CN111511910A

CN111511910A - 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途

Info

Publication number: CN111511910A
Application number: CN201880083193.8A
Authority: CN
Inventors: 郑义骏; 金真荣; 崔仁荣; 郑圣烨
Original assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hanmi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: MX2020006635A; PH12020550927A1; KR20190076909A; KR20230143985A; IL275248A; CN119307474A; AU2018388331A1; SG11202005510SA; US12435328B2; JP7403455B2; CN111511910B; EP3708661A4; KR102588611B1; TWI896518B; EP3708661A1; IL275248B1; BR112020012346A2; IL275248B2; NZ765453A; AU2018388331B2

Abstract

本发明涉及二聚的治疗酶与免疫球蛋白Fc区的融合蛋白、及其制备方法、以及包含其的组合物。

Description

具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及含有二聚的治疗酶的酶融合蛋白、其制备方法、以及含有其的组合物。

背景技术

溶酶体是细胞质细胞器，其具有降解诸如蛋白质、多核苷酸、多糖和脂质等大分子的功能。溶酶体内环境是酸性，其中含有促进生物大分子水解的水解酶。也已经发现溶酶体通过细胞内的内吞作用对分子的吸收起到某种作用。

溶酶体贮积症(以下简称LSD)是以溶酶体功能丧失为特征的遗传性代谢病症。LSD是由降解物质(如脂质、蛋白质、多糖等)的酶的不足引起的，且LSD通常以十万分之一的发生率发生并作为常染色体隐性性状被遗传。当存在特异性降解酶不足或缺少时，LSD就会出现，且当这些降解酶不足时，所产生的过量物质积累而不被降解，最终导致细胞功能出现问题。像许多其他遗传病症一样，LSD遗传自父母。此外，这些疾病中的每种都是由于参与不同酶的翻译的基因中的任何的突变而发生的。引起这些疾病的酶通常具有相似的生化性质，且所有的LSD都是由溶酶体中物质的异常积累引起的。目前，已知约50种不同类型的LSD(例如，尼曼-皮克病、法布里病、戈谢病、亨特综合征、马-拉综合征等)。

法布里病，被称为LSD，是一种鞘糖脂的先天性代谢病症，其是由于溶酶体中存在的水解酶α-半乳糖苷酶A的酶活性的不足或缺少所致。

α-半乳糖苷酶A是将神经酰胺己三糖苷(Gb3)水解成乳糖酰鞘氨醇的酶，且已知α-半乳糖苷酶A的病症导致Gb3在血管壁和身体各部位的异常积累，从而导致法布里病的发生。

治疗这些LSD的代表性方法可能是酶替代疗法(ERT)，并且许多相关研究目前正在进行(Frances M.Platt et al.,J Cell Biol.2012Nov 26；199(5):723to 34)。特别地，由于LSD是由特定酶的遗传缺陷导致的病症，替代疗法对于有缺陷的酶的治疗是必不可少的。酶替代疗法是LSD的标准疗法，且疗法通过替代不足的酶而具有缓解现有症状或延缓疾病进展的作用。

然而，表现出这种治疗作用的蛋白质通常具有较低的稳定性，且因此容易变性和被血液中的蛋白酶分解。因此，要维持这些蛋白的血液浓度和效能，对患者频繁给予是必要的。

然而，在以注射形式向患者给予蛋白质药物的情况下，频繁注射以维持活性多肽的血液浓度可能会给患者造成显著的痛苦。为了解决这些问题，一直在努力通过提高治疗酶的血液稳定性，并使其血液浓度在较长时间段维持在较高水平，以最大化药理学功效。需要这种治疗酶的长效制剂来增加治疗酶的稳定性，并同时将药物本身的效能维持在足够高的水平，以及在患者中不引起免疫反应。

因此，需要开发对目标疾病具有治疗作用的治疗剂，其中在体内稳定地增加融合蛋白的持续时间的同时维持融合蛋白的活性。

发明内容

[技术问题]

本发明的目的是提供下式1的酶融合蛋白：

[式1]

其中X和X′各自独立地为相同或不同种类的治疗酶；

L和L'是接头，各自独立地为相同或不同种类的接头；

F是免疫球蛋白Fc区；

|是共价键；和

:是共价键或非共价键。

本发明的另一目的是提供含有酶融合蛋白的用于预防或治疗LSD的药物组合物。

本发明的又一目的是提供编码酶融合蛋白的多核苷酸。

本发明的又一目的是提供含有多核苷酸的表达载体。

本发明的又一目的是提供其中引入表达载体的转化体。

本发明的又一目的是提供制备酶融合蛋白的方法，其包括培养转化体以获得培养物；以及从培养物中回收酶融合蛋白。

[发明的有益效果]

本发明涉及含有二聚的治疗酶的融合蛋白，且更具体地，涉及酶融合蛋白，其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，使得治疗酶具有增加的稳定性且通过肾脏的酶移除机制被降低。本发明的酶融合蛋白由于增加的持续时间，能够被患者有效地使用。另外，本发明的酶融合蛋白含有二聚的治疗酶，以及因此可以减少制备步骤，且生产成本可被降低。

附图说明

图1显示了示例α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的活性的测量结果。

图2显示了阿加糖酶(agalsidase)-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之间的体外酶活性的比较结果。

图3显示了示例阿加糖酶-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之间的体外细胞内吸收活性的比较结果的图表。

图4显示了示例阿加糖酶-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白之间的药动学行为的比较结果的图表。

[技术方案]

本发明的一方面提供了酶融合蛋白，其中治疗酶和免疫球蛋白Fc区被融合在一起。

在本发明的具体实施方式中，酶融合蛋白可以由下式1表示：

[式1]

其中X和X′各自独立地为相同或不同种类的治疗酶；

L和L'是接头，各自独立地为相同或不同种类的接头；

F是免疫球蛋白Fc区；

|是共价键；和

:是共价键或非共价键。

在根据前述具体实施方式的酶融合蛋白中，治疗酶可通过非共价键形成二聚体。

在根据前述具体实施方式中的任一项的酶融合蛋白中，治疗酶可以以彼此反向平行构型形成二聚体。

在根据前述具体实施方式中的任一项的酶融合蛋白中，与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，酶融合蛋白可以增加稳定性和降低对溶酶体受体的结合亲和力。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，酶可选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、和髓过氧化物酶。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，酶可以是α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以在天然免疫球蛋白Fc区的至少一个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变化。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，在具有SEQ ID NO:8的氨基序列的免疫球蛋白Fc区中，第2个氨基酸可以被脯氨酸取代；第71个氨基酸被谷氨酰胺取代；或者第2个氨基酸可以被脯氨酸取代且第71个氨基酸可以被谷氨酰胺取代。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，在免疫球蛋白Fc区中可能不会发生链交换。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区域可选自：

(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；

(b)CH1结构域和CH2结构域；

(c)CH1结构域和CH3结构域；

(d)CH2结构域和CH3结构域；和

(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多个结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分之间的组合。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以是单体的形式。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以由铰链区域、CH2结构域和CH3结构域组成。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，在免疫球蛋白Fc区中：

可以移除能够形成二硫键的区；

可以在天然Fc的N-末端移除某个氨基酸残基；

可以在天然Fc形式的N-末端添加甲硫氨酸残基；

可以移除补体结合位点；或

可以缺失抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以是非糖基化的。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以是具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源的结构域的杂化物。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，免疫球蛋白Fc区可以是IgG4Fc区。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，IgG4 Fc区的铰链区可以被IgG1铰链区取代。

在根据前述具体实施方式中任一项的酶融合蛋白中，酶融合蛋白可以包括SEQ IDNO:13的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了含有酶融合蛋白的用于预防或治疗LSD的药物组合物。

在根据具体实施方式的组合物中，LSD可选自粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积症、鞘脂贮积症、尼曼-皮克病、法布里病、戈谢病、亨特综合征、和马-拉综合征。

在根据前述具体实施方式的组合物中，组合物可降低酶对溶酶体受体的结合亲和力。

本发明的又一方面提供编码酶融合蛋白的多核苷酸。

本发明的又一方面提供含有多核苷酸的表达载体。

本发明的又一方面提供其中引入了表达载体的转化体。

本发明的又一方面提供制备酶融合蛋白的方法。

在根据具体实施方式的制备酶融合蛋白的方法中，方法可包括培养转化体以获得培养物；以及从培养物回收酶融合蛋白。

具体实施方式

下面详细描述优选实施方式。同时，本公开中公开的各个描述和实施方式也可应用于其它描述和实施方式。也就是说，本公开中公开的各种要素的所有组合都落入本发明的范围内。进一步，本发明的范围不受以下具体描述的限制。

