CN111505151A - 高效液相色谱法测定l-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用高效液相色谱法测定L‑缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，配制L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸对照品溶液；经高效液相色谱仪检测，供试品色谱图与对照品溶液色谱图中L‑正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行对比，判定供试品溶液中是否含有其他氨基酸。本方法通过筛选氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，具体为采用高效液相色谱法检测L-缬氨酸原料中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的残留的方法。
技术背景
L-缬氨酸(L-2-氨基-3-甲基丁酸；CAS号：72-18-4)属人体必需氨基酸，作为氨基酸类药，营养增补剂，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分。其具有分子式C10H20N2O4，且具有下述结构式：
L-缬氨酸是三个支链氨基酸之一，属必需氨基酸，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，其作为氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，具有广泛的市场前景。针对发酵法生产缬氨酸均为L-型，无需旋光拆分，但在成品中会存在一些其他氨基酸，给其临床应用带来一些影响。同时由于L-缬氨酸其他氨基酸检测，在中国药典2015年版和美国药典42 版均采用薄层色谱法，其检测灵敏度差，各类氨基酸不明确，无法明确显示各类其他氨基酸的具体含量。采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系，氨基柱使用寿命不长，基线不稳，且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。采用氨基酸分析仪，设备成本和检测成本昂贵，不宜普及。本发明针对现有技术不足，经过长期实践研究，确定一种灵敏度高，检测时间短的其他氨基酸检测方法，其能够快速灵敏的检测出L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的含量，并且能够使L-缬氨酸与其他氨基酸基线分离。
发明内容
本发明的技术方案利用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸含量的检测方法。本方法通过筛选不同品牌的氨丙基键合硅胶色谱柱，找到分离效果，基线效果最好的色谱柱，筛选波长，找到各氨基酸的最大吸收，并利用乙腈/磷酸盐缓冲液二元流动相，通过调节三乙胺比例、pH值及两相比例，选择合适三乙胺的量、pH及两相比例来调控各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间，提高峰的分离度和理论塔板数，改善色谱峰形，空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。
本发明实施例采用了如下技术方案：
一种用高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为70～76：24～30的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为10～20mmol/L，加入0.1％-0.3％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.0～6.5；
流速：0.8～1.2ml/min；
柱温：20～30℃；
进样体积：20μl；
检测波长：UV210nm。
相对于现有技术，本方法简单，高效，灵敏度高，在本发明提供的检测条件下，各氨基酸峰在色谱柱上的保留时间合适，色谱峰形和分离度良好，理论塔板数高，且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，并有效防止氨基柱中键合氨丙基的水解脱落，解决氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。该方法同时检测了7种氨基酸，为控制L-缬氨酸生产工艺中的L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸检测提供了准确可靠的检测方法。
具体的，优选的，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的含量：
优选的色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
优选的流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
优选的所述磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
优选的流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
优选的，进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱。
从色谱图1-14，采用本发明的检测方法，可以快速分离L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，并能够确定各氨基酸的具体类型和含量，本发明的检测方法对于提高L-缬氨酸的纯度，更好的应用于临床用药具有重要意义。
附图说明
图1：实施例1色谱图。
图2：实施例2色谱图。
图3：实施例3色谱图。
图4：L-缬氨酸对照溶液色谱图。
图5：苯丙氨酸对照溶液色谱图。
图6：亮氨酸对照溶液色谱图。
图7：异亮氨酸对照溶液色谱图。
图8：L-正缬氨酸对照溶液色谱图。
图9：丙氨酸对照溶液色谱图。
图10：甘氨酸对照溶液色谱图。
图11：混合对照1色谱图。
图12：混合对照2色谱图。
图13：混合溶液1色谱图。
图14：混合溶液2色谱图。
图15：实施例4色谱图。
具体实施方式
实施例1
取S200308批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.1％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.1；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.1％的三乙胺，用磷酸调pH为6.1；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图1所示。
实施例2
取S200301批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为74：26的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.3％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.4；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.3％的三乙胺，用磷酸调pH为6.4；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图2所示。
实施例3
取200309批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图3所示。
实施例4
取S200307批L-缬氨酸原料约20mg，加流动相10ml溶解，作为供试品溶液，进样20μl，色谱条件如下：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L；
磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱，得到色谱图，如图15所示。
实施例5
对照样品试验：
