CN111518194A

CN111518194A - 具有抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染活性的ecl2多肽及其应用

Info

Publication number: CN111518194A
Application number: CN202010375836.5A
Authority: CN
Inventors: 肖一红; 丁国飞
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-08-11
Anticipated expiration: 2040-05-07
Also published as: CN111518194B

Abstract

本发明公开了一种具有抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染活性的ECL2多肽及其应用。本发明研究发现CLDN4的胞外区ECL2可以与PRRSV的GP3蛋白相互作用，合成的ECL2多肽，可显著降低PRRSV在细胞中的感染，也可中和细胞培养上清中的PRRSV粒子，因此ECL2的多肽可开发成防治PRRSV感染的药物，来抑制PRRSV感染，降低PRRSV的病毒血症，从而为PRRS研究和防治提供了重要的物质基础，对于实际生产有着极为重要的意义。

Description

具有抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染活性的ECL2多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物学技术领域，具体涉及一种具有抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染活性的ECL2多肽及其应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称为蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)引起的一种急性传染病。该病主要特征为母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难，对养猪业造成巨大的经济损失。PRRSV具有高度的变异性，我国于1996年首次分离到该病毒，称为低致病性PRRSV(LP-PRRSV)，10年后出现了高致病性猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(HP-PRRSV)，2013年出现了NADC30-样PRRSV(NADC30-like)。自NADC30-样PRRSV的出现以来，不断有该毒株与HP-PRRSV进行重组组成的新的变异株的出现，变异株不仅在基因组上发生变化，而且在毒力和诱导的机体的免疫反应等方面都发生了变化，所以导致现有的疫苗对其免疫保护力减弱，致使PRRS不断的暴发和流行，急需找到治疗该病的药物或者是有有效的疫苗毒株。

细胞粘附是维持组织结构稳定的基本组成，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，影响细胞的增殖、分化等重要功能。紧密连接(Tight junctions，TJ)是其中的一种重要形式，由咬合蛋白(occludin，OCLN)，闭合蛋白(claudin，CLDN)和连接黏附分子(Junctionadhesion molecule，JAM)3种完整的膜蛋白和闭合小环蛋白(ZO-1，ZO-2和ZO-3)等外周胞浆蛋白组成。其中以CLDN的功能最为重要，是构成TJ的主要骨架蛋白。目前，在哺乳动物中，已发现27种CLDN分子，这些CLDN分子不仅可以作为细胞与细胞之间的物理性屏障阻止病毒感染，也可以被病毒利用或者破坏，从而有利于病毒的感染。

CLDN4蛋白作为紧密连接蛋白家族中的主要成员之一，主要分布于脑、肾、肺、小肠和结肠的组织中，在多种病毒感染过程中起着重要作用。发明人在前期研究PRRSV感染的转录组学时发现，PRRSV感染早期下调CLDN4表达，感染后期上调CLDN4；并进一步研究了CLDN4在PRRSV感染过程中的作用。但是，对于CLDN4与PRRSV相互作用的结构区域目前还未见有报道，这制约了CLDN4在开发PRRSV治疗药物中的应用。

发明内容

针对上述现有技术，本发明深入研究了CLDN4在PRRSV感染过程中的作用，发现CLDN4在不同类型PRRSV感染过程中起着相同或相似的作用，可以作为抗不同类型PRRSV感染的靶标。对于CLDN4与PRRSV相互作用的结构区域，本发明研究发现CLDN4可以和PRRSV的GP3相互作用，其具体结合部位在CLDN4胞外区ECL2。基于此，本发明提出了下述方案：

本发明的第一方面，提供一种ECL2多肽，所述ECL2多肽为如下(1)-(2)中的任一：

(1)猴源ECL2多肽(mCLDN4-ECL2)，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)猪源ECL2多肽(sCLDN4-ECL2)，其序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述ECL2多肽在制备抑制猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