此外，本领域技术人员将能够基于常规实验认识到或确认本申请中描述的本发明的具体实施方式的许多等同物，并且这些等同物意图被包括在本发明中。

贯穿整个说明书，不仅使用用于天然存在的氨基酸的常规一字母或三字母编码，而且使用通常允许用于其它氨基酸的那些三字母编码，例如α-氨基异丁酸(Aib)、Sar(N-甲基甘氨酸)、α-甲基-谷氨酸等。此外，本文中以缩写提到的氨基酸根据IUPAC-IUB规则被描述如下：

本发明的一方面提供如下式1的酶融合蛋白；

[式1]

其中X和X′各自独立地为相同或不同种类的治疗酶；

L和L'是接头，各自独立地为相同或不同种类的接头；

F是免疫球蛋白Fc区；

|是共价键；和

:是共价键或非共价键。

如本文所用，术语“酶融合蛋白”可指其中免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合的蛋白，使得与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，治疗酶可维持其活性，同时其与溶酶体受体的结合亲和力降低，从而增加了其血液半衰期。本发明的酶融合蛋白可以用作酶替代治疗(ERT)的药物。酶替代疗法可以通过补充引起疾病的缺陷的酶或不足的酶来恢复退化的酶的功能，来预防或治疗疾病。

本发明人已经制备了具有免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，以增加治疗酶的血液半衰期。特别地，作为Fc区，使用了IgG4 Fc类似物，其中潜在的糖基化序列被取代以抑制糖基化，并且另外地IgG4 Fc的铰链序列被取代以抑制链交换。

另外地，确认了在制备本发明的酶融合蛋白时，当与免疫球蛋白Fc区融合的各治疗酶形成二聚体，特别地是以反向平行构型连接的二聚体时，可以在维持治疗酶活性的同时增加酶融合蛋白的体内持续时间，并且此外，可以减少酶融合蛋白的制备步骤，从而使高效的生产成为可能。

由此，本发明的酶融合蛋白与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶相比，具有的优点在于增加酶的稳定性的同时，能够维持酶的活性，并且能够降低生产成本。

如本文所用，术语“治疗酶”是指用于治疗由于酶的缺少、不足、功能障碍等而发生的疾病的酶，并且酶可以通过酶替代治疗、给予等来治疗患有疾病的受试者。具体地，酶可以是用于治疗可能由于溶酶体酶的缺少、不足等而发生的LSD的酶，但是酶不限于此。

本发明的酶融合蛋白中包括的治疗酶没有特别的限制，但是可以包括与未融合免疫球蛋白Fc区的治疗酶类型相比具有延长的体内持续时间的优点的任何治疗酶。在本发明的示例性实施方式中，酶融合蛋白是治疗酶的融合蛋白。

本发明的酶融合蛋白中包括的治疗酶可以是通过非共价键形成二聚体的酶，但治疗酶不限于此。具体地，当融合蛋白在转化体中表达且免疫球蛋白Fc区形成二聚体时，治疗酶可形成二聚体。

这种治疗酶的二聚体可以是由彼此相同的两种酶形成的二聚体，或也可以是由两种不同的酶形成的二聚体。只要这些酶在体内具有期望的活性，构成二聚体的酶的具体种类并不受限制。

同时，这些构成二聚体的治疗酶依据它们被连接的方向可以是平行二聚体或反向平行二聚体的形式，但是治疗酶不限于此。

在本发明的示例性实施方式中，制备了其中α-半乳糖苷酶(即，治疗酶)与免疫球蛋白Fc区融合的融合蛋白，并且确认了α-半乳糖苷酶通过非共价键形成反向平行二聚体，同时融合蛋白的免疫球蛋白Fc区形成二聚体。此外，确认了即使在融合蛋白与免疫球蛋白Fc区融合的状态下，融合蛋白也可维持酶的活性(实施例2)。

在本发明的另一个示例性实施方式中，比较了其中α-半乳糖苷酶与免疫球蛋白Fc区融合的融合蛋白和未融合免疫球蛋白Fc区的阿加糖酶-β。结果，确认了即使与Fc区融合，融合蛋白仍维持体外酶活性和细胞内吸收活性(实施例2和3)，并且还确认这些融合蛋白由于与Fc区融合而具有优良的药动学行为(实施例4)。

如本文所用，术语“平行二聚体”是指当各单体形成二聚体时，各单体的氨基酸序列的N-末端和C-末端沿相同方向形成二聚体。特别地，二聚体可以通过非共价键或共价键形成，但平行二聚体形成的方法不限于此。

如本文所用，术语“反向平行二聚体”是指当各单体形成二聚体时，各单体的氨基酸序列的N-末端和C-末端以彼此不同的方向形成二聚体。特别地，二聚体可以通过非共价键或共价键形成，但是反向平行二聚体形成的方法不限于此。

换言之，在本发明的酶融合蛋白中，有可能(i)一种治疗酶(X)的N-末端和另一种治疗酶(X')的N-末端可以以相同方向形成二聚体；(ii)一种治疗酶(X)的C-末端和另一种治疗酶(X')的C-末端可以以相同方向形成二聚体；(iii)一种治疗酶(X)的N-末端和另一种治疗酶(X')的C-末端可以以相同方向形成二聚体；或者(iv)一种治疗酶(X)的C-末端和另一种治疗酶(X')的N-末端可以以相同方向形成二聚体。情况(i)和(ii)中的二聚体称为平行二聚体，以及情况(iii)和(iv)中的二聚体称为反向平行二聚体。这些二聚体的形成可以通过共价键或非共价键，但二聚体的形成不限于此。

具体地，在上述二聚体的形成中，平行二聚体或反向平行二聚体的形成可以是这样的，随着免疫球蛋白Fc区形成二聚体，与其连接的单体的α-半乳糖苷酶A通过共价键或非共价键形成二聚体。

关于含有本发明的反向平行构型的二聚的治疗酶的融合蛋白，制备该融合蛋白的过程的优异的优点在于它可以减少制备步骤的数量，从而降低生产成本，并且可以维持酶活性，同时降低由于体内pH变化导致的二聚体类型的不稳定性。

本发明的治疗酶可以是选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、和髓过氧化物酶的治疗酶。本发明的治疗酶可以是人来源的酶，但是不管酶的来源或种类，任何对LSD具有治疗作用的治疗酶都可以不受限制地被包括在本发明中。

更具体地，酶可以是α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。

如本文所用，术语“α-半乳糖苷酶A”是存在于脾、脑、肝等的溶酶体中的酶，其水解糖脂和糖蛋白中的末端α-半乳糖基部分，并且是同型二聚的糖蛋白。具体地，已知α-半乳糖苷酶A水解神经酰胺三己糖苷，催化蜜二糖水解成半乳糖和葡萄糖，且特别地，已知与法布里病(LSD)有关。

在本发明中，α-半乳糖苷酶A可以与阿加糖酶-α或阿加糖酶-β(即重组型)互换使用，并且不管其序列、来源、制备方法等如何，具有等同活性并且表现出对LSD的治疗作用的任何酶都可以不受限制地被包括在本发明的范围内。具体地，α-半乳糖苷酶可以由SEQ IDNO:5的多核苷酸序列编码，并且可以包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列，但是α-半乳糖苷酶的序列不限于此。

本发明的酶融合蛋白中包括的治疗酶可以是天然存在的类型和由治疗酶的一部分组成的片段，或者其中发生了选自一些氨基酸的取代、添加、缺失、和修饰及其组合的变化的治疗酶的类似物，只要其具有与治疗酶的天然存在类型的活性等同的活性，可以不受限制地被包括在本发明中。

此外，治疗酶的类似物包括其中将一个或多个氨基酸被添加到天然存在类型的治疗酶的氨基末端和/或羧基末端的所有那些。

对于氨基酸的取代或添加，不仅可以使用人体蛋白质中常见的20种氨基酸，也可以使用非典型或非天然存在的氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可以包括Sigma-Aldrich、ChemPep Inc.、Genzyme Pharmaceuticals等。包括这些氨基酸和非典型肽序列的肽可以被合成和从商业供应商(例如American peptide Company、Bachem(美国)、或Anygen(韩国))购买，但商业来源不限于此。

