CN111511387A

CN111511387A - 肠促胰岛素类似物及其用途

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Publication number: CN111511387A
Application number: CN201880082714.8A
Authority: CN
Inventors: J.阿尔西纳-费尔南德斯; T.科斯昆; 郭莉莉; 屈红昌
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-08-07
Also published as: US20240190936A1; EP3727425A1; IL325352A; JP2022043082A; TW201938187A; AR113487A1; BR112020010410A2; TW202233227A; ECSP20032306A; MX2020006547A; PE20200926A1; UA127589C2; DOP2020000124A; KR20200088418A; KR102440323B1; IL275469A; US11834486B2; JP2021506825A; AU2018388895B2; AU2018388895A1

Abstract

提供了在GIP、GLP‑1和胰高血糖素受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物。所述肠促胰岛素类似物具有导致在这些受体的每一种处的平衡活性和延长作用持续时间的结构特征。还提供了用于治疗疾病、诸如糖尿病、血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎和肥胖的方法。

Description

肠促胰岛素类似物及其用途

本公开涉及在葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和胰高血糖素受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物。本文所述的肠促胰岛素类似物可以具有在这些受体的每一种处提供平衡活性并具有延长作用持续时间的结构特征。此类肠促胰岛素类似物可用于治疗病症，诸如2型糖尿病(T2DM)、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和/或肥胖。

在过去几十年，糖尿病的患病率已继续提高。T2DM是糖尿病的最常见形式，其占所有糖尿病的约90%。T2DM的特征在于由胰岛素抵抗引起的高血液葡萄糖水平。T2DM的当前护理标准包括饮食和锻炼，以及用口服药和可注射降葡萄糖药物，包括基于肠促胰岛素的疗法，诸如GLP-1受体激动剂治疗。

GLP-1是一种36-氨基酸肽，其主要生物活性片段作为30-氨基酸C末端酰胺化肽(GLP-1_7-36；SEQ ID NO:2)产生，其刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌并防止糖尿病中的高血糖。各种GLP-1类似物目前可用于治疗T2DM，包括度拉糖肽(dulaglutide)、艾塞那肽和利拉鲁肽。然而，许多目前销售的GLP-1受体激动剂在剂量上受胃肠道副作用(诸如恶心和呕吐)限制。当用口服药和基于肠促胰岛素的治疗不足时，考虑用胰岛素治疗。尽管治疗选择可用，但许多接受批准疗法的个体没有达到血糖控制目标(参见例如Casagrande等人(2013)Diabetes Care 36:2271-2279)。

不受控制的糖尿病可导致影响此类个体的发病率和死亡率的一种或多种状况。T2DM的主要风险因素之一是肥胖，并且大多数T2DM患者(~90%)超重或肥胖。据记录，身体肥胖的降低将导致肥胖相关的合并症(包括高血糖和心血管事件)的改善。因此，更好的疾病管理需要有效控制葡萄糖和减重的疗法。

鉴于此，所研究的新疗法包括不仅在GLP-1受体处具有活性、而且在一种或多种其他受体、诸如GIP和/或胰高血糖素受体处具有活性的化合物。实际上，某些化合物已被描述为具有三重激动剂活性(即在胰高血糖素、GLP-1和GIP受体的每一种处的活性)。例如，国际专利申请公开号WO 2015/067716描述了具有三重激动剂活性的胰高血糖素类似物。类似地，国际专利申请号WO 2016/198624描述了具有三重激动剂活性的毒晰外泌肽-4(exendin-4)的类似物，所述毒晰外泌肽-4本身是一种GLP-1类似物。同样地，国际专利申请号WO 2014/049610和WO 2017/116204各自描述了各种具有三重激动剂活性的类似物。此外，国际专利申请号WO 2017/153375描述了也声称具有GIP活性的胰高血糖素和GLP-1协同激动剂。

然而，仍然需要能够提供有效葡萄糖控制、具有减重益处和有利的副作用概况的治疗，尤其是T2DM的治疗。还需要可以足够延长的作用持续时间使用以允许以每日一次、每周三次、每周两次或每周一次的低频率给药的治疗剂。

本文所述的肠促胰岛素类似物试图满足上述需要。相应地，本公开描述了在GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物。有利地，本文所述的肠促胰岛素类似物具有平衡活性，其允许施用的剂量在各受体处提供足够的活性以提供该受体的激动益处，同时避免与太高活性相关的不期望副作用。此外，本文所述的肠促胰岛素类似物在GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种处具有延长作用持续时间以允许以每日一次、每周三次、每周两次或每周一次的低频率给药。以该方式，该肠促胰岛素类似物导致增强的葡萄糖控制、代谢益处、诸如体重降低和/或改善身体组成、脂质益处、诸如前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)/kexin类型9(PCSK9)降低、和/或其他益处、诸如骨量增加或骨形成或骨吸收减少。本公开还描述了其他病症或病况，包括肥胖、NAFLD、NASH、血脂异常和/或代谢病症的有效治疗。

