的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株使如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6
关于编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中的突变，任何突变均是适当的，特别是减少或消除葡萄糖从培养基输入细菌中的任何突变。可以通过如下方法获得并鉴定此种突变：将编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因引入以上在I至V中披露的本发明的任何菌株中，并通过测试B确定用所述菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度，其中与在I至V中披露的本发明的菌株相比葡萄糖浓度的增加意味着编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因根据本发明突变。
在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是引起基因敲除(即，完全破坏)的突变。
在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是该基因的启动子的突变，特别是该基因的启动子的降低或抑制基因转录的突变。
在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是引入所述基因编码序列中的突变，特别是引起由突变的基因编码的蛋白质的葡萄糖输入活性降低或消除，特别是引起IIABMan蛋白、IICMan蛋白或IIDMan蛋白的葡萄糖输入活性降低或消除的突变。
在一个实施例中，编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因或manN基因的突变，是如下突变，其在所述基因的编码序列中，产生截短的蛋白质，特别是分别产生截短的IIABMan蛋白、截短的IICMan蛋白或截短的IIDMan蛋白，特别是产生具有降低或消除的葡萄糖输入活性的截短的蛋白(诸如截短的IIABMan蛋白、截短的IICMan蛋白或截短的IIDMan蛋白)。无论截短的位置如何，引入基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代，或引起开放阅读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入。在一个实施例中，引入基因中的突变是产生终止密码子的核苷酸取代。在一个实施例中，引入基因中的突变是引起开放阅读框移框并且产生提前终止密码子的缺失、插入或缺失/插入。
尽管两个嗜热链球菌菌株可以因为其各自的manL、manM或ManN基因的序列而不同，但此并不一定是指在本发明的意义上这些基因之一被突变。实际上，以下在本发明中不认为是manL、manM或ManN基因的突变：
-不会引起蛋白质层面的任何改变(沉默变化)并且不会影响manL、manM或ManNRNA的翻译的核苷酸层面的变化；
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变不会使甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的葡萄糖输入活性降低或消除；以及
-确实引起蛋白质层面的改变的核苷酸层面的变化，但是其中此改变在引入以上在I至V中披露的本发明的任何菌株中时，不能使葡萄糖释放水平增加。
在本发明的意义上不被认为是突变的manL、manM和ManN基因(分别编码IIABMan蛋白、IICMan蛋白和IIDMan蛋白)的非限制性实例是：
-编码如SEQ ID NO：122中所定义的IIABMan蛋白(IIABMan类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：121中所定义的多核苷酸；此IIABMan类型是DGCC7710菌株之一；
-分别编码如SEQ ID NO：124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152和154中所定义的IIABMan蛋白(IIABMan类型ST2至ST17)的manL多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：121，123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147、149、151和153中所定义的多核苷酸。如SEQ ID NO：124、126、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146、148、150、152和154中所定义的IIABMan蛋白的序列与SEQ ID NO：122具有98.4％至99.6％同一性。
-编码如SEQ ID NO：174中所定义的IICMan蛋白(IICMan类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：173中所定义的多核苷酸；此IICMan类型是DGCC7710菌株之一；
-分别编码如SEQ ID NO：176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198和200中所定义的IICMan蛋白(IICMan类型ST2至ST14)的manM多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197和199中所定义的多核苷酸。如SEQID NO：176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198和200中所定义的IICMan蛋白的序列与SEQ ID NO：174具有98.5％至99.6％同一性。
-编码如SEQ ID NO：211中所定义的IIDMan蛋白(IIDMan类型ST1)的多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：210中所定义的多核苷酸；此IIDMan类型是DGCC7710之一；
-分别编码如SEQ ID NO：213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247和249中所定义的IIDMan蛋白(IIDMan类型ST2至ST20)的manN多核苷酸，特别是如SEQ ID NO：212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246和248中所定义的多核苷酸。如SEQ ID NO：213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、233、235、237、239、241、243、245、247和249中所定义的IIDMan蛋白的序列与SEO ID NO：210具有97.3％至99.6％同一性。
本发明人已经鉴定manL基因中的至少一个突变，在将所述突变插入原始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株[在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中突变，并且如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，诸如以上在I至V中披露的本发明的任何菌株]的manL基因中时，在通过测试B测定时与原始菌株相比能够增加葡萄糖浓度。
因此，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中携带突变，并且在manL基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，manL基因中的突变使IIABMan蛋白在第305位被截短。在一个实施例中，manL基因中的突变是在第916位以核苷酸T取代核苷酸G(使得在第306位产生终止密码子)。在第305位被截短的嗜热链球菌IIABMan蛋白在本文中称为IIABMan 305。
在一个实施例中，在第305位被截短的所述IIABMan蛋白的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：156中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：156具有至少90％相似性或同一性的IIABMan变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。
为了定义与SEQ ID NO：156具有至少90％相似性的IIABMan变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性或同一性。在一个实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156具有至少95％相似性或同一性。在一个实施例中，IIABMan变体序列与SEQ IDNO：156具有至少97％相似性或同一性。在一个实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156具有至少98％相似性或同一性。
在一个具体的实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156的差异在于1至30个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156的差异在于1至20个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156的差异在于1至15个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIABMan变体序列与SEQ ID NO：156的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IIABMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：156至172组成的组。
在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manL基因编码IIABMan蛋白，所述IIABMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：156和与如本文中所定义的SEQ ID NO：156具有至少90％相似性或同一性的任何IIABMan变体序列(特别是SEQ ID NO：157至172)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manL基因如SEQ ID NO：155中所定义。
诸位发明人已经鉴定manM基因中的至少一个突变，在将所述突变插入原始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株[在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中突变，并且如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，诸如以上在I至V中披露的本发明的任何菌株]的manL基因中时，在通过测试B测定时与原始菌株相比能够增加葡萄糖浓度。
因此，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中携带突变，并且在manM基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，manM基因中的突变使IICMan蛋白在第208位被截短。在一个实施例中，manM基因中的突变是在第625位以核苷酸T取代核苷酸G(使得在第209位产生终止密码子)。在第208位被截短的嗜热链球菌IICMan蛋白在本文中称为IICMan 208。
在一个实施例中，在第208位被截短的所述IICMan蛋白的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：202中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：202具有至少90％相似性或同一性的IICMan变体序列，特别是长度为208个氨基酸的序列。
为了定义与SEQ ID NO：202具有至少90％相似性的IICMan变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性或同一性。在一个实施例中，IICMan变体序列与SEQID NO：202具有至少95％相似性或同一性。在一个实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202具有至少97％相似性或同一性。在一个实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202具有至少98％相似性或同一性。
在一个具体的实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202的差异在于1至30个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202的差异在于1至20个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202的差异在于1至15个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IICMan变体序列与SEQ ID NO：202的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IICMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：202至209组成的组。
在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manM基因编码IICMan蛋白，所述IICMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：202和与如本文中所定义的SEQ ID NO：202具有至少90％相似性或同一性的任何IICMan变体序列(特别是SEQ ID NO：203至209)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manM基因如SEQ ID NO：201中所定义。
诸位发明人已经鉴定manN基因中的至少一个突变，在将所述突变插入原始乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manN基因中[在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中突变，并且如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，所述菌株诸如上文在I至V下披露的本发明的任何菌株]时，在通过测试B测定时与原始菌株相比能够增加葡萄糖浓度。
因此，本发明涉及一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在glcK基因、ccpA基因、glcK基因和ccpA基因两者、lacZ基因或ptsH基因中携带突变，并且在manN基因中携带突变，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。在一个实施例中，manN基因中的突变使IIDMan蛋白在第28位被截短。在一个实施例中，manN基因中的突变是在第37-41位具有5个核苷酸A的段中插入核苷酸A(产生具有6个核苷酸A的片段，引起IIDMan蛋白在第28位的移框和截短)。在第28位被截短的此种嗜热链球菌IIDMan蛋白在本文中称为IIDMan 28。
在一个实施例中，在第28位被截短的所述IIDMan蛋白的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：251中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：251具有至少90％相似性或同一性的IIDMan变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。
为了定义与SEQ ID NO：251具有至少90％相似性的IIDMan变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中类似或相同氨基酸残基的数量]。在一个实施例中，IIDMan变体序列与SEQ ID NO：251具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性或同一性。在一个实施例中，IIDMan变体序列与SEQID NO：251具有至少95％相似性或同一性。在一个实施例中，IIDMan变体序列与SEQ ID NO：251具有至少96％相似性或同一性。在一个实施例中，IIDMan变体序列与SEQ ID NO：251具有至少97％相似性或同一性。
在一个具体的实施例中，IIDMan变体序列与SEQ ID NO：251的差异在于1至10个氨基酸取代。在一个具体的实施例中，IIDMan变体序列与SEQ ID NO：251的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的IIDMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：251至255组成的组。
在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌菌株携带的manN基因编码IIDMan蛋白，所述IIDMan蛋白的序列选自由SEQ ID NO：251和与如本文中所定义的SEQ ID NO：251具有至少90％相似性或同一性的任何IIDMan变体序列(特别是SEQ ID NO：252至255)组成的组。在一个实施例中，由本发明的嗜热链球菌菌株携带的manN基因选自由SEQ ID NO：250组成的组。
在用于发酵奶时，本发明的还在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株(本文VI中所定义)除用本文所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6来表征以外，还可以用其释放葡萄糖的能力表征。
因此，本发明的还在编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株(本文VI中所定义)的特征还在于如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少80mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少90mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少100mM。在一个具体的实施例中，如通过测试B所测定用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度选自由以下浓度组成的组：至少80mM、至少90mM和至少100mM。
可以使用任何方法来鉴定适合于本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因中，特别是manL基因、manM基因或manN基因中的突变。
例如，为了获得并鉴定manL基因、manM基因或manN基因中的合适突变，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供DSM32587菌株(其glcK基因突变)
b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的manL、manM或manN基因进行诱变，以获得序列与DSM32587的manL、manM或manN基因的序列不同的manL、manM或manN基因，从而获得man突变的DSM32587菌株；
c)确定b)中获得的man突变的DSM32587菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择呈现如本文中所定义的至少4.10-6的比率的man突变的DSM32587菌株；以及
