CN111518809A - 干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干扰新冠病毒COVID‑19基因表达的siRNA，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：正义链为序列表中的SEQ ID NO:5，反义链为序列表中的SEQ ID NO:6的双链RNA序列；正义链为序列表中的SEQ ID NO:7，反义链为序列表中的SEQ ID NO:8的双链RNA序列；与上述限定的双链RNA序列具有95％以上相似性，且具有沉默RDRP基因或S基因功能的双链RNA序列。本发明提供的siRNA序列是针对COVID‑19病毒S蛋白和RDRP酶的mRNA序列设计，可有效抑制病毒关键蛋白的表达，为抗COVID‑19病毒药物的开发提供重要的参考意义。
Description
技术领域
本发明涉及RNA干扰抗病毒领域，具体涉及一种干扰新冠病毒COVID-19 基因表达的siRNA及其应用。
背景技术
新冠病毒COVID-19属于严重急性呼吸综合征相关冠状病毒的一个新毒株， 与2003年发现的SARS-CoV为姊妹株，均同属于冠状病毒科B-冠状病毒属。 COVID-19病毒的人传人能力超强，其传染性及所造成的绝对病死率远远超过 SARS-CoV及MERS-CoV的感染。
COVID-19病毒侵入宿主细胞主要依靠由S基因编码表达的病毒表面刺突蛋 白(SProtein)与宿主细胞表面的血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，使病毒基 因组进入人体细胞开始感染。S蛋白的两个功能单位中，S1亚基含有一个重要 的C端受体结合结构域，促进病毒结合到宿主细胞受体，因此，沉默S蛋白的 编码基因，抑制S蛋白的产生，可有效阻止病毒与人体细胞附着和结合。
COVID-19病毒侵入宿主细胞后，依赖RDRP酶进行大量复制。COVID-19 病毒是一种冠状病毒科阳性单链RNA病毒，可直接由mRNA链指导蛋白质的合 成，也可以以病毒基因组RNA为模板，利用宿主细胞的蛋白质合成系统翻译出 RDRP酶，再利用该酶进行其他结构蛋白质的mRNA合成，生成负链完成病毒 基因组RNA的复制，从而启动病毒粒子的生命循环。因此，RDRP酶是COVID-19 病毒复制过程中的必须酶，在病毒基因组的复制和转录中具有重要作用。
RNAi(RNAinterference)技术，即RNA干扰技术，是指在真核生物中利用 21-23bp小干扰RNA诱导与其具有同源序列的靶mRNA降解的过程，从而抑制 该基因的表达。RNAi技术作为诺贝尔医学奖技术，在近年来的研究中取得重大 进展，2018年成功上市的patisiran，成为RNAi现象被发现20年以来获准上市 的首款RNAi药物；随后，在2019年11月用于治疗急性肝卟啉的givosiran成为 第二款RNAi药物获准上市。RNAi技术在动物体内能激发高效的抗病毒效应， 因此还被广泛应用于病毒性疾病的研究中，如Alnylam、Arrowhead、Dicerna等 制药公司采用RNAi技术在抗病毒研究中取得重大突破，所开发的HIV、HBV、 HCV等多种抗病毒RNAi药物已进入临床研究阶段。
COVID-19病毒是mRNA正义单链病毒，更加适合采用RNAi技术诱导病毒 mRNA降解。由于COVID-19病毒的基因序列已经明确，基因组长度约为29 903 核苷酸，因此，运用RNAi技术研究抗COVID-19病毒专用药物是完全可能的。
发明内容
本发明的目的是提供一种干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA及其 应用，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA，所 述siRNA对应的靶序列为新冠病毒COVID-19上RDRP酶或S蛋白的基因序列 上连续的21-25个核苷酸。
进一步地，所述靶序列为序列表中的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序 列。
进一步地，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：
1)正义链为序列表中的SEQ ID NO:5，反义链为序列表中的SEQ ID NO:6 的双链RNA序列；
2)正义链为序列表中的SEQ ID NO:7，反义链为序列表中的SEQ ID NO:8 的双链RNA序列；
3)与1)限定的双链RNA序列具有95％以上相似性，且具有沉默RDRP 基因功能的双链RNA序列；
4)与2)限定的双链RNA序列具有95％以上相似性，且具有沉默S基因功 能的双链RNA序列。
进一步地，双链RNA 3′端还含有dTdT结构。
本发明根据siRNA设计原则，选择的siRNA(RDRP酶)的cDNA序列GC含 量为33％、siRNA(S蛋白)的cDNA序列GC含量为33％，分别对应RDRP基因 mRNA序列的第84-104位核苷酸、S基因mRNA序列的第215-235位核苷酸，3′ 端dTdT结构增加了siRNA的稳定性。