如本文所用，术语“片段”指移除天然治疗酶或天然治疗酶的类似物的氨基末端或羧基末端的一个或多个氨基酸的形式。不管片段的大小或氨基酸的种类如何，只要它们具有治疗酶的活性，天然治疗酶或其类似物属于本发明的范围。

治疗酶类似物可包括相应治疗酶的生物仿制药(biosimilars)和生物改良药(biobetters)。例如，关于生物仿制药，考虑到已知治疗酶与表达其的宿主的差异、糖基化特征及其程度的差异、以及按照标准序列，在取代程度不是100％取代的情况下，对应酶的特定氨基酸残基中的取代程度的差异，它们属于被用作本发明的酶融合蛋白的生物类似酶。治疗酶可以通过本领域已知的方法，具体地通过遗传重组在动物细胞、大肠杆菌(E.coli)、酵母、昆虫细胞、植物细胞、活体动物等中生产，并且制备方法不限于此，并且可以购买和使用商业可获得的酶，但是酶不限于此。

此外，治疗酶可以包括与上述酶或其类似物具有至少60％、70％或80％，更具体地90％，且甚至更具体地91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％、或更高同源性的氨基酸序列，并且治疗酶可以通过重组技术从微生物获得或是商业可获得的酶，但治疗酶不限于此。

如本文所用，术语“同源性”表示与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列的相似程度，并且同源性比较可以通过肉眼或使用易于购买的比较程序进行。两个或更多序列之间的同源性可以使用商业计算机程序以百分比(％)计算。可以对相邻序列计算同源性(％)。

对于治疗酶或其类似物的序列和编码其的核苷酸序列的信息可从已知数据库(例如，NCBI等)获得。

治疗酶可以通过本领域已知的方法制备或制造，且具体地，酶可以在培养其中插入了动物表达载体的动物细胞后从培养物中纯化，或者可以在购买可商业获得的酶后使用，但酶不限于此。

本发明的酶融合蛋白可以是其中治疗酶和免疫球蛋白Fc区通过肽接头融合的蛋白。即，式1的L或L’可以是肽接头，但只要它们可将免疫球蛋白Fc区与治疗酶融合，L或L’没有特别地限制。

肽接头可以包括至少一个氨基酸，例如1至1,000个氨基酸，本领域已知的任何肽接头(例如，包括[GS]_x接头、[GGGS]_x接头、和[GGGGS]_x接头等，其中x是1或更大的自然数(例如，1、2、3、4、5或更大)，但肽接头不特别限于此。具体地，本发明的肽接头可以由10至50个氨基酸序列，且更具体地，可以由20至40个氨基酸序列组成，并且可以由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成。

为了本发明的目的，只要肽接头能够连接治疗酶和免疫球蛋白Fc，同时维持治疗酶的活性，肽接头与治疗酶和免疫球蛋白Fc融合的位置不受限制，具体地，治疗酶和免疫球蛋白Fc区的两端，且更具体地，治疗酶的C-末端和免疫球蛋白Fc区的N-末端，但位置不限于此。

如本文所用，术语“N-端”和“C-端”分别指蛋白质的氨基端和羧基端。例如，“N-末端”或“C-末端”不仅可以包括N-末端或C-末端的最末端氨基酸残基，还可以包括与N-末端或C-末端的氨基酸残基相邻的氨基酸残基，且具体地，是从末端本身开始的第1个氨基酸残基至第20个氨基酸残基，但N-末端或C-末端不限于此。

在本发明的一个实施方式中，经由合成制备了融合蛋白(SEQ ID NO:13)，其中IgG4的N-末端被融合到治疗酶的C-末端，使得α-半乳糖苷酶(治疗酶)在基因水平上被融合到接头-IgG4，并且已确认了融合蛋白在融合蛋白被转化到其中的转化体中被表达(实施例2)。

在本发明中，肽接头可以是连接到由单体的免疫球蛋白Fc区形成的二聚体的每个免疫球蛋白Fc区的接头，且连接到每个免疫球蛋白Fc区的接头可以是相同的或不同的种类。

作为本发明的酶融合蛋白的部分的免疫球蛋白Fc区可以是在各单体的免疫球蛋白Fc区之间形成了二聚体的免疫球蛋白Fc区。

如本文所用，术语“免疫球蛋白Fc区”是指免疫球蛋白分子的区，其包括重链恒定区2(CH2)和/或重链恒定区3(CH3)，不包括重链和轻链的可变区。为了本发明的目的，这样的免疫球蛋白Fc区可以包括修饰铰链区，但不限于此。具体地，免疫球蛋白Fc区可以是在天然免疫球蛋白Fc区的至少一个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变化的免疫球蛋白Fc区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。

免疫球蛋白Fc区是在制备药物中用作载体的物质，且为了稳定蛋白并防止其从肾脏被移除，近来正积极开展利用免疫球蛋白Fc区的融合蛋白研究。免疫球蛋白是血液的主要成分，且有五种不同类型(即，IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)。在融合蛋白研究中最常用的类型是IgG，且它被分为四个亚型。利用免疫球蛋白Fc制备的融合蛋白可以增加蛋白的大小，且从而防止它们在肾脏中的移除，并且还可以与FcRn受体结合，以及从而通过内吞作用和循环进入细胞而具有增加血液半衰期的作用。

这样的免疫球蛋白Fc区可以包括重链恒定区中的铰链区，且单体的免疫球蛋白Fc区可以由于铰链区形成二聚体，但是免疫球蛋白Fc区不限于此。此外，只要免疫球蛋白Fc区具有与其天然类型相同或更好的效果，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是包括重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)的全部或部分的扩展的Fc区，不包括免疫球蛋白的重链和轻链的可变区。此外，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中与CH2和/或CH3相对应的显著长的氨基酸序列的一部分被移除的区。

具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是选自(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、和CH4结构域；(b)CH1结构域和CH2结构域；(c)CH1结构域和CH3结构域；(d)CH2结构域和CH3结构域；以及(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区或铰链区的一部分之间的组合的免疫球蛋白Fc区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。更具体地，免疫球蛋白Fc区可以是由铰链区、CH2结构域、和CH3结构域组成的免疫球蛋白Fc区，但是免疫球蛋白Fc区不限于此。

在实施方式中，铰链区可以是其中具有以下氨基酸序列的铰链序列的一部分被缺失或修饰的铰链区。

Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(SEQ ID NO:14)

具体地，铰链区可以是具有变化的铰链区，其中铰链区的一部分被缺失以仅包括一个半胱氨酸(Cys)残基；或者可以是参与链交换的丝氨酸(Ser)残基被脯氨酸(Pro)残基取代的铰链区，且更具体地，是其中铰链序列的第2个丝氨酸被脯氨酸残基取代的铰链区，但铰链区不限于此。

在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以通过包括其天然形式的铰链区或修饰铰链区来防止Fc区中的链交换和单体的形成的同时，增加融合的治疗酶的稳定性。

在本发明中，免疫球蛋白Fc区可以是单体的形式，但免疫球蛋白Fc区不限于此。具体地，上述式1中表示为F的免疫球蛋白Fc区可以是单体形式，并通过肽接头与单体的治疗酶融合而表达。随着免疫球蛋白Fc区的单体形成二聚体，与免疫球蛋白Fc区融合的治疗酶可以通过非共价键形成二聚体，但不限于此。

用作药物载体的免疫球蛋白Fc区的缺点在于，其可引起意外的免疫应答，例如具有效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。这些功能通过免疫球蛋白Fc区与Fc受体或补体的结合、或Fc区的糖基化而发生。此外，极有可能在体内发生Fc本身的不稳定性。

在本发明中，本发明人已经努力通过取代免疫球蛋白Fc区中铰链区的序列来解决上述问题。具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中有效的糖基化序列被取代用于糖基化的调节或参与链交换的序列被取代的免疫球蛋白Fc区，或者可以对应于这两种情况。更具体地，本发明的酶融合蛋白的免疫球蛋白Fc区可以是其中不发生链交换的免疫球蛋白Fc区。

