CN111440811A - 同时靶向hpv16 l1及hpv16 e5e6e7的宫颈癌疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了同时靶向HPV16 L1及HPV16 E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备方法，采用SEQ ID NO：1编码的HPV16 L1蛋白与E5、E6、E7抗原肽组合制备宫颈癌疫苗。本发明利用生物信息学分析针对人类主要HLA型别筛选评分较高的长肽肽片段，结合体外试验得到免疫效果最强的E5E6E7多肽片段组成双效疫苗核心，应用昆虫细胞‑杆状病毒表达系统制备L1‑E5E6E7宫颈癌疫苗,该宫颈癌疫苗具有预防、治疗双重效应。

Description

同时靶向HPV16 L1及HPV16 E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备 方法

一、技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域。

二、背景技术

子宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,在全球妇女癌症发病率中居第2位， 严重威胁着广大妇女的健康和生命。WHO资料显示，全球每年宫颈癌的新发病例 为45万例，其中80％以上发生在发展中国家。我国是仅次于智利的宫颈癌第二高 发国家。虽然国际上已开发出九价，四价，二价宫颈癌预防性疫苗，但它们只能 对尚未存在HPV感染的人群起效，对于那些长期持续感染HPV的患者单纯的预防性 治疗无法解决其实际问题，特异的治疗性疫苗的研发迫在眉睫；另外，大多数宫 颈癌患者及术后复发患