CN111455065B - Rpl19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。本发明筛选了12个广聚萤叶甲候选内参基因，获得候选内参基因的基因序列，设计简并引物，克隆得到广聚萤叶甲中上述候选基因的部分核苷酸序列，并基于该序列设计特异性定量引物，利用SYBR GreenI染料技术的RT‑qPCR方法，筛选出了广聚萤叶甲不同发育时期及性别、不同组织、不同体型雄虫中稳定表达的内参基因，为开展广聚萤叶甲基因功能研究提供了稳定内参基因。

Description

RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。

背景技术

广聚萤叶甲(Ophraella communa)，属鞘翅目(Coleoptera)叶甲科(Chrysomelidae)，源于北美洲，是恶性入侵杂草-豚草的重要安全性天敌。由于豚草的入侵性极强，其已由南至北扩散至我国多个省市，防治的难度增大。豚草天敌-广聚萤叶甲其幼虫和成虫可大面积取食豚草叶片，成虫也可取食其花序，并呈火烧状推进，能够从根源上对恶性豚草加以控制、防除，且该天敌对环境友好，经济成本低，故是一种最佳防治方案。了解广聚萤叶甲的生理及行为的分子机制有助于更有效的提高广聚萤叶甲在豚草防治中的性能。然而现有技术对其分子生物学层面的研究开展极少，基因信息极其匮乏。

在分子生物学研究中，明确基因表达水平对于研究基因的功能至关重要。在众多定量基因表达水平的方法中，实时荧光定量PCR因其准确、特异、灵敏、快速等优点而被广泛应用。然而RT-qPCR的检测结果经常受到诸如样本差异、cDNA合成效率差异以及引物性能等多种因素的影响。为了消除不确定因素带来的误差，通常以表达量恒定的管家基因作为参照物对定量的数据进行归一化处理。管家基因数目众多，不同的研究对象、不同的实验条件下，表达量稳定的管家基因也不尽相同。因此，在明确实验目的前提下，首先应该验证并获得稳定表达的管家基因。然而，现有技术还没有广聚萤叶甲内参基因的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用。

根据本发明具体实施方式的RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用，所述RPL19基因通过以下引物扩增得到RPL19的基因序列

F:5’-GGAAGGCATTGTGGATTTGG-3’，

R:5’-CATTACCCTTAGCTTTCATG-3’。

根据本发明的具体实施方式，本发明筛选的12个内参基因包括内参基因为肌动蛋白基因(ACT1)、肌动蛋白基因(ACT2)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基(GAPDH)、核糖体蛋白L4基因(RPL4)、核糖体蛋白L19基因(RPL19)、核糖体蛋白S18基因(RPS18)、延伸因子1α基因(EF1A)、β-微管蛋白C基因(βTUBC)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、ADP核糖基化因子1基因(ARF1)、ADP核糖基化因子4基因(ARF4)、细胞色素氧化酶基因(COX)，其中，RPL19基因可以在不同发育时期、不同性别以及不同体型雄虫精巢和附腺中稳定表达。

本发明获得广聚萤叶甲不同发育时期及性别中稳定表达的RPL19基因，其可作为广聚萤叶甲相关分子生物学实验中的内参基因或者功能基因，填补了广聚萤叶甲内参基因筛选的空白。

附图说明

图1-1，图1-2显示广聚萤叶甲各候选内参基因引物在进行荧光定量PCR实验时的标准曲线；

图2-1，图2-2，图2-3，图2-4显示广聚萤叶甲各候选内参基因引物在进行荧光定量PCR实验时的溶解曲线；

图3显示广聚萤叶甲各候选内参基因的表达水平，其中，广聚萤叶甲候选内参基因表达水平由所有试验条件下的原始Ct值表示；箱型上下线分别为上四分位数和下四分位数，中线为中位数，中垂线的上下限分别为最大值和最小值；

图4显示各处理条件下候选基因的最适数目判定结果。通过geNorm软件在标准化因子Vn和Vn+1之间计算平均成对变化(V)来指导qRT-PCR数据标准化所需的参考基因的最佳数目。当Vn/Vn+1值小于0.15时，表明额外的参考基因在qRT-PCR数据中的标准化没有显着改进，此时n为最合适的内参基因数目。