具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是其中为了防止链交换和N-糖基化，SEQID NO:8的免疫球蛋白Fc区的第2个氨基酸和/或第71个氨基酸被不同氨基酸取代的免疫球蛋白Fc区。更具体地，本发明的免疫球蛋白Fc区可以是1)其中第2个氨基酸(即丝氨酸)被脯氨酸取代的免疫球蛋白Fc区，2)其中第71个氨基酸(即天冬酰胺)被谷氨酰胺取代的免疫球蛋白Fc区，或3)其中第2个氨基酸被脯氨酸取代且第71个氨基酸被谷氨酰胺取代的免疫球蛋白Fc区，且具体地是由SEQ ID NO:9的氨基酸序列代表的免疫球蛋白Fc区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。除了上面描述的变化之外，免疫球蛋白Fc区作为用于增加治疗酶的稳定性的药物载体可以包括的适当变化。

具体地，免疫球蛋白Fc区可以是其中免疫球蛋白IgG4 Fc的铰链区被IgG1铰链区取代的免疫球蛋白Fc区，但免疫球蛋白Fc区不限于此。

在本发明的实施方式中，免疫球蛋白Fc的第2个氨基酸被脯氨酸取代，并且免疫球蛋白Fc的第71个氨基酸被谷氨酰胺取代，以及从而减少了链交换和N-糖基化(实施例1)。

如本文所用，术语“链交换”是指其中当IgG4 Fc被用作蛋白融合体的载体时，IgG4Fc与体内存在的IgG4形成杂化物或作为单体存在，并且改变原始结构以具有低治疗活性的结构的问题，并且先前报道了当其中融合了蛋白质的蛋白融合体用于治疗目的时，存在显著困难(van der Neut Kolfschoten,等人,Science,317:1554至1557.2007)。

此外，在另一个具体实施方式中，本发明的免疫球蛋白Fc区不仅包括天然氨基酸序列，而且包括其序列类似物。氨基酸类似物是指在天然氨基酸序列的至少一个氨基酸残基中发生了选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变化。

例如，IgG Fc中已知对连接重要的在214至238、297至299、318至322、或327至331位置的氨基酸残基可以用作适于变化的位点。

此外，各种类型的类似物是可能的，例如，其中能够形成二硫键的位点被移动的类似物；其中几个N-末端氨基酸从天然Fc被移除的类似物；其中甲硫氨酸残基被添加到天然Fc的N末端的类似物等。另外，可以移除补体结合位点(例如，C1q结合位点)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点以移除效应子功能。制备免疫球蛋白Fc区的序列类似物的技术公开在国际公开号WO 97/34631、WO 96/32478等中。

不改变分子全部活性的蛋白质或肽分子中的氨基酸取代是本领域公知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的取代发生在Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly的氨基酸残基之间。在一些情况下，氨基酸可能通过磷酸化、硫酸化、丙烯酸化、糖基化、甲基化、法尼基化、乙酰化、酰胺化等被修饰。

此外，上面描述的Fc类似物可以是那些表现出与本发明的Fc区相同的生物活性，但具有Fc区对热、pH等增加的结构稳定性。

此外，这样的Fc区可以从人或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)分离的天然类型获得，或者可以是从转化的动物细胞或微生物获得的重组体或其类似物。在本文，Fc区可以通过从人或动物生物体分离完整的免疫球蛋白并用蛋白酶处理它们而从天然Fc获得。木瓜蛋白酶将天然Fc区消化成Fab和Fc区，并且胃蛋白酶处理导致pF’c和F(ab)₂片段的产生。这些片段可进行尺寸排阻色谱以分离Fc或pF’c。在更具体的实施方式中，Fc区可以是重组免疫球蛋白Fc区，其中人源Fc区从微生物获得。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是天然聚糖的形式、与其天然类型相比增加或减少的聚糖的形式、或者是去糖基化或非糖基化的形式。免疫球蛋白Fc聚糖的增加、减少或移除可以通过常规方法(如化学方法、酶法和使用微生物的基因工程方法)实现。特别地，从Fc区移除聚糖的免疫球蛋白Fc区显示出对补体(C1q)的结合亲和力的显著降低，以及抗体依赖性细胞毒性或补体依赖性细胞毒性的降低或移除，且因此它不会在体内诱导不必要的免疫应答。在这方面，去糖基化或非糖基化的免疫球蛋白Fc区中的免疫球蛋白Fc区可以是更合适的形式以满足作为药物载体的本发明原始目的。

如本文所用，术语“去糖基化”是指通过酶从Fc区移除糖部分，和术语“非糖基化”是指在原核生物(更具体地，大肠杆菌)中产生的未糖基化(unglycosylated)的Fc区。

同时，免疫球蛋白Fc区可源自人或动物(例如，牛、山羊、猪、小鼠、兔、仓鼠、大鼠、豚鼠等)，并且在更具体的实施方式中，其可源自人。

此外，免疫球蛋白Fc区可以是源自IgG、IgA、IgD、IgE、IgM、或其组合或其杂化物的Fc区。在更具体的实施方式中，它可以源自IgG或IgM，它们是人血液中最丰富的蛋白质，并且在甚至更具体的实施方式中，它可以源自IgG，已知其增强配体结合蛋白的半衰期。在更具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区可以是IgG4 Fc区，在甚至更具体的实施方式中，它可以是源自人IgG4的非糖基化Fc区，并且在最具体的实施方式中，免疫球蛋白Fc区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9，以及编码氨基酸序列的多核苷酸序列可以是SEQ ID NO:7，但是免疫球蛋白Fc区不限于此。

如本文所用，术语“组合”是指编码相同来源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽被连接到不同来源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。即，二聚体或多聚体可由选自IgG Fc、IgAFc、IgM Fc、IgD Fc、和IgE Fc的Fc片段的两个或更多个片段制备。

此外，本发明的治疗酶或酶融合蛋白可以是其中蛋白质的N-末端和/或C-末端未被修饰的那些，但是，为了保护治疗酶不受蛋白酶的影响和提高治疗酶在体内的稳定性，治疗酶的N-末端和/或C-末端被化学修饰或被有机基团保护，或者治疗酶的氨基末端被氨基酸的添加等修饰的那些治疗酶或酶融合蛋白也被包括在根据本发明的蛋白质的范围内。治疗酶的C-末端未被修饰时，根据本发明的治疗酶或酶融合蛋白的末端可以具有羧基末端，但是本发明的治疗酶或酶融合蛋白不特别限于此。

特别地，由于化学合成的蛋白质的N-末端和C-末端具有电荷，因此可以对N-末端进行乙酰化和/或对C-末端进行酰胺化以移除这些电荷，但方法并不特别限于此。

除非在本说明书中另有说明，否则在本发明的具体描述或权利要求中描述的关于根据本发明的“酶”或“融合蛋白”的技术将不仅应用于相关酶或融合蛋白，而且应用于包括相关酶或融合蛋白的所有盐(例如，融合蛋白的药学上可接受的盐)、或其溶剂化物的范围。因此，尽管在说明书中被简单地描述为“酶”或“融合蛋白”，但相关描述同样将应用于特定盐、特定溶剂化物、以及特定盐的特定溶剂化物。这样的盐形式可以是例如使用任何药学上可接受的盐的形式，但是盐的种类没有特别地限制。那些盐形式可以是例如对哺乳动物安全有效的盐形式，但盐形式不特别限于此。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在医药决策的范围内，可有效地用于预期用途而不会引起过度毒性、刺激或变态反应等的物质。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的无机盐、有机盐、或碱的盐。合适的酸的实例可包括盐酸、溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。源自合适碱的盐的实例可包括碱金属，如钠、钾等；碱土金属，如镁等；铵等。

此外，如本文所用，术语“溶剂化物”是指溶剂分子和根据本发明的酶、融合蛋白、或其盐之间形成的复合物。

本发明的酶融合蛋白可以通过本领域已知的方法制备。

在本发明的实施方式中，制备了其中α-半乳糖苷酶(即，治疗酶)可以以融合到肽接头-免疫球蛋白Fc的形式表达的重组载体，并且通过在CHO细胞系中将其表达来制备了治疗酶(实施例1和2)。

然而，本发明的酶融合蛋白可以通过上述实施方式中描述的那些以外的方法制备。本发明的酶融合蛋白可以包括SEQ ID NO:13的氨基酸序列，但氨基酸序列不限于此。

根据本发明的酶融合蛋白可通过经由治疗酶与免疫球蛋白Fc区的融合，在维持治疗酶活性的同时提高治疗酶的体内稳定性，来增加对LSD表现治疗作用的治疗酶的半衰期。特别地，与修饰的免疫球蛋白Fc区融合的治疗酶具有减少的链交换和糖基化，且因此与Fc未融合的治疗酶相比，可以具有对于溶酶体受体更低的结合亲和力，并且从而可以具有高持续时间，确认这种治疗酶对于LSD的治疗是有效的。