在一个实施方案中，提供了肠促胰岛素类似物，其包括下式：

其中X₂为Aib，X₃为Q或H，X₆为αMeF或αMeF(2F)，X₁₃为L或αMeL，X₁₇为具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸，其中所述官能团缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸，X₂₀为Aib、Q或H (SEQ ID NO:5)，且C-末端氨基酸任选地被酰胺化，或其药学上可接受的盐。

在另一个实施方案中，提供用于治疗疾病、诸如血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、NASH、肥胖症和T2DM的方法。此类方法可包括向有此需要的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物的至少一个步骤。在一些情况下，所述疾病是脂肪肝病、肥胖症、NASH或T2DM。

在另一个实施方案中，如本文所述的肠促胰岛素类似物被提供用于疗法中。例如，如本文所述的肠促胰岛素类似物被提供用于治疗疾病、诸如血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、NASH、肥胖症和T2DM。在一些情况下，所述疾病是脂肪肝病、肥胖症、NASH或T2DM。

在另一个实施方案中，如本文所述的肠促胰岛素类似物被提供用于制备用于治疗血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、NASH、肥胖症和T2DM的药物。在一些情况下，所述疾病是脂肪肝病、肥胖症、NASH或T2DM。

在另一个实施方案中，提供了包括如本文所述的肠促胰岛素类似物和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的本领域普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管类似于或相当于本文所述的方法和材料的任何方法和材料可用于实践或测试肠促胰岛素类似物、药物组合物和方法，但优选的方法和材料描述于本文中。

此外，通过不定冠词“一个/种(a或an)”对“一要素”的提及并不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个且仅存在一个要素。因此，不定冠词“一个/种(a或an)”通常意指“至少一个/种”。

GIP为42-氨基酸肽(SEQ ID NO:4)且为肠促胰岛素，其通过在葡萄糖存在的情况下刺激胰脏β细胞分泌胰岛素而在葡萄糖体内平衡中发挥生理作用。

GLP-1为36-氨基酸肽(SEQ ID NO:2)且还是肠促胰岛素，其刺激葡萄糖依赖性胰岛素分泌且显示其预防糖尿病患者中的高血糖症。

胰高血糖素为29-氨基酸肽(SEQ ID NO:1)，其通过结合且活化肝细胞上的胰高血糖素受体，通过称作糖原分解的方法引起肝脏释放以糖原的形式储存的葡萄糖而帮助保持血液葡萄糖。

胃泌酸调节肽(OXM)为37-氨基酸肽，其不仅包括胰高血糖素的29-氨基酸序列而且包括活化胰高血糖素和GLP-1受体两者的八肽羧基端延伸段(SEQ ID NO:3)，其中对于胰高血糖素受体的功效略微高于对于GLP-1受体。

除了T2DM之外，对GIP、GLP-1和/或胰高血糖素受体中的一种或多种具有活性的肠促胰岛素和其类似物已被描述为在许多其他病况、疾病或病症(包括，例如，肥胖症、NAFLD和NASH、血脂异常、代谢综合征、骨骼相关病症、阿尔兹海默氏症(Alzheimer's disease)和帕金森氏病(Parkinson's disease))中具有治疗价值的潜能。参见，例如Jall等人 (2017)Mol. Metab. 6:440-446; Carbone等人 (2016) J. Gastroenterol. Hepatol. 31:23-31; Finan等人 (2016) Trends Mol. Med. 22:359-376; Choi等人 (2017) Potent body weight loss and efficacy in a NASH animal model by a novel long-acting GLP-1/ Glucagon/GIP triple-agonist (HM15211), ADA Poster 1139-P; Ding (2008) J. Bone Miner. Res. 23:536-543; Tai等人 (2018) Brain Res. 1678:64-74; Müller等人(2017) Physiol. Rev. 97:721-766; Finan等人 (2013) Sci. Transl. Med. 5:209; Hölscher (2014) Biochem. Soc. Trans. 42:593-600。

如本文所用，“约”意指在一个或多个值，诸如例如指定浓度、长度、分子量、pH、序列同一性、时间长度、温度或体积的统计上有意义的范围内。这种数值或范围可在给定数值或范围的通常20%内、更通常10%内和甚至更通常5%内的量级内。“约”涵盖的容许偏差将取决于受研究的特定系统，并且可以是本领域技术人员容易认识到的。

如本文所用并且关于GIP、GLP-1或胰高血糖素受体的一种或多种，“活性”、“活化(activate)”、“活化(activating)”等意指如使用本领域中已知的测定法，诸如下述体外测定法测量的化合物，诸如本文所述的肠促胰岛素类似物结合受体并在受体处诱导应答的能力。