d)通过测试B确定用在c)中选择的所述man突变的DSM32587菌株发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中
d1)至少80mM的葡萄糖浓度意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。在一个实施例中，当在步骤d)中测量的葡萄糖浓度为至少90mM或至少100mM时，认为突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的，或
d2)与DSM32587菌株相比，用c)中选择的man突变的DSM32587菌株获得的葡萄糖浓度的增加意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。
替代性地，本领域技术人员可以通过以下方法进行操作：
a)提供DGCC7710菌株，其中所述菌株的ccpA基因已用如SEQ ID NO：71中所定义的突变的ccpA基因(ccpAΔ1A114-120)置换，所述菌株在本文中称为DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；
b)例如通过随机或定向诱变对a)中的菌株的manL、manM或manN基因进行诱变，以获得序列与DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的manL、manM或manN基因的序列不同的manL、manM或manN基因，从而获得man突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；
c)确定b)中获得的man突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，并选择呈现如本文中所定义的至少4.10-6的比率的man突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株；以及
d)通过测试B确定用在c)中选择的所述man突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株发酵的奶中的葡萄糖浓度，其中
d1)至少80mM的葡萄糖浓度意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。在一个实施例中，当在步骤d)中测量的葡萄糖浓度为至少90mM或至少100mM时，认为突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的；或
d2)与DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株相比，用c)中选择的man突变的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株获得的葡萄糖浓度的增加意味着突变的manL、manM或manN基因是根据本发明的。
在上述方法中，与步骤d)中的参考[原始]菌株相比，表述“增加葡萄糖浓度”或“葡萄糖浓度的增加”是指在如下两种菌株均通过测试B测定时，测试菌株的葡萄糖浓度为参考[原始]菌株葡萄糖浓度的至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
在一个实施例中，与步骤d)中的DSM32587相比，表述“葡萄糖浓度的增加”是指在如下两种菌株均通过测试B测定时，测试菌株[在manL、manM或manN基因中突变]的葡萄糖浓度为DSM32587菌株葡萄糖浓度的至少150％、至少200％或至少300％。
在一个实施例中，与步骤d)中的DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物相比，表述“葡萄糖浓度的增加”是指在如下两种菌株均通过测试B测定时，测试菌株[在manL、manM或manN基因中突变]的葡萄糖浓度为DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物葡萄糖浓度的至少150％、至少200％、至少300％、至少400％或至少500％。
鉴定后，可以引入根据本发明的突变的manL、manM或manN基因以代替以上在I、II、III、IV或V中定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的manL、manM或manN。
本发明的一些菌株的实例
本发明涉及2017年8月15日保藏在DSMZ的嗜热链球菌DSM32587菌株，或其任何变体。携带如SEQ ID NO：21中所定义的glcK基因(编码如SEQ ID NO：22中所定义的葡萄糖激酶)的DSM32587菌株显示所述菌株中的葡萄糖激酶活性为907U/g总蛋白提取物，所述菌株中的Vmax为914U/g总蛋白提取物，同时在发酵奶中释放29mM葡萄糖(分别通过测试A、测试C和测试B测定)。
DSM32587菌株的变体在本文中定义为获自DSM32587菌株并且具有与DSM32587菌株相同的glcK基因(SEQ ID NO：21)的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，并且其中所述菌株中的葡萄糖激酶活性满足本文中所定义的“被显著降低但不为零”的特征，并且满足本文中所定义的葡萄糖激酶Vmax的“被显著降低但不为零”的特征。
在一个实施例中，DSM32587菌株的变体表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3。
在一个具体的实施例中，DSM32587菌株的变体表达如SEQ ID NO：22中所定义的GlcK蛋白，如通过测试A所测定，在所述变体中所述GlcK蛋白的葡萄糖激酶活性为800至1000U/g总蛋白提取物，并且如通过测试C所测定，所述变体中的葡萄糖激酶Vmax为800至1000U/g总蛋白提取物。
在一个具体的实施例中，本发明的DSM32587变体的特征还在于如通过测试B所测定用所述变体发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少20mM。在一个具体的实施例中，本发明的DSM32587变体的特征在于如通过测试B所测定用所述变体发酵的奶中葡萄糖的浓度至少为如通过测试B所测定用DSM32587菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度。
变体的非限制性实例为例如CRISPR变体，即一个或多个CRISPR基因座通过插入和/或缺失一个或多个间隔子(与DSM32587菌株的一个或多个CRISPR基因座相比)而修饰的DSM32587菌株的变体。
本发明还涉及以下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株：
-对应于DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于DSM32587菌株的菌株，其中manL基因的编码序列用SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305终止)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变manL基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于DSM32587菌株的菌株，其中manM基因的编码序列用SEQ ID NO：201中所示的序列(编码IICMan 208)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变manM基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于DSM32587菌株的菌株，其中manN基因的编码序列用SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变manN基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manL基因的编码序列用SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305终止)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manL基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manM基因的编码序列用SEQ ID NO：201中所示的序列(编码IICMan 208)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manM基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manN基因的编码序列用SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manN基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3；
-对应于DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3。
-对应于DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manL基因的编码序列用SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305终止)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manL基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3。
-对应于所述DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manM基因的编码序列用SEQ ID NO：201中所示的序列(编码IICMan 208)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manM基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3。
-对应于所述DSM28255菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列用SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且manN基因的编码序列用SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换，及其变体；变体在本文中定义为如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株带有相同的突变ccpA基因和相同的突变manN基因，并且表现出如下通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，其最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地其最大值小于8.10-3。
在一个具体的实施例中，如本文中所定义的菌株变体的基因组序列与获得所述变体的菌株的基因组序列具有至少90％同一性，特别是与获得所述变体的菌株的基因组序列具有至少90％、至少91％、至少95％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.92％、至少99.94％、至少99.96％、至少99.98％或至少99.99％同一性。同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的，并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株不携带编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶的glcK基因(即，glcK基因的第144个密码子不编码丝氨酸)，但选自由以下组成的组的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除外：
a)如III中所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；以及
b)如VI中所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株携带编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶的glcK基因，但选自由以下组成的组的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除外：
a)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ccpA基因如III中所定义突变，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
b)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manL基因如VI中所定义突变，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
c)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manM基因如VI中所定义突变，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；以及
d)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manN基因如VI中所定义突变，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株不携带编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶的glcK基因，但选自由以下组成的组的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株除外：
a)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其ccpA基因如SEQ ID NO：71中所定义，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
b)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manL基因编码在第305位被截短的IIABMan，诸如在SEQ ID NO：156中定义的IIABMan，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
c)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manM基因编码在第208位被截短的IICMan，诸如在SEQ ID NO：202中定义的IICMan，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
d)如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其manN基因编码在第28位被截短的IIDMan，诸如在SEQ ID NO：251中定义的IIDMan，并且其glcK基因编码在第144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶；
在一个实施例中，如以上在I中定义的本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株不携带编码在144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶的glcK基因。
在一个实施例中，本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株不携带编码在144位具有丝氨酸的葡萄糖激酶的glcK基因。
本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的组合物、方法和用途
本发明还涉及一种细菌组合物，其包含以下或由以下组成：至少一种，特别是一种本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个具体实施例中，所述细菌组合物是纯培养物，即包含单个细菌菌株或由其组成。在另一个实施例中，细菌组合物是混合的培养物，即包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种其他细菌菌株。“至少”(关于菌株或细菌)是指1种或多种，并且特别是1种、2种、3种、4种或5种菌株。
因此，在一个实施例中，本发明的细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种选自由以下组成的组的物种的乳酸细菌：乳球菌属(Lactococcus)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、包括嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的乳杆菌属(Lactobacillus)物种、肠球菌属(Enterococcus)物种、片球菌属(Pediococcus)物种、明串珠菌属(Leuconostoc)物种、双歧杆菌属(Bifidobacterium)物种和酒球菌属(Oenococcus)物种或其任何组合。乳球菌属物种包括嗜酸乳杆菌和乳酸乳球菌，包括乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactissubsp.lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和乳酸乳球菌乳酸亚种二乙酰乳酸生物突变株(Lactococcus lactis subsp.lactis biovardiacetylactis)。双歧杆菌属物种包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，特别是动物双歧杆菌乳乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp lactis)。其他乳酸细菌物种包括明串珠菌属物种、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种和瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
在一个实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株和至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株和/或至少一种乳杆菌属物种的菌株和/或其任何组合。在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、一种或几种德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株和/或一种或数种瑞士乳杆菌物种菌株和/或其任何组合，以及任选地至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株。在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、至少一种与本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株不同的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株。在另一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种物种菌株。
在一个具体的实施例中，细菌组合物包含以下或由以下组成：本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株、乳酸乳球菌乳酸亚种和/或乳酸乳球菌乳脂亚种。
在本文中所定义的纯培养物或混合培养物形式的任何细菌组合物的一个具体的实施例中，细菌组合物还包含至少一种益生菌菌株，诸如动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)或干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。