本发明的又一方面提供了用于预防或治疗LSD的药物组合物，药物组合物含有酶融合蛋白作为活性成分。

根据本发明的组合物特征在于增加了治疗酶的体内持续时间和稳定性。

具体地，本发明的药物组合物的酶融合蛋白可以是其中α-半乳糖苷酶A和免疫球蛋白Fc区融合在一起的酶融合蛋白，但酶融合蛋白不限于此。

另外，根据本发明的组合物可以其中是当免疫球蛋白Fc区形成二聚体时，融合蛋白中的α-半乳糖苷酶A(即，治疗酶)也可以形成二聚体的组合物，且更具体地，α-半乳糖苷酶A的二聚体是由彼此非共价键形成的二聚体，且特别地，其特征在于以反向平行取向形成二聚体。

如本文所用，术语“溶酶体”是存在于细胞质中的细胞器之一，含有许多水解酶，且因此分解体内不需要的物质(如大分子、细菌等)，并有助于分解产物在细胞的其它部分中的利用。溶酶体的功能可以由许多酶来执行。当特定的酶由于变化、不足等而丧失其功能时，它引起溶酶体的分解功能的丧失，并导致必须被分解的大分子等在细胞内积聚，并诱导细胞损伤等，从而引起疾病。

如本文所用，术语“溶酶体贮积症(LSD)”是指由于上面描述的溶酶体功能丧失而引起的罕见遗传病，并且使用缺陷酶的酶替代疗法是必要的。LSD可包括粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积症、鞘脂贮积症、尼曼-皮克病、法布里病、戈谢病、亨特综合征、和马-拉综合征等。

如本文所用，术语“法布里病”是LSD，作为与性染色体相关的隐性形式被遗传，并由X-失活引起。法布里病是先天性鞘糖脂代谢病症，其是由于溶酶体中存在的水解酶α-半乳糖苷酶A的活性的缺少或不足而发生。已知α-半乳糖苷酶A的缺陷会导致神经酰胺己三糖苷(Gb3)在血管壁和身体各部分(例如皮肤、肾脏、心脏、神经系统等)中的异常积累，且从而影响血液循环并减少营养供应。无汗症(缺少出汗)、感觉异常、剧烈疼痛、心绞痛角化瘤、角膜混浊、心脏缺血、心肌梗死、肾衰竭等症状可能表现出来，导致肾衰竭，并最终导致死亡。

如本文所用，术语“预防”是指通过给予酶融合蛋白或含有酶融合蛋白的组合物，抑制或延迟LSD的发生的所有行为，而术语“治疗”是指通过给予酶融合蛋白或含有酶融合蛋白的组合物，改善或有利地改变LSD症状的所有行为。

如本文所用，术语“给予”是指通过任何适当的方法将特定物质引入患者内，并且组合物的给予途径可以是能够将组合物递送至体内目标的任何常规途径，例如，腹膜内给予、静脉内给予、肌肉内给予、皮下给予、皮内给予、口服给予、局部给予、鼻内给予、肺内给予、直肠内给予等。然而，由于肽在口服给予时被消化，因此用于口服给予的组合物的活性成分优选被包衣或配制以防止在胃中降解，并且具体地，可以以可注射形式给予。另外，药物组合物可以使用能够将活性成分输送到靶细胞中的某种装置被给予。

本发明的药物组合物的总有效剂量可以以单剂量向患者给予，或者可以根据分次治疗方案(fractionated treatment protocol)以多剂量(multiple doses)长时间段给予。在本发明的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾病严重程度而变化。具体地，本发明的融合蛋白的总日剂量可以是患者每1千克体重约0.0001mg至500mg。然而，除了考虑药物组合物的给予途径和治疗频率外，还考虑包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食、排泄率等多种因素来确定融合蛋白的有效剂量。在这方面，本领域技术人员可以容易地确定适合于本发明药物组合物特定用途的有效剂量。只要其显示本发明的效果，根据本发明的药物组合物不特别限于制剂、给予途径和方法。

在本发明中，作为载体使用的酶融合蛋白的实际剂量可以与诸如待治疗的疾病、给予途径、患者的年龄、性别和体重、疾病的严重程度等各种因素一起基于作为活性成分使用的治疗酶的类型来确定。由于本发明的酶融合蛋白具有显著优异的体内持续时间，所以可以显著减少含有本发明的酶融合蛋白的药物制剂的给予剂量、次数和频率。

本发明的药物组合物可进一步含有药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。药学上可接受的载体可以是非天然存在的。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指具有足够量以表现治疗作用而不引起不利影响的性质，并且本领域技术人员可以基于医学领域中公知的要素(如疾病种类、患者的年龄、重量、健康状况、性别、药物敏感性、给予途径、给予方法、给予频率、治疗持续时间、待混合或同时给予的药物(一种或多种)等)容易地确定。

药学上可接受的载体可包括：对于口服施用，粘合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂、调味剂等；对于注射，缓冲剂、保藏剂、止痛剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等，其可被组合以使用；以及对于局部给予，基质、赋形剂、润滑剂、保藏剂等。

本发明组合物的制剂类型可以通过与上面描述的药学上可接受的载体组合而多种不同地制备。例如，对于口服给予，组合物可被配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafer)等；对于注射，组合物可配制成单位剂量的安瓿或多剂量的容器。此外，组合物还可以被配制成溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂等。

同时，合适的载体、赋形剂和稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。另外，组合物可进一步含有填料、抗凝剂、润滑剂、湿润剂、调味剂、防腐剂等。

此外，酶融合蛋白可以通过与批准为药物的各种药学上可接受的载体(如生理盐水或有机溶剂)混合来使用。为了增加稳定性或吸收性，碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)，以及抗氧化剂(如抗坏血酸和谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质、或其它稳定剂可用作药物。

药物组合物可以含有0.01％至99％(w/v)的量的上述成分(活性成分)，但量不限于此。

本发明的又一方面提供编码根据本发明的酶融合蛋白的多核苷酸。

编码根据本发明的酶融合蛋白的多核苷酸可以是，编码治疗酶的部分和编码肽接头—免疫球蛋白Fc区的部分被连接的形式的多核苷酸，且具体地，是编码其中免疫球蛋白Fc区的N末端通过GGGGS接头与治疗酶的C末端连接的融合蛋白的多核苷酸，但多核苷酸不限于此。更具体地，本发明的多核苷酸可以包括SEQ ID NO:12的序列，但只要多核苷酸能够编码治疗酶和免疫球蛋白Fc区的融合蛋白，该序列不限于此。

本发明的又一方面提供了包括多核苷酸的重组表达载体。

如本文所用，术语“重组载体”是指其中靶肽(例如，酶融合蛋白)可操作地被连接到适当的控制序列以使靶肽(例如，酶融合蛋白)能够在适当的宿主中表达的DNA构建体。根据本发明的重组载体可以被构建为用于典型克隆的载体或用于表达的载体，并且可以被构建使用原核细胞或真核细胞作为宿主细胞。

控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制转录的任何操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合域的序列、以及控制转录和翻译终止的序列。重组载体在转化到合适的宿主细胞后，可以与宿主基因组无关地被复制或起作用，或者可以被整合到宿主基因组本身中。

本发明中使用的重组载体没有特别地限制，只要载体能够在宿主细胞中复制，并且其可以使用本领域已知的任何载体构建。载体的实例可包括天然或重组质粒、粘粒、病毒和噬菌体。可用于本发明的载体没有特别限制，但可以使用任何已知的表达载体。

重组载体用于宿主细胞的转化以产生本发明的酶融合蛋白。此外，作为本发明的一部分，这些转化的细胞可以用于核酸片段和载体的扩增，或者它们可以是本发明的酶融合蛋白的重组生产中使用的培养的细胞或细胞系。

如本文所用，术语“转化”是指将包括编码靶蛋白(例如，治疗酶、酶融合蛋白)的多核苷酸的重组载体引入到宿主细胞中，从而使由多核苷酸编码的蛋白能够在宿主细胞中表达的过程。对于转化的多核苷酸，只要其能在宿主细胞中表达，无论其被插入宿主细胞的染色体中并位于其中或位于染色体外并不重要，且这两种情况均被包括在内。