如本文所用，“具有可用于缀合的官能团的氨基酸”意指具有可借助例如接头缀合至脂肪酸的官能团的任何天然或非天然氨基酸。此类官能团的实例包括但不限于炔基、烯基、氨基、叠氮基、溴、羧基、氯、碘和硫醇基团。包括此类官能团的天然氨基酸的实例包括K(氨基)、C(硫醇)、E(羧基)和D(羧基)。

如本文所用，“C₁₆-C₂₂脂肪酸”意指具有16至22个碳原子的羧酸。适于本文使用的C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是饱和单酸或饱和二酸。如本文所用，“饱和”意指脂肪酸不含碳-碳双键或三键。

如本文所用，“有效量”意指在单剂或多剂施用于有此需要的个体后，在被诊断或治疗的这种个体中提供期望作用的一种或多种本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的量、浓度或剂量。本领域技术人员通过使用已知技术和通过观察在类似情况下获得的结果容易确定有效量。在确定对个体而言有效的量时，考虑许多因素，包括但不限于哺乳动物的物种；其体型、年龄和总体健康状况；涉及的特定疾病或病症；疾病或病症的程度或涉及或严重程度；个体患者的应答；施用的特定肠促胰岛素类似物；施用模式；施用的制剂的生物利用度特征；所选的剂量方案；伴随药物治疗的使用；和其他相关情况。

如本文所用，“延长作用持续时间”意指肠促胰岛素类似物的结合亲和力和活性的持续时间段大于天然人GIP、GLP-1和胰高血糖素肽，允许至少以每日一次或甚至每周三次、每周两次或每周一次的低频率给药。可使用已知的药代动力学测试方法，诸如下文的实施例中利用的那些，测量肠促胰岛素类似物的作用时间概况。

如本文所用，“肠促胰岛素类似物”意指与GIP、GLP-1和胰高血糖素，尤其是人GIP(SEQ ID NO:4)、GLP-1 (SEQ ID NO:2)和胰高血糖素(SEQ ID NO:1)的每一种具有结构相似性、但具有许多差异的化合物。本文所述的肠促胰岛素类似物包括产生对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种具有亲和力和活性(即三重激动剂活性)的化合物的氨基酸序列。

如本文所用，“有此需要的个体”意指具有需要治疗或疗法的病况、疾病、病症或症状，包括例如本文中列举的那些的哺乳动物，诸如人。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”等意指抑制、减缓、停止或逆转现有病况、疾病、病症或症状的进展或严重程度。

如本文所用并且关于肠促胰岛素类似物，“三重激动剂活性”意指在GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物，尤其是在各受体处具有平衡和足够活性以提供对该受体的激动益处、同时避免与太多活性相关的不期望副作用的类似物。此外，具有三重激动剂活性的肠促胰岛素类似物在GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种处具有延长作用持续时间，其有利地允许以每日一次、每周三次、每周两次或每周一次的低频率给药。

如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”意指抑制、减缓、停止或逆转现有病况、疾病、病症或症状的进程或严重程度。

如本文所用，且关于肠促胰岛素类似物，“三重激动剂活性”意指在胰高血糖素、GLP-1和GIP受体的每一种处具有活性的肠促胰岛素类似物，尤其是在各受体处具有平衡且足够活性以提供对该受体的激动益处、同时避免与太多活性相关的不期望副作用的类似物。此外，具有三重激动活性的肠促胰岛素类似物对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体各自具有延长作用持续时间，其有利地允许以每日一次、每周三次、每周两次或每周一次的低频率给药。

本文所述的肠促胰岛素类似物的结构特征产生在GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种处具有足够活性的类似物，以获得在各受体处的活性(即三重激动剂活性)的有利作用，但在任一受体处的活性没有高到压倒在其他受体中任一种处的活性或在以足以在所有三种受体处产生活性的剂量施用时没有导致不期望副作用。在某些实施方案中和关于SEQID NO:5，此类结构特征的非限制性实例包括位置6的αMeF或αMeF(2F)，其被发现有助于最佳的胰高血糖素活性；位置13的L或αMeL，其被发现有助于最佳胰高血糖素和GIP活性；位置20的Aib，其被发现有助于最佳GIP活性；位置17的酰化，其被发现有助于最佳胰高血糖素活性；和位置25的Y，其被发现有助于最佳胰高血糖素和/或GIP活性。此类结构特征的其他实例包括在位置22、24和28-39的本文所述的氨基酸，其被发现有助于在所有三种受体处的最佳结合和功效。

本文所述的肠促胰岛素类似物的结构特征还导致类似物具有与它们作为治疗处理的可发展性(developability)相关的许多其他有益属性，包括改进该类似物在水溶液中的溶解度、改进化学和物理制剂稳定性、延长药代动力学概况和使免疫原性潜力最小化。导致此类属性的特定结构特征的非限制性实例包括在位置17用C₂₀脂肪酸酰化，这有助于最佳药代动力学(PK)概况和可发展性；在位置20的Aib或H，其有助于最佳PK概况和可发展性；和位置22、24和28-39的本文所述的氨基酸，其有助于最佳PK、免疫原性、可发展性和稳定性。