在一个具体的实施例中，如上文所定义的纯培养物或混合培养物形式的细菌组合物为冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，为颗粒或冷冻颗粒的形式，或为粉末或干粉形式。在一个具体实施例中，本发明的细菌组合物是以冷冻形式或处于球粒或冷冻球粒的形式，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。在另一个实施例中，如本文所定义的细菌组合物是在粉末形式下，如干燥或冷冻干燥的粉末，具体是包含在一个或多个盒或小袋中。
在一个具体的实施例中，如上文所定义的纯培养物或混合培养物形式并且无论何种形式(冷冻、干燥、冷冻干燥、液体或固体形式，颗粒或冷冻颗粒的形式，或粉末或干粉形式)的本发明细菌组合物包含本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其浓度包含在105至1012cfu(菌落形成单位)/克细菌组合物范围内。在一个具体的实施例中，本发明的细菌组合物内一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的浓度为107至1012cfu/克细菌组合物，并且特别是至少107、至少108、至少109、至少1010或至少1011CFU/g细菌组合物。在一个具体的实施例中，当为冷冻或干燥浓缩物的形式时，细菌组合物内纯培养物或混合培养物形式的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的浓度为108至1012cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物，并且更优选至少108、至少109、至少1010、至少1011或至少1012cfu/g冷冻浓缩物或干燥浓缩物。
本发明还涉及一种用于制造发酵产品的方法，所述方法包括：a)用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株接种底物，和b)发酵所述接种的底物，以获得发酵产品。在一个具体的实施例中，将本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株以如本文中所定义的细菌组合物诸如纯培养物或混合培养物的形式接种。在一个实施例中，本发明的一种或多种嗜热链球菌菌株或细菌组合物所添加的底物是奶底物。‘奶底物’是指源自动物和/或植物的奶。在一个具体的实施例中，奶底物源自动物，诸如母牛、山羊、绵羊、水牛、斑马、马、驴或骆驼等。奶可以为天然状态、复原乳、脱脂乳或补充有细菌生长或后续发酵奶处理所必需的化合物的奶。因此，在一个具体的实施例中，本发明还提供一种用于制造发酵乳产品的方法，所述方法包括：a)用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或细菌组合物接种奶底物，和b)发酵所述接种的奶底物，以获得发酵乳产品。
本发明还涉及本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或本发明的组合物制造发酵乳产品的用途。
本发明还涉及一种发酵乳产品，其使用本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或本发明的细菌组合物获得，特别是通过或可通过本发明的方法获得。因此，本发明涉及一种发酵乳产品，其包含本发明的一种或多种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在一个具体实施例中，本发明的发酵乳食物产品是新鲜发酵奶。在一个具体的实施例中，本发明的发酵乳产品，特别是如本文中所定义的新鲜发酵奶含有如本文中所定义的于2017年8月15日保藏在DSMZ的DSM32587菌株或其任何变体。
蛋白质、核酸、载体、构建体及其用途
本发明还涉及一种嗜热链球菌葡萄糖激酶，在DGCC7710衍生物中，其葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。为了测试本发明的葡萄糖激酶满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的葡萄糖激酶活性特征，用编码待测定的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的glcK基因置换DGCC7710菌株的glcK基因，获得DGCC7710的衍生物，并通过测试A测定所述DGCC7710衍生物(参见实例4)。
当出现如下情形时，嗜热链球菌葡萄糖激酶满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的葡萄糖激酶活性特征
a)如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为200至1500U/g总蛋白提取物，如通过测试A所测定，特别是300至1200U/g或400至1000U/g总蛋白提取物，或
b)当均通过测试A测定时，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％，特别是DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％或15％至40％，其中所述DG7710衍生物中的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性通过测试A测定。
在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为200至1500U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为300至1200U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为400至1000U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。值得注意的是，如测试A所提及，本文披露的葡萄糖激酶活性值是三个实验(一式三份)的平均值。
在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％的活性。“DGCC77l0菌株的葡萄糖激酶活性”是指DGCC7710菌株中通过测试A测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQ ID NO：2)的活性[即，使用DGCC7710菌株进行测试A]。百分比值是根据DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性计算的，两个葡萄糖激酶活性均通过测试A测定。
在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株葡萄糖激酶活性的5％至60％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株葡萄糖激酶活性的10％至50％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为菌株DGCC7710的葡萄糖激酶活性的15％至40％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。在一个具体的实施例中，并且无论百分比范围如何，均通过本文所述的测试A在DGCC7710衍生物中测定本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性。值得注意的是，本文披露的百分比值是根据葡萄糖激酶活性值计算的，所述葡萄糖激酶活性值是通过测试A测定的三个独立实验(一式三份)的平均值。
特征“DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”还可以用在DGCC7710衍生物中，葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)或葡萄糖激酶对其底物即葡萄糖和ATP中的一种或两种的亲和力(称为Km)来表征。在一个实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的特征“DGCC7710衍生物中被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性”还可以用DGCC7710衍生物中此葡萄糖激酶的最大正向速度来表征。
因此，与本文中定义的特征“DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”的实施例组合，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零。为了测试本发明的葡萄糖激酶满足在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的Vmax特征，用编码待测定的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的glcK基因的开放阅读框置换DGCC7710菌株glcK基因的开放阅读框，获得DGCC7710的衍生物，并通过测试C测定所述DGCC7710衍生物(参见实例4)。术语“DGCC7710衍生物”如上文所定义。
本发明葡萄糖激酶的Vmax的“在DGCC7710衍生物中被显著降低但不为零”特征可以由这些参数中的一个或两个定义：
-如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物；
-当均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。
在一个具体的实施例中，本发明涉及本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶，DGCC7710衍生物中所述葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零(如本文中所定义)，并且其中DGCC7710衍生物中所述葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零，并由以下这些参数中的一个或两个定义：
-如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物；
-当均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％。
在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为200至1500U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为300至1200U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为400至1000U/g总蛋白提取物。在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。
在一个具体的实施例中，在均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％。“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax”是指DGCC7710菌株中通过测试C测定的DGCC7710菌株葡萄糖激酶(即，具有SEQ ID NO：2)的Vmax[即，使用DGCC7710菌株进行测试C]。百分比值是根据DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax和DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax计算的，两个Vmax均通过测试C测定。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。在一个具体的实施例中，DGCC7710衍生物中本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。
在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第275位(基于如SEQ ID NO：25中所定义的序列编号)具有不是谷氨酸的氨基酸(即是除谷氨酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第275位(基于如SEQ ID NO：25中所定义的序列编号)具有不是酸性氨基酸的氨基酸(即是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第275位(基于如SEQ ID NO：25中所定义的序列编号)具有选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第275位(基于如SEQ ID NO：25中所定义的序列编号)具有是赖氨酸的氨基酸。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的长度为322个氨基酸。在一个实施例中，当嗜热链球菌葡萄糖激酶在其第275位具有不是谷氨酸的氨基酸(特别不是酸性氨基酸，特别是赖氨酸)时，嗜热链球菌葡萄糖激酶在其第278位具有精氨酸和/或在其第279位具有丝氨酸。
在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第144位(基于如SEQ ID NO：46中所定义的序列编号)具有不是甘氨酸的氨基酸(即是除甘氨酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第144位(基于如SEQ ID NO：46中所定义的序列编号)具有不是脂族氨基酸的氨基酸(即是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸)。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的Vmax的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第144位(基于如SEQ ID NO：46中所定义的序列编号)具有选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组的氨基酸。在一个实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列在其第144位(基于如SEQ ID NO：46中所定义的序列编号)具有是丝氨酸的氨基酸。在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的长度为322个氨基酸。
在一个具体的实施例中，在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性并且任选地在DGCC7710衍生物中具有显著降低但不为零的本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：25中所定义的序列，其中第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸；以及
b)与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。在一个实施例中，所述GlcK变体在其第278位具有精氨酸和/或在其第279位具有丝氨酸。
c)如SEQ ID NO：46中所定义的序列，其中第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸；以及
d)与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列的长度是322个氨基酸。
为了定义与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO：25中所定义的第275位不被考虑用于相似性或同一性的计算。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％相似性或同一性，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：25具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。
在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸(第275位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：25的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO：25的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO：25的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。
在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列选自由SEQ IDNO：25、26、27、28、29、30、31、32、33和34组成的组，其中所述变体第275位的氨基酸是除谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是除酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是赖氨酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是谷氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第275位的氨基酸)不是酸性氨基酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第275位的氨基酸)选自由赖氨酸及其任何保守氨基酸组成的组。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：25或本文所定义的与SEQ IDNO：25具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：26、27、28、29、30、31、32、33或34)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25第275位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第275位的氨基酸)是赖氨酸；因此，在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列选自由SEQ ID NO：22、35、36、37、38、39、40、41、42和43组成的组。
为了定义与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体，在本文中在最佳比对后在2个序列的整个长度上计算相似性或同一性[即，序列的一个或多个比对部分中相似或相同氨基酸残基的数量]；如SEQ ID NO：46中所定义的第144位不被考虑用于相似性或同一性的计算。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46具有至少91、92、93、94、95、96、97、98或99％的相似性或同一性，其中葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：46具有至少95％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46具有至少97％相似性或同一性，其中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。
