CN111518037B

CN111518037B - [2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐及在制备抗癌药物中的应用

Info

Publication number: CN111518037B
Application number: CN202010481067.7A
Authority: CN
Inventors: 刘明星; 王友运; 刘建; 郭惠玲
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Wuhan Geditai Health Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-31
Filing date: 2020-05-31
Publication date: 2021-04-23
Anticipated expiration: 2040-05-31
Also published as: CN111518037A

Abstract

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种5‑氟尿嘧啶与二硫代氨基甲酸盐化合物P1的设计、合成及其在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及一种[2‑（5´‑氟尿嘧啶）乙酸‑乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐及其在制备抗肿瘤药物中的应用。将5‑氟尿嘧啶进行一定的衍生之后，与乙基苯基二硫代氨基甲酸锌通过化学键结合，设计并合成了一个潜在的多靶点抗肿瘤新药。细胞毒性实验验证了其抗肿瘤活性，并且联合铜离子使用，其对应的肿瘤细胞生长的抑制能力显著增强。肿瘤细胞克隆形成实验进一步表明其抑制细胞增殖活性的能力，细胞转移实验也显示出其对肿瘤细胞转移能力的抑制作用。

Description

[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐及在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明属于抗肿瘤药物制备技术领域，具体涉及一种5-氟尿嘧啶与二硫代氨基甲酸盐化合物P1的设计、合成及其在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其涉及一种[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

5-氟尿嘧啶(5-FU)是抑制胸苷酸合成酶(TS)的抗代谢药物，进入体内后，能在分子水平上代替正常代谢物，掺入生物大分子，干扰DNA的合成，发挥细胞毒作用从而杀灭肿瘤细胞。5-FU是细胞周期特异性药物，对S期细胞敏感。主要作用于胃肠癌、肝癌和结肠癌等的治疗。5-FU及其衍生物己应用于临床，但由于具有骨髓抑制和胃肠道等副反应，毒副作用大，因此长期以来人们一直致力于对5-FU的各种改性，试图寻找选择性更好，毒副作用更低的氟尿嘧啶化合物作为抗癌药物的先导化合物。

二硫代氨基甲酸盐衍生物可与铜离子络合形成复合物，具有抗细菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性。多项研究已报道二硫代氨基甲酸盐衍生物吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和双硫仑(DSF)能够有效降低体内铜水平，抑制蛋白酶体活性和诱导肿瘤凋亡。其中双硫仑的抗癌机制已被报道，双硫仑在机体内代谢产生两分子乙基苯基二硫代氨基甲酸根离子，这种离子与铜离子螯合形成有活性的抗癌复合物，这种复合物可以与p97-NPL4通路中的NPL4蛋白牢固结合，抑制其“质量控制”功能，使癌细胞内积累大量的残次蛋白，最终诱导癌细胞的凋亡。

药物拼合原理是药物化学中的一种常用的药物结构改造手段。其不足之处在于：由于拼合后药物分子结构比较大，往往会与设想的目标产生较大的出入。如：有时拼合药物分子的立体选择性会发生改变；有时药效基团会受到邻位较大基团的掩蔽，构成较大的空间位阻；并且断键的难易也与所连基团结构有关。药物结构改变后，药物在体内的吸收、转运、代谢等方面也随之发生变化，会导致药效学的复杂情况。如：拼合后的分子一般相对分子质量较大，所以它的细胞通透性较差；而且分子结构大，相对来说性质不太稳定，易分解，从而导致没有实际药用价值；另外有些分子在体内过于稳定，对水解酶不敏感，不能迅速定量地释放出目标药物，所以也没有临床意义。

发明内容

针对现有技术中存在的不足和为了填补本领域的技术空白，本发明的第一个目的在于提供了一种化合物P1：[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐，其结构式如下：

分子式：C₁₅H₁₄FN₃O₃S₂

分子量：367.04606

该化合物是将5-氟尿嘧啶进行适当衍生后，通过酸酐键使其与乙基苯基二硫代氨基甲酸酯连接在一起，其溶解性好，可以作为前药，在人体内酯酶的作用下分解成两种具有药物活性的化合物，从而发挥疗效，而且这两种药物在药理活性上又可以相互促进，达到增强疗效、减轻毒副作用、提高药物的生物利用度的目的。而且成酯后的药物要通过酯酶水解才可以释放出来，有延长作用时间的可能，所以值得研究开发。

本发明的第二个目的在于提供了一种所述化合物P1在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明对其进行了初步的生物活性评价，结果显示，该化合物具有明显的抑制肿瘤细胞MCF-7、U87MG、HepG2、BGC823生长的作用。