取对照溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。色谱图中主成分峰的拖尾因子应不大于 1.5，重复进样6次，RSD应不大于2.0％，理论塔板数按L-缬氨酸峰计算应不低于2000。
其中有关物质的确定方法如下：
XP205电子天平，Dionex U3000液相色谱仪
对照溶液的制备：
L-缬氨酸对照溶液：称取L-缬氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，再量取500μl用流动相稀释至25ml，摇匀。
L-正缬氨酸对照溶液：称取L-正缬氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，作为L-正缬氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至 25ml，摇匀。
亮氨酸对照溶液：称取亮氨酸对照品(含量：99.0％)28.76mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为亮氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
异亮氨酸对照溶液：称取异亮氨酸对照品(含量：99.0％)26.24mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为异亮氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
甘氨酸对照溶液：称取甘氨酸对照品(含量：99.0％)10.00mg，用流动相溶解并稀释至20ml，摇匀，作为甘氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至25ml，摇匀。
丙氨酸对照溶液：称取丙氨酸对照品(含量：99.5％)19.79mg，用流动相溶解并稀释至50ml，摇匀，作为丙氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
苯丙氨酸对照溶液：称取苯丙氨酸对照品(含量：99.5％)20.39mg，用流动相溶解并稀释至100ml，摇匀，作为苯丙氨酸储备液；再量取500μl用流动相稀释至20ml，摇匀。
混合对照：量取L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl，丙氨酸储备液200μl，用流动相溶解并稀释至10ml，摇匀，进样两针。
混合溶液：称取L-缬氨酸(含量：99.0％)20mg，分别加入上述的L-正缬氨酸储备液、甘氨酸储备液、亮氨酸储备液、异亮氨酸储备液、苯丙氨酸储备液各100μl，储备液对照溶液200μl，用流动相溶解并稀释至10ml，摇匀，进样两针。
按照以下色谱条件和方法进行：
色谱柱：氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex Luna NH2。
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；磷酸盐缓冲液为：称取1.2g磷酸二氢钾和0.7g磷酸氢二钠溶解于1L水中，加入0.2％的三乙胺，用磷酸调pH为6.2；
用50％乙腈平衡柱子至少30分钟，然后用流动相平衡柱子至少30分钟。
流速为1.0ml/min；
检波长：210nm；
柱温：25℃；
进样方式：自动进样；
检测器：紫外检测器；
进样量为20μl；
洗脱方式：等度洗脱。
取上述混合溶液20μl注入液相色谱仪，得到色谱图，如图13和14所示，从混合溶液色谱中检查各峰之间能否分开，计算其分离度。
测定结果：取各氨基酸对照溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，对各氨基酸进行定位，结果如下表1。
表1
| 名称 | 保留时间 | 相对保留时间 | 理论塔板数 | 分离度 | 图谱号 |
| 苯丙氨酸 | 5.987 | 0.70 | 6894 | 2.57 | 图5 |
| 亮氨酸 | 6.730 | 0.79 | 8529 | 1.80 | 图6 |
| 异亮氨酸 | 7.273 | 0.85 | 8570 | 2.30 | 图7 |
| L-正缬氨酸 | 7.943 | 0.93 | 13889 | 1.72 | 图8 |
| L-缬氨酸 | 8.530 | 1.00 | 6772 | 5.61 | 图4 |
| 丙氨酸 | 11.090 | 1.30 | 7841 | 2.48 | 图9 |
| 甘氨酸 | 12.380 | 1.45 | 8318 | NA | 图10 |
| 混合对照 | NA | NA | NA | NA | 图11和图12 |
| 混合溶液 | NA | NA | NA | NA | 图13和图14 |
本领域技术人员知晓，上述检测的L-正缬氨酸和L-缬氨酸为异构体，性质相似，亮氨酸和异亮氨酸为异构体，性质相似，且L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸均为含有羧基和氨基的一类小分子物质，理化性质相似，不易实现分离，本申请人按照中国药典2015年版和美国药典42版均采用薄层色谱法，其检测灵敏度差，各类氨基酸不明确，无法显示各类其他氨基酸的具体含量。本申请人采用美国药典40版的磷酸盐和乙腈二元流动相体系，氨基柱使用寿命不长，基线不稳，且L-缬氨酸与本发明提到的其他氨基酸无法基线分离。但采用本申请的检测方法，调控了L-缬氨酸、L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸峰在色谱柱上的保留时间，提高峰的分离度和理论塔板数，改善色谱峰形，且空白溶剂不干扰各氨基酸的检测，使各氨基酸在检测时分离，并准确定量，同时有效解决了氨基柱反相使用寿命不长，基线不稳的问题。
Claims (3)
1.高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，所述的其他氨基酸为L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，其特征在于，包括如下步骤：
（1）制备对照品溶液：称取L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸分别置于不同量瓶中，用流动相溶解、定容、摇匀；
（2）制备供试品溶液：称取L-缬氨酸原料用流动相溶解、定容、摇匀；
（3）高效液相色谱法测定：分别取对照品溶液注入高效液相色谱仪，记录保留时间和峰面积；取供试品溶液注入高效液相色谱仪，供试品色谱图中出峰时间及峰形与对照品溶液色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸的出峰时间及峰形进行比对，判定供试品溶液是否含有L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，将供试品色谱图中L-正缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸峰面积与对照溶液相应氨基酸峰面积对比，计算出L-缬氨酸原料中各氨基酸的含量。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱: 氨丙基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为70-76：24-30的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为10-20mmol/L，加入0.1%-0.3%的三乙胺，用磷酸调节pH为6.0-6.5；
流速：0.8-1.2ml/min；
柱温：20-30℃；
进样体积：20µl；
检测波长：UV210nm。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定L-缬氨酸原料中其他氨基酸的方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱: 氨丙基键合硅胶色谱柱，250mm×4.6mm，5µm；
流动相：体积比为72：28的乙腈与磷酸盐缓冲液的混合溶液，其中磷酸盐缓冲液浓度为15mmol/L，加入0.2%的三乙胺，用磷酸调节pH为6.2；
流速：1.0ml/min；
柱温：25℃；
进样体积：20µl。
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