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CN111440839A - 一种纤维素乙醇的制备方法 - Google Patents

一种纤维素乙醇的制备方法 Download PDF

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CN111440839A CN202010452186.XA CN202010452186A CN111440839A CN 111440839 A CN111440839 A CN 111440839A CN 202010452186 A CN202010452186 A CN 202010452186A CN 111440839 A CN111440839 A CN 111440839A
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ethanol
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agricultural
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王明
杨生妹
王瑶
于明浩
孙晓凤
顾明慧
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Yangzhou University
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    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Abstract

一种纤维素乙醇的制备方法，属于生物技术领域，本发明提出的纤维素乙醇的制备方法原理清晰，通过耐寒短杆菌和酿酒酵母共发酵降解纤维素生成乙醇效果显著，能够有效分解纤维素，生成乙醇；本发明使用的生产原料为农业废弃物，菌株为筛选菌株耐寒短杆菌和保存菌株酿酒酵母BY4741，纤维素乙醇制备过程简单，成本较低，对环境无二次污染，可通过纤维素分解菌对农作物秸秆进行降解，能够得到所需求的能源物质，反应过程中对能源的需求较低，对于能源有较少的损耗，可以产生更大的经济价值，以较低的成本获得较高的经济回报，该发明在工业生产以及农业资源废弃物利用方面皆有较好的表现，具有广泛的应用前景。