本发明的实验证明：乙基苯基二硫代氨基甲酸酯基团的引入增加了5-氟尿嘧啶衍生物的活性，说明乙基苯基二硫代氨基甲酸酯基团对5-氟尿嘧啶的抗癌活性有协同作用。在联合铜离子使用时，化合物P1的抗肿瘤活性明显增强，说明此化合物P1在肿瘤细胞内酶的作用下代谢出乙基苯基二硫代氨基甲酸盐，并与铜离子形成螯合物，进而增强活性。此化合物P1与铜离子联合使用(优选将化合物P1与铜离子按照摩尔比1:1联合使用)时，可抑制肿瘤细胞的增殖活性和转移能力，并且可以造成肿瘤细胞G1期阻滞。

所述化合物P1可以采取以下合成工艺路线来制备：

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：

1、提供了一种新的、优势突出的药用化合物；

2、制备本发明新化合物的操作步骤简单、副反应少、原料易得、溶剂绿色环保。

附图说明

图1为实施例一合成的5-氟尿嘧啶-1乙酸的¹H NMR图谱；

图2为实施例二合成的5-氟尿嘧啶-1-乙酰氯的¹H NMR图谱；

图3为实施例三合成的[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐的¹HNMR图谱；

图4为实施例三合成的[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐的¹³CNMR图谱；

图5为实施例四中MCF-7细胞毒性实验结果图；

图6为实施例四中U87MG细胞毒性实验结果图；

图7为实施例四中HepG2细胞毒性实验结果图；

图8为实施例四中BGC823细胞毒性实验结果图；

图9为实施例五中MCF-7细胞凋亡检测实验结果图，其中，*:p<0.05,**:p<0.01；

图10为实施例五中U87MG细胞凋亡检测实验结果图，其中，*:p<0.05,**:p<0.01；

图11为实施例六中MCF-7细胞克隆形成实验结果图；

图12为实施例六中U87MG细胞克隆形成实验结果图；

图13为实施例六中HepG2细胞克隆形成实验结果图；

图14为实施例六中BGC823细胞克隆形成实验结果图；

图11-14中，*:p<0.05,**:p<0.01；

图15为实施例七中MCF-7细胞Transwell实验结果图；

图16为实施例七中U87MG细胞Transwell实验结果图；

图17为实施例七中HepG2细胞Transwell实验结果图；

图18为实施例七中BGC823细胞Transwell实验结果图；

图15-18中，*:p<0.05,**:p<0.01；

图19为实施例八中MCF-7细胞的细胞周期检测实验结果图；

图20为实施例八中U87MG细胞的细胞周期检测实验结果图。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明化合物P1的制备过程及应用过程做详细说明，便于本领域技术人员清楚地理解本发明。但应该理解，以下实施例不应以任何方式被解释为对本申请权利要求书请求保护范围的限制。

实施例一-三是化合物P1的制备实施例，所用试剂均为常见市售商品，纯度级别均为分析纯，浓盐酸浓度为37wt％。

实施例一、5-氟尿嘧啶-1-乙酸的合成

向三口烧瓶中加入0.2mol氢氧化钾，40ml水，搅拌溶解后，加入0.04mol 5-氟尿嘧啶，加热至60℃搅拌30min，缓慢滴加含0.072mol溴乙酸的溴乙酸水溶液，滴加完毕后继续反应至终点(TLC跟踪)，用浓盐酸(37wt％)调pH至5.5，放入4℃冰箱冷却2h，若有沉淀析出，滤除，再用浓盐酸(37wt％)将pH调至2，放冰箱冷藏室冷却12h，过滤，沉淀物用纯水洗涤3次，再用纯水重结晶，烘干得针状晶体5-氟尿嘧啶-1-乙酸4.8g(收率63％)。¹H NMR(400MHz,dmso)δ13.22(s,1H),11.91(d,J＝5.0Hz,1H),8.05(d,J＝6.8Hz,1H),4.34(s,2H).m.p.280.3～280.9℃.

实施例二、5-氟尿嘧啶-1-乙酰氯的合成

将0.02mol实施例一制备的5-氟尿嘧啶-1乙酸溶于20mL二氯甲烷，冷却到0℃，缓慢滴加15ml二氯亚砜，滴完升至室温继续反应至终点(TLC跟踪)，旋干之后得到淡黄色固体状5-氟尿嘧啶-1-乙酰氯3.15g(收率76％)。¹H NMR(400MHz,dmso)δ11.87(d,J＝5.0Hz,1H),8.07(dd,J＝6.8,1.8Hz,1H),4.34(s,2H).m.p.270.0～272.0℃.