此外，多核苷酸包括编码靶蛋白的DNA和RNA。只要多核苷酸能被引入到宿主细胞中并在其中表达，其可以以任何形式插入。例如，多核苷酸可以以表达盒的形式被引入到宿主细胞中，表达盒是包括自我表达所需的所有必需元件的基因构建体。表达盒可常规地包括可操作地连接到多核苷酸的启动子、转录终止信号、核糖体结合结构域、和翻译终止信号。表达盒可以是能够自我复制的表达载体的形式。此外，多核苷酸可以原样被引入到宿主细胞中并可操作地连接到其在宿主细胞中表达所必要的序列，但多核苷酸不限于此。

此外，如本文所用，术语“可操作地连接”是指启动子序列(其启动并介导编码本发明的靶肽的多核苷酸的转录)和上述基因序列之间的功能性连接。

只要其可以表达本发明的多核苷酸，不会具体限制用于本发明的适当的宿主。适当的宿主的实例可包括属于埃希菌属(genus Escherichia)的细菌，如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属(genus Bacillus)的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；属于假单胞菌属(genus Pseudomonas)的细菌，如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf9)；和动物细胞，例如CHO、COS、BSC等。

本发明的又一方面提供了其中引入表达载体的转化体。

为了本发明的目的，只要转化体能够表达和产生酶融合蛋白，其中引入本发明的表达载体的转化体可以不受限制，但是转化体可以是属于埃希菌属的细菌，如大肠杆菌；属于芽孢杆菌属的细菌，如枯草芽孢杆菌；属于假单胞菌属的细菌，如恶臭假单胞菌；酵母，如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母和粟酒裂殖酵母；昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Sf9)；和动物细胞，如CHO、COS、BSC等。

本发明的又一方面提供了制备根据本发明的酶融合蛋白的方法。

具体地，方法可包括(a)培养转化体以获得培养物；以及

(b)从培养物中回收酶融合蛋白，但方法不限于此。

在本发明中，用于培养转化体的培养基必须以适当的方式满足宿主细胞培养的要求。为了宿主细胞生长，可根据由其制备的转化体的类型由本领域技术人员的决定，适当地选择可包含在培养基中的碳源，并且可选择适当的培养条件，以控制培养的周期和量。

在培养基中使用的糖源的实例可以包括糖和碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素)；油类和脂肪(如大豆油、葵花籽油、蓖麻油、和椰子油)；脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸、和亚油酸)；醇(如甘油和乙醇)；和有机酸(如乙酸)。这些物质可以单独使用，或可以组合使用。

所使用的氮源的实例可以包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)。氮源也可以单独使用或组合使用。

所使用的磷源的实例可以包括磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。此外，培养基可以含有生长所必需的金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)。

最后，可以使用必需的生长物质(如氨基酸和维生素)。此外，也可以使用适当的培养基前体。在通过分批培养或连续培养的培养期间，上述源可以适当地被添加到培养物。可以使用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾和氨)，或酸性化合物(如磷酸或硫酸)适当地调节培养物的pH。此外，可以添加诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂以防止泡沫的产生。此外，为了保持培养物的好氧状态，可以向培养物中注入氧气或含氧气体(例如，空气)。

本发明的转化体可在20℃至45℃下，且特别地在25℃至40℃下培养。此外，继续培养直到获得期望的治疗酶或酶融合蛋白的最大生产量，并且在这方面，培养一般可以持续10小时至160小时。

如上面描述的，当根据宿主细胞提供适当的培养条件时，本发明的转化体可以产生治疗酶或酶融合蛋白，并且根据宿主细胞的载体构造和特征产生的治疗酶或酶融合蛋白可以在宿主细胞的细胞质内分泌或分泌到周质空间中或细胞外。

在宿主细胞内或宿主细胞外表达的蛋白质可通过常规方法纯化。纯化方法的实例可以包括盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)，溶剂沉淀(例如，使用丙酮或乙醇的蛋白质分级沉淀等)、透析、凝胶过滤、离子交换或色谱法(如反向柱色谱，超滤等)，并且这些方法可以单独使用或组合使用。

本发明的又一方面提供了方法，其包括向受试者给予用于预防或治疗LSD的酶融合蛋白或含有酶融合蛋白的组合物。

由于本发明的酶融合蛋白含有能够预防或治疗LSD的治疗酶，因此可以通过向怀疑患有LSD的受试者给予含有治疗酶的酶融合蛋白或含有酶融合蛋白的药物组合物来预防或治疗LSD。

如本文所用，术语“受试者”是指怀疑患有LSD的受试者，并且怀疑患有LSD的受试者是指患有LSD或处于发展LSD风险下的哺乳动物，包括人、大鼠、家畜等，但是不受限制地包括可用本发明的酶融合蛋白或含有酶融合蛋白的组合物治疗的任何受试者。

本发明的方法可包括给予药学上有效量的含有酶融合蛋白的药物组合物。组合物的适当的每日总剂量可由医师在正确的医学判断范围内确定，且组合物可每日一次给予或分剂量多次给予。然而，为了本发明的目的，优选地，根据各种因素，不同地应用用于任何特定患者的组合物的具体治疗有效剂量，各种因素包括要实现的应答的种类和程度，包括是否偶尔与其它药剂一起使用的具体组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给予时间、给予途径、组合物的排泄率、治疗持续时间、与具体组合物组合使用或同时使用的其它药物，以及医学领域中公知的类似因素。

同时，用于LSD的预防或治疗方法可以是组合疗法，其进一步包括给予对至少一种LSD具有治疗作用的化合物或物质，但方法不限于此。

如本文所用，术语“组合”必须理解为指同时、分开或顺序给予。当给予是顺序或分开给予时，允许给予第二种成分的间隔必须是不应失去组合的有益效果的间隔。

对于LSD具有治疗活性的酶融合蛋白的给予剂量可以是每1kg患者体重约0.0001μg至500mg，但是剂量没有特别限制。

本发明的又一方面提供了酶融合蛋白、或含有酶融合蛋白的组合物在制备用于预防或治疗LSD的药物(或药物组合物)中的用途。

在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅用于说明性目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。

实施例1：酶融合蛋白的制备

为了生产包括反向平行二聚体形式的治疗酶的酶融合蛋白，本发明人在基因水平上已经融合天然α-半乳糖苷酶、接头(SEQ ID NO:10)、和Fc免疫球蛋白区(SEQ ID NO:7)，并已将融合产物插入到表达载体中。

为了移除构建的融合蛋白的Fc区中的链交换和N-糖基化的位点，采用了定点诱变(site-directed mutagenesis)PCR技术。

具体地，使用引物(SEQ ID NO:1和2)将涉及链交换的Fc区的第2个氨基酸(即，丝氨酸)取代为脯氨酸，以及使用来自Fc区(SEQ ID NO:8)的引物(SEQ ID NO:3和4)将涉及N-糖基化的Fc区的第71个氨基酸(即，天冬酰胺)取代为谷氨酰胺。

[表1]用于诱变的引物

利用限制性内切酶将编码合成的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的多核苷酸插入到表达载体(XOGC载体)中。BamHI和XhoI两者都是不切割α-半乳糖苷酶和Fc免疫球蛋白区的限制性内切酶。将用上述限制性内切酶切割的α-半乳糖苷酶-Fc插入到了用相同限制性内切酶切割的XOGC载体中，并且从而完成了能够表达α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的载体。当免疫球蛋白Fc区形成二聚体时，α-半乳糖酶形成反向平行二聚体。

α-半乳糖苷酶-Fc的DNA和蛋白质序列示于下表2中，其中划线部分代表信号序列，粗体部分代表取代的氨基酸，以及斜体部分代表接头。

[表2]酶融合蛋白的DNA序列和蛋白质序列

将实施例1中制备的酶融合蛋白表达载体命名为α-半乳糖苷酶-Fc。

实施例2:酶融合蛋白的体外酶活性的确认

实施例2-1：α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的制备

将实施例1中制备的α-半乳糖苷酶-Fc表达载体(pX0GC-α半乳糖苷酶-Fc)转化到CHO-S细胞系中，并且从而制备了能够大量生产α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的细胞系。