Description

一种纤维素乙醇的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种乙醇的制备方法，具体的说是涉及一种纤维素乙醇的制备方法。
背景技术
不断发展的农业科技产生越来越多的农业废弃物，包括农作物秸秆、谷壳、果皮等，如何处理这些废弃物是现在面临的一个严峻问题。目前对于农业废弃物的主要利用方式主要集中在制作饲料和沤肥还田，大量的农业废弃物未得到合理的利用造成极大的资源浪费。
农业废弃物主要成分是木质纤维素，木质纤维素主要由纤维二糖和葡萄糖二聚体组成。现阶段研究表明，水解纤维素的复合酶，主要组分为内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，由这三类酶协同作用解聚纤维素。纤维素在纤维素酶的作用下，最终被降解为葡萄糖，葡萄糖可以进一步转化为乙醇、丁醇等其他有用的化学制品。
乙醇是极有潜力代替传统化石燃料的可再生能源之一，被认为是对因滥用化石燃料而引起的环境问题的解决方案之一。据有关报道，到2024年，生物燃料产业预计将产生9.5亿美元，到2025年将取代30％的石油燃料；生物乙醇是利用植物生物质生产的，可以通过直接发酵单糖(称为第一代乙醇)或糖化复杂糖并将其发酵(称为第二代乙醇)来获得。其中第一代生物乙醇的主要原料主要以粮食为主，包括玉米、小麦等淀粉含量搞得农作物，第二代生物乙醇的生产可以使用任何纤维素材料生产。
对于纤维素生物乙醇以农工业废渣作为生产原料，以降低原料成本，增加价值，但在第一代生物乙醇向第二代生物乙醇转型的阶段需要较大的投入，因为它具有更多的步骤以及不完善的技术。然而，生产原料为农业废弃物，不与粮食生产相干扰，既解决了粮食危机，也可以缓解能源问题，同时对现阶段的农业废弃物污染起到缓解作用。并且随着研究的不断深入，生产成本也在不断降低。玉米秸秆，香蕉杆径，甘蔗渣，玉米芯，腰果苹果渣，稻草等都是生物乙醇生产纤维素来源的原料。
传统的生产乙醇的方法主要以粮食作物作为原料来进行生产和化学合成法进行乙醇的制备，以粮食为原料生产其生产原料成本较高，同时造成粮食资源的短缺；化学合成法则需要较大的能耗，生产过程中产生较多的副产物，对环境造成一定的污染，均不适宜后期大规模的推广与生产。为了解决上述问题，一种降低生产原料成本，减少生产过程中副产物产生的乙醇生产方法就尤为必要。
发明内容
本发明目的是针对目前市场上生产乙醇存在生产原料成本较高，生产过程存在副产物污染等不足，提出一种纤维素乙醇的制备方法，农作物秸秆通过耐寒短杆菌降解，最终得到葡萄糖，葡萄糖在酿酒酵母的发酵转化下生成乙醇，成本低且无二次污染，可降低生产过程中的能耗，减少次级产物的产生，可获得较好的经济效益。
本发明的技术方案：一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)选择预先筛选出的降解纤维素的菌株：耐寒短杆菌；酿酒酵母菌株：BY4741酿酒酵母菌；将上述耐寒短杆菌接种于无菌的LB培养基中220r/min摇菌8h后备用，酿酒酵母菌接种于YPD培养基中220r/min摇菌8h后备用，作为后续发酵种子液；
(2)准备发酵产酶材料：农业秸秆粉、氯化钠、胰蛋白胨、酵母粉和蒸馏水；
(3)准备所需的仪器和设备：全温摇瓶柜、顶空气相色谱仪、离心机、pH计、玻璃棒和烧杯；
(4)选用农作物秸秆作为实验对象，按照工艺参数，对该农业废弃物进行发酵培养制备乙醇；
(5)具体制备步骤如下：
(5-1)取上述步骤(1)中得到的LB发酵种子液按照4％的接种量加入无菌的农业秸秆发酵培养基中；
(5-2)将接种后的发酵产酶培养基放入全温摇瓶柜，180r/min恒温摇床培养36h；
(5-3)向摇菌36h后的发酵瓶中按照5％的接种量加入YPD发酵种子液；
(5-4)将再次接种后的发酵瓶放入全温摇瓶柜，100r/min恒温摇床培养60h；
(5-5)接种YPD发酵种子液后每隔12h，取5mL发酵液放4℃保存备用；
(5-6)将所取发酵液10000r/min离心10min所得上清液即为制备的含纤维素乙醇的物料；
(5-7)通过顶空气相色谱法测定含纤维素乙醇的物料中的乙醇含量；分离得到纤维素乙醇。
步骤(2)中所述的农业秸秆粉包括玉米秸秆粉、大豆秸秆粉、花生秸秆粉、高粱秸秆粉、小麦秸秆粉、水稻秸秆粉中的至少一种。
步骤(4)中所述的工艺参数为：玉米秸秆粉的浓度为10％，氯化钠2％，胰蛋白胨的浓度为3％，酵母粉1.5％，培养基PH＝6，接种量LB发酵种子液为2％，接种量YPD发酵种子液为5％。
步骤(5-1)中所述的农业秸秆发酵培养基pH为6。
步骤(5-2)中所述的培养温度为15℃。
步骤(5-4)中所述的培养温度为30℃。
步骤(5-7)中所述的含纤维素乙醇的物料，发酵原料为农作物植物秸秆，生产成本低；通过纤维素降解菌与酿酒酵母同步共发酵，生产工艺简单；生产过程中无其他污染产生，同时利用农业废弃物，减少环境污染；发酵过程中发酵条件简单，反应温度较低，降低能源损耗；发酵原料为农业废弃物，原料来源广泛，适应面广。
本发明的有益效果为：本发明提出的一种纤维素乙醇的制备方法，纤维素乙醇的制备方法原理清晰，通过耐寒短杆菌和酿酒酵母共发酵降解纤维素生成乙醇效果显著，能够有效分解纤维素，生成我们所需的能源物质乙醇；本发明使用的生产原料为农业废弃物，菌株为筛选菌株耐寒短杆菌(生长繁殖速度较快，生长温度较低，产酶性能良好)和保存菌株酿酒酵母BY4741(生长性能稳定，转化率高)，纤维素乙醇制备过程简单，成本较低，对环境无二次污染，可通过纤维素分解菌对农作物秸秆进行降解，能够得到所需求的能源物质，反应过程中对能源的需求较低，对于能源有较少的损耗，可以产生更大的经济价值，以较低的成本获得较高的经济回报，该发明在工业生产以及农业资源废弃物利用方面皆有较好的表现，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是本发明中标准品色谱图。
图2是本发明中乙醇含量与峰面积的标准曲线图。
图3是本发明测定发酵液乙醇含量色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
如图1所示，一种纤维素乙醇的制备方法，通过耐寒短杆菌降解纤维素得到葡萄糖，利用酿酒酵母将葡萄糖转化成纤维素乙醇，具体步骤如下：
选择预先筛选出的降解纤维素的菌株：耐寒短杆菌；酿酒酵母菌株：BY4741酿酒酵母菌。将上述耐寒短杆菌接种于无菌的LB培养基中220r/min摇菌8h后备用，酿酒酵母菌接种于YPD培养基中220r/min摇菌8h后备用，作为后续发酵种子液。
准备发酵产酶材料：农业秸秆粉、氯化钠、胰蛋白胨、酵母粉和蒸馏水；准备所需的仪器和设备：全温摇瓶柜、顶空气相色谱仪、离心机、pH计、玻璃棒和发酵瓶。
选用农作物秸秆作为实验对象，按照工艺参数，对该农业废弃物进行发酵培养制备乙醇；工艺参数为：玉米秸秆粉的浓度为10％，氯化钠2％，胰蛋白胨的浓度为3％，酵母粉1.5％，培养基PH＝6，接种量LB发酵种子液为2％，接种量YPD发酵种子液为5％；各原料与添加量见表(1)，制作过程如下：
取上述得到的LB发酵种子液按照2％的接种量加入无菌的玉米秸秆发酵培养基中，初始发酵pH为6；将接种后的发酵产酶培养基放入全温摇瓶柜，15℃下180r/min恒温摇床培养36h；向摇菌36h后的发酵瓶中按照5％的接种量加入YPD发酵种子液；将再次接种后的发酵瓶放入全温摇瓶柜，30℃下100r/min恒温摇床培养60h；接种YPD发酵种子液后每隔12h，取5mL发酵液放4℃保存备用；将所取发酵液10000r/min离心10min所得上清液即为制备的含纤维素乙醇的物料；通过顶空气相色谱法测定含纤维素乙醇的物料中的乙醇含量。分离得到纤维素乙醇。
表(1)
Figure BDA0002507979350000051
Figure BDA0002507979350000061
实施例1
测定纤维素乙醇制备产量
为了探究纤维素乙醇制备产量，在上述条件下进行制备发酵，每隔12h，取新鲜发酵液测定乙醇含量，做三组平行；发酵液10000r/min离心10min所得上清液即为制备的含纤维素乙醇的物料；通过顶空气相色谱法测定含纤维素乙醇的物料中的乙醇含量。利用无水乙醇梯度稀释制作标曲。标准品色谱图如图1所示；标曲如图2所示，测定发酵液乙醇含量色谱图如图3所示，纤维素乙醇制备量如表(2)所示。
表(2)
Figure BDA0002507979350000062
从图(1)可以得出，乙醇在3min前会出峰，故后续测定样品中乙醇峰图即可确定，通过标曲测定可以得到乙醇与峰面积的标准曲线如图2所示。测定物料中乙醇含量如图3所示，峰在3min前，按照测定的峰图可得乙醇含量的结果进而得到表(2)，从表中显示的结果可以看出本案例成功利用纤维素分解菌与酿酒酵母菌发酵产生纤维素乙醇，随着发酵时间的推移，其乙醇产量逐渐升高，前期含量较低的原因可能是由于酿酒酵母刚接入发酵瓶处于自我复制增殖阶段，后面即呈现较高的乙醇转化率。可见该种生产方法在农业废弃物转化方面具有较好的表现，可用于实际应用。
通过上述实验可以发现，利用农作物植物秸秆为原料生产纤维素乙醇，生产成本低；通过纤维素降解菌与酿酒酵母同步共发酵，生产工艺简单；生产过程中无其他污染产生，同时利用农业废弃物，减少环境污染；发酵过程中发酵条件简单，反应温度较低，降低能源损耗；发酵原料为农业废弃物，原料来源广泛，适应面广。该方法在农业废弃物处理以及工业生产方面具有良好的发展前景。

