CN111518816A

CN111518816A - 一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用

Info

Publication number: CN111518816A
Application number: CN202010397092.7A
Authority: CN
Inventors: 李有志; 樊宪伟; 高珺; 雷玲
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: CN111518816B

Abstract

本发明公开了一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述得玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因在促进拟南芥开花中的应用。本发明提供了一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因、该基因编码的蛋白氨基酸及其用于促进拟南芥开花中的应用。本发明一是利用玉米的“黑暗”响应的白化/玻璃黄色12蛋白的基因，二是异源表达玉米的白化/玻璃黄色12基因促进植物开花，三是白化/玻璃黄色12蛋白的基因与已报道的开花相关基因不同，是一个促进植物开花的新的基因。

Description

一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种玉米黑暗响应玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用。

背景技术

植物开花是繁殖发育的重要环节(Imaizumi&Kay,2006)，因此控制开发就成为植物生产中的核心内容研究内容之一(Hung et al.,2012；Wu et al.,2016)。植物开花基因结构和功能是保守的(Kojima et al.,2002；Nemoto et al.,2003)，基于拟南芥、水稻和玉米等模式植物的控制开花的分子遗传机制研究已十分广泛和深入，这些研究均是感光基因为基础和出发点(Miller et al.,2008；Meng et al.,2011；Dong et al.,2012；Yang etal.,2013；Mascheretti et al.,2015；Li et al.,2017)，但是单子叶与双子叶植物感光系统的基因组成有明显差别(Shen et al.,2008；Dunlap&Loros,2017；Hoang et al.,2019)。

玉米(Zea mays)是重要的粮食作物之一(Doeble,2004)，因起源热带地区并适应在短日照条件下正常开花(Wu et al.,2016)，因此对日照长度变化具有先天的敏感性(Mascheretti et al.,2015)。如果不经驯化，它们在高纬度长日照地区不开花或者延迟开花(Hung et al.,2012；Wu et al.,2016)。据研究，玉米的开花途径之一是由感光基因组成的光周期响应基因控制，由上游的conz1，gigz1A，gigz1B和id1以及下游的FLOWERINGLOCUS T(FT)-like基因例如ZCN8组成,其中上游的基因成份在长日照适应性和短日照适应性玉米中都是保守的(Miller et al.,2008；Meng et al.,2011；Dong et al.,2012；Yanget al.,2013；Mascheretti et al.,2015；Li et al.,2017)。与拟南芥和水稻不同，玉米感光系统由6个基因组成，但缺失了与拟南芥的phyD(E)两个同源物(Pham et al.,2018)，说明玉米有独特的控制开花的基因。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，认为光周期由光照和黑暗时段组成，由此推测，黑暗也是影响开花的时间因素之一。据此思路，本发明在B73玉米自交系中克隆了一个被注释为“黑暗”响应的编码白化/玻璃黄色12(albino or glassy yellow 12)蛋白的基因，通过转基因在拟南芥中的异源表达，转基因拟南芥能够提早开花。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明的目的是提供一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因，所述基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述的cDNA长315个核苷酸残基，在核苷酸水平上与高粱的蛋白转位酶亚基(NCBI accession no.XM_021456548.1)基因的cDNA序列具有96.88％的一致性；

所述玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，该基因编码蛋白长105个氨基酸残基，与高粱的蛋白转位酶亚基(NCBI accessionno.XP_021312223.1)的氨基酸残基序列具有98.11％一致性。

本发明的另一个目的是提供上述玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因在促进拟南芥开花中的应用。

本发明所提供的玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因在促进拟南芥或其他植物开花中的应用，是将目的基因导入拟南芥中，得到转基因拟南芥植株。

其中，将目的基因的cDNA序列克隆到植物转基因表达载体Pcambia-1301Vector的NoclⅠ和PmlⅠ酶切位点，获得重组表达载体。

其中，所述重组表达载体导入拟南芥的方法包括以下步骤：

(1)将重组表达载体导入农杆菌菌株，得到重组农杆菌菌株；

(2)按照传统的蘸花转化法，用重组农杆菌菌株培养液浸泡拟南芥的花器并在室内继续培养产生的T0代拟南芥种子，通过后续筛选，获得异源表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株。

其中，所述的后续筛选为：T0代拟南芥种子在含有20mg/mL卡那霉素的MS培养基上、16h光照/8h黑暗光周期条件下进行抗性筛选，获得抗性转化拟南芥幼苗，抗性转化拟南芥幼苗以序列特异性引物{Seca2-2-F(1301)，如SEQ ID NO.3所示；Seca2-2-R(1301，如SEQID NO.4所示}为基础经过PCR扩增鉴定为转基因后，利用定量PCR方法检测靶标基因是否表达，平行对照实验为非转基因拟南芥，经过上述检测分析后，如玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因已表达，即获得异源表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因、该基因编码的蛋白氨基酸及其用于促进拟南芥开花中的应用。本发明一是利用玉米的“黑暗”响应的白化/玻璃黄色12蛋白的基因，二是异源表达玉米的白化/玻璃黄色12基因促进植物开花，三是白化/玻璃黄色12蛋白的基因与已报道的开花相关基因不同，是一个促进植物开花的新的基因。