应当注意到，结构特征的上述列表是示例性的而非全面的，并且本文所述的示例性类似物的有益特征的组合不是单独的任一修饰的结果，而是通过本文所述的结构特征的新型组合实现。此外，上述修饰列表的上述作用不是排他的，因为许多这些修饰也具有如下所述对本文所述的化合物的特征重要的其他作用。

本文所述的肠促胰岛素类似物的氨基酸序列并入在本文中通常使用标准的单字母代码(例如L = 亮氨酸)描绘的天然存在的氨基酸，以及天然氨基酸的α-甲基取代的残基(例如α-甲基亮氨酸(αMeL)、α-甲基赖氨酸(αMeK)、α-甲基苯丙氨酸(αMeF)和α-甲基2-氟苯丙氨酸(αMeF(2F))，和某些其他非天然氨基酸，诸如α氨基异丁酸(Aib)。下面描绘这些氨基酸的结构：

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如上文所示，本文所述的肠促胰岛素类似物与天然人肽中的任一者具有结构相似性，但具有许多结构差异。例如，当与天然人GIP (SEQ ID NO:4)相比时，本文所述的肠促胰岛素类似物包括在位置2、3、6、7、13、14、17、18-21、23-25、28-29和30-42中的一者或多者的修饰。在一些情况下，本文所述的肠促胰岛素类似物包括在位置2、3、6、7、13、14、17、18、21、23-25、29和30-42各自对天然人GIP (SEQ ID NO:4)的氨基酸的修饰。在某些情况下，本文所述的肠促胰岛素类似物包括以下氨基酸修饰：位置2的Aib；位置3的Q或H；位置6的αMeF或αMeF(2F)；位置7的T；位置13的L或αMeL；位置14的L；位置17的修饰的K残基，其通过用C₁₆至C₂₂脂肪酸，任选地通过使用接头，缀合至K侧链的ε-氨基进行修饰；位置18的A；位置19的Q；位置20的Aib、Q或H；位置21的A；位置23的I；位置24的E；位置25的Y；位置28的E；位置29的G；和用以下氨基酸序列GPSSGAPPPS (SEQ ID NO:12) (和尾端的截短类似物)替代位置30-42的氨基酸。在又其他情况下，本文所述的肠促胰岛素类似物被酰胺化。除了本文所述的修饰以外，本文所述的肠促胰岛素类似物可包括一个或多个另外氨基酸修饰，然而条件为类似物保持能够结合且活化GIP、GLP-1和胰高血糖素受体中的每一种。

如上所示，本文所述的肠促胰岛素类似物包括例如借助接头缀合至具有可用于缀合的官能团的天然或非天然氨基酸上的脂肪酸部分。这种缀合有时被称为酰化。在某些情况下，具有可用于缀合的官能团的氨基酸可以是K、C、E和D。在特定情况下，具有可用于缀合的官能团的氨基酸是K，其中缀合至K侧链的ε-氨基。

本文所述的肠促胰岛素类似物的酰化在SEQ ID NO:5中的位置17，这被确定为是用于包括该结构的最佳位置。脂肪酸和在某些实施方案中的接头，充当白蛋白粘合剂，并提供生成长效化合物的潜力。

本文所述的肠促胰岛素类似物采用通过直接键或通过接头化学缀合至氨基酸的官能团的C₁₆-C₂₂脂肪酸。脂肪酸的长度和组成影响肠促胰岛素类似物的半衰期、它们在体内动物模型中的功效和它们的溶解度和稳定性。缀合至C₁₆-C₂₂饱和脂肪单酸或二酸产生表现出期望的半衰期、在体内动物模型中的期望功效和期望的可溶性和稳定性特征的肠促胰岛素类似物。

本文所用的饱和C₁₆-C₂₂脂肪酸的实例包括但不限于棕榈酸(十六烷酸)(C₁₆单酸)、十六烷二酸(C₁₆二酸)、margaric acid(十七烷酸)(C₁₇单酸)、十七烷二酸(C₁₇二酸)、硬脂酸(C₁₈单酸)、十八烷二酸(C₁₈二酸)、nonadecylic acid(十九烷酸)(C₁₉单酸)、十九烷二酸(C₁₉二酸)、花生酸(二十烷酸)(C₂₀单酸)、二十烷二酸(C₂₀二酸)、heneicosylic acid(二十一烷酸)(C₂₁单酸)、二十一烷二酸(C₂₁二酸)、山嵛酸(二十二烷酸)(C₂₂单酸)、二十二烷二酸(C₂₂二酸)，包括它们的支化和取代衍生物。

在某些情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是饱和C₁₈单酸、饱和 C₁₈二酸、饱和C₁₉单酸、饱和C₁₉二酸、饱和C₂₀单酸、饱和C₂₀二酸及其支化和取代衍生物。在更具体的情况下，C₁₆-C₂₂脂肪酸可以是硬脂酸、花生酸或二十烷二酸，尤其是花生酸。