在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至30个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸(第144位不被考虑用于一个或多个取代的数量的计算)。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至20个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK变体序列与SEQ IDNO：46的差异在于1至15个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO：46的差异在于1至10个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，GlcK序列与SEQ ID NO：46的差异在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个氨基酸取代，其中所述GlcK变体第1445位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。
在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列选自由SEQ IDNO：46、47、48、49、50、51、52、53、54和55组成的组，其中所述变体第144位的氨基酸是除甘氨酸以外的任何氨基酸，特别是除脂族氨基酸以外的任何氨基酸，特别是丝氨酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是甘氨酸。
在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第144位的氨基酸)不是脂族氨基酸。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第144位的氨基酸)选自由丝氨酸及其任何保守氨基酸组成的组。在一个具体的实施例中，作为SEQ ID NO：46或本文所定义的与SEQ IDNO：46具有至少90％相似性或同一性的任何GlcK变体序列(特别是SEQ ID NO：47、48、49、50、51、52、53、54或55)，本发明的葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46第144位的氨基酸(或本发明的葡萄糖激酶第144位的氨基酸)是丝氨酸；因此，在一个具体的实施例中，本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列选自由SEQ ID NO：45、56、57、58、59、60、61、62、63和64组成的组。
在定义本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶的序列时，根据本申请的教导，表达此葡萄糖激酶的DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性如本文中所定义被显著降低但不为零，并且任选地DGCC7710衍生物中此葡萄糖激酶的Vmax如本文中所定义被显著降低但不为零。
本发明还涉及编码本发明的葡萄糖激酶，特别是本发明的322个氨基酸的葡萄糖激酶的多核苷酸。在一个具体的实施例中，所述多核苷酸来自嗜热链球菌菌株。基于遗传密码，本领域技术人员知道多核苷酸是否编码本发明的嗜热链球菌葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，当编码的葡萄糖激酶的长度为322个氨基酸时，本发明的多核苷酸的长度为969个核苷酸。
本发明的多核苷酸的非限制性实例披露于SEQ ID NO：21中。本发明的多核苷酸的另一个非限制性实例披露于SEQ ID NO：44中。本发明的多核苷酸的其他非限制性实例是如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第144个密码子或第275个密码子分别编码除甘氨酸或谷氨酸以外的任何氨基酸，特别是分别编码除脂族或酸性氨基酸以外的任何氨基酸，特别是分别编码丝氨酸或赖氨酸。特别地，本发明的多核苷酸的非限制性实例是如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第275个密码子是AAA或AAG。特别地，本发明的多核苷酸的非限制性实例是如SEQ ID No：1、3、5、7、9、11、13、15、17和19中所定义的序列，但是其中第144个密码子是AGT、AGC、TCT、TCC、TCA或TCG。
本发明还涉及本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)用于设计细菌细胞，特别是革兰氏阳性细菌细胞，特别是嗜热链球菌细胞的用途。在一个具体的实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换嗜热链球菌菌株的glcK基因，使得嗜热链球菌菌株表达本发明的葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，由所述获得的嗜热链球菌表达的唯一葡萄糖激酶是本发明的葡萄糖激酶。在一个具体的实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换乳糖阳性嗜热链球菌菌株的glcK基因。在一个实施例中，使用本发明的多核苷酸(或构建体、质粒或载体)置换乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的glcK基因。
本发明还涉及如上文所定义或鉴定的突变的ccpA基因(或突变的ccpA多核苷酸)。
在一个实施例中，本发明涉及一种(突变的)嗜热链球菌ccpA多核苷酸，当其代替DGCC7710菌株的ccpA基因插入时[产生DGCC7710衍生物]，产生表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6的DGCC7710衍生物。在本文中，DGCC7710衍生物是如下菌株DGCC7710，其中原始ccpA基因已用待测定的突变的ccpA基因置换。
在一个实施例中，本发明涉及一种(突变的)嗜热链球菌ccpA，当其代替DSM32587菌株的ccpA基因插入时[产生DSM32587衍生物]，产生如下DSM32587衍生物：
-其表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-其释放如通过测试B测定的至少50mM的葡萄糖浓度，或在均通过测试B测定时，释放与所述DSM32587菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度。
在本文中，DSM32587衍生物是如下菌株DSM32587，其中原始ccpA基因已用待测定的突变的ccpA基因置换。
在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸不是ccpA基因的敲除等位基因(即，破坏的等位基因)。
在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸是在编码序列中突变的ccpA基因的等位基因。在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸的编码序列与如SEQ ID NO：65、66、67、68、69或70中所定义的ccpA基因相差至少一个突变，特别是一个突变。
在一个实施例中，ccpA基因携带选自由以下组成的组的突变：位于ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于ccpA基因的编码序列的前四分之一处(即，在第1个核苷酸与第250个核苷酸之间)引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变。在一个实施例中，引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第50个核苷酸与第200个核苷酸之间。在一个实施例中，引起ccpA基因的开放阅读框移框的突变位于ccpA基因编码序列的第100个核苷酸与第150个核苷酸之间。无论引起移框的突变位置是哪个，所述突变均选自由缺失、插入或缺失/插入(均不是3的倍数)组成的组。在一个实施例中，ccpA基因的突变是在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失。
在一个实施例中，突变的ccpA多核苷酸的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ IDNO：71中所定义的序列；和b)与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性的ccpA变体序列(特别是SEQ ID NO：72至76)。具有至少90％同一性的ccpA变体的定义如以上II中详述。
本发明还涉及如本文中所定义的glcK多核苷酸[编码如本文中所定义的突变的嗜热链球菌葡萄糖激酶]的用途和/或如本文中所定义的ccpA多核苷酸设计嗜热链球菌菌株的用途。如本文中所定义的glcK多核苷酸和ccpA多核苷酸被认为是根据本发明突变的(即，如本文中所定义或可通过本文中所述的方法鉴定的突变等位基因)。在一个实施例中，使用如本文中所定义的glcK多核苷酸。在一个实施例中，使用如本文中所定义的ccpA多核苷酸。在一个实施例中，使用如本文中所定义的glcK多核苷酸和如本文中所定义的ccpA多核苷酸两者。
在一个实施例中，所述用途在于用如本文中所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因，以设计一个或多个原始基因用如本文中所定义的一个或多个(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。本发明还涉及一种设计嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：1)用如本文中所定义的突变的glcK多核苷酸和/或突变的ccpA多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的glcK基因和/或ccpA基因，和2)获得一个或多个原始基因用如本文中所定义的一个或多个(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。在所述用途或所述方法的一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。在所述用途或所述方法的一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其表现出小于4.10-6或小于3.10-6的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率。在所述用途或所述方法的一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其携带如本文中所定义的突变的glcK基因或如本文中所定义的突变的ccpA基因，并且表现出大于4.10-6的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率。
本发明还针对突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是突变的manL基因、突变的manM基因、突变的manN基因或突变的manO设计菌株的用途。在一个实施例中，本发明涉及突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是突变的manL基因、突变的manM基因或突变的manN基因设计菌株的用途。如本文中所定义的manL基因、manM基因或manN基因被认为是根据本发明突变的(即，如本文中所定义或可通过本文中所述的方法鉴定的突变等位基因)。在一个实施例中，所述用途在于分别用如本文中所定义的突变的manL、manM或manN多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的manL基因、manM基因或manN基因，以设计原始基因用如本文中所定义的(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。本发明还涉及一种设计嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：1)分别用如本文中所定义的突变的manL、manM或manN多核苷酸取代[或置换]原始嗜热链球菌菌株的manL基因、manM基因或manN基因，和2)获得原始基因用如本文中所定义的(突变)的基因置换的嗜热链球菌菌株。在所述用途或所述方法的一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。“分别”是指用突变的manL置换原始manL，用突变的manM置换原始manM和/或用突变的manN置换原始manN。
在所述用途或所述方法的一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是如下乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其表现出如本文中所定义至少4.10-6的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率。在一个实施例中，原始嗜热链球菌菌株是如以上要点I至V中任一个中所定义的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。本发明人已经显示，将突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是突变的manL基因、突变的manM基因或突变的manN基因引入嗜热链球菌中，如本文中所定义其[通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的]比率为至少4.10-6，引起关于葡萄糖释放的协同作用。
在一个实施例中，本发明涉及分别编码IIABMan蛋白、IICMan蛋白或IIDMan蛋白的突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的用途，其中所述蛋白的葡萄糖输入活性被降低或消除，所述用途用于置换乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的相应manL基因、manM基因或manN基因，所述菌株表现出如本文中所定义的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的特征在于，当代替DSM32587菌株的manL基因、manM基因或manN基因单独插入时[得到DSM32587衍生物]，DSM32587衍生物：
-表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-在均通过测试B测定时，释放与DSM32587菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度。
在本文中，DSM32587衍生物是如下菌株DSM32587，其中原始manL基因、manM基因或manN基因已用待测定的突变的manL基因、manM基因或manN基因置换。
在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的特征在于，当代替DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株(即，如下DGCC7710菌株，其中其ccpA基因先前已经用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换)的manL基因、manM基因或manN基因单独插入时[得到DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物]，DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物：
-表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-在均通过测试B测定时，释放与所述DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度。
在本上下文中，DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株是ccpA基因先前用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换的DGCC7710菌株。在本文中，DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物是如下DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物，其中原始manL基因、manM基因或manN基因已经用待测定的突变的manL基因、manM基因或manN基因置换，即，如下DGCC7710菌株，其中原始ccpA基因已经用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换，并且原始manL基因、manM基因或manN基因已经用待测定的突变的manL基因、manM基因或manN基因置换。
“单独插入”是指为了表征突变的man基因，将DSM32587菌株或DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株的仅一个man基因用待表征的各自的突变man基因置换(或取代)。
在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是突变的manL基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL编码嗜热链球菌IIABMan蛋白，所述蛋白的葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第305位被截短的嗜热链球菌IIABMan蛋白(IIABMan 305)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL编码截短的嗜热链球菌IIABMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：156中所定义的序列，和b)与SEQ IDNO：156具有至少90％相似性或同一性的IIAB变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manL基因编码IIABMan蛋白，所述蛋白的序列选自由SEQ ID NO：156至172组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因如SEQ ID NO：155中所定义。
在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是突变的manM基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM编码嗜热链球菌IICMan蛋白，所述蛋白的葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第208位被截短的嗜热链球菌IICMan蛋白(IICMan 208)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM编码截短的嗜热链球菌IICMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：202中所定义的序列，和b)与SEQ IDNO：202具有至少90％相似性或同一性的IICMan变体序列，特别是长度为208个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manM基因编码IICMan蛋白，所述蛋白的序列选自由SEQ ID NO：202至209组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manM基因如SEQ ID NO：201中所定义。