上述应用中，所述猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒为：HP-PRRSV、LP-PRRSV和/或NADC30-like。

上述应用中，所述ECL2多肽通过与猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的GP3蛋白相互作用来抑制病毒感染。

本发明的第三方面，提供一种抑制猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂，所述阻断剂以上述的ECL2多肽为有效成分。

本发明的第四方面，提供上述ECL2多肽或者阻断剂在制备防治PRRSV感染的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明研究发现CLDN4蛋白是通过胞外区ECL2与PRRSV结构蛋白GP3相互作用来实现抑制PRRSV感染的，因此设计合成了猪源ECL2多肽和猴源ECL2多肽，结果发现这两种ECL2多肽均可以显著抑制PRRSV在细胞中复制和在细胞上清中的滴度，可以开发成防治PRRSV感染的药物。

本发明还研究发现CLDN4蛋白可以作为抗不同类型PRRSV感染的靶标，因此，以CLDN4蛋白为靶标开发的ECL2多肽治疗药物对不同类型PRRSV均具有治疗效果，有效解决了由于PRRSV高度变异性所导致的治疗药物药效降低或者无效的问题。

附图说明

图1：Marc-145细胞感染HP-PRRSV对紧密连接蛋白家族成员CLDN3和CLDN4的mRNA水平和蛋白水平影响的Real-time PCR(A)和Western blot(B)检测结果。

图2：CLDN4过表达的Marc-145细胞系中CLDN4表达验证(A)和PRRSV N基因表达的Real-time PCR(B)结果以及N蛋白表达的Western blot(C)检测结果。

图3：LP-PRRSV CH-1R毒株(A和C)和NADC30-like毒株(B和D)在CLDN4过表达和敲除的Marc-145细胞系中N基因表达的Real-time PCR检测结果。

图4：HEK293T细胞中通过免疫沉淀实验验证PRRSV结构蛋白与CLDN4的相互作用(A)以及CLDN4两个胞外区ECL1和ECL2与结构蛋白GP3之间的相互作用(B)。

图5：不同浓度的ECL2多肽在Marc-145细胞(A)以及PK15^CD163细胞(B)中对病毒增殖影响的Real-time PCR检测结果。

图6：在Marc-145细胞(A)以及PK15^CD163细胞(B)中感染TA-12 12、24小时后，在细胞培养上清中加入不同浓度ECL2对细胞上清中PRRSV感染影响的Real-time PCR结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，PRRSV具有高度的变异性，变异株不仅在基因组上发生变化，而且在毒力和诱导的机体的免疫反应等方面都发生了变化，因此，现有的PRRSV药物难以实现对不同类型的PRRSV感染进行同时阻断，给目前临床上以HP-PRRSV和LP-PRRSV流行为主的疫情的预防和治疗带来了极大的困难。

CLDN是构成紧密连接的主要骨架蛋白，CLDN分子不仅可以作为细胞与细胞之间的物理性屏障阻止病毒感染，也可以被病毒利用或者破坏，从而有利于病毒的感染。本申请发明人在前期研究中发现PRRSV感染早期下调CLDN4表达，感染后期上调CLDN4，因此可以确定CLDN4在PRRSV感染中是发挥重要作用的。但是，对于具体的作用机理还有待进一步研究。

基于此，本发明在前期研究的基础上，对CLDN4在PRRSV感染中的作用过程进行了如下深入研究：

第一，本发明研究发现CLDN4过表达的Marc-145细胞系能显著的抑制HP-PRRSV、LP-PRRSV和NADC30-like毒株的感染；CLDN4的敲除能显著的促进HP-PRRSV、LP-PRRSV和NADC30-like毒株的感染。这些结果表明，CLDN4在不同类型PRRSV感染过程中起着相同或者相似的作用。说明CLDN4可以作为抗不同类型PRRSV感染细胞靶标。