在一些情况下，接头可具有1至4个氨基酸、氨基聚乙二醇羧酸酯或其混合物。在某些情况下，氨基聚乙二醇羧酸酯具有以下结构：

其中m是1至12的任何整数，n是1至12的任何整数，且p是1或2。

在某些情况下，接头可具有一个或多个(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)部分，任选与1至4个氨基酸组合。

在接头包括至少一个氨基酸的情况下，该氨基酸可以是1至4个Glu或γGlu氨基酸残基。在一些情况下，接头可包括一个或两个Glu或γGlu氨基酸残基，包括其D形式。例如，接头可包括一个或两个γGlu氨基酸残基。或者，接头可包括与最多达36个(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)部分组合使用的1至4个氨基酸残基(诸如例如Glu或γGlu氨基酸)。具体地，接头可以是1至4个E或γE氨基酸和1至4个(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)部分的组合。在其他情况下，接头可以是一个或两个γGlu氨基酸和一个或两个(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)部分的组合。

在一种具体情况下，本文所述的肠促胰岛素类似物具有接头和具有下式的结构的脂肪酸组分：

其中a是0、1或2，b是1或2，且c是16或18。在一种具体情况下，a是2，b是1，且c是18，下面描绘其结构：

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在另一种具体情况下，a是1，b是2，且c是18，下面描绘其结构：

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在另一种具体情况下，a是0，b是2，且c是18，下面描绘其结构：

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如以下实施例1-6的化学结构中所示，上述接头-脂肪酸部分可连接至赖氨酸(K)侧链的epsilon (ε)-氨基。

可使用本领域中已知的测量受体结合水平的技术，包括例如以下实施例中描述的那些技术测量本文所述的肠促胰岛素类似物对GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的每一种的亲和力，并通常表示为抑制常数(Ki)值。也可使用本领域中已知的技术，包括例如下述体外活性测定法测量本文所述的肠促胰岛素类似物在各受体处的活性，并通常表示为有效浓度50(EC₅₀)值，其为在剂量应答曲线中引起半最大值模拟的化合物浓度。

本文所述的肠促胰岛素类似物可配制为药物组合物，其可通过肠胃外途径(例如皮下、静脉内、腹膜内、肌肉内或经皮)施用。此类药物组合物及其制备技术是本领域中众所周知的。参见例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Troy, 编, 第21版, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。在特定情况下，皮下施用肠促胰岛素类似物。

本文所述的肠促胰岛素类似物可与许多无机和有机酸/碱的任一种反应以形成药学上可接受的酸/碱加成盐。药学上可接受的盐及其常用制备技术是本领域中众所周知的(参见例如Stahl等人, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selectionand Use, 第2修订版(Wiley-VCH, 2011))。本文所用的药学上可接受的盐包括钠盐、三氟乙酸盐、盐酸盐和乙酸盐。

本公开还提供了并因此涵盖合成本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的新型中间体和方法。本文所述的中间体和肠促胰岛素类似物可通过本领域已知的各种技术制备。例如，在以下实施例中举例说明使用化学合成的方法。所述各途径的具体合成步骤可以不同方式组合以制备本文所述的肠促胰岛素类似物。试剂和起始材料是本领域技术人员易得的。

本文所述的某些肠促胰岛素类似物通常在宽剂量范围内是有效的。例如，用于每周一次施用的剂量可落在约0.01至约30 mg/人/周的范围内、在约0.1至约10 mg/人/周的范围内或甚至在约0.1至约3 mg/人/周的范围内。因此，本文所述的肠促胰岛素类似物可每日、每周三次、每周两次或每周一次给药，尤其是每周一次施用。

本文所述的肠促胰岛素类似物可用于治疗各种病况、病症、疾病或症状。具体而言，提供了用于治疗个体中的T2DM的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

另外，提供了用于治疗个体中的肥胖症的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

另外，提供了用于诱导个体中的非治疗性体重减轻的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

另外，提供了用于治疗个体中的代谢综合征的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

另外，提供了用于治疗个体中的NASH的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的个体施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

另外，提供了用于治疗个体中的FLD的方法，其中此类方法至少包括向需要这种治疗的受试者施用有效量的本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐的步骤。

在这些方法中，肠促胰岛素类似物的有效性可通过例如观察血液葡萄糖的显著降低、观察胰岛素的显著增加、观察HbA1c的显著降低和/或观察体重的显著减少来评价。

或者，本文所述的肠促胰岛素类似物或其药学上可接受的盐可用于提高有此需要的个体中的骨强度。在一些情况下，有此需要的个体具有低骨生成或骨质疏松症(hypo-osteoidosis)，或正从骨折、矫形手术、假肢植入、牙植入和/或脊柱融合术愈合。本文所述的肠促胰岛素类似物也可用于治疗其他病症，诸如帕金森氏病或阿尔茨海默氏病。

肽合成

实施例1：

实施例1是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-QGT-αMeF-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂ (SEQ ID NO:6).