在一个实施例中，突变的编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因是突变的manN基因。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN编码嗜热链球菌IIDMan蛋白，所述蛋白的葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是在第28位被截短的嗜热链球菌IIDMan蛋白(IIDMan 28)。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN编码截短的嗜热链球菌IIDMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：251中所定义的序列；和b)与SEQ IDNO：251具有至少90％相似性或同一性的IIDMan变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的manN基因编码IIDMan蛋白，所述蛋白的序列选自由SEQ ID NO：251至255组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因如SEQ ID NO：250中所定义。
表述“具有至少90％相似性或同一性的IIABMan变体、IICMan变体和IIDMan变体”如以上部分VI中所定义。
在一个实施例中，提供分离形式的如本文中所定义的多核苷酸。“分离”的多核苷酸基本上或本质上不含如在所述基因天然存在环境中发现的通常与其相伴或相互作用的组分。因此，分离的多核苷酸基本上不含其他细胞物质，或当通过重组技术产生时基本上不含培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品。
本发明还涉及包含如本文中所定义的多核苷酸的构建体。在一个实施例中，本发明涵盖一种构建体，其包含可操作地连接至调控序列的本发明的多核苷酸。术语“可操作地连接”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。调控序列“可操作地连接”至编码序列是以使得该编码序列的表达能在与该控制序列相容的条件下实现的方式连接。术语“调控序列”包括启动子和/或增强子以及其他表达调控信号。术语“启动子”是以本领域的标准意义使用，例如RNA聚合酶结合位点。在一个实施例中，构建体独立地或以与“调控序列”实施例组合的方式含有或表达另一种基因，诸如允许选择所述构建体的标记物。存在可以使用的各种标记物，例如提供抗生素抗性，例如对细菌抗生素(诸如红霉素(Erythromycin)、氨苄青霉素(Ampicillin)、链霉素(Streptomycin)和四环素(Tetracycline))的抗性的那些标记物。
因此，在另一方面，提供了一种包含如本文中所定义的多核苷酸或构建体的载体。如本文所用，术语“载体”是指如下任何核酸分子，可以将另一种核酸(例如，本发明的多核苷酸)插入所述核酸分子中，并且可以将其引入细菌菌株诸如嗜热链球菌菌株中并在所述菌株中复制。因此，所述术语是指能够用于将遗传物质引入细菌菌株，特别是嗜热链球菌菌株中的任何核酸构建体(和需要时任何相关的递送系统)。适当载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。在一个实施例中，载体是质粒。如本文所用，术语“质粒”是指可以用作将DNA引入细菌菌株，特别是嗜热链球菌菌株中的载体的环状双链(ds)DNA构建体。可以将构建体或载体引入本文所述的细菌菌株，诸如DGCC7710菌株中。
可以使用任何可用方法将本文披露的本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中。
“引入”(和“引入的”)旨在指以某种方式向嗜热链球菌菌株呈递如本文中所定义的本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒，以使得一种或多种组分能进入嗜热链球菌菌株的内部。所述方法和组合物不依赖于将序列引入嗜热链球菌菌株中的具体方法，只要本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒能够进入嗜热链球菌菌株的内部。引入包括将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒掺入嗜热链球菌菌株中，其中可以将本发明的多核苷酸或构建体掺入嗜热链球菌菌株的基因组中，并且包括瞬时(直接)提供嗜热链球菌菌株的多核苷酸或构建体。
将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中可以通过几种方法进行，包括转化、缀合、转导或原生质体融合。用于通过转化向嗜热链球菌菌株中引入本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒的方法包括但不限于显微注射、电穿孔、稳定的转化方法、短暂转化方法[诸如使用化学(例如，二价阳离子诸如CaCl2)或机械(电穿孔)手段诱导感受态]、弹道粒子加速(粒子轰击)、直接基因转移、病毒介导的引入、细胞穿透肽或介孔二氧化硅纳米粒子(MSN)介导的直接蛋白质递送。可以通过缀合将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中，所述方法是需要细胞与细胞物理接触的天然DNA交换的特定方法。可以通过转导将本发明的多核苷酸、构建体、载体或质粒引入嗜热链球菌菌株中，所述方法是通过病毒(例如，噬菌体)感染引入DNA，这也是DNA交换的天然方法。通常，此类方法涉及将多核苷酸掺入病毒DNA或RNA分子内。
本发明还涉及以下突变的man基因自身及其相应的编码蛋白：
-突变的嗜热链球菌manL，其编码嗜热链球菌的截短的IIABMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：156中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO：156具有至少90％相似性或同一性的IIAB变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因编码IIABMan蛋白，所述蛋白的序列选自由SEQ ID NO：156至172组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manL基因如SEQ ID NO：155中所定义。
-突变的嗜热链球菌manN，其编码嗜热链球菌的截短的IIDMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：251中所定义的序列；和b)与SEQ ID NO：251具有至少90％相似性或同一性的IIDMan变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因编码IIDMan蛋白，所述蛋白的序列选自由SEQ ID NO：251至255组成的组。在一个实施例中，突变的嗜热链球菌manN基因如SEQ ID NO：250中所定义。
表述“具有至少90％相似性或同一性的IIABMan变体和IIDMan变体”如以上部分VI中所定义。
本发明还涉及一种设计分泌葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：
a)提供乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，在通过测试B测定时，其分泌小于1mM的葡萄糖浓度；
b)使选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的一种或多种基因突变，并且任选地使编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因突变；以及
c)从b)中获得的突变体中选择乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如本文中所定义，通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
在一个实施例中，a)中提供的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株表现出如本文中所定义小于4.10-6或小于3.10-6的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率。
本发明还涉及一种设计分泌葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：
a)提供乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其表现出如所定义的通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，并且在通过测试B测定时释放8至50mM的葡萄糖浓度；
b)使a)中提供的菌株中编码甘露糖-葡萄糖特异性PTS的蛋白质的基因，特别是manL基因、manM基因或manN基因突变；
c)从b)中获得的突变体中选择乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中b)中获得的所述突变体在通过测试B测定时释放至少60mM的葡萄糖浓度。在一个实施例中，b)中获得的所述突变体释放至少70mM的葡萄糖浓度。在一个实施例中，b)中获得的所述突变体释放至少80mM的葡萄糖浓度。在一个实施例中，b)中获得的所述突变体释放至少90mM的葡萄糖浓度。在一个实施例中，b)中获得的所述突变体释放至少100mM的葡萄糖浓度。
本发明还涉及一种选择根据本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的方法，所述方法包括：
1)提供表达原始葡萄糖激酶的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，如通过测试A所测定，所述原始葡萄糖激酶的活性为大于1800U/g总蛋白提取物，如通过测试A所测定，特别是大于2000U/g总蛋白提取物；
2)修饰步骤1)的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的glcK基因的开放阅读框，使得所述修饰的嗜热链球菌菌株表达如本文中所定义，在与原始葡萄糖激酶的序列相比时序列被修饰的葡萄糖激酶；
3)通过测试A测定步骤2)中获得的所述修饰的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性；
4)选择表达如下葡萄糖激酶的修饰的嗜热链球菌菌株，如本文中所定义，通过测试A，在所述修饰的菌株中所述葡萄糖激酶的活性被降低但不为零；
5)任选地，通过测试C测定在步骤4)中选择的所述修饰的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶Vmax，并选择表达如下葡萄糖激酶的修饰的嗜热链球菌菌株，如本文中所定义，通过测试C，在所述修饰的菌株中所述葡萄糖激酶的Vmax被降低但不为零。
在步骤2)的实施例中，通过定向诱变步骤1)的嗜热链球菌菌株的glcK基因来进行glcK基因的开放阅读框的修饰。在步骤2)的实施例中，通过用如下glcK基因的异源开放阅读框(其中“异源”是指glcK基因的开放阅读框最初不存在于步骤1的菌株中，例如合成设计的glcK基因的开放阅读框或从另一个嗜热链球菌菌株获得的glcK基因的开放阅读框)置换步骤1)的菌株的glcK基因的原始开放阅读框来进行glcK基因的开放阅读框的修饰。
在步骤4)的一个实施例中，特征“所述修饰的菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零”如上文对于本发明的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株所定义。在一个具体的实施例中，如通过测试A所测定，修饰的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为200至1500、300至1200、400至1000U/g总蛋白提取物，或如通过测试A所测定为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。在一个具体的实施例中，修饰的嗜热链球菌菌株中的葡萄糖激酶活性为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％至60％、10％至50％、15％至40％的活性(两者均通过测试A测定)，或为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的40％、50％和60％组成的组的最大百分比(两者均通过测试A测定)。表述“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性”如上文所定义。
在步骤5)的一个具体的实施例中，特征“所述修饰的菌株中的葡萄糖激酶Vmax被显著降低但不为零”如上文对于本发明的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株所定义。在一个具体的实施例中，如通过测试C所测定，修饰的嗜热链球菌菌株中葡萄糖激酶的最大正向速度为200至1500、300至1200、400至1000U/g总蛋白提取物，或如通过测试C所测定为选自由200、300和400U/g总蛋白提取物组成的组的最小值至选自由1000、1200和1500U/g总蛋白提取物组成的组的最大值。在一个具体的实施例中，在均通过测试C测定时，修饰的嗜热链球菌菌株中葡萄糖激酶的Vmax为DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的5％至60％、10％至50％、15％至40％，或为选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的Vmax的5％、10％和15％组成的组的最小百分比至选自由DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的40％、50％和60％组成的组的最大百分比。表述“DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax”如上文所定义。
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现在，通过非限制性实例的方式来描述本发明的各种优选特征和实施例。
材料和方法
菌株和生长条件
使本申请中披露的嗜热链球菌菌株(ST)在37℃下在M17肉汤(
Figure BDA0002550677360000971
公司，供应商参考号CM0817)中生长，所述肉汤中添加有30g/L适当碳水化合物，并且必要时添加15g/L的细菌琼脂A型(博尔卡公司(Biokar)，供应商参考号A1010HA)，或在43℃下在奶(UHT半脱脂奶“Le Petit Vendéen”+3％奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司)中生长。向高压灭菌的M17肉汤中添加0.2μm过滤的乳糖、蔗糖、半乳糖或葡萄糖。通过在补充有5g/L乳糖和10％甘油的M17中半稀释过夜培养物获得ST菌株的冷冻储液，并储存在-20℃下。
奶发酵期间碳水化合物分解代谢的定量[测试B]
以1％(v/v，约107CFU/ml)用待测定的嗜热链球菌菌株的培养物(来自在补充有3％蔗糖的M17中生长的过夜培养物的无碳水化合物M17再悬浮细胞)接种预先在90℃下巴氏灭菌10min的含有3％(w/v)奶粉(BBA公司，兰特黎斯公司(Lactalis))的UHT半脱脂奶“LePetit Vendéen”(“酸奶”)。发现此奶含有约175mM乳糖。将接种的奶瓶在43℃的水浴中静置孵育24h，获得发酵奶。
将T0样品和发酵奶(T24h)样品(5g)在25g 0.025N H2SO4中稀释，随后在4℃下以4600rpm离心10分钟。将上清液通过0.2μm尼龙滤膜(德国阿沙芬堡的菲罗门公司)直接过滤到2ml HPLC小瓶中。将样品储存在-20℃下直至进一步分析。在35℃下，通过配备有折射率检测器的高效液相色谱(安捷伦(Agilent)1200HPLC)，使用Aminex HPX-87H阴离子交换柱(伯乐实验室公司(Bio-Rad Laboratories Inc.))，使用12.5mM H2SO4作为洗脱液和0.6mlmin-1的流速对碳水化合物进行定量。用Chemstation再处理软件(安捷伦公司)进行结果的开发。
glcK测序
使用引物GlcK-F4(5’-CAGGTATGAGTTTAGCAACGG-3’)和GlcK-R12(5’-ATTCACCACGGCCTGAGAC-3’)进行葡萄糖激酶基因的PCR扩增，[在98℃下进行孵育步骤，5min，随后进行33个98℃，45s；58℃，30s；68℃，3min的循环，在72℃下进行最终延伸步骤7min]。然后根据制造商的说明(通用医疗公司(GE Healthcare))用IllustraTMExoProStarTM处理2788bp的PCR产物。通过使用
Figure BDA0002550677360000981
Terminator v3.1循环测序试剂盒(生命技术公司(Life Technologies))，根据制造商的说明，使用AB3500(AppliedBiosystemsTM)和表2中列出的引物进行测序反应。
引物 序列
GlcK-F4 CAGGTATGAGTTTAGCAACGG
GlcK-R8 AGTTCAATCTTCATCATCTCG
GlcK-F5 GTAGCCACATTGTTCCTGAC
GlcK-R6 TTGCTGAAGCTACAGTTTCC
GlcK-R4 TAAGCAAGACTAGCAGCTCC
GlcK-F7 TTGCGTAGTCGTGTTGAAGG
GlcK-R10 ATTGTCCCTTCATAAGCATCG
GlcK-F11 CGAACTGGGTGCAGATGATG
GlcK-R12 ATTCACCACGGCCTGAGAC
表2：用于glcK测序的引物的清单。
葡萄糖激酶活性[测试A]
获得了嗜热链球菌菌株在含有30g/L乳糖的M17中的新鲜过夜培养物，并将所述培养物用于以1％(体积/体积)接种10ml含30g/L乳糖的新鲜M17。在0.8+/-0.2的600nm光密度(OD600)时，通过离心(6000g，10min，4℃)收集细胞，在5ml冷GLCK缓冲液(5mM MgCl2，10mMK2HPO4/KH2PO4[pH 7.2])中洗涤，并再悬浮于500μl冷GLCK缓冲液中。如供应商所述，将无EDTA的蛋白酶抑制剂“cOmpleteTM”(罗氏公司，供应商参考号04693132001)添加到GLCK缓冲液中。通过向200μl再悬浮细胞中添加100mg玻璃珠(150-212μm，西格玛公司(Sigma)G1145)并在MM200振荡磨机(德国哈恩市莱驰公司(Retsch，Haan，Germany))中以30个循环/秒的频率振荡6min来破坏细胞。通过离心(14000g，15min，4℃)去除细胞碎片和玻璃珠，并将上清液转移至保存在冰上的1.5mL洁净离心管中。通过使用弗卢卡蛋白质快速定量试剂盒(参考号51254)确定总蛋白含量。通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6PDH，EC1.1.1.49)：NADPH偶联测定(Porter等人，1982)，基本上如Pool等人(2006)所述用分光光度法确定细胞提取物中的葡萄糖激酶活性。将每种样品(5、10和20μL)以最终体积250μL添加至测定缓冲液(10mMK2HPO4/KH2PO4[pH 7.2]、5mM MgCl2、1mM ATP、20mM葡萄糖、1mM NADP、1U G-6PDH)中，并且将混合物在30℃下放置5min。通过使用Synergy HT多检测微板酶标仪(伯腾公司)测量340nm下的光密度5分钟。一单位的葡萄糖激酶对应于在测定条件下每分钟催化1微摩尔D-葡萄糖磷酸化为D-葡萄糖6-磷酸的酶的量。葡萄糖激酶活性如下计算：
葡萄糖激酶活性(U/g总蛋白提取物)＝dOD x V/[dt x l x ε x Qprot]，其中：
-dOD是340nm下光密度(OD)的变化
-V是反应体积(本文中为250μL)
dt＝测量时间(以分钟计)
l＝光路长度(在本文中为0.73cm)
ε＝NADPH的摩尔衰减系数；H+(本文中为6220cm2/μmol)
Qprot＝比色皿中蛋白质的量(以克计)
对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试A给出的葡萄糖激酶比活性值是三次独立实验的平均值。
GlcK的最大正向速度[测试C]
通过对如“葡萄糖激酶活性”(测试A)中所述制备的粗提取物使用各种葡萄糖浓度(0、5、10、15、20mM)来确定GlcK的最大正向速度(Vmax)。对于每个样品测量三次，并且本文中根据测试C给出的Vmax值是三次独立实验的平均值。呈现出比速度倒数随葡萄糖浓度倒数的变化的线性回归给出了与图形Y轴相交处的最大正向速度的倒数。
奶酸化性能