附图说明

图1是RT-PCR方法扩增玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因的电泳图。

图2是拟南芥植株在MS培养基上的筛选；其中(a)为非转基因拟南芥在不含卡那霉素的MS培养基上的筛选，(b)为非转基因拟南芥在含卡那霉素的MS培养基上的筛选，(c)为本发明转基因拟南芥在含卡那霉素的MS培养基上的筛选。

图3是拟南芥移植栽培一周后情况；其中(a)为本发明表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的T1代拟南芥，(b)为非转基因的拟南芥。

图4是拟南芥移植栽培两周半后情况；其中(a)为非转基因的拟南芥，(b)为本发明表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的T1代拟南芥。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

基于RT-PCR白化/玻璃黄色12基因的克隆

提取玉米B73自交系的总RNA，并将总RNA反转录合成为第一链cDNA，以第一链cDNA为模板，利用序列特异性引物，按照常规的PCR方法克隆出预期的大小的基因的PCR扩增的产物DNA片段(图1)，PCR扩增的DNA片段经过测序分析为玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12蛋白基因。

实施例2

转基因及转基因植株的筛选

将实施例1中所得玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的cDNA的完整开放阅读框序列(如SEQ ID NO.1的序列所示)克隆在植物转基因表达载体Pcambia-1301Vector的NoclⅠ和PmlⅠ酶切位点，产生带有玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的cDNA开放阅读序列的重组表达载体。将重组表达载体导入农杆菌菌株产生带有重组表达载体的重组农杆菌菌株，得到重组农杆菌菌株，然后按照传统的蘸花转化法，也就是用重组农杆菌菌株培养液浸泡拟南芥的花器并在室内继续培养产生的T0代拟南芥种子，T0代拟南芥种子在含有20mg/mL卡那霉素得MS培养基上、16h光照/8h黑暗光周期条件下进行抗性筛选，获得抗性转化拟南芥幼苗(图2中的c)，抗性转化拟南芥幼苗以序列特异性引物{Seca2-2-F(1301)，如SEQ IDNO.3所示；Seca2-2-R(1301，如SEQ ID NO.4所示}为基础经过PCR扩增鉴定为转基因后，利用定量PCR方法检测靶标基因是否表达。平行对照实验为非转基因拟南芥，即非转基因拟南芥在不含卡那霉素的MS培养基上的筛选(图2中的a)以及非转基因拟南芥在含卡那霉素的MS培养基上的筛选(图2中的b)，经过上述检测分析后，如玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因已表达，即为获得异源表达玉米玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株，并对转基因拟南芥进行功能研究。

结果：

表达玉米黑暗响应玉米白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株的种子分别种植在不含以及含有20mg/mL卡那霉素的两种MS培养基上，同时以种植非转基因拟南芥为对照。把MS培养基上生长的卡那霉素抗性拟南芥转基因植株和非转基因拟南芥植株，移栽到盆土中进行盆栽。结果是与非转基因的野生型拟南芥相比，移植栽培一周，表达玉米白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株提前抽抽苔开花(图3中的a)，移植栽培两周半后，地上植株高度显著增高并且花的数量明显增多(图4中的b)。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

序列表

<110> 广西大学

<120> 一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因及其应用

<130> JC

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2390

<212> DNA

<213> zea mays(玉米)