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例1的结构，除了残基Aib2、αMeF6、K17和Aib20以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

在Symphony X Peptide Synthesizer (Protein Technologies, Inc. Tucson,AZ)上使用芴基甲氧基羰基(Fmoc)/叔丁基(t-Bu)化学法合成实施例1的肽骨架。

该树脂由0.3-0.4 meq/g的取代度下的1% DVB交联的聚苯乙烯(Fmoc-Rink-MBHALow Loading Resin, 100-200目, EMD Millipore)组成。使用标准侧链保护基。Fmoc-Lys(Mtt)-OH)用于位置17的赖氨酸，且Boc-Tyr(tBu)-OH)用于位置1的酪氨酸。在各偶联步骤(2 x 7分钟)前使用20%哌啶/DMF除去Fmoc基团。所有标准氨基酸偶联使用等摩尔比的Fmoc氨基酸(0.3mM)、二异丙基碳二亚胺(0.9mM)和Oxyma (0.9mM)在超过理论肽载量9倍摩尔过量下进行1小时(偶联至伯胺)和3小时(偶联至仲胺)。例外是偶联至Cα-甲基化氨基酸，其偶联3小时。在完成肽骨架的合成后，该树脂用DCM充分洗涤6次以除去残余DMF。使用30%六氟异丙醇(Oakwood Chemicals)/DCM的两次处理(2 x 40分钟处理)从肽树脂选择性除去在位置17的赖氨酸上的Mtt保护基。

通过2-[2-(2-Fmoc-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酸(Fmoc-AEEA-OH, ChemPep,Inc.)、Fmoc-谷氨酸α-t-丁酯(Fmoc-Glu-OtBu, Ark Pharm, Inc.)、单-OtBu-二十烷二酸(WuXi AppTec, Shanghai, China)的偶联实现脂肪酸-接头部分的随后连接。3倍过量的试剂(AA:PyAOP:DIPEA = 1:1:1 mol/mol)用于1小时长的每个偶联。

在合成完成后，用DCM洗涤肽树脂，且然后充分风干。干燥树脂用10 mL裂解混合物(三氟乙酸: 水: 三异丙基硅烷，95:2.5:2.5 v/v)在室温下处理2小时。滤出树脂，每次用2毫升纯TFA洗涤两次，且合并的滤液用5倍冷二乙醚(-20℃)处理以沉淀粗制肽。肽/醚悬浮液然后以3500 rpm离心2分钟以形成固体沉淀，滗析上清液，且固体沉淀用乙醚磨碎另外两次并在真空中干燥。将粗制肽溶解在20%乙腈/20%乙酸/60%水中并通过在Luna 5 µm苯基-己基制备柱(21 x 250 mm, Phenomenex)上用100%乙腈和0.1% TFA/水缓冲体系的线性梯度(30-50%乙腈，在60 min内)的RP-HPLC纯化。使用分析型RP-HPLC评价肽的纯度并且合并标准是>95%。发现实施例1的主要合并纯度是99.2%。最终主要产物合并物的随后冻干产生冻干的肽TFA盐。通过LC-MS测定分子量(obsd: M+4H+/4 =1219.9; Calc M+4H+/4 =1220.1)。

实施例2：

实施例2是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-QGT-αMeF-TSDYSI-αMeL-LDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO:7)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例2的结构，除了残基Aib2、αMeF6、αMeL13、K17和Aib20以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

使用与上文对实施例1所述的方法类似的方法合成肽骨架，缀合脂肪酸-接头部分，检查纯度和证实实施例2的分子量。

实施例3：

实施例3是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-HGT-αMeF(2F)-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)₂-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO:8)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例3的结构，除了残基Aib2、αMeF(2F)6、K17和Aib20以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

使用与上文对实施例1所述的方法类似的方法合成肽骨架，缀合脂肪酸-接头部分，检查纯度和证实实施例3的分子量。

实施例4：

实施例4是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-QGT-αMeF(2F)-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQ-Aib-AFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂(SEQ ID NO:9)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例4的结构，除了残基Aib2、αMeF(2F)6、K17和Aib20以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

使用与上文对实施例1所述的方法类似的方法合成肽骨架，缀合脂肪酸-接头部分，检查纯度和证实实施例4的分子量。

实施例5：

实施例5是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-QGT-αMeF(2F)-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQQAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂ (SEQ ID NO:10)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例5的结构，除了残基Aib2、αMeF(2F)6和K17以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

使用与上文对实施例1所述的方法类似的方法合成肽骨架，缀合脂肪酸-接头部分，检查纯度和证实实施例5的分子量。

实施例6：

实施例6是由以下描述代表的化合物：

Y-Aib-QGT-αMeF(2F)-TSDYSILLDKK((2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)-(γGlu)-CO-(CH₂)₁₈-CO₂H)AQHAFIEYLLEGGPSSGAPPPS-NH₂ (SEQ ID NO:11)。