如测试B中所述，通过在奶发酵期间记录pH值随时间的变化来评价嗜热链球菌菌株的酸化特性。如前述使用CINAC系统(法国联合仪器公司(Alliance Instruments，France)；pH电极为梅特勒(Mettler)405DPAS SC(西班牙托莱多(Toledo，Spain)))监测pH24小时。每5分钟测量并记录一次pH。使用CINAC v2.07软件，计算pH 6.0与pH 5.5(UpH/分钟)之间的斜率[斜率pH 6-5.5]。
ST0菌株的glcK等位基因转移至其他3个嗜热链球菌菌株的基因组中
使用引物GlcK-F1(5’-GAAGCAGTTTGGGGTAGTAG-3’)和GlcK-R2(5’-GAGTTATCTACAGGAGCTGG-3’)获得带有ST0菌株的glcK基因的1889bp PCR产物。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物，并在无RNA酶的水中洗脱。使用NanoDrop 2000分光光度计(马萨诸塞州威尔明顿的赛默科技公司(Thermo Scientific，Wilmington，MA))确定PCR产物的浓度。通过基于凝胶的毛细管电泳
Figure BDA0002550677360001001
系统(德国希尔登的凯杰公司(Qiagen，Hilden，Germany))验证PCR产物的大小和纯度。用1889bp PCR产物转化菌株DGCC7710 ST1.1和ST1.2，并选择glcK基因被ST0菌株的glcK等位基因置换的突变体(通过测序检查ST0菌株的glcK等位基因是否存在)。
结果
在WO 2013/160413申请和
Figure BDA0002550677360001011
等人(2016)中，通过从半乳糖发酵菌株的集合中选择2-脱氧葡萄糖(2-DOG)抗性突变体来选择glcK突变体(WO申请的实例2)。已经描述了三种突变体，CHCC15757(也称为St1-GS-1)、CHCC15887和St2-GS-1，其葡萄糖激酶中存在氨基酸改变，分别为T141I、S72P和G249R。然而，已显示所得突变体的酸化动力学受影响(关于S72P改变，参见以下实例4)。
据报道表达具有T141I、S72P或G249R改变的葡萄糖激酶的菌株的葡萄糖激酶活性不可检测(关于S72P改变，参见以下实例4)。此可以解释WO 2013/160413申请和
Figure BDA0002550677360001012
等人(2016)中报道的延迟的酸化动力学。假设用于选择的方法可以解释仅表达零葡萄糖激酶活性(即不可检测)的葡萄糖激酶的突变体的获得。实际上，在带有野生型葡萄糖激酶的半乳糖发酵菌株中，2-DOG将被葡萄糖激酶(GlcK)磷酸化，然后其不能被磷酸葡萄糖变位酶(PGM)用作底物。因此，2-DOG对半乳糖发酵菌株有毒，这不仅由于2-DOG与葡萄糖之间竞争GlcK的结合位点，而且还因为不能由糖酵解路径再生的ATP的消耗(由葡萄糖激酶)。因此，为了生存，半乳糖发酵菌株的最佳选择是关闭葡萄糖激酶的活性。因此，WO 2013/160413申请和
Figure BDA0002550677360001013
等人(2016)中描述的选择方法预期将主要提供半乳糖发酵菌株，其glcK基因不表达功能性葡萄糖激酶。
实例1：嗜热链球菌集合中葡萄糖分泌菌株的筛选
为了选择分泌葡萄糖的菌株，本申请的发明人使用了另一种方法。通过测试B筛选嗜热链球菌集合中能够在发酵奶中分泌葡萄糖的菌株。使用10mM的量的葡萄糖作为选择的最小阈值。选择了一种菌株ST0，使用测试B，其在发酵奶中释放了30mM葡萄糖。
实例2.鉴定glcK基因中的突变
对ST0菌株中已知参与嗜热链球菌中碳水化合物的分解代谢的几种基因进行测序，并且与我们的集合中其他嗜热链球菌的相应基因序列比对。
在ST0菌株的GlcK序列中鉴定到非保守性氨基酸差异E275K，所述差异在所述集合中其他嗜热链球菌菌株的任何GlcK序列中均未发现；此氨基酸差异通过在glcK基因第823位用A代替G而产生。其他嗜热链球菌菌株的glcK基因编码的葡萄糖激酶的其他比较证实，第275位的赖氨酸(代替谷氨酸)是ST0特有的，并且在107个其他菌株中的任一个中均未发现。
表3中呈现了从这108个菌株引出的葡萄糖激酶中鉴定出的其他氨基酸差异。因此，可以区分出10种不同的葡萄糖激酶类型(如分别在SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18和20中所阐述的GlcK 1型至GlcK 10型)。对于后续实验，选择了10个菌株ST1至ST10，所述菌株各自表达独特的葡萄糖激酶。将SEQ ID NO：2用作参考序列，因为在108个所分析菌株的约70％中发现了此GlcK类型。特别地，2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株编码如SEQ ID NO：2中所定义的葡萄糖激酶
值得注意的是，由ST0菌株编码的葡萄糖激酶序列与SEQ ID NO：2之间的唯一氨基酸差异是第275位的氨基酸差异。
Figure BDA0002550677360001031
Figure BDA0002550677360001032
表3：通过比较由108个嗜热链球菌编码的GlcK蛋白序列与由ST0和ST20编码的GlcK蛋白序列鉴定的GlcK蛋白差异。列出的氨基酸位置指示了GlcK蛋白之间的所有氨基酸差异。选择来自ST1的GlcK蛋白序列(SEQ ID NO：2)作为参考序列。此表中未列出的氨基酸位置对于此研究的所有葡萄糖激酶是相同的。“aa diff”栏给出了与SEQ ID NO：2相比的氨基酸差异数。“％id”栏给出了与SEQ ID NO：2的同一性百分比
实例3.ST0菌株的葡萄糖激酶活性的测量以及与其他菌株(ST1至ST10)的比较
使用测试A将ST0菌株的葡萄糖激酶活性与如实施例2中报道选择的ST1至ST10菌株的葡萄糖激酶活性比较。将结果总结于表4中。
Figure BDA0002550677360001041
表4：11个菌株的葡萄糖激酶比活性：10个菌株-ST1至ST10-每一个代表不同的GlcK蛋白变体，和实例1中鉴定的ST0；ND：未确定
这些数据显示，如通过测试A所测定，菌株ST1至ST10的葡萄糖激酶活性为2014至2791U/g总蛋白提取物。认为高于1800U/g总蛋白提取物的葡萄糖激酶活性代表正常的葡萄糖激酶活性。DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性被认为是参考葡萄糖激酶活性(因为表达最常见的GlcK类型，所述类型被定义为SEQ ID NO：2)。
相反，如通过测试A所测定，表达第275位带有赖氨酸的GlcK蛋白的ST0菌株的葡萄糖激酶活性为约977U/g总蛋白提取物，即比DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性低约3倍(35％)。
这些数据显示，本发明人保留的方法能够首次选择表达葡萄糖激酶的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述葡萄糖激酶的活性被显著降低但不为零。
实例4：比较DGCC7710菌株、带有E275K差异的DGCC7710衍生物和带有零葡萄糖激酶氨基酸改变的DGCC7710的半乳糖阳性变体的葡萄糖激酶活性、Vmax、Km、葡萄糖释放和酸化动力学
为了检验ST0菌株的葡萄糖分泌特征是由于葡萄糖激酶活性的降低和在葡萄糖激酶中鉴定出的E275K氨基酸差异，设计了DGCC7710菌株的衍生物，其中glcK基因编码第275位的谷氨酸(E)用氨基酸赖氨酸(K)置换的葡萄糖激酶。此衍生物(DGCC12534)在2017年8月15日以保藏号DSM32587保藏在DSMZ。其GlcK蛋白的序列如SEQ ID NO：22中所定义。
同时，产生了DGCC7710的突变体，其中第72位的丝氨酸(S)用脯氨酸(P)置换，从而得到具有如SEQ ID NO：23中所定义的序列的GlcK蛋白[S72P氨基酸取代；在申请WO 2013/160413的菌株DSM25851中报道]。由于S72P氨基酸取代产生零葡萄糖激酶活性(即，不能通过葡萄糖激酶使用葡萄糖的菌株)，所以所述突变体先前被赋予半乳糖阳性(以便能够使用半乳糖，因为表现出零葡萄糖激酶活性的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株预期是不可行的)。因此，预先根据申请WO 2011/026863使DGCC7710菌株的gal操纵子启动子突变，得到具有如SEQ NO：24中所定义的序列的gal操纵子启动子。获得了在GlcK蛋白中带有S72P氨基酸取代的半乳糖阳性突变体，并称为ST1m-glcK0-gal+。
图1中披露了DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶蛋白序列的比对。
如材料和方法中所述确定DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶活性、葡萄糖激酶的Vmax和Km、发酵奶中的葡萄糖释放以及酸化动力学。获得的结果披露于表5至7中和图2中，并总结于表8中。
Figure BDA0002550677360001061
表5：DGCC7710菌株以及DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株中的葡萄糖激酶比活性和与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性相比的活性％
Figure BDA0002550677360001062
表6：DGCC7710菌株以及DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶的Vmax、与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax相比的葡萄糖激酶Vmax％以及DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株的葡萄糖激酶的Km活性；ND：未确定
Figure BDA0002550677360001063
表7：用DGCC7710、DSM32587或ST1m-glcK0-gal+菌株发酵(24h)的奶中碳水化合物的分解代谢
Figure BDA0002550677360001064
Figure BDA0002550677360001071
表8：DGCC7710、DSM32587和ST1m-glcK0-gal+菌株性能的总结；ND：未确定
首先，表5的数据很好地显示，在DGCC7710衍生物(DSM32587)中，仅用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白第275位的谷氨酸(E)就足以将葡萄糖激酶活性从2756U/g显著降至907U/g(即，DGCC7710活性的33％)。对于ST1m-glcK0-gal+突变体获得的数据证实S72P氨基酸改变足以完全消除葡萄糖激酶活性。与葡萄糖激酶活性一起，本发明人还研究了在DSM32587菌株中观察到的葡萄糖激酶活性的降低是否是由于葡萄糖激酶对其底物(葡萄糖)的亲和力(Km)降低和/或葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)降低。表6的数据证实，在DGCC7710衍生物(DSM32587)中，仅用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白第275位的谷氨酸(E)就足以将葡萄糖激酶的Vmax从2855U/g显著降至914U/g(即，DGCC7710 Vmax的32％)。在ST1m-glcK0-gal+突变体中不存在功能性葡萄糖激酶时，不能确定Vmax。
表7的数据显示，DSM32587菌株在奶发酵后释放29mM葡萄糖，而具有高的葡萄糖激酶活性的DGCC7710菌株不释放大量葡萄糖；此外，DSM32587菌株消耗的乳糖比DGCC7710菌株多1.5倍。用DSM32587发酵的奶中释放的葡萄糖对应于所消耗乳糖的35％，而用DGCC7710菌株发酵的奶中释放的葡萄糖低于检测水平(仅奶中发现含有175mM乳糖以及不可检测水平的其他碳水化合物或酸)。这些数据显示，DSM32587菌株(其中葡萄糖激酶的活性和Vmax比DGCC7710菌株降低了约3倍)通过多消耗1.5倍乳糖并在24h之后释放所消耗乳糖的葡萄糖部分的35％来补偿其较低的细胞内葡萄糖分解代谢。最后，就ST1m-glcK0-gal+突变体而言，此半乳糖阳性突变体几乎消耗了奶中存在的所有乳糖(175mM中的160mM)，并分泌了109mM葡萄糖，对应于所消耗乳糖的68％。假设葡萄糖的剩余部分会分泌于奶中，但在通过PTS系统运输后会被细胞重新消耗。
最后，图2的数据显示，与DGCC7710菌株相比，DSM32587菌株的酸化动力学没有受到显著影响(DSM32587菌株的斜率pH 6-5.5为-0.0141UpH/min，相比之下，DGCC7710菌株为-0.0117UpH/min)。相反地，ST1m-glcK0-gal+突变体的斜率pH 6-5.5受到显著影响(-0.0077UpH/min)。
总而言之，这些数据显示，葡萄糖激酶活性和Vmax降低得越多(最高为0)，菌株消耗的乳糖越多，并且葡萄糖的分泌量越大。这些数据证实，不存在功能性葡萄糖激酶，尽管提供大量分泌的葡萄糖，但显著影响半乳糖阳性嗜热链球菌的酸化动力学。本发明人首次惊讶地显示嗜热链球菌菌株的“半乳糖阴性”特征和此菌株中的“被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性”特征以及此菌株中的“被显著降低但不为零的葡萄糖激酶Vmax”的组合能够获得在用这些菌株发酵的奶中具有葡萄糖分泌特性(大于10mM)的菌株。
实例5：表达标准葡萄糖激酶活性的2个嗜热链球菌菌株及其带有E275K差异的各个变体的葡萄糖激酶活性、Vmax、Km、葡萄糖释放和酸化动力学的比较
为了检验葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零的半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株在发酵后的葡萄糖释放和酸化动力学方面的性能不限于DGCC7710的遗传背景，将氨基酸差异E275K引入具有2个不同遗传背景的2个半乳糖阴性的嗜热链球菌：ST1.1菌株和ST1.2菌株中。各个突变体被称为ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK。这两个突变体的GlcK序列如SEQ IDNO：22中所定义。
如材料和方法中所述确定ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK突变体的葡萄糖激酶活性、葡萄糖激酶的Vmax和Km、发酵奶中的葡萄糖释放以及酸化动力学，并与ST1.1和ST1.2菌株比较。获得的结果披露于表9至11中和图3A和3B中，并总结于表12中。
Figure BDA0002550677360001091
表9：ST1.1和ST1.2菌株及其各个E275K突变体的葡萄糖激酶比活性和与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性相比的活性％
Figure BDA0002550677360001092
表10：ST1.1和ST1.2菌株及其各个E275K突变体的葡萄糖激酶的Vmax、与DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax相比的葡萄糖激酶Vmax％以及ST1.1和ST1.2菌株及其各个E275K突变体的葡萄糖激酶的Km活性
Figure BDA0002550677360001093
Figure BDA0002550677360001101
表11：用ST1.1菌株、ST1.2菌株及其各个E275K突变体发酵(24h)的奶中碳水化合物的分解代谢
Figure BDA0002550677360001102
表12：ST1.1、ST1.2菌株及其各个E275K突变体的性能的总结
首先，表9的数据很好地显示，分别地，在ST1.1的遗传背景中，仅用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白第275位的谷氨酸(E)就足以将葡萄糖激酶活性从2584U/g降至755U/g(即，如下葡萄糖激酶活性，其为DGCC7710的27％)，并且在ST1.2的遗传背景中，就足以将葡萄糖激酶活性从2239U/g降至453U/g(即，如下葡萄糖激酶活性，其为DGCC7710的16％)。对于葡萄糖激酶的Vmax也进行了类似的观察，其中，分别地，在ST1.1的遗传背景中，用赖氨酸(K)置换GlcK蛋白第275位的谷氨酸(E)将葡萄糖激酶的Vmax从2687U/g降至795U/g(即，DGCC7710的28％)，并且在ST1.2的遗传背景中，将葡萄糖激酶的Vmax从2431U/g降至501U/g(即，DGCC7710的18％)(表10)。
表11的数据显示，葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零且Vmax被显著降低但不为零的菌株ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK在奶发酵后分别释放30和18mM葡萄糖，而具有高的葡萄糖激酶活性的ST1.1和ST1.2菌株不释放大量葡萄糖。此外，ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK菌株消耗的乳糖比菌株ST1.1和ST1.2菌株分别多1.6和1.3倍。用菌株ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK发酵的奶中释放的葡萄糖分别对应于所消耗乳糖的35％和26％，而用ST1.1和ST1.2菌株发酵的奶中释放的葡萄糖低于检测水平或非常接近零。这些数据显示，ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK(其中葡萄糖激酶的活性和Vmax比ST1.1和ST1.2菌株降低了至少3倍)通过多消耗1.3至1.6倍乳糖并在24h之后释放所消耗乳糖的葡萄糖部分的26％至35％来补偿其较低的细胞内葡萄糖分解代谢。
最后，图3的数据显示，分别与ST1.1和ST1.2菌株相比，ST1.1m-glcK和ST1.2m-glcK菌株的酸化动力学没有受到显著影响(ST1.1m-glcK菌株的斜率pH 6-5.5为-0.0169UpH/min，相比之下ST1.1菌株为-0.0160UpH/min，并且ST1.2m-glcK菌株的斜率pH6-5.5为-0.0150UpH/min，相比之下ST1.1菌株为-0.0136UpH/min)。
总而言之，这些数据证实，在具有不同遗传背景的2种半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的GlcK蛋白中引入E275K差异足以提供具有关注水平葡萄糖的发酵奶。
总之，此申请首次报道嗜热链球菌菌株的“半乳糖阴性”特征与此菌株中的“被显著降低但不为零的葡萄糖激酶活性”特征以及此菌株中的“被显著降低但不为零的葡萄糖激酶Vmax”的组合能够获得可用于提供具有释放/积聚的葡萄糖的发酵奶的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
实例6：其他GlcK突变蛋白的鉴定
鉴定了一种嗜热链球菌菌株(ST20)，所述菌株的glcK基因含有非保守氨基酸差异G144S。在集合(GlcK类型ST1至ST10)的其他嗜热链球菌菌株的任何GlcK序列中均未发现此氨基酸改变。值得注意的是，由ST20菌株编码的葡萄糖激酶序列与SEQ ID NO：2之间的唯一氨基酸差异是第144位的氨基酸差异(表3)。
实例7：glcK突变体中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的表征
几个专利申请(WO 2015/0149940、WO 2013/160413和WO 2017/103051)报道了释放葡萄糖的嗜热链球菌菌株。然而，这些申请中披露的菌株是半乳糖阳性的菌株，这不是必须的表型，并且已经证明是不稳定的，特别是在菌株在含乳糖的培养基上培养时。
如上文所提及，所述结果指示菌株中的葡萄糖激酶活性(如本文中所定义被降低但不为零)是鉴定释放葡萄糖的嗜热链球菌菌株的受关注参数。然而，当单独使用时，此参数可能不足以鉴定一个或多个除glck基因以外的其他基因突变的释放葡萄糖的嗜热链球菌。
因此，本发明人已经观察并检验到，不仅葡萄糖激酶活性，β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率也是极佳的参数，不仅用于鉴定glcK基因中突变的释放葡萄糖的嗜热链球菌，而且用于鉴定其他基因中突变的释放葡萄糖的嗜热链球菌。
因此，此比率通过以下计算：
-通过测试D确定菌株中的β-半乳糖苷酶活性(U/g蛋白)
-通过测试E确定所述相同菌株中的葡萄糖激酶活性(U/g蛋白)；以及