图5显示当运用不同的内参校正时，ACE基因在广聚萤叶甲不同组织中的表达情况。

具体实施方式

实施例1广聚萤叶甲虫源的饲养及样品的收集。

本发明所用虫源广聚萤叶甲成虫于2017年6月采自广西来宾市，在室内饲养于气候条件为：温度26℃-28℃，相对湿度60-80％，光周期(L:D)14:10的温室中，饲养两代后，开始对该发明中涉及的样品进行收集。

1.1收集样品

①广聚萤叶甲不同发育阶段及性别样品的收集：将所要收集的样品用酒精进行消毒，分别取广聚萤叶甲卵150粒，一龄幼虫30头，二龄幼虫20头，三龄幼虫8头，初羽化1d的雌虫5头、雄虫5头，羽化8d的雌虫5头、雄虫5头，每组样品3个生物学重复，取完用液氮速冻，存于-80℃冰箱。

②广聚萤叶甲不同组织样品的收集：使用解剖镊在冰冷的PBS缓冲液(1x)中解剖组织，解剖后迅速放入1.5mL无RNA酶离心管中，随后-80℃保存，以便后续提取RNA。样品包括头、附腺、精巢、肠道、脂肪体。所有组织均来自于5日龄雄虫。每组样品共解剖10只雄虫。每组样品4个生物学重复，依照上述①中方法保存。

③不同体型广聚萤叶甲样品的收集：按照统计学方法挑选翅长具有显著性差异的雄虫，然后依照②中方法分别解剖，取大小雄虫精巢和附腺，依照上述①中方法保存。

1.2候选内参基因序列的获得与验证

提取上述样品中的总RNA并反转录得到cDNA，并以之为模板进行PCR反应，广聚萤叶甲的候选内参基因RT-PCR引物表1所示：

表1候选内参基因RT-PCR引物及序列信息

广聚萤叶甲RPL19基因175bp核苷酸片段的克隆方法，包括以下步骤：

(1)从广聚萤叶甲中利用Trizol试剂提取总RNA，然后反转录合成cDNA：

(2)以cDNA为模板，利用表1扩增引物，PCR扩增广聚萤叶甲RPL19内参基因的核苷酸序列片段；

(3)琼脂凝胶电泳检测(2)中扩增结果，切胶回收目的片段纯化，纯化产物与pEASY-T3载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞Transl-T1，37℃LB平板培养过夜，蓝白斑筛选含RPL19片段的阳性克隆子；

(4)将(3)所获得的阳性克隆子送生物公司测序，测序所得的序列在NCBI上BLAST分析比较，进而确定所得的核苷酸序列为RPL19片段序列。

1.3分析内参基因表达扩增效率

提取上述样品的总RNA，反转录得到cDNA，定量到1μg，并以此为模板进行qRT-PCR反应；利用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行PCR反应。

反应结束后，绘制定量PCR的扩增曲线和溶解曲线。通过设置5倍梯度稀释绘制标准曲线的方法确定引物的扩增效率。每个样品重复3次，每组3个技术重复。

图1-1和图1-2为12个候选内参基因定量引物的标准曲线，通过标准曲线的绘制得出qRT-PCR引物的扩增效率为97.046％～105.63％，相关系数R²值均高于99％，说明标准曲线线性关系良好。如图2-1～图2-4所示，由内参基因的荧光定量PCR的溶解曲线分析可知，12个候选内参基因的定量引物的溶解曲线均为单峰。因此，本发明的内参定量引物符合实验要求，可继续用于后续实验。

1.4分析内参基因的表达稳定性

(1)△Ct法分析各候选内参基因的稳定性

将各候选内参基因的表达量(CT值)做成箱装图，各候选内参基因Ct值变化情况如图3所示，12个内参基因的表达水平均呈不同程度的波动，平均Ct值范围为19.83-25.92。

在广聚萤叶甲不同发育阶段与性别样品之间，GADPH差异最大(相差4.19个CT)，RPL19差异最小(相差0.83个CT)，RPL4、ACT2、ACT1、RPS18及EF1α的Ct值差异均在3个循环以内，其余候选内参的Ct值差异均在3.17-4.19之间。

广聚萤叶甲雄虫不同组织样品间内参基因的表达类似于不同发育历期及性别，RPL19与COX差异均小于1个CT值，SDH相差4个CT值，其它候选内参的差异均在1-3个CT值之间。

