CN111518803B - 一种RNAi片段及其用于调控木质素合成的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种RNAi片段及其用于调控木质素合成的应用，属于植物基因工程技术领域，将如SEQ ID NO.1所示的改良DNA序列，以“尾尾相连”的方式组成RNAi片段，其序列如SEQ ID NO.2所示。将该RNAi片段应用于转基因植株中，证明了该RNAi片段具有调控木质素合成的作用。本发明通过对尾叶桉CAD基因序列的研究，有助于推动尾叶桉转基因定向调控木质素合成的基因工程育种。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种RNAi片段及其用于调控木质素合成的应用。
背景技术
广西的桉树研究在我国处于领先地位，20世纪70年代初期就开始引种，经过多年的引种试验及杂交选育，得到了多个优良树种、优良种源及优良家系。尾叶桉GLU4无性系(Eucalyptus urophylla clone GLU4)是广西广泛种植的桉树良种，因其纤维素含量、纤维素长度等制浆指标显著优于其他桉树品种，成为纸浆材造林首选树种。从纸浆材生产需求出发，希望木材中的木质素含量更低所以定向调控木质素合成，成为纸浆材品质提升的主要研究策略。但至目前为止，在尾叶桉中尚未有CAD基因序列的报道，利用其中的基因序列进行基因工程调控尚未开展。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种RNAi片段及其构建得到的植物表达载体、宿主细胞等在植物木质素单体用于调控木质素合成的应用，以有效地定向调控木质素合成，在木质素合成调控的基因工程研究中的发挥重要作用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种RNAi片段，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列具有如SEQ ID NO.1所示DNA序列。
SEQ ID NO.1tggttgagtgccgcagaagctgtcgcccttgcaattccgaccag
进一步地，所述RNAi片段的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.2
tggttgagtgccgcagaagctgtcgcccttgcaattccgaccag ctggtcggaattgcaagggcgacagcttctgcggcactcaacca
本发明提供一种重组植物表达载体，包含所述的RNAi片段。
进一步地，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S2。
本发明提供一种宿主细胞，包含所述的RNAi片段或所述的重组植物表达载体。
进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。如大肠杆菌JM109菌株、农杆菌LBA4404菌株。
本发明提供一种源于尾叶桉CAD基因序列的RNAi片段的应用，是将所述的RNAi片段、所述的重组植物表达载体、或所述的宿主细胞应用于降低植物木质素合成中。
进一步地，是将所述的RNAi片段或重组植物表达载体转化入植物，定向降低植物木质素合成。
进一步地，是将所述宿主细胞侵染植物。降低植株木质素含量的效果。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明摒弃了传统研究策略中使用全长基因的思路，通过对尾叶桉CAD基因序列进行生物信息学分析，根据序列编码蛋白的结构域预测以及结构域对酶活性的重要性的分析，选取了其中一段较短的DNA序列，该段序列编码蛋白包含对CAD酶活性极为重要的Zn结合结构位点。同时根据陆生植物CAD序列同源比对分析结果，对序列进行了碱基改良，得到了改良后的DNA序列：SEQ ID NO.1tggttgagtgccgcagaagctgtcgcccttgcaattccgaccag。
2.利用本发明获得的改良后的DNA序列构建成RNAi片段，可以高效识别CAD基因中的Zn结合结构位点目标片段，并引发RNA干扰，抑制CAD基因表达，降低植物中CAD酶活性。
3.本发明在应用中仅使用较短的DNA序列“尾尾相连”组成RNAi片段，通过序列合成的方式商业化的获得目标RNAi片段，避免了传统研究策略中利用限制性内切酶的构建过程，大大简化了实验步骤，缩短实验周期。
4.本发明对RNAi片段转化烟草植株的木质素含量进行检测，结果显示转基因烟草植株中木质素含量比野生型烟草降低11.44％，验证了RNAi片段对木质素合成的调控作用，证明了这段RNAi片段具有抑制木质素合成的作用，可达到降低植株木质素含量的效果。
附图说明
图1是本发明实施例中野生型植株茎部切片的照片。
图2是本发明实施例中转基因型植株茎部切片的照片。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、改良DNA序列
利用Blastp、ProtParam、psipred、SWISS-MODEL生物信息学软件对尾叶桉CAD基因序列进行序列分析，筛选得到一段编码蛋白序列富含Zn结合结构位点的候选DNA序列(SEQID NO.3：tggttgggtgccgcagaagctgtggcccttgcaattcggaccag)，以此候选序列为基础，利用Blastn等在线工具将候选序列与陆生植物CAD基因序列别对，根据序列同源性、一致性分析结果，对候选序列进行改良，得到一段44bp序列S-2(SEQ ID NO.1)，序列信息为：5'–tggttgagtgccgcagaagctgtcgcccttgcaattccgaccag-3'。