具体地，使用无血清培养基(FreeStyle^TM CHO表达培养基(Expression Medium),Thermo Fisher Scientific,Cat.No.12651014)，通过悬浮培养在1L的锥形瓶(CorningInc.,Cat.No.431147)中，使CHO-S细胞增殖。当培养容器内的细胞达到5×10⁸细胞的汇合时，使用FreeStyle^TM MAX(Thermo FisherScientific,Cat.No.16447-100)转化它们。也就是说，两个管中的每一个各自装10mL OptiPro^TM SFM(Thermo FisherScientific,Cat.No.12309-019)，然后，一个管装500vg的DNA，且另一个管装500vL的FreeStyle^TM MAX。将每个管中的两种溶液混合，在室温下放置10分钟，并且分别加入到其中预先用新鲜FreeStyle^TMCHO表达培养基(Thermo FisherScientific,Cat.No.12651014)置换了培养基的细胞中。细胞在培养箱(37℃，5％CO₂)中以125rpm的转速培养约96小时。

然后，在第4天通过离心回收了培养物的上清液，并且测量了体外酶活性，以根据α-半乳糖酶-Fc的生产，检验酶活性的变化。

实施例2-2：α-半乳糖苷酶-Fc体外酶活性的确认

为了检验α-半乳糖苷酶-Fc的体外酶活性，将产生的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白与酶的已知底物pNP-gal(对硝基苯-α-D-半乳吡喃糖苷(p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside))在37℃下建立温度平衡30分钟。然后，将底物溶液与α-半乳糖苷酶-Fc在37℃下反应了30分钟，以及测量了产物的吸光度，以测量α-半乳糖苷酶-Fc的体外酶活性。

结果，从体外酶活性测量中，确认了α-半乳糖苷酶-Fc的表达水平为1,649ng/mL(图1)。这些结果暗示，本发明的酶融合蛋白的α-半乳糖苷酶形成反向平行二聚体，并且反向平行二聚体的α-半乳糖苷酶将酶活性维持在显著水平。

实施例2-3：α-半乳糖苷酶和α-半乳糖苷酶-Fc之间的体外酶活性的比较

同时，将实施例1中制备的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的体外酶活性与未连接Fc区的阿加糖酶-β的体外酶活性进行了比较。

具体地，α-半乳糖苷酶-Fc和阿加糖酶-β与酶的底物pNP-gal(对硝基苯基-α-D-半乳吡喃糖苷)在37℃下建立温度平衡30分钟。然后，底物溶液与α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白在37℃下反应20分钟。然后，测量了最终产生的4-硝基酚的吸光度，以比较α-半乳糖苷酶-Fc和阿加糖酶-β的酶活性。

结果，确认了α-半乳糖苷酶-Fc和阿加糖酶-β的酶活性(比活性(specificactivity))分别为70.9μmol/min/mg和67.6μmol/min/mg(图2)。从这些结果，确认了α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白具有95.4％的酶活性，这一水平与未连接Fc区的酶的水平相似。这意味着本发明的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白即使当Fc区连接到其上时也不会损失其酶活性。

实施例3：α-半乳糖苷酶-Fc的体外细胞内吸收活性的确认

已知α-半乳糖苷酶在被吸收到细胞中之后，通过甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)发挥作用。因此，本发明人已经确认了α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白所表现的细胞吸收活性如下。

具体地，将已知表达M6PR的CCD986SK细胞(人皮肤成纤维细胞)分别用阿加糖酶-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白处理，以及在37℃下诱导了细胞内吸收。24小时后，通过酶活性测量法确认了阿加糖酶-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的存在。

作为α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的浓度与其细胞内吸收的相关性的分析结果，发现了代表最大吸收率的一半的米-门(Michaelis-Menten)常数K_m值为11.55nM，因此显示出与阿加糖酶-β(K_m＝10.92nM)相似的细胞内吸收活性水平(图3)。从这些结果，确认了本发明的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白即使当Fc区连接到其上时也没有丧失其细胞内吸收活性。

实施例5：α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白在ICR小鼠中的药效动力学行为的确认

在ICR小鼠(3只小鼠/组)中，在血样采集的每个时间点，根据每组的每个血样采集，比较了阿加糖酶-β(对照组)和在实施例中制备的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白(试验组)的血液稳定性和药动学系数。

具体地，基于阿加糖酶，分别以1.0mg/kg的浓度通过静脉内和皮下注射将阿加糖酶-β(对照组)和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白(试验组)向对照组和实验组的ICR小鼠给予。在注射后0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、和4小时从通过静脉内注射给予的组，以及在注射后0、1、4、8、24、48、72、96、120、144、168、192和216小时从通过皮下注射给予的组采血样。血清中蛋白质的量通过体外酶活性的测量来定量。

结果，与Fc区未连接至其的对照组相比，α-半乳糖酶-Fc融合蛋白显示出半衰期(T_1/2)、血液中的最大药物浓度(C_max)和曲线下面积(area under curve，AUC)全部的增加。AUC代表体内暴露于药物分子的水平(图4，表3)。根据这些结果，确认了由于与Fc区的连接，本发明的α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白，不管给予途径如何，显示出高的血液半衰期、血液中的最大药物浓度(C_max)和体内生物利用度(AUC)。

[表3]阿加糖酶-β和α-半乳糖苷酶-Fc融合蛋白的药效动力学参数

*NA＝不适用

这些结果暗示，能够增加α-半乳糖苷酶(即，已知对LSD具有治疗作用的那些治疗酶的实例)的半衰期和体内生物利用率的本发明的新型融合蛋白可以用作LSD的治疗剂，同时能够维持酶活性。

根据以上所述，本发明所属领域的技术人员将能够理解，在不修改本发明的技术概念或本质特征的情况下，本发明可以以其它具体形式体现。在这方面，本文公开的示例性实施方式仅用于说明性目的，而不应被解释为限制本发明的范围。相反，本发明意图在不仅覆盖示例性实施方式，而且覆盖可包括在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的各种替代、修改、等同物和其它实施方式。

<110> 韩美药品株式会社

<120> 具有新颖结构的治疗酶融合蛋白及其用途

<130> OPA18301-PCT

<150> KR 10-2017-0178378

<151> 2017-12-22

<160> 14

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(S2P)_F

<400> 1

ctggcggtgg cggatcgcca ccatgcccag cacctgagtt cct 43

<210> 2

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(S2P)_R

<400> 2

aggaactcag gtgctgggca tggtggcgat ccgccaccgc cag 43

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(N71Q)_F

<400> 3

agccgcggga ggagcagttc caaagcacgt accgtgtggt cag 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc(N71Q)_R

<400> 4

ctgaccacac ggtacgtgct ttggaactgc tcctcccgcg gct 43

<210> 5

<211> 1287

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60

ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120

accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180

gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240

tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300

gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360

gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420

acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480

gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540

gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600

tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660

cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720

agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780

ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840

gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900

cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960

caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020

gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080

ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140

gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200

tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260

atgcagatgt cattaaaaga cttactt 1287

<210> 6

<211> 429

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu

20 25 30

Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu

35 40 45

Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile

50 55 60

Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly

65 70 75 80

Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met

85 90 95

Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg

100 105 110

Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly

115 120 125

Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly

130 135 140

Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala

145 150 155 160

Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser

165 170 175

Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn

180 185 190

Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met

195 200 205

Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn

210 215 220

His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys

225 230 235 240

Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val

245 250 255

Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn

260 265 270

Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala

275 280 285

Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser

290 295 300

Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn

305 310 315 320

Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn

325 330 335

Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala

340 345 350

Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala

355 360 365

Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile

370 375 380

Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln

405 410 415

Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu

420 425

<210> 7

<211> 666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc变体

<400> 7

ccaccatgcc cagcacctga gttcctgggg ggaccatcag tcttcctgtt ccccccaaaa 60

cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 120

agccaggaag accctgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 180

gccaagacaa agccgcggga ggagcagttc caaagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 240

accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 300

ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 360

caggtgtaca ccctgccccc atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 420