在大小个体的雄虫之间样品间，12个候选内参基因的稳定性均较好，基因表达差异在3.2个CT值之内，RPL4转录水平表达差异性最小，仅0.15个CT值。

(2)利用不同软件分析候选内参基因的稳定性

利用geNorm version3.5、NormFinder version0.953和BestKeeper(Pfaff letal 2004)三个软件综合分析内参基因在广聚萤叶甲不同发育阶段及性别、不同组织、不同体型雄虫精巢和附腺中的稳定性，发现各个分析软件的排名结果有差异。

(1)在分析候选内参基因在不同发育阶段及性别之间的稳定性方面，本发明发现三个软件给出的计算并不完全一致，例如，Bestkeeper、NormFinder计算出RPL19为最稳定内参基因，而geNorm推荐的最稳定内参基因为RPL14，bestkeeper计算出的COX、ARF1、ARF4稳定性相近，且COX稳定性优于ARF1、ARF4，而在normFinder中COX的稳定性介于ARF1、ARF4之间，在geNorm中，COX稳定性大于ARF1，且COX、ARF1的稳定性数值远远大于ARF4。

(2)在分析广聚萤叶甲候选内参基因在不同组织之间的稳定性排名方面，本发明发现三个软件给出的计算并不完全一致，例如，Bestkeeper软件推荐RPL19为最稳定的内参，NormFinder推荐RPL4为最稳定的内参，geNorm推荐COX/ARF1为最稳定内参。

(3)在分析广聚萤叶甲候选内参基因在不同体型雄虫精巢和附腺中的稳定性排名方面

表2广聚萤叶甲候选内参基因在不同体型雄虫精巢和附腺中的稳定性排名

1.5分析各条件下最佳的内参基因数目

V_n/V_n+1值可用来确定最适内参基因的数目，当V_n/V_n+1值小于0.15时，n个内参基因适合于准确的内参基因计算，已不需要更多的内参基因。通过geNorm法计算获得本研究中各处理条件下的V_n/V_n+1值均小于0.05(图4)，表明基因表达的标准化最理想的内参基因数目是2。

1.6验证内参基因表达的稳定性

以血管紧张肽转化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)为目标基因，分别以稳定性不同的3个基因(COX，RPL19和SDH)作为内参基因，使用2-^ΔΔCt方法计算Ance在广聚萤叶甲雄成虫各部位中的相对表达量，以验证内参基因的稳定性。统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA)，多重比较采用邓肯法检验。

结果如图5所示，A、B、C、D代表差异性的显著与否，当以RPL19为内参基因时，目标基因ACE在雄虫附腺中表达量显著高于其他组织样本，以RPL19和COX同时作为内参基因时，ACE的表达规律与单独RPL19的校正结果基本一致。

以稳定性最差的SDH为内参基因，ACE在雄成虫头部的表达量明显高于附腺组织，差异倍数达两倍，在其他组织之间的表达模式与RPL19及RPL19/COX的校正结果相差很大。

ACE作为一种精液蛋白合成基因，和其他组织相比，在精液蛋白合成场所附腺中呈现较高表达模式。上述结果的说明，不稳定性的内参基因可能影响荧光定量PCR结果的准确性，甚至导致错误的分析结论。本发明分析得出，利用单内RPL19或者双内RPL19和COX对于广聚萤叶甲不同组织中基因的表达量进行均一化较为合理、准确。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用

<150> 2019107766211

<151> 2019-08-22

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 263

<212> DNA

<213> 广聚萤叶甲(Ophraella communa)

<400> 1

aattaaaaaa ccagtagcgg tacactctcg tgcacgcgtt cgtaagaata cagaggctcg 60

tagaaaagga aggcattgtg gatttggtaa aagaaaaggt acagctaatg caagaactcc 120

tcaaaaggaa ttatggattc aacgtatgcg agatttgcgt cgtttactca aaaagtaccg 180

tgaagcaaaa aaaattgata gacaccttta ccattctcta tacatgaaag ctaagggtaa 240

tgtatttaag aacaagagag ttc 263

Claims (1)

1.RPL19基因作为广聚萤叶甲内参基因的应用，其中，所述RPL19基因通过以下引物扩增得到：

F: 5’- GGAAGGCATTGTGGATTTGG-3’，

R: 5’- CATTACCCTTAGCTTTCATG-3’，

其中，

所述RPL19基因作为在广聚萤叶甲的不同发育阶段稳定表达的内参基因；

所述RPL19基因作为不同性别广聚萤叶甲中稳定表达的内参基因；或者

所述RPL19基因作为在广聚萤叶甲不同体型雄虫精巢和附腺中稳定表达的内参基因。

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