-计算所述菌株中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率。
在DGCC7710菌株、DSM32587菌株(在其glcK基因中携带E275K突变)、ST1.1菌株、ST1.1m-glcK菌株(在其glcK基因中携带E275K突变)、ST20菌株(在其glcK基因中携带G144S突变)和ST5菌株中计算此比率。值得注意的是，在ST1m-glcK0-gal+突变体中不存在功能性葡萄糖激酶(GlcK活性小于0.1)时，无法确定此比率。结果总结于表13和图4中。
还如材料和方法中所述确定了这6个菌株在发酵奶中的葡萄糖释放和酸化动力学，总结在表14中，并与ST1m-glcK0-gal+的性能进行了比较。
Figure BDA0002550677360001131
表13：DGCC7710、DSM32587、ST1.1、ST1.1m-glcK、ST20和ST5菌株中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的总结
Figure BDA0002550677360001132
表14：DGCC7710、DSM32587、ST1.1、ST1.1m-glcK、ST20、ST5和ST1m-glcK0-gal+菌株的性能总结
这些数据显示，所有释放葡萄糖(至少32mM)的菌株表现出的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率等于或大于9.10-6，而葡萄糖水平不可检测的所有菌株表现出的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率为约2至310-6。
此证实β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率(如本文中所计算)是鉴定释放大量葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的极佳参数。
实例8：ccpA突变体中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的表征
基于实例7的结论，本发明人已经确定了杜邦公司(DuPont)所有的集合中乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株(其glcK基因中未突变)的β-半乳糖苷酶活性(测试D)比葡萄糖激酶活性(测试E)。
已经显示一种菌株(ST30)表现出此种比率。此菌株基因组的测序显示了ccpA基因中的突变：在第114-120位具有7个核苷酸A的段中核苷酸A的缺失(SEQ ID NO：71)，所述突变引起ccpA基因的开放阅读框移框。
将此突变引入DGCC7710菌株的背景中，得到ST1m-ccpA菌株(即，设计了第一DGCC7710衍生物，其中DGCC7710菌株的ccpA基因用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换)。将相同突变引入ST1.1菌株的背景中，得到ST1.1m-ccpA菌株。也将此突变引入DSM32587(即，带有编码具有取代E275K的葡萄糖激酶的突变glcK基因的DGCC7710)中，得到ST1m-glck+ccpA。
在DGCC7710菌株、ST1m-ccpA菌株、ST1.1菌株和ST1.1m-ccpA菌株中计算β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率。结果总结于表15和图4中。还如材料和方法中所述确定了这4个菌株在发酵奶中的葡萄糖释放和酸化动力学，并总结在表16中。
Figure BDA0002550677360001141
表15：DGCC7710、ST1m-ccpA、ST1.1和ST1.1m-ccpA菌株中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的总结
Figure BDA0002550677360001151
表16：DGCC7710、ST1m-ccpA、ST1m-KOccpA、ST1m-glcK+ccpA、ST1.1和ST1.1m-ccpA菌株性能的总结(nd：未确定)
首先，这些数据证实，鉴定的ccpA突变产生表现出6和9.810-6的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的菌株，而在ccpA基因中未突变的菌株表现出2.5.10-6至3.10-6的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率。然后，这些数据还证实，与在ccpA基因中未突变的菌株相反，携带突变的ccpA突变的菌株在奶发酵期间释放葡萄糖。最后，这些数据还显示，携带突变的ccpA突变的菌株的酸化动力学不受影响。
总之，这些结果证实如本文中所定义的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率是鉴定释放大量葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的极佳参数。
结果还显示，除了编码活性被降低但不为零的葡萄糖激酶的glcK基因的突变以外，本发明人还鉴定了另一种基因(ccpA基因)，所述基因可以被突变(但不敲除)以得到释放葡萄糖并具有良好的酸化动力学的菌株。将携带突变的ccpA基因(SEQ ID NO：71)的DGCC7710菌株[ST1m-ccpA]的性能与将DGCC7710菌株的ccpA基因敲除的DGCC7710衍生物(ST1m-KOccpA)的性能比较。有趣的是，此比较显示ST1m-KOccpA的酸化动力学受显著影响，而ST1m-ccpA菌株并不(表16)，显示ST1m-ccpA菌株中ccpA基因的突变有别于完全敲除所述基因。
最后，在DGCC7710菌株中引入突变的glcK基因和突变的ccpA基因两者显示与DSM32587菌株(表14)和与ST1m-ccpA菌株相比增加的葡萄糖量(39mM)。
实例9：manL基因中突变以及ccpA和manL基因中均突变的菌株中β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的表征，以及与glcK基因或ccpA基因中突变的菌株中的比率的比较
在其他实验中，本发明人鉴定了一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株(其glcK基因中未突变)，所述菌株在manL基因(编码IIABMan蛋白的基因，所述蛋白为甘露糖-葡萄糖-特异性PTS的一部分)中携带突变。manL基因的突变是第916位以核苷酸T取代核苷酸G，使得在蛋白[IIABMan 305]的第306位产生终止密码子(SEQ ID NO：155)。
将此突变引入DGCC7710菌株的背景中，得到ST1m-manL菌株；将相同的突变引入ST1.1菌株的背景中，得到ST1.1m-manL菌株。另外，将manL突变的基因引入实例8中详述的ST1m-ccpA菌株和ST1.1m-ccpA菌株(即，携带突变的ccpA基因的菌株DGCC7710和ST1.1)中。
计算DGCC7710菌株、ST1m-manL菌株、ST1m-ccpA菌株、ST1m-ccpA+manL菌株、ST1.1菌株、ST1.1m-manL菌株、ST1.1m-ccpA菌株和ST1.1m-ccpA+manL菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率。结果总结于表17和图4中。还如材料和方法中所述确定了这8个菌株在发酵奶中的葡萄糖释放和酸化动力学，并总结在表18中。
Figure BDA0002550677360001171
表17：DGCC7710、ST1m-manL、ST1m-ccpA、ST1m-ccpA+manL、ST1.1、ST1.1m-manL、ST1.1m-ccpA和ST1.1m-ccpA+manL菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率的总结
Figure BDA0002550677360001172
表18：DGCC7710、ST1m-manL、ST1m-ccpA、ST1m-ccpA+manL、ST1.1、ST1.1m-manL、ST1.1m-ccpA和ST1.1m-ccpA+manL菌株的性能的总结
首先，这些数据显示，仅在manL基因中突变的菌株(ST1m+manL或ST1.1m-manL)尽管未表现出与DGCC7710或ST1.1菌株或多或少类似的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率，但在奶发酵期间释放葡萄糖。此表明manL突变不影响嗜热链球菌菌株中葡萄糖激酶的活性和/或β-半乳糖苷酶的活性。
这些数据还显示，在ccpA基因和manL基因中均突变的菌株(ST1m-ccpA+manL和ST1.1m-ccpA+manL菌株)表现出的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率类似于或高于仅在ccpA基因中突变的菌株(ST1m-ccpA和ST1.1m-ccpA菌株)。此证实了可以使用β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率(如本文中所定义)通过以下方法来产生和鉴定glcK基因、ccpA基因和man基因中的其他突变：组合这些待测定的一个或多个突变基因与具有已知突变的glcK基因、ccpA基因和一个或多个man基因(并确定比率)。
有趣的是，双(ccpA+manL)突变体释放的葡萄糖浓度高于100mM，并且其为ST1m-ccpA和ST1.1m-ccpA菌株的葡萄糖浓度的7至10倍。这些数据显示，在释放的葡萄糖浓度方面存在协同作用[使用双突变体释放的葡萄糖浓度远大于使用ccpA突变的菌株释放的葡萄糖浓度加上使用manL突变的菌株释放的葡萄糖浓度]。尽管这些双突变菌株的酸化动力学受影响，但是发酵期间释放的葡萄糖浓度使得这些双突变菌株在工业上是有用的。这些数据证实β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率(如本文中所定义)可以用于鉴定释放大量葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
最后，本文证实的β-半乳糖苷酶活性相对于葡萄糖激酶活性的比率与奶发酵期间的葡萄糖释放之间的关联可以用于鉴定其他基因，所述其他基因的突变产生如本文中所定义的比率，从而实现设计更多释放葡萄糖的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的目的。
实例10：各种突变的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的葡萄糖释放
基于增强乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株中突变的ccpA基因的葡萄糖释放作用的manL突变的鉴定，本发明人鉴定了manM(编码IICMan蛋白)和ManN(编码IIDMan蛋白)中的其他突变：
-如SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因，所述基因在第625位以核苷酸T取代核苷酸G，使得在第209位产生终止密码子；
-如SEQ ID NO：250中所定义的突变的manN基因，所述基因在第37-41位具有5个核苷酸A的段中插入核苷酸A(产生具有6个核苷酸A的片段，引起IIDMan蛋白在第28位的移框和截短)；
基于以下突变的基因，在DGCC7710(ST1)的背景中或在ST1.1的背景中设计了双突变和三突变菌株。
-ST1m-manM：DGCC7710衍生物，其中DGCC7710菌株的manM基因用如SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因置换；
-ST1m-manN：DGCC7710衍生物，其中manN基因用如SEQ ID NO：250中所定义的突变的manN基因置换；
-ST1m-glck+manM：DSM32587衍生物(携带编码具有取代E275K的葡萄糖激酶的glcK基因；实例2)，其中manM基因被SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因置换；
-ST1m-ccpA+manM：ST1m-ccpA衍生物(DGCC7710，其携带SEQ ID NO：71中所定义的突变的ccpA基因；实例8)，其中manM基因用如SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因置换；
-ST1m-ccpA+manN：ST1m-ccpA衍生物，其中manN基因用如SEQ ID NO：250中所定义的突变的manN基因置换；
-ST1m-glcK+ccpA+manM：DSM32587衍生物，其中ccpA基因用如SEQ ID NO：71中所定义的突变的ccpA基因置换，并且manM基因用SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因取代；以及
-STl.1m-glcK+manM：ST1.1m-glcK衍生物(ST1.1菌株，其携带编码具有取代E275K的葡萄糖激酶的glcK基因；实例2)，其中manM基因用如SEQ ID NO：201中所定义的突变的manM基因置换。
如材料和方法中所述确定了这7个额外菌株和前述实例中披露的菌株在发酵奶中的葡萄糖释放和酸化动力学，并总结在表19中。
Figure BDA0002550677360001201
表19：DGCC7710、ST1.1菌株及其突变体的性能的总结(nd：未确定)
这些数据显示，单个man(manL、manM或ManN)突变体释放7至18mM葡萄糖，而在glcK基因和/或ccpA基因中携带突变的菌株中引入这些突变的manL、manM或ManN基因产生释放89至多达125mM葡萄糖的双或三突变体。这些观察结果证实了突变的man基因对葡萄糖释放的增强作用。
这些数据还证实可以使用如本文中所定义的β-半乳糖苷酶活性比葡萄糖激酶活性成功地鉴定突变的基因，然后组合以设计在奶发酵期间释放大量葡萄糖的菌株。确定此比率是与葡萄糖释放有关的极佳参数不仅为glcK基因、ccpA基因、manL基因、manM基因和manN基因中其他突变的产生和鉴定开辟了道路，而且为任何其他目的基因中其他突变的产生和鉴定开辟了道路(只要达到定义的比率的最小值)。
序列
SEQ ID NO：2
Figure BDA0002550677360001211
SEQ ID NO：22
Figure BDA0002550677360001212
SEQ ID NO：45
Figure BDA0002550677360001213
SEQ ID NO：23
Figure BDA0002550677360001214
SEQ ID NO：65
Figure BDA0002550677360001221
SEQ ID NO：71
Figure BDA0002550677360001222
SEQ ID NO：122
Figure BDA0002550677360001223
SEQ ID NO：155
Figure BDA0002550677360001224
SEQ ID NO：156
Figure BDA0002550677360001231
SEQ ID NO：174
Figure BDA0002550677360001232
SEQ ID NO：201
Figure BDA0002550677360001233
SEQ ID NO：202
Figure BDA0002550677360001234
SEQ ID NO：211
Figure BDA0002550677360001235
SEQ ID NO：250
Figure BDA0002550677360001241
SEQ ID NO：251
Figure BDA0002550677360001242
菌株
DGCC编号是杜邦丹尼斯克集合(DuPont Danisco collection)的内部参考；DSM编号是根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏后，由莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司(Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung yonMikroorganismen und Zellkulturen，GmbH)(布伦瑞克市D-38124因霍芬大街7B(Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig))分配的编号。
就2014年1月14日根据布达佩斯条约以编号DSM28255保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司的嗜热链球菌菌株DGCC7710而言，我们在此证实保藏人丹尼斯克德国有限公司(Danisco Deutschland GmbH)(德国尼布勒市D-25899布希-约翰森大街1号(Busch-Johannsen-Strasse 1，D-25899Niebüll，Germany))已授权申请人(杜邦营养生物科学公司(DuPont Nutrition Biosciences ApS))在本申请中引用保藏的生物材料。表述“DGCC7710菌株”和“DGCC7710衍生物”与表述“DSM28255菌株”和“DSM28255衍生物”可互换使用。
2017年8月15日根据布达佩斯条约以编号DSM32587保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏有限公司的嗜热链球菌菌株由杜邦营养生物科学公司保藏。
本申请人要求本文所述的保藏的微生物的样品仅可在授予专利的日期之前提供给专家。
就寻求欧洲专利保护的那些指定而言，在提及授予欧洲专利的公告之前或在所述申请被驳回或撤回、或被视为撤回之日之前可获得这些保藏的微生物的样品，且此样品的发放仅限于由请求获得所述样品的请求人指定的专家，且视情况需征得i)申请人和/或ii)欧洲专利局同意。
参考文献
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Figure IDA0002550677470000021
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Claims (37)

1.一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株，其在一个或多个选自由glcK基因、ccpA基因、lacZ基因和ptsH基因组成的组的基因中携带突变，并且任选地在编码甘露糖-葡萄糖-特异性PTS的蛋白质的基因中携带突变，
其中通过测试D测定的所述菌株中的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的所述菌株中的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6，并且任选地小于8.10-3。
2.根据权利要求1所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株中的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零。
3.根据权利要求2所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，所述菌株在其glck基因中，特别是在其glck基因的开放阅读框中突变。
4.根据权利要求2或3所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如通过测试A所测定，所述菌株中的葡萄糖激酶活性为300至1200U/g或400至1000U/g总蛋白提取物。
5.根据根据权利要求2或3所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中所述菌株中的葡萄糖激酶活性是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％，特别是所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的15％至40％，其中所述菌株的葡萄糖激酶活性和所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性均通过测试A测定。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中所述菌株中其葡萄糖激酶的最大正向速度(Vmax)被显著降低但不为零，并且由以下这些参数中的一个或两个定义：