第二，本发明以HP-PRRSV(代表毒株为TA-12，GenBank的登录号为HQ416720)为例研究发现，CLDN4可以和PRRSV的GP3相互作用，其具体结合部位在CLDN4胞外区ECL2。

第三，为了研究ECL2作为抗PRRSV感染的药物的可能性，本发明合成了猪源和猴源ECL2的多肽，其氨基酸序列如下：

猴源ECL2(mCLDN4-ECL2)多肽序列：NIIQDFYNPLVASGQKREMGAS；(SEQ ID NO.1)。

猪源ECL2(sCLDN4-ECL2)多肽序列：AHNVIRDFYNPLVASGQKRE(SEQ ID NO.2)。

发现在感染HP-PRRSV的Marc-145细胞中加入猴源ECL2多肽可以显著抑制病毒在细胞中复制和在细胞上清中的滴度，在猪源细胞系PK15^CD163中加入猪源ECL2多肽可以显著抑制病毒在细胞中复制和在细胞上清中的滴度。

进一步研究发现，ECL2多肽加入量的增加和作用时间的延长，都会显著抑制病毒感染，ECL2的抗PRRSV感染效果呈剂量依赖性。

以上研究表明：CLDN4胞外区ECL2多肽能够稳定地作为PRRSV感染细胞的多肽，可以将ECL2多肽开发成防治PRRSV感染的药物，该药物对不同类型PRRSV感染均会具有很好的治疗效果，对于实际生产有着极为重要的意义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：CLDN4参与PRRSV感染

CLDN4是紧密连接家族的重要成员，是构成细胞紧密连接的主要骨架蛋白。我们前期在研究HP-PRRSV感染Marc-145细胞的转录组学时发现，CLDN4参与PRRSV感染。因此我们进一步通过Real-time PCR和Western blot检测HP-PRRSV感染Marc-145细胞时重要的紧密连接家族成员CLDN3和CLDN4的mRNA水平以及蛋白水平变化，发现病毒感染早期可以下调CLDN4表达，感染后期可以上调CLDN4表达，但对CLDN3的表达没有影响(见图1A和B)。

实施例2：CLDN4抑制PRRSV感染

为了进一步研究CLDN4参与PRRSV感染，根据NCBI公布的CLDN4(GenBank登录号：NM_001194564.3和NM_001161637.1)基因序列，设计了CLDN4(Monkey)基因慢病毒载体克隆引物(见表1)，构建了CLDN4过表达的Marc-145细胞系，分析对HP-PRRSV感染的影响。

从源自Marc-145细胞的cDNA扩增CLDN4基因，并将其亚克隆至含有嘌呤霉素抗性基因的cDNA中。将这些构建体(或pWPXLd空载体)与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.G(以3：2：1的比例)共转染到六孔板的HEK293T细胞中(40％-50％融合)。根据制造商的说明使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂。在48h时，收集慢病毒并感染Marc-145细胞。孵育12小时后，将用过的培养基替换为新鲜培养基。加入10μg/mL嘌呤霉素筛选CLDN4过表达的细胞以及pWPXLd空载体感染的细胞。获得CLDN4稳定过表达的Marc-145细胞，并将其称为Marc-145^CLDN4细胞。包含pWPXLd空载体的细胞称为Marc-145^wpxld细胞。

Real-time PCR和Western blot的结果显示：过表达组(Marc-145^CLDN4)CLDN4的表达量为对照组(Marc-145^wpxld)的5.06和5.3倍(见图2A)。

为了进一步验证CLDN4蛋白过表达在HP-PRRSV感染过程中的重要作用，将上述细胞系接种PRRSV(TA-12)，在不同时间点收集样品，用Real-time PCR检测病毒拷贝数，结果发现，过表达CLDN4基因后能显著的降低HP-PRRSV感染。在感染后12h、24h和36h时，对照组病毒拷贝数分别是过表达组的2.9，27.99和3.24倍(见图2B)。Western blot验证也发现CLDN4基因过表达后显著降低了HP-PRRSV的感染(见图2C)。