以下是使用标准单字母氨基酸代码描绘实施例6的结构，除了残基Aib2、αMeF(2F)6和K17以外，其中已展开这些氨基酸残基的结构：

。

使用与上文对实施例1所述的方法类似的方法合成肽骨架，缀合脂肪酸-接头部分，检查纯度和证实实施例6的分子量。

体外功能

结合亲和力:

运行放射性配体竞争结合测定法以测定实例化合物和比较物分子的平衡解离常数。这种测定法使用闪烁迫近测定法(SPA)和由过表达人GIP受体(GIPR)、GLP-1受体(GLP-1R)或人胰高血糖素受体(GcgR)的转染HEK293细胞制备的膜。

在作为非特异性阻断剂的杆菌肽存在的情况下进行测定以防止测试类似物的酰化部分结合标准测定缓冲液中使用的蛋白组分(例如白蛋白)。

作为特异性抑制百分比(y-轴) vs化合物的对数浓度(x-轴)绘制竞争曲线并使用具有可变斜率的四参数非线性回归拟合(ABase或Genedata)分析。根据方程K_i = IC₅₀/(1+(D/K_d))计算K_i值，其中IC₅₀是导致50%结合抑制的化合物浓度，D是该测定中使用的放射性配体的浓度，且K_d是由饱和结合分析测定的受体和放射性配体的平衡解离常数(显示在下表1中)。

表1. 由饱和结合分析测定的平衡解离常数(K_d)。

示例性类似物和比较物分子的K_i值显示于表2中。

表2. 实施例和比较物对人GIPR、GLP-1R和GcgR的体外结合亲和力(K_i)。

注: 修饰符(>)表明数据没有达到相对于最大结合的50%抑制，由此使用在该测定中测试的最高浓度计算K_i。n=1/x意味着仅使用总复制数(x)中的一个值表达平均值。只有存在n=2或更多的不合格结果时才计算SEM。

如表2中所见，示例性类似物在GIP、GLP-1和Gcg受体的每一种处具有结合亲和力。

功能活性:

在表达GIP-R- GLP-1R-和GcgR-的HEK-293克隆细胞系中测定功能活性。在20 µl测定体积中，在补充有1X GlutaMAX^TM (Gibco Cat# 35050)、0.25% FBS (胎牛血清, GibcoCat# 26400)、0.05%级分V BSA (牛血清白蛋白, Gibco Cat# 15260)、250 µM IBMX和20mM HEPES (Gibco Cat# 15630)的DMEM (Gibco Cat# 31053)中用肽(20 point CRC,2.75-倍Labcyte Echo直接稀释)处理过表达各受体的细胞系。

在室温下孵育60分钟后，使用CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF测定试剂盒(62AM4PEJ)定量测定所得的细胞内cAMP的增加。简言之，通过添加在细胞裂解缓冲液中的cAMP-d2缀合物，随后添加抗体抗-cAMP-Eu³⁺-穴状化合物(也在细胞裂解缓冲液中)，检测细胞内的cAMP水平。所得的竞争测定在室温下孵育至少60分钟，且然后使用具有在320 nm处的激发和在665 nm和620 nm处的发射的PerkinElmer Envision®仪器检测。Envision单位(在665nm/620nm处的发射*10,000)与存在的cAMP的量成反比并使用cAMP标准曲线转化成每孔的nM cAMP。

将在每个孔中生成的cAMP量(nM)转化成用人GLP-1(7-36)NH₂、人Gcg或人GIP(1-42)NH₂观察到的最大应答的百分比。使用最大应答百分比 vs. 添加的肽浓度，通过非线性回归分析推导相对EC₅₀值，拟合至四参数对数方程中。

示例性类似物和hGIP(1-42)NH₂、hGLP-1(7-36)NH₂和hGcg的数据显示于下表3中。

表3. 示例性类似物和比较物在FBS和BSA存在的情况下的功能cAMP功效(EC₅₀)。

注：在人GLP-1R处的人GLP-1(7-36)NH₂、在人GcgR处的人Gcg和在人 GIP-R处的人GIP(1-42)NH₂的EC₅₀测定：肽浓度范围是448 pM至99.5 nM。实施例在人GLP-1R、人GcgR和人GIP-R处的EC₅₀测定：肽浓度范围是51.5 fM至11.4 µM。

如表3中所见，在FBS和BSA存在的情况下，示例性类似物具有如通过人GIP-R、GLP-1R和GcgR cAMP测定法测定的激动剂活性，其低于天然配体。

在表达人GLP-1、GIP和胰高血糖素受体的HEK293细胞中进行额外组的cAMP测定。使用均相时间分辨荧光方法，进行测定以测定示例性类似物和比较物分子的固有功效，其在不与分析的分子的脂肪酸部分相互作用的酪蛋白(代替血清白蛋白)作为非特异性封闭剂存在的情况下进行。