实施例三、[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐(化合物P1)的合成

向烧瓶中加入2.5mmol乙基苯基二硫代氨基甲酸锌和15mL四氢呋喃(THF)，搅拌，缓慢滴加含有5mmol实施例二制备的5-氟尿嘧啶-1-乙酰氯的15ml THF溶液，升温至60℃反应至终点(TLC跟踪)，过滤，将滤液蒸干，用氯仿洗涤干燥后得到类白色固体粉末状化合物P11.3g(收率71％)。¹H NMR(400MHz,dmso)δ11.88(d,J＝4.8Hz,1H),8.05(d,J＝6.8Hz,1H),7.57–7.40(m,5H),4.33(s,2H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),1.12(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,dmso)δ193.63(s),169.73(s),158.01(s),157.75(s),150.08(s),140.87(s),138.59(s),131.13(s),130.79(s),130.66–130.21(m),128.61(s),54.84(s),49.09(s),11.72(s).m.p.186.9～190.8℃.

实施例四、细胞毒性实验

人乳腺癌细胞MCF-7、胶质瘤细胞U87MG、肝癌细胞HepG2和胃癌细胞BGC823均为本申请发明人实验室的冻存材料(湖北工业大学特聘教授刘滨磊课题组赠送)。依据计数结果取适量的各肿瘤细胞悬液分别加入空白高糖培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗溶液的DMEM高糖培养基(所述双抗溶液配制方法如下：用分析天平称取1.5g青霉素和3.75g链霉素，加入到250mlPBS溶液(PBS浓度为10mM，pH为7.4，下同，不赘述)中，超声至完全溶解，在超净工作台中过滤，分装于10ml的EP管中，保存在-20℃冰箱中，备用。后续的双抗溶液与此相同，均不赘述)中，然后平均分配到96孔板中的每个孔中(100μl/孔)。在板上标记上细胞名称和铺板日期即可将96孔板放入培养箱培养(37℃，5％CO₂)。24小时后，待细胞贴壁恢复形态进入对数生长期。将化合物P1(储存浓度为10mM，溶剂为DMSO)用完全培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗溶液的DMEM高糖培养基)倍减稀释配成不同浓度，弃去96孔板中上层培养基，换为含不同浓度5-FU、化合物P1、P1/Cu(等摩尔的P1和葡萄糖酸铜混合后溶解，配制成不同浓度的溶液，该浓度指P1或葡萄糖酸铜的摩尔浓度。下同，不赘述)的培养基(含有10％胎牛血清和1％双抗溶液的DMEM高糖培养基，100μl/孔)培养(37℃，5％CO₂)24h。取MTT储备液(0.5g MTT，完全溶解于100ml1×PBS中，分装后于-20℃冰箱中冷冻备用)解冻，在96孔板中加入MTT储备液(20μl/孔)，在37℃下孵育4个小时。从培养箱中拿出96孔板，弃去上清，加入DMSO(分析纯)150μl放在摇床上10分钟溶解。在酶标仪上测其在490nm处的吸光度值。计算不同化合物处理后细胞的存活率。对照组存活率为100％，化合物P1处理过的细胞存活率＝(实验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光度-空白组吸光度)×100％，空白组只加培养液、噻唑蓝、二甲基亚砜，对照组药物浓度为零。重复噻唑蓝分析实验六次，结果见图5-8，对应的数据见表1-表4。

表1 MCF-7细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表2 U87MG细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表3 HepG2细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

表4 BGC823细胞毒性实验结果(细胞存活率/％)

从图中可以看出，在没有铜离子时，P1和阳性对照组5-FU的细胞毒性相近，而有铜离子时，P1/Cu的细胞毒性明显增强，显著强于对照组5-FU，说明P1在细胞内代谢产生5-FU和乙基苯基二硫代氨基甲酸盐共同发挥抗肿瘤作用，而乙基苯基二硫代氨基甲酸盐与铜离子形成螯合物使其抗肿瘤活性显著增强。

实施例五、细胞凋亡检测

各细胞培养至传代之后于六孔板中铺肿瘤细胞(15×10⁴/孔)，24小时后待细胞贴壁恢复形态，置换为等量的新鲜空白培养基或者含有不同浓度的P1/Cu的新鲜培养基(2mL/孔)，在培养箱中孵育48小时(37℃，5％CO₂)。

准备好一定数量的5mL EP管并标明序号置于碎冰上。取出培养板，收集上清液于相应EP管中。1×PBS洗去剩余的培养基。加入胰酶消化，待细胞成花斑状后收集所有细胞，1200rpm离心5分钟。弃去上清，以1×PBS洗2次，此时的细胞已被转移到1.5ml EP管中。加入Annexin V结合液将细胞弹散，并加入FITC染液(2.5μl/管)吹打均匀，在摇床上孵育15分钟。加入PI(碘化丙啶)染液(5μl/管)，吹打均匀，在摇床上孵育5分钟。调整每个EP管中的细胞密度(使每秒检测到的细胞数为300-500个)，过筛之后用流式细胞仪检测，结果见图9-10。