Claims (7)

1.一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
(1)选择预先筛选出的降解纤维素的菌株：耐寒短杆菌；酿酒酵母菌株：BY4741酿酒酵母菌；将上述耐寒短杆菌接种于无菌的LB培养基中220r/min摇菌8h后备用，酿酒酵母菌接种于YPD培养基中220r/min摇菌8h后备用，作为后续发酵种子液；
(2)准备发酵产酶材料：农业秸秆粉、氯化钠、胰蛋白胨、酵母粉和蒸馏水；
(3)准备所需的仪器和设备：全温摇瓶柜、顶空气相色谱仪、离心机、pH计、玻璃棒和烧杯；
(4)选用农作物秸秆作为实验对象，按照工艺参数，对该农业废弃物进行发酵培养制备乙醇；
(5)具体制备步骤如下：
(5-1)取上述步骤(1)中得到的LB发酵种子液按照4%的接种量加入无菌的农业秸秆发酵培养基中；
(5-2)将接种后的发酵产酶培养基放入全温摇瓶柜，180r/min恒温摇床培养36h；
(5-3)向摇菌36h后的发酵瓶中按照5%的接种量加入YPD发酵种子液；
(5-4)将再次接种后的发酵瓶放入全温摇瓶柜，100r/min恒温摇床培养60h；
(5-5)接种YPD发酵种子液后每隔12h，取5mL发酵液放4℃保存备用；
(5-6)将所取发酵液10000r/min离心10min所得上清液即为制备的含纤维素乙醇的物料；
(5-7)通过顶空气相色谱法测定含纤维素乙醇的物料中的乙醇含量；分离得到纤维素乙醇。
2.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的农业秸秆粉为玉米秸秆粉、大豆秸秆粉、花生秸秆粉、高粱秸秆粉、小麦秸秆粉、水稻秸秆粉中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的工艺参数为：玉米秸秆粉的浓度为10%，氯化钠2%，胰蛋白胨的浓度为3%，酵母粉1.5%，培养基PH=6，接种量LB发酵种子液为2%，接种量YPD发酵种子液为5%。
4.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于：步骤(5-1)中所述的农业秸秆发酵培养基pH为6。
5.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于：步骤(5-2)中所述的培养温度为15℃。
6.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于：步骤(5-4)中所述的培养温度为30℃。
7.根据权利要求1所述的一种纤维素乙醇的制备方法，其特征在于：步骤(5-7)中所述的含纤维素乙醇的物料，发酵原料为农作物植物秸秆，生产成本低；通过纤维素降解菌与酿酒酵母同步共发酵，生产工艺简单；生产过程中无其他污染产生，同时利用农业废弃物，减少环境污染；发酵过程中发酵条件简单，反应温度较低，降低能源损耗；发酵原料为农业废弃物，原料来源广泛，适应面广。
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