本发明第二方面提供了上述干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA在 制备抗新冠病毒COVID-19药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明公开了有效干扰新冠病毒COVID-19基因表达的靶序列和siRNA序 列。针对新冠病毒COVID-19RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)、表面S蛋白 的基因序列分别设计一组siRNA分子，根据siRNA设计规则，筛选出理论上可 高效抗COVID-19病毒的siRNA分子。本发明中涉及的COVID-19病毒靶点可 以作为抗COVID-19病毒靶点进行药物开发；利用本发明设计的siRNA分子， 可有效抑制病毒关键蛋白的表达，可以用于制备治疗或预防COVID-19病毒所引 起的新型冠状病毒肺炎药物，为抗COVID-19病毒的RNAi药物开发提供有效的 技术和手段。
附图说明
图1为pcDNA3.1(+)质粒结构图。
图2为RDRP、S基因转染VeroE6细胞后的PCR扩增图。
图3为RDRP-siRNA、S-siRNA对基因的抑制率。
图4RDRP-siRNA、S-siRNA对蛋白的相对表达量。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明 本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
下述试验方法和所使用的实验材料如无特别说明，均为常规方法，实验材料 均可从商业公司获取。
实施例1新冠病毒COVID-19RDRP基因、S基因的siRNA的设计和合成
参考siRNA设计原则，从目标mRNA的起始密码子AUG下游50-100nt处 搜索理想的siRNA序列，其3′端相邻21nt序列作为候选靶点，选择GC含量在 30-60％的siRNA序列，根据相应靶位点分别设计和合成一组siRNA，并通过Blast 功能与人类基因组序列进行比对，确保与人类基因无同源性。最终选择的RDRP 酶基因序列为CCCUACUAUAACUCAAAUGAA，GC含量为33％，对应mRNA 的第84-104位核苷酸；S蛋白基因序列为GACAUAUGUGACUCAACAAUU， GC含量为33％，对应mRNA的第215-235位核苷酸。其序列如下表所示：
实施例2体外构建新冠病毒COVID-19的RDRP基因、S基因
以新冠病毒COVID-19RDRP基因(序列号：1449584)、S基因(序列号： 43740568)为目标序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司在无病毒体系中合成 寡核苷酸片段，片段末端两两互补，再经过PCR过程相互延伸，最终分别组装 成完整的RDRP基因、S基因。分别将组装好的RDRP基因片段、S基因片段克 隆至质粒pcDNA3.1(+)(如图1所示)，获得两种真核表达质粒pcDNA3.1-RDRP、 pcDNA3.1-S，经过测序分析，所获得的RDRP基因、S基因序列与新冠病毒 COVID-19的RDRP基因、S基因序列一致，完全符合预期设计。
实施例3细胞培养与体外构建的RDRP基因、S基因转染
用含有10％(v/v)胎牛血清DMEM(高糖)培养基的培养瓶培养VeroE6 细胞，将培养瓶置于37℃无菌CO2细胞培养箱中。将大小均匀、状态良好的 VeroE6细胞约1.2×106分到6孔板中，并使其均匀分布。24小时后，将构建的 pcDNA3.1-RDRP、pcDNA3.1-S质粒按照SuperFect Transfection转染说明书分别 进行。转染6小时后，进行细胞换液1-2次，48小时后，收获细胞上清，45000 转/分钟、4℃离心2小时，将离心到管底部的细胞用少量DMEM高糖培养基重 悬。提取转染细胞的总RNA，经逆转录后作PCR分析，结果发现，RDRP、S 基因片段被成功扩增(如图2所示)，表明，体外构建的RDRP基因、S基因在 宿主细胞中能正确转录靶基因。
实施例4siRNA的转染
将已感染含有RDRP基因、S基因假病毒的VeroE6细胞约1.2×104分到 24孔板，24小时后进行转染。转染时按照lipofectamine RNAiMAX转染说明书 进行。大孔上每孔siRNA终浓度为50nM,lipofectamine RNAiMAX加入1Ul。转 染6小时后去掉细胞上清，加入新鲜DMEM高糖培养基培养24小时，之后将 细胞分到96孔板中，转染48小时。
实施例5实时荧光定量PCR检测siRNA对基因的抑制效果
分别收集实施例4的细胞，用trizol试剂提取总RNA，然后使用TaKa逆转 录试剂盒进行逆转录合成cDNA后，通过实时荧光定量PCR观察siRNA对基因 的抑制效果，实时荧光定量PCR采用荧光定量PCR试剂盒(QIAGEN)，内参 基因采用GAPDH。结果显示(如图3所示)，与阴性对照组相比，RDRP-siRNA 对RDRP基因的抑制率为79.5％；S-siRNA对S基因的抑制率为83.5％。
实施例6流式细胞仪检测VeroE6细胞中RDRP、S蛋白的表达情况
siRNA转染后72小时，分别收集每孔内的VeroE6细胞，用胰酶消化细胞， 加入5mlDMEM高糖培养基反复吹打，1000转/分钟离心5分钟，用PBS缓冲液 (0.01M，pH 7.4)清洗2次后重悬于PBS中，用流式细胞仪在488nm激光波长 下检测每孔细胞平均荧光强度及荧光阳性细胞比率，计算每孔细胞的总荧光强 度。结果显示(如图4所示)，与阴性对照组相比，RDRP-siRNA对RDRP蛋白 表达的抑制率为68.3％；S-siRNA对S蛋白表达的抑制率为72.3％。