本实施例中所用培养基和实施例四相同。

本实施例用到了Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，100次，上海贝博生物。

从图9-10中可以看出，随着浓度的增加，无论是MCF-7细胞还是U87MG细胞，凋亡细胞所占的比例逐渐增加，说明P1/Cu可通过促进肿瘤细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。

实施例六、克隆形成实验

各细胞传代之后于六孔板中铺肿瘤细胞(5000/孔)。24小时后待细胞贴壁恢复形态置换为等量的空白培养基或者含有不同浓度的P1/Cu的培养基孵育7天。弃去上清，用1×PBS洗2次洗去多余的培养基。用甲醇37℃固定30分钟，1×PBS洗去多余甲醇。1×结晶紫染液(1mM)染30分钟，1×PBS洗去多余染液，拍照，结果见图11-14，对应的数据见表5。

本实施例中所用培养基和实施例四相同。

从图中可以看出，随着浓度的增加，细胞克隆数逐渐减少，当浓度为62.5μM时，细胞克隆数已接近为零，说明P1/Cu可通过抑制细胞增殖来发挥抗肿瘤作用。

表5不同细胞在不同浓度下的克隆形成率(％)

实施例七、Transwell实验

各细胞传代之后用无血清培养基混悬肿瘤细胞并进行计数。在EP管中取无血清培养基配制成浓度为0、15.625、31.25、62.5、125、250μM的P1/Cu溶液，并加入适量细胞悬液，保证每管细胞密度为1×10⁴/100μl，在Transwell板上室加入用无血清培养基配制成的细胞悬液200μl，下室加入600μl含2％胎牛血清的培养基。放在培养箱培养(37℃，5％CO₂)48小时后，吸走上室的液体后将上室放在Calcein-AM染料中染色30分钟。染色结束后用超纯水洗去多余染液，并用棉签擦去上室上表面的细胞。将Transwell小室置于载玻片上用倒置荧光显微镜拍照，结果见图15-18。

本实施例中所用培养基和实施例四相比，不含胎牛血清或含2％胎牛血清，其余均相同。即，本实施例加到Transwell板上室的为培养基+1％双抗溶液，不含胎牛血清；加到下室的为培养基+1％双抗溶液+2％胎牛血清。

从图中可以看出，随着浓度的增加，转移到transwell板上室下表面的细胞逐渐减少，这说明P1/Cu可通过降低肿瘤细胞的转移能力来发挥抗肿瘤作用。

实施例八、细胞周期检测

各细胞传代之后于六孔板中铺对数生长期的肿瘤细胞(15×10⁴/孔)。24小时后待细胞贴壁恢复形态开始进入对数生长期，加入等量的空白培养基或者不同浓度的P1/Cu(2ml/孔)在培养箱中孵育48h(37℃，5％CO₂)。

准备好一定数量的5ml EP管并标明序号置于碎冰上。取出培养板，收集上清液于相应EP管中。1×PBS洗去剩余的培养基。加入胰酶消化，待细胞成花斑状收集所有细胞，1200rpm离心5分钟。弃去上清，以1×PBS洗2次，此时的细胞已被转移到1.5ml EP管中。用预冷的70v/v％乙醇4℃固定过夜。300g离心小心弃去乙醇液并加入1ml 1×PBS将细胞团弹散洗去乙醇。加入DNA酶污染的RNA酶(50μl/管)弹散细胞37℃孵育30分钟，加入PI(终浓度50μg/ml)/10％曲拉通之后冰上作用15分钟，调整每个EP管中的细胞密度(使每秒检测到的细胞数为300-500个)，过筛之后用流式细胞仪检测。结果见图19-20。

本实施例中所用培养基和实施例四相同。

本实施例用到细胞周期检测试剂盒(100次)，上海贝博生物。

从图中可以看出，随着浓度的增加，MCF-7细胞的G0/G1期的细胞比例由37.2％增加到51.2％，U87MG细胞的G0/G1期的细胞比例由33.9％增加到53.9％，说明P1/Cu可通过阻滞细胞分裂周期来发挥抗肿瘤作用。

Claims

1.化合物[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐，其结构式为：

2.权利要求1所述的化合物[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐在制备抗肿瘤药物中的应用。

3.权利要求1所述的化合物[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐在制备抑制肿瘤细胞MCF-7、U87MG、HepG2或BGC823生长的药物中的应用。

4.权利要求1所述的化合物[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐联合铜离子在制备抑制肿瘤细胞MCF-7、U87MG、HepG2或BGC823生长的药物中的应用。

5.权利要求1所述的化合物[2-(5′-氟尿嘧啶)乙酸-乙基苯基二硫代氨基甲酸]酐联合铜离子在制备抑制肿瘤细胞MCF-7、U87MG、HepG2或BGC823的增殖活性和转移能力，并且造成肿瘤细胞G1期阻滞的药物中的应用。