-如通过测试C所测定，所述菌株中的葡萄糖激酶Vmax为300至1200U/g或400至1000U/g总蛋白质提取物；
-在均通过测试C测定时，所述菌株中的葡萄糖激酶Vmax是2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％，特别是所述DGCC7710的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中所述突变的glcK基因编码选自由以下组成的组的葡萄糖激酶：
a)在其第275位具有如下氨基酸的葡萄糖激酶，所述氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；
b)其序列如SEQ ID NO：25中所定义的葡萄糖激酶，其中所述SEQ ID的第275位的氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；
c)其序列与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性，特别是长度为322个氨基酸的葡萄糖激酶，其中所述葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25的第275位的氨基酸(或所述葡萄糖激酶的第275位的氨基酸)不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；
d)在其第144位具有如下氨基酸的葡萄糖激酶，所述氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸；
e)其序列如SEQ ID NO：46中所定义的葡萄糖激酶，其中第144位的氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸；或
f)其序列与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性，特别是长度为322个氨基酸的葡萄糖激酶，其中所述葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46的第144位的氨基酸(或所述葡萄糖激酶的第144位的氨基酸)不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸。
8.根据权利要求3至7中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其还在所述ccpA基因中突变。
9.根据权利要求1所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其在所述ccpA基因中突变。
10.根据权利要求8或9所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中所述ccpA基因携带选自由以下组成的组的突变：位于所述ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于所述ccpA基因的编码序列的前四分之一中导致所述ccpA基因的开放阅读框移框的突变。
11.根据权利要求10所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中所述突变的ccpA基因的序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：71中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性的ccpA变体序列。
12.根据权利要求1的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其在编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因中突变，使得所述β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性增加。
13.根据权利要求1所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其在编码HPr的ptsH基因中突变。
14.根据权利要求2至13中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其还在编码甘露糖-葡萄糖-特异性PTS的蛋白质的一个或多个基因、特别是一个基因中突变，特别是在选自由manL基因、manM基因和manN基因组成的组的一个或多个基因、特别是一个基因中突变。
15.根据权利要求14所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中编码所述甘露糖-葡萄糖-特异性PTS的蛋白质的突变的基因编码如下蛋白质，其葡萄糖输入活性被降低或消除，特别是选自由以下组成的组的蛋白质：
a)在第305位被截短的嗜热链球菌IIABMan蛋白(IIABMan 305)；
b)在第208位被截短的嗜热链球菌IICMan蛋白(IICMan 208)；以及
c)在第28位被截短的嗜热链球菌IIDMan蛋白(IIDMan 28)。
16.根据权利要求14或15所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，
其中所述IIABMan 305蛋白的蛋白序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：156中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：156具有至少90％相似性或同一性的IIAB变体序列，特别是其长度为305个氨基酸；
其中所述IICMan 208的蛋白序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：202中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：202具有至少90％相似性或同一性的IICMan变体序列，特别是其长度为208个氨基酸；
其中所述IIDMan 28蛋白的蛋白序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：251中所定义的序列；以及
b)与SEQ ID NO：251具有至少90％相似性或同一性的IIDMan变体序列，特别是其长度为28个氨基酸。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其中如通过测试B所测定，用所述嗜热链球菌菌株发酵的奶中葡萄糖的浓度为至少8mM。
18.一种乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，其选自由以下组成的组：
-2017年8月15日保藏在DSMZ的DSM32587菌株；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中manL基因的编码序列被SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中manM基因的编码序列被SEQ ID NO：201中所示的序列(编码IICMan 208)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中manN基因的编码序列被SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manL基因的编码序列被SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manM基因的编码序列被SEQ ID NO：201中所示的序列(编码IICMan 208)置换；
-对应于所述DSM32587菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manN基因的编码序列被SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换；
-对应于DSM28255菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换；
-对应于所述DSM28255菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manL基因的编码序列被SEQ ID NO：155中所示的序列(编码IIABMan 305)置换；
-对应于所述DSM28255菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manM基因的编码序列被SEQ ID NO：201中示述的序列(编码IICMan 208)置换；
-对应于所述DSM28255菌株的菌株，其中所述ccpA基因的编码序列被SEQ ID NO：71中所示的序列(ccpAΔ1A114-120)置换并且所述manN基因的编码序列被SEQ ID NO：250中所示的序列(编码IIDMan 28)置换；以及
-它们的变体，其表现出如下的通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率，所述比率的最小值选自由至少4.10-6、至少5.10-6、至少6.10-6、至少7.10-6和至少8.10-6组成的组，并且任选地所述比率的最大值小于8.10-3。
19.一种组合物，其包含至少一种、特别是一种根据权利要求1至18中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株，特别是与另一种乳酸细菌组合，特别是与一种或多种选自由以下组成的组的菌株组合：乳杆菌属(Lactobacillus)的菌株，诸如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp bulgaricus)菌株；乳球菌属(Lactococcus)的菌株，诸如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株；或双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株。
20.一种用于制造发酵乳产品，特别是发酵奶的方法，所述方法包括用根据权利要求1至18中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或根据权利要求19所述的组合物接种奶底物，并且发酵所述接种的奶，以获得发酵乳产品。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株或根据权利要求19所述的组合物用于制造发酵乳产品的用途。
22.一种发酵乳产品，其包含至少一种、特别是一种根据权利要求1至18中任一项所述或通过根据权利要求20所述的方法获得的乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株。
23.一种嗜热链球菌葡萄糖激酶，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性被显著降低但不为零，如以下所定义：
a)如通过测试A所测定，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为300至1200U/g或400至1000U/g总蛋白提取物，或
b)当均通过测试A测定时，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的葡萄糖激酶活性为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的10％至50％，特别是所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性的15％至40％，其中所述DGCC7710衍生物中的葡萄糖激酶活性和所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶活性通过测试A测定。
24.根据权利要求23所述的葡萄糖激酶，其特征还在于具有在DGCC7710衍生物中“被显著降低但不为零”的最大正向速度(Vmax)，如由以下这些参数中的一个或两个所定义：
a)如通过测试C所测定，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为300至1200U/g或400至1000U/g总蛋白质提取物；
b)当均通过测试C测定时，DGCC7710衍生物中所述嗜热链球菌葡萄糖激酶的Vmax为2014年1月14日以保藏号DSM28255保藏在DSMZ的所述DGCC7710菌株的葡萄糖激酶的Vmax的10％至50％，特别是所述DGCC7710的葡萄糖激酶的Vmax的15％至40％。
25.根据权利要求23或24所述的嗜热链球菌的葡萄糖激酶，所述葡萄糖激酶选自由以下组成的组：
a)在第275位具有如下氨基酸的葡萄糖激酶，所述氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸，
b)在第275位具有如下氨基酸并且在第278位具有精氨酸和/或在第279位具有丝氨酸的葡萄糖激酶，所述氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；以及
c)在第144位具有如下氨基酸的葡萄糖激酶，所述氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的葡萄糖激酶，其序列选自由以下组成的组：
a)如SEQ ID NO：25中所定义的序列，其中所述SEQ ID的第275位的氨基酸不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；以及
b)与SEQ ID NO：25具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中所述葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：25的第275位的氨基酸(或所述葡萄糖激酶的第275位的氨基酸)不是谷氨酸，特别地不是酸性氨基酸，特别地是赖氨酸；
c)如SEQ ID NO：46中所定义的序列，其中第144位的氨基酸不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸；以及
d)与SEQ ID NO：46具有至少90％相似性或同一性的GlcK变体序列，其中所述葡萄糖激酶中对应于SEQ ID NO：46的第144位的氨基酸(或所述葡萄糖激酶的第144位的氨基酸)不是甘氨酸，特别地不是脂族氨基酸，特别地是丝氨酸。
27.一种多核苷酸，其编码根据权利要求23至26中任一项所述的嗜热链球菌葡萄糖激酶。
28.一种嗜热链球菌ccpA多核苷酸，其选自由以下组成的组：
a)ccpA多核苷酸，当其代替DGCC7710菌株的ccpA基因插入时，产生表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6的DGCC7710衍生物；以及
b)ccpA多核苷酸，当其代替DSM32587菌株的ccpA基因插入时，产生如下DSM32587衍生物：
-其表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-其释放如通过测试B测定的至少50mM的葡萄糖浓度，或在均通过测试B测定时，释放与所述DSM32587菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度。
29.根据权利要求28所述的嗜热链球菌ccpA多核苷酸，所述ccpA多核苷酸携带选自由以下组成的组的突变：位于所述ccpA基因的编码序列的第1个核苷酸与第270个核苷酸之间的无义突变，和位于所述ccpA基因的编码序列的前四分之一中导致所述ccpA基因的开放阅读框移框的突变，特别是如下多核苷酸，其序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：71中所定义的序列；和b)与SEQ ID NO：71具有至少90％同一性的ccpA变体序列。
30.根据权利要求27所述的多核苷酸和/或根据权利要求28或29所述的多核苷酸用于设计嗜热链球菌菌株的用途。
31.分别编码IIABMan蛋白、IICMan蛋白或IIDMan蛋白的突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的用于分别置换乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株的相应manL基因、manM基因或manN基因的用途，其中所述蛋白的葡萄糖输入活性被降低或消除，所述菌株表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6。
32.根据权利要求31所述的用途，其中表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6的所述乳糖阳性半乳糖阴性的嗜热链球菌菌株是根据权利要求2至13中所定义的菌株中的任一种。
33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因的特征在于：
a)当代替所述DSM32587菌株的所述manL基因、manM基因或manN基因单独插入时，所述DSM32587衍生物：
-表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-在均通过测试B测定时，释放与所述DSM32587菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度；或
b)当代替先前已经用如SEQ ID NO：71中所定义的ccpA基因置换了所述ccpA基因的DGCC7710菌株(即，DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株)的所述manL基因、manM基因或manN基因单独插入时，所述DGCC7710-ccpAΔ1A114-120衍生物：
-表现出通过测试D测定的β-半乳糖苷酶活性相对于通过测试E测定的葡萄糖激酶活性的比率为至少4.10-6；并且
-在均通过测试B测定时，释放与所述DGCC7710-ccpAΔ1A114-120菌株释放的葡萄糖浓度相比增加至少150％或至少200％的葡萄糖浓度。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的用途，其中所述突变的嗜热链球菌manL基因编码在第305位截短的嗜热链球菌IIABMan蛋白(IIABMan 305)，特别是截短的IIABMan 305蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：156中所定义的序列，和b)与SEQ IDNO：156具有至少90％相似性或同一性的IIABMan变体序列，特别是长度为305个氨基酸的序列。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的用途，其中所述突变的嗜热链球菌manM基因编码在第208位截短的嗜热链球菌IICMan蛋白(IICMan 208)，特别是截短的IICMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：202中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO：202具有至少90％相似性或同一性的IICMan变体序列，特别是长度为208个氨基酸的序列。
36.根据权利要求31至33中任一项所述的用途，其中所述突变的嗜热链球菌manN基因编码在第28位截短的嗜热链球菌IIDMan蛋白(IIDMan 28)，特别是截短的IIDMan蛋白，所述蛋白的序列选自由以下组成的组：a)如SEQ ID NO：251中所定义的序列，和b)与SEQ ID NO：251具有至少90％相似性或同一性的IIDMan变体序列，特别是长度为28个氨基酸的序列。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的用途，其中所述突变的嗜热链球菌manL基因、manM基因或manN基因选自由SEQ ID NO：155X、SEQ ID NO：201和SEQ ID NO：250组成的组。
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