实施例2、构建RNAi片段
根据实施例1的序列S-2，以“尾尾相连”的方式设计成反向重复序列S2(SEQ IDNO.2)，序列信息为：
5'–tggttgagtgccgcagaagctgtcgcccttgcaattccgaccagctggtcggaattgcaagggcgacagcttctgcggcactcaacca-3'。
实施例3、构建RNAi表达载体
在实施例2所述序列S2两端附加XhoI酶切位点后，交由生物公司合成序列，得到携带目标片段的克隆载体pUC57-S2。
取携带pUC57-S2质粒的大肠杆菌过夜培养菌液，采用离心柱型普通质粒小提试剂盒(天根)完成质粒提取。将质粒用XhoI酶消化，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，切取100bp左右的目标序列S2条带，用Universal DNA纯化回收试剂盒(天根)回收。同时利用XhoI酶消化pCAMBIA3301质粒，得到去除掉bar基因序列的载体骨架，将载体骨架与目标序列S1连接，连接产物转化DH5a，应用载体上的测序引物3301-F(5'–CCCTTATCTGGGAACTACTCAC-3')/3301-R(5'–CGCTGAAATCACCAGTCTCTC-3')对转化子进行PCR鉴定，构建正确的载体可扩增得到200bp左右的特异性条带，对长度正确的克隆提取质粒进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的为构建成功的RNAi载体，命名为pCAMBIA3301-S2。
实施例4、利用RNAi片段调控烟草木质素合成
采用常规方法，将实施例3中的pCAMBIA3301-S2重组载体导入农杆菌LBA4404，经抗生素平板筛选、PCR鉴定以及测序鉴定得到阳性菌株。按照常规方法农杆菌菌液侵染烟草叶片，经共培养、分化、壮苗、生根、移栽等阶段的培养后，获得转基因烟草小苗。
移栽8周后，采集小苗叶片提取总DNA，用特异性引物3301-F/3301-R对小苗进行PCR鉴定，能成功扩增出约200bp条带的植株，进一步对PCR产物进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的植株鉴定为阳性转基因植株。
转基因植株在生长上与野生型并没有明显差异，植株叶片展开，叶色翠绿，茎干挺直，8月龄时苗高达到1.5m左右，10月龄时开花结实。8月龄时采集样品用于表型检测，包括以下几方面检测：
(1)目标基因表达水平检测
采用烟草actin基因(EU938079)作为内参基因，烟草CAD基因(X62343.1)做为目标基因，设计荧光定量检测引物，检测RNAi片段对目标基因表达水平的影响，引物序列如下：
actin-F CTGGAATCCATGAGACTACTTACAA；
actin-R AACCGCCACTGAGCACAATA；
CAD-F:GTATGGCACCAGAACAAGCAG；
CAD-R:CCAATGCCTCTTGTCTCTTCTTAT。
在转基因烟草植株茎尖向下第5节处采集叶片组织，以野生型烟草做为对照，采用RNA prep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒进行RNA提取，后采用RNA LA PCR反转录试剂盒合成cDNA。采用ABI SybrGreen PCR Master Mix(2X)试剂盒对基因表达水平进行荧光定量PCR检测。检测到烟草CAD基因表达水平见表1。
表1：转基因烟草中CAD基因表达水平分析
| 植株编号 | 烟草CAD基因相对表达水平 |
| 野生型 | 1.0131±0.0125 |
| 转基因植株 | 0.1270±0.0267 |
由表1可见，在对转基因植株进行检测时，检测到烟草CAD基因表达水平降低至野生型的12.71％，说明转入的RNAi片段如预期显著抑制了烟草CAD基因的表达。
(2)茎部木质素含量检测
分别选取对照及转基因烟草植株，选择茎部顶端向下数第3节至第10节，摘去叶子，将茎杆切成小段，放置在60℃烘箱中烘干24小时后，粉碎过150目筛，用于酸性洗涤木质素含量检测。酸性洗涤木质素含量测定采用GB/T 20805-2006方法。检测结果见表2。
表2：转基因烟草中木质素含量
| 植株编号 | 木质素含量(％) |
| 野生型 | 13.37±0.04 |
| 转基因植株 | 11.84±0.05 |
由表2检测结果可见，转基因植株中木质素降低11.44％。
(3)转化植株茎部直径、木质部厚度变化
取9月龄烟草茎部顶端向下数第6节茎部组织，按常规方法横切制成石蜡切片，并用番红-固绿法染色，根据切片测量茎部直径和木质部厚度。所述野生型植株切片如图1所示，转基因型植株切片如图2所述。具体数据见表3。
表3转化植株茎部直径、木质部厚度变化
根据图1、图2、以及测量其结果表3可见，转基因株系和野生型之间的茎部直径的测量结果显示无差异显著，但转基因植株木质部厚度较野生型降低了7.61％。说明本发明RNAi片段对木质素合成的调控作用。
实施例5、将重组载体转化入植物调控烟草木质素合成
将实施例3中的pCAMBIA3301-S2重组载体提取质粒后，按照常规方法与金粉混合并利用基因枪轰击烟草愈伤组织。按照常规方法，经高渗培养、恢复培养、分化、壮苗、生根、移栽等阶段的培养后，获得转基因烟草小苗。