表1：荧光定量引物和构建CLDN4过表达细胞系用的引物

注：本发明中使用了Marc-145细胞系，Marc-145细胞系是PRRSV的易感细胞系，来自于猴肾上皮细胞。CLDN4基因序列找的是猴源保守的序列。

为了进一步研究CLDN4在不同类型的PRRSV感染中的作用，分别将LP-PRRSV CH-1R毒株和NADC30-like毒株接种在CLDN4过表达和敲除CLDN4的Marc-145细胞系中，在不同时间点收集样品，用Real-time PCR检测病毒拷贝数。

结果如图3所示，结果表明：CLDN4过表达的Marc-145细胞系能显著的抑制LP-PRRSV和NADC30-like毒株的感染(图3A、图3B)；CLDN4的敲除能显著的促进LP-PRRSV和NADC30-like毒株的感染(图3C、图3D，图中，Marc-145^CLDN4-KO表示敲除CLDN4的Marc-145细胞系)。这些结果表明，CLDN4在不同类型PRRSV感染过程中起着相同或者相似的作用。说明CLDN4可以作为抗不同类型PRRSV感染细胞靶标。

实施例3：与PRRSV结构蛋白相互作用的CLDN4胞外结构域的确定

前期在研究HP-PRRSV感染Marc-145细胞的转录组学时发现，CLDN4参与PRRSV感染，同时CLDN4过表达可以抑制PRRSV感染，接下来我们研究PRRSV与CLDN4具体的相互作用。CLDN4主要位于细胞表面，最有可能与PRRSV病毒粒子表面的结构蛋白发挥相互作用，因此，本发明以HP-PRRSV(代表毒株为TA-12，GenBank的登录号为HQ416720)为例，将HP-PRRSV结构蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M基因以及CLDN4基因连接到pEGFP-C1真核表达载体，在HEK293T细胞中表达，经GFP-Trap琼脂糖珠收集与CLDN4可能相互作用的病毒结构蛋白，通过免疫沉淀结果验证发现结构蛋白GP3与CLDN4具有相互作用(见图4A)。

为了进一步研究GP3与CLDN4发挥具体相互作用的结构域，将CLDN4两个跨膜结构域ECL1和ECL2连接到真核表达载体，进一步通过免疫沉淀实验发现CLDN4胞外区ECL2与GP3具有相互作用(见图4B)。

实施例4：使用CLDN4-ECL2多肽不同量对HP-PRRSV感染的阻断实验

根据以上结果，为了进一步研究CLDN4对PRRSV感染的抑制作用，我们合成了CLDN4胞外区ECL2的多肽，分别为：mCLDN4-ECL2(NIIQDFYNPLVASGQKREMGAS)和sCLDN4-ECL2(AHNVIRDFYNPLVASGQKRE)；同时使用CLDN3的ECL2多肽(mCLDN3-ECL2：NTIIREFYNPVVPEAQKREMGTS，GenBank登录号：NM_001194562.2；sCLDN3-ECL2：VGAQCTNCVQDDTAKAKILY，GenBank登录号：NM_001160075)作为对照；MOCK组是使用稀释多肽的溶剂做同样的处理得出的结果。

在37℃下用不同浓度的CEL2肽处理细胞1h，并通过在室温下用TA-12感染细胞来验证多肽对PRRSV病毒传播的影响。

将mCLDN4-ECL2和sCLDN4-ECL2肽(10μg、50μg、100μg、200μg、400μg、800μg和1600μg)与TA-12在37℃孵育1小时，然后分别接种到Marc145或过表达CD163受体的PK15细胞系(PK15^CD163细胞)上，在37℃下进一步孵育24小时，以检测ECL2在病毒感染中的作用。提取所有收集的细胞的病毒RNA，并通过Real-time PCR检测。还检测到mCLDN3-ECL2和sCLDN3-ECL2在TA-12感染中的作用作为对照。所有肽均由GenScript(中国南京)合成。