序列表
<110> 杭州勇诚睿生物科技有限公司
<120> 干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 338
<212> DNA
<213> RDRP基因cDNA(人工序列)
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ttcaagactc actttcttcc acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc 60
aaaatgcaca agctttaaac acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt 120
caagtgtttt aaatgatatc ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg 180
ataggttgat cacaggcaga cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta 240
gagctgcaga aatcagagct tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac 300
ttggacaatc aaaaagagtt gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc 360
agtcagcacc tcatggtgta gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga 420
acttcacaac tgctcctgcc atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg 480
tctttgtttc aaa 493
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> RDRP-RNA(人工序列)
<400> 3
cccuacuaua acucaaauga a 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> S-RNA(人工序列)
<400> 4
gacauaugug acucaacaau u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> RDRP-siRNA正义链(人工序列)
<400> 5
cccuacuaua acucaaauga a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> RDRP-siRNA反义链(人工序列)
<400> 6
gggaugauau ugaguuuacu u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> S-siRNA正义链(人工序列)
<400> 7
gacauaugug acucaacaau u 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> S-siRNA反义链(人工序列)
<400> 8
cuguauacac ugaguuguua a 21
Claims (5)
1.一种干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA对应的靶序列为新冠病毒COVID-19上RDRP酶或S蛋白的基因序列上连续的21-25个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA，其特征在于，所述靶序列为序列表中的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示序列。
3.根据权利要求2所述的干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA是下述双链RNA序列之一：
1)正义链为序列表中的SEQ ID NO:5，反义链为序列表中的SEQ ID NO:6的双链RNA序列；
2)正义链为序列表中的SEQ ID NO:7，反义链为序列表中的SEQ ID NO:8的双链RNA序列；
3)与1)限定的双链RNA序列具有95％以上相似性，且具有沉默RDRP基因功能的双链RNA序列；
4)与2)限定的双链RNA序列具有95％以上相似性，且具有沉默S基因功能的双链RNA序列。
4.根据权利要求3所述的干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA，其特征在于，双链RNA 3′端还含有dTdT结构。
5.权利要求1-4任一权利要求所述的干扰新冠病毒COVID-19基因表达的siRNA在制备抗新冠病毒COVID-19药物中的应用。
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