移栽8周后，采集小苗叶片提取总DNA，用特异性引物3301-F/3301-R对小苗进行PCR鉴定，能成功扩增出约200bp条带的植株，进一步对PCR产物进行测序，测序结果与目标序列比对，序列一致的植株鉴定为阳性转基因植株。
将得到的转基因植株在生长上与野生型进行对比，其外观并没有明显差异，植株叶片展开，叶色翠绿，茎干挺直，8月龄时苗高达到1.5m左右，10月龄时开花结实。8月龄时采集样品用于如实施例4的表型检测，得到的检测结果与实施例4相近，说明本发明中的pCAMBIA3301-S2重组载体转化入植物与宿主侵染植物得到的结果一致，具有重现性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区林业科学研究院
<120> 一种RNAi片段及其用于调控木质素合成的应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 尾叶桉(Eucalyptus calophylla)
<400> 1
tggttgagtg ccgcagaagc tgtcgccctt gcaattccga ccag 44
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggttgagtg ccgcagaagc tgtcgccctt gcaattccga ccagctggtc ggaattgcaa 60
gggcgacagc ttctgcggca ctcaacca 88
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 尾叶桉(Eucalyptus calophylla)
<400> 3
tggttgggtg ccgcagaagc tgtggccctt gcaattcgga ccag 44
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Cys Cys Thr Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Ala Cys Thr
1 5 10 15
Ala Cys Thr Cys Ala Cys
20
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Cys Gly Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr
1 5 10 15
Cys Thr Cys Thr Cys
20
<210> 6
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Thr Gly Gly Ala Ala Thr Cys Cys Ala Thr Gly Ala Gly Ala Cys
1 5 10 15
Thr Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Ala
20 25
<210> 7
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Ala Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys
1 5 10 15
Ala Ala Thr Ala
20
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Thr Ala Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Gly Ala Ala Cys Ala
1 5 10 15
Ala Gly Cys Ala Gly
20
<210> 9
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Gly Thr Cys Thr
1 5 10 15
Cys Thr Thr Cys Thr Thr Ala Thr
20
Claims (7)
1.一种RNAi片段，其特征在于，是由一段源于尾叶桉CAD基因的改良的DNA序列以“尾尾相连”的方式组成；所述改良的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述RNAi片段的DNA序列如SEQID NO.2所示。
2.一种重组植物表达载体，其特征在于：包含权利要求1所述的RNAi片段。
3.根据权利要求2所述的重组植物表达载体，其特征在于，所述重组植物表达载体是以pCAMBIA3301为基础，构建得到的重组载体pCAMBIA3301-S2。
4.一种宿主细胞，其特征在于：包含如权利要求1所述的RNAi片段或包含权利要求2或3所述的重组植物表达载体；所述宿主细胞为大肠杆菌或农杆菌。
5.权利要求 1所述的RNAi片段、权利要求2或3所述的重组植物表达载体、或权利要求4所述的宿主细胞在降低烟草木质素合成中的应用。
6.根据权利要求5所述的在降低烟草木质素合成中的应用，其特征在于，是将所述的RNAi片段或重组植物表达载体转化入烟草，定向降低烟草木质素合成。
7.根据权利要求5所述的在降低烟草木质素合成中的应用，其特征在于，是将所述宿主细胞侵染烟草。
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