在结果中我们发现：在Marc-145细胞中加入mCLDN4-ECL2多肽100μg、200μg、400μg、800μg、1600μg时，多肽处理组病毒增殖相对于对照组分别抑制了1204、794、31398、35661和34074倍(见图5A)。同时在猪源细胞系PK15^CD163细胞系中也得到了相同的效果，在加入sCLDN4-ECL2多肽100μg、200μg、400μg、800μg、1600μg时，病毒增殖相对于对照组分别抑制了90.4、501.2、631、707.9和1058倍(见图5B)。

实施例5：使用CLDN4-ECL2多肽不同时间对HP-PRRSV感染的阻断实验

基于以上研究结果，我们又进一步通过在病毒感染不同时间加入多肽验证ECL2多肽对病毒的影响。首先用MOI为1的TA-12感染Marc145或PK15^CD163细胞12h和24h加入mCLDN4-ECL2和sCLDN4-ECL2肽(100μg、300μg和900μg)，同时用mCLDN3-ECL2和sCLDN3-ECL2在TA-12感染中的作用作为对照。提取所有收集的细胞的病毒RNA，并通过Real-time PCR检测。结果发现在感染病毒12h加入多肽100、300和900μg后，多肽处理组病毒增殖相对于对照组分别抑制了7.94、702和3981倍。在感染病毒24h加入多肽300μg和900μg后，多肽处理组病毒增殖相对于对照组分别抑制了22.9和758.6倍(见图6A)。同时在猪源细胞系PK15^CD163细胞系中也得到了相同的效果，在感染病毒12h加入sCLDN4-ECL2多肽100μg、300μg和900μg后，多肽处理组病毒增殖相对于对照组分别抑制了40.7、5.01和12.6倍。在感染病毒24h加入多肽300μg和900μg后，多肽处理组病毒增殖相对于对照组分别抑制了12.5和50.1倍(见图6B)。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 具有抑制猪繁殖与呼吸综合症病毒感染活性的ECL2多肽及其应用

<130> 2020

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Ile Ile Gln Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly Gln Lys

1 5 10 15

Arg Glu Met Gly Ala Ser

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Ala His Asn Val Ile Arg Asp Phe Tyr Asn Pro Leu Val Ala Ser Gly

1 5 10 15

Gln Lys Arg Glu

20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcgtcatca tcagcatca 19

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ggcagagtaa gccttgtc 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agatcatcgc ccaacaaaac 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacacaattg ccgctcacta 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acccactctt ccaccttcga cgct 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgttgctgta gccaaattcg 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cgacgcgtat gggtagcagc catcatcatc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cttcccgggt tacacgtagt tgctggcggc 30

<210> 11

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Asn Thr Ile Ile Arg Glu Phe Tyr Asn Pro Val Val Pro Glu Ala Gln

1 5 10 15

Lys Arg Glu Met Gly Thr Ser

20

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Val Gly Ala Gln Cys Thr Asn Cys Val Gln Asp Asp Thr Ala Lys Ala

1 5 10 15

Lys Ile Leu Tyr

20

Claims

1.一种ECL2多肽，其特征在于，所述ECL2多肽为如下(1)-(2)中的任一：

(1)猴源ECL2多肽，其序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)猪源ECL2多肽，其序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的ECL2多肽在制备抑制猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒为：HP-PRRSV、LP-PRRSV和/或NADC30-like。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述ECL2多肽通过与猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的GP3蛋白相互作用来抑制病毒感染。

5.一种抑制猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒感染的阻断剂，其特征在于，所述阻断剂以权利要求1所述的ECL2多肽为有效成分。

6.权利要求1所述的ECL2多肽或者权利要求5所述的阻断剂在制备防治PRRSV感染的药物中的应用。