<400> 1

gaaattgtgg agaagcaagc tcctggattg atgaaggaag ctgagcggtt tctaattctc 60

agcaatattg ataggctgtg gaaagagcat ctgcaggcac taaagtttgt ccaacaagct 120

gttggtttaa ggggttatgc ccaacgagat ccccttattg agtataaact tgagggatat 180

aatcttttct tagacatgat ggctcaaatc aggaggaatg ttatttattc tgtatatcag 240

gtaagttcat ccacatgtcc taaaaatttc tttcatgcta cgtttttgtt ttaaataata 300

tttgaaccac taagtttgga gtaatgtaat tactacttca ttgaaagata ggtcttatac 360

tgattagttg ctcgtgcata cggtttctat atatcataca gttaaacatt gcttatagca 420

caaaccaaca cgagctgtag tggttagagg cgagtgcttt gtttctagag acccacagtt 480

tgaatcccag tggacacgtc tttttttgat attttgctga gcacgtgggg gaactctagc 540

gatgcttgct acgcgcgtgg ggagggggac gacgcacgac gaaactctca ctttaaaggt 600

gtagtgatat aatcagcaat ggttcccttt ctgtagtggc atgcatgatg taaagacttg 660

gtatgaacat atttgaataa actagatcta cataacatgt aacttgaggt ttctgctatc 720

ggactgtctt gcactctgat ctggttaagc atcttgatcc tgattcttga atggtcacat 780

gcttcttcac ccctcaaagg gttgtgggtt ttttctctac caatgggggc tttcccttca 840

ccaccccatg ggggtggtcc acagggttca taactgcccc aacccataat gaaaacatta 900

gtgagaatca aatgcctcga aaacccaaga tttcctctgc aaggtttgtc cacgaagata 960

ttcactggac tgtcagcatg tcctagagta aaggcttcca cggcaggttg cccaaaatga 1020

ggatcccaaa tggcatgagc aatgggatat ggactaactg gaaaagtaaa gctgtaagcc 1080

ctgcatgggg tctatttttc atgcttttcc cgatgatcta gagaaaccat tgctgtttca 1140

ttcctattca tgtttatgat gttcaatatt caaatagcgt agaataggtg gaacatttaa 1200

acaagtttgg ttctttgtcg gatcataaaa cctactttta tccaagactt gtatgatttg 1260

atgatgccat gtgaactgct ggaaacatgt gaagtgtatg gctaacccaa taacaaaagt 1320

ttcagccatt acttcgtcgg tccaaaccaa ggaattcatt agaaatgttt tgaaatggat 1380

agccctctat catatatata tatatatata tatatatata gaatagtcct tttatgcaga 1440

ctgctaagtg cggagacagg aattaaaccc gtgacctcaa ggttatgagc cttgtgggct 1500

accaaattgc tcctcaaggt gtgggctacc aaattgctct gctttgctct gtagggctga 1560

aaactggtgg acgaaagaaa aagattgaat acaagtctct gttatgaatt gcactacatt 1620

caatatgagg gcgctagctc tcgtatggcc gtagcacctg tctcctctct tggggagacc 1680

ttacccctca tctcctctct ctctctctct ggccactctc tggccgccgt cgtcagcgct 1740

cccatggtcg gcgtgcctgt ctcctcccat ggggaggcct tcctcctatc atctctctcc 1800

ctagtcgttt gtgggctggc gtcactggtg tcatcaaatg catatatttg gtactattag 1860

cacggcgtcc tttagtttat atatatattc tgattcttct aaaatcatcc tctttttcaa 1920

cagttcaaac cagtagtgaa gaaccaagaa ggggaagcat cccaaaaggt gtcaaaaaag 1980

aaactggaca aaggagctaa caaacttggt gctgcccaag ctgcgtcatg atcttcctgt 2040

gagaaacgtt gctggtgctt ttagttgcag tggctgcagt ctccacgtgt acaaagatgg 2100

tctatactcg ataccgtatg agaaatgtac ttcatgcatg gtatgagtaa gctgattttg 2160

gtagcttcat acaggggcag ccttccagta tatatatata tatatatata tatatatatg 2220

ctttcttgag ctattgatgt tatcagcaga tcctgtgcct cagcagattg ttgttcatag 2280

tgcatagcat cgattttact agttgtacag aaatagaaca cggtcaatga aagagtcttt 2340

gctcctcaac ccacactttt ttgtataata atgtaattca ttcttatcgg 2390

<210> 2

<211> 105

<212> PRT

<213> zea mays(玉米)

<400> 2

Met Lys Glu Ala Glu Arg Phe Leu Ile Leu Ser Asn Ile Asp Arg Leu

1 5 10 15

Trp Lys Glu His Leu Gln Ala Leu Lys Phe Val Gln Gln Ala Val Gly

20 25 30

Leu Arg Gly Tyr Ala Gln Arg Asp Pro Leu Ile Glu Tyr Lys Leu Glu

35 40 45

Gly Tyr Asn Leu Phe Leu Asp Met Met Ala Gln Ile Arg Arg Asn Val

50 55 60

Ile Tyr Ser Val Tyr Gln Phe Lys Pro Val Val Lys Asn Gln Glu Gly

65 70 75 80

Glu Ala Ser Gln Lys Val Ser Lys Lys Lys Leu Asp Lys Gly Ala Asn

85 90 95

Lys Leu Gly Ala Ala Gln Ala Ala Ser

100 105

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial sequence(人造序列)

<400> 3

acgggggact cttgaccatg aaggaagctg agcggttt 38

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial sequence(人造序列)

<400> 4

gtcacctgta attcacacgt gtcatgacgc agcttgggc 39

Claims

1.一种玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因，其特征在于：所述基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因，其特征在于：所述玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种如权利要求1所述得玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因在促进拟南芥开花中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将所述得玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因导入拟南芥中，得到转基因拟南芥植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将所述得玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因cDNA序列克隆到植物转基因表达载体Pcambia-1301Vector的NoclⅠ和PmlⅠ酶切位点，获得重组表达载体。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述重组表达载体导入拟南芥的方法包括以下步骤：

(1)将重组表达载体导入农杆菌菌株，得到重组农杆菌菌株；

(2)用重组农杆菌菌株培养液浸泡拟南芥的花器并在室内继续培养产生的T0代拟南芥种子，通过后续筛选，获得异源表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的后续筛选为：T0代拟南芥种子在含有20mg/mL卡那霉素的MS培养基上、16h光照/8h黑暗光周期条件下进行抗性筛选，获得抗性转化拟南芥幼苗，抗性转化拟南芥幼苗以序列特异性引物为基础经过PCR扩增鉴定为转基因后，利用定量PCR方法检测靶标基因是否表达，经过上述检测分析后，如玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因已表达，即获得异源表达玉米黑暗响应白化/玻璃黄色12基因的拟南芥转基因植株。