通过使用标准曲线外推测定细胞内cAMP水平。作为针对最小值(仅缓冲液)和最大值(各对照配体的最大浓度)归一化的刺激百分比绘制化合物的剂量应答曲线并使用具有可变斜率的四参数非线性回归拟合(Genedata Screener 13)分析。EC₅₀是在剂量应答曲线中引起半最大模拟的化合物浓度。

数据提供于下表4中。

表4. hGLP-1R、hGIPR、hGcgR在0.1%酪蛋白存在的情况下的功能活化。

如表4中所见，示例性类似物在0.1%酪蛋白存在的情况下刺激来自人GIP、GLP-1和胰高血糖素受体的cAMP。

SEQ ID NO:1 –人胰高血糖素

SEQ ID NO:2 –人GLP-1 (7-36)酰胺

SEQ ID NO:3 –人OXM

SEQ ID NO:4 –人GIP

SEQ ID NO:5 –肠促胰岛素类似物

其中

X₂为Aib；

X₃为Q或H；

X₆为αMeF或αMeF(2F)；

X₁₃为L或αMeL；

X₁₇为具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸，其中所述官能团缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸；

X₂₀为Aib、Q或H

SEQ ID NO:6 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:7 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:8 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:9 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:10 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:11 –肠促胰岛素类似物

SEQ ID NO:12 –人工序列

Claims

1.肠促胰岛素类似物，其包含：

其中：

X₂为Aib，

X₃为Q或H，

X₆为αMeF或αMeF(2F)，

X₁₃为L或αMeL，

X₁₇为具有可用于缀合的官能团的任何氨基酸，且所述官能团缀合至C₁₆-C₂₂脂肪酸；

X₂₀为Aib、Q或H，

(SEQ ID NO:5)，且C末端氨基酸任选地被酰胺化；

或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的肠促胰岛素类似物，其中在位置X₁₇的具有可用于缀合的官能团的氨基酸选自K、C、E和D。

3.权利要求1的肠促胰岛素类似物，其中在位置X₁₇的具有可用于缀合的官能团的氨基酸是K。

4.权利要求1至3任一项的肠促胰岛素类似物，其中在位置X₁₇的具有可用于缀合的官能团的氨基酸和C₁₆-C₂₂脂肪酸在所述氨基酸和所述脂肪酸之间通过接头缀合。

5.权利要求4的肠促胰岛素类似物，其中所述接头包含1至4个氨基酸。

6.权利要求5的肠促胰岛素类似物，其中所述氨基酸是Glu或γGlu。

7.权利要求4至6任一项的肠促胰岛素类似物，其中所述接头进一步包含以下结构：

其中m是1至12的任何整数，n是1至12的任何整数，且p是1或2。

8.权利要求4至7任一项的肠促胰岛素类似物，

其中所述接头进一步包含1至4个(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)部分。

9.权利要求1的肠促胰岛素类似物，其中X₁₇是用以下结构通过缀合至K侧链的ε-氨基而化学修饰的K：

(2-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)_a-(γGlu)_b-CO-(CH₂)_c-CO₂H，

其中_a是0、1或2；_b是1或2；且_c是16至18的整数。

10.权利要求9的肠促胰岛素类似物，其中a是1。

11.权利要求9的肠促胰岛素类似物，其中a是2。

12.权利要求9至11任一项的肠促胰岛素类似物，其中b是1。

13.权利要求9至11任一项的肠促胰岛素类似物，其中b是2。

14.权利要求9至13任一项的肠促胰岛素类似物，其中c是18。

15.权利要求1至14任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₁₃是αMeL。

16.权利要求1至14任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₁₃是L。

17.权利要求1至16任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₃是Q。

18.权利要求1至16任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₃是H。

19.权利要求1至18任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₆是αMeF。

20.权利要求1至18任一项的肠促胰岛素类似物，其中X₆是αMeF(2F)。

21.肠促胰岛素类似物，其具有选自SEQ ID NO:5-11的式。

22.治疗选自T2DM、肥胖症、脂肪肝病、NASH、血脂异常和代谢综合征的疾病的方法，

所述方法包括以下步骤：

向有此需要的个体施用有效量的权利要求1至21中任一项的肠促胰岛素类似物。

23.治疗II型糖尿病的方法，所述方法包括以下步骤：

24.药物组合物，其包含：

权利要求1至21任一项的肠促胰岛素类似物；和

药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

25.权利要求1至21任一项的肠促胰岛素类似物，其用于治疗选自糖尿病、血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎和肥胖症的疾病。

26.权利要求1至21任一项的肠促胰岛素类似物，其用于治疗II型糖尿病。

27.权利要求1至21任一项的肠促胰岛素类似物在制备用于治疗选自糖尿病、血脂异常、脂肪肝病、代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎和肥胖症的疾病的药物中的用途。

28.权利要求1至21任一项的肠促胰岛素类似物在制备用于治疗II型糖尿病的药物中的用途。