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 480

ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 540

tacagcaggc taaccgtgga caagagcagg tggcaggagg ggaacgtctt ctcatgctcc 600

gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctctgggt 660

aaatga 666

<210> 8

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc变体

<400> 8

Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 9

<211> 221

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc变体

<400> 9

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

1 5 10 15

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

20 25 30

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

35 40 45

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

50 55 60

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

65 70 75 80

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

85 90 95

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

100 105 110

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

115 120 125

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

130 135 140

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

145 150 155 160

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

165 170 175

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

180 185 190

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

195 200 205

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215 220

<210> 10

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 10

ggcggcggag gttcaggtgg tggtggctct ggcggtggag ggtcgggggg aggcggctct 60

ggaggagggg gctccggtgg gggaggtagc 90

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 12

<211> 2043

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α半乳糖苷酶-Fc融合蛋白

<400> 12

atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc 60

ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct 120

accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca 180

gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc 240

tggaaggatg caggttatga gtacctctgc attgatgact gttggatggc tccccaaaga 300

gattcagaag gcagacttca ggcagaccct cagcgctttc ctcatgggat tcgccagcta 360

gctaattatg ttcacagcaa aggactgaag ctagggattt atgcagatgt tggaaataaa 420

acctgcgcag gcttccctgg gagttttgga tactacgaca ttgatgccca gacctttgct 480

gactggggag tagatctgct aaaatttgat ggttgttact gtgacagttt ggaaaatttg 540

gcagatggtt ataagcacat gtccttggcc ctgaatagga ctggcagaag cattgtgtac 600

tcctgtgagt ggcctcttta tatgtggccc tttcaaaagc ccaattatac agaaatccga 660

cagtactgca atcactggcg aaattttgct gacattgatg attcctggaa aagtataaag 720

agtatcttgg actggacatc ttttaaccag gagagaattg ttgatgttgc tggaccaggg 780

ggttggaatg acccagatat gttagtgatt ggcaactttg gcctcagctg gaatcagcaa 840

gtaactcaga tggccctctg ggctatcatg gctgctcctt tattcatgtc taatgacctc 900

cgacacatca gccctcaagc caaagctctc cttcaggata aggacgtaat tgccatcaat 960

caggacccct tgggcaagca agggtaccag cttagacagg gagacaactt tgaagtgtgg 1020

gaacgacctc tctcaggctt agcctgggct gtagctatga taaaccggca ggagattggt 1080

ggacctcgct cttataccat cgcagttgct tccctgggta aaggagtggc ctgtaatcct 1140

gcctgcttca tcacacagct cctccctgtg aaaaggaagc tagggttcta tgaatggact 1200

tcaaggttaa gaagtcacat aaatcccaca ggcactgttt tgcttcagct agaaaataca 1260

atgcagatgt cattaaaaga cttacttggc ggcggaggtt caggtggtgg tggctctggc 1320

ggtggagggt cggggggagg cggctctgga ggagggggct ccggtggggg aggtagccca 1380

ccatgcccag cacctgagtt cctgggggga ccatcagtct tcctgttccc cccaaaaccc 1440

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 1500

caggaagacc ctgaggtcca gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 1560

aagacaaagc cgcgggagga gcagttccaa agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 1620

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc 1680

ctcccatcct ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1740

gtgtacaccc tgcccccatc ccaggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1800

ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1860

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1920

agcaggctaa ccgtggacaa gagcaggtgg caggagggga acgtcttctc atgctccgtg 1980

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tctgggtaaa 2040

tga 2043

<210> 13

<211> 680

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α半乳糖苷酶-Fc融合蛋白

<400> 13

Met Gln Leu Arg Asn Pro Glu Leu His Leu Gly Cys Ala Leu Ala Leu

1 5 10 15

Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu

20 25 30

Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu

35 40 45

Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile

50 55 60

Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly

65 70 75 80

Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met

85 90 95

Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg

100 105 110

Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly

115 120 125

Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly

130 135 140

Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala

145 150 155 160

Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser

165 170 175

Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn

180 185 190

Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met

195 200 205

Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn

210 215 220

His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys

225 230 235 240

Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val

245 250 255

Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile Gly Asn

260 265 270

Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala

275 280 285

Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser

290 295 300

Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn

305 310 315 320

Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn

325 330 335

Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala

340 345 350

Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala

355 360 365

Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile

370 375 380

Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln

405 410 415

Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu Gly Gly Gly

420 425 430

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

435 440 445

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ala

450 455 460

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

465 470 475 480

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

485 490 495

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

500 505 510

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

515 520 525

Phe Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

530 535 540

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

545 550 555 560

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

565 570 575

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

580 585 590

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

595 600 605

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

610 615 620

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

625 630 635 640

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

645 650 655

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

660 665 670

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

675 680

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

Claims

1.下式1的酶融合蛋白；

[式1]

其中X和X′各自独立地为相同或不同种类的治疗酶；

L和L'是接头，各自独立地为相同或不同种类的接头；

F是免疫球蛋白Fc区；

|是共价键；和

:是共价键或非共价键。

2.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述治疗酶通过非共价键形成二聚体。

3.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述治疗酶以彼此反向平行的构型形成二聚体。

4.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中与免疫球蛋白Fc区未融合至其的治疗酶相比，所述酶融合蛋白具有增加的稳定性和降低的对溶酶体受体的结合亲和力。

5.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述酶选自β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯酶、酸性α-葡糖苷酶、酸性神经酰胺酶、酸性鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、芳基硫酸酯酶A、芳基硫酸酯酶B、β-氨基己糖苷酶A、β-氨基己糖苷酶B、肝素N-硫酸酯酶、α-D-甘露糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、溶酶体酸性脂肪酶、α-N-乙酰-氨基葡糖苷酶、葡糖脑苷脂酶、丁酰胆碱酯酶、壳多糖酶、谷氨酸脱羧酶、葡糖苷脂酰鞘氨醇酶类似物、脂肪酶、尿酸氧化酶、血小板活化因子乙酰水解酶、中性内肽酶、和髓过氧化物酶。

6.权利要求5所述的酶融合蛋白，其中所述酶是α-半乳糖苷酶A或β-半乳糖苷酶。

7.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区在天然免疫球蛋白Fc区的至少一个氨基酸中具有选自取代、添加、缺失、修饰及其组合的变化。

8.权利要求7所述的酶融合蛋白，其中在具有SEQ ID NO:8的氨基序列的所述免疫球蛋白Fc区中，第2个氨基酸被脯氨酸取代；第71个氨基酸被谷氨酰胺取代；或者第2个氨基酸被脯氨酸取代且第71个氨基酸被谷氨酰胺取代。

9.权利要求8所述的酶融合蛋白，其中在所述免疫球蛋白Fc区中不发生链交换。

10.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区选自

(a)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域；

(b)CH1结构域和CH2结构域；

(c)CH1结构域和CH3结构域；

(d)CH2结构域和CH3结构域；和

(e)CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和CH4结构域中的一个或两个或更多结构域与免疫球蛋白铰链区或所述铰链区的一部分之间的组合。

11.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区为单体形式。

12.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区由铰链区、CH2结构域、和CH3结构域组成。

13.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中在所述免疫球蛋白Fc区中，

(a)移除能够形成二硫键的区；

(b)在天然Fc的N-末端移除某个氨基酸残基；

(c)在天然Fc形式的N-末端添加甲硫氨酸残基；

(d)移除补体结合位点；或

(e)缺失抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点。

14.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是非糖基化的。

15.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是源自IgG，IgA，IgD，IgE或IgM的Fc片段。

16.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是具有源自选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的免疫球蛋白的不同来源的结构域的杂化物。

17.权利要求16所述的酶融合蛋白，其中所述免疫球蛋白Fc区是IgG4 Fc区。

18.权利要求17所述的酶融合蛋白，其中所述IgG4 Fc区的所述铰链区被IgG1铰链区取代。

19.权利要求1所述的酶融合蛋白，其中所述酶融合蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

20.用于预防或治疗溶酶体贮积症(LSD)的药物组合物，其包含权利要求1至19中任一项所述的酶融合蛋白。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述溶酶体贮积症(LSD)选自粘多糖贮积症(MPS)、糖原贮积症、鞘脂贮积症、尼曼-皮克病、法布里病、戈谢病、亨特综合征、和马-拉综合征。

22.权利要求19所述的药物组合物，其中所述组合物降低酶对溶酶体受体的结合亲和力。

23.多核苷酸，其编码权利要求1至19中任一项所述的酶融合蛋白。

24.表达载体，其包含权利要求21所述的多核苷酸。

25.转化体，其中引入了权利要求22所述的表达载体。

26.制备酶融合蛋白的方法，所述方法包括：

(a)培养权利要求25所述的转化体以获得培养物；以及

(b)从所述培养物中回收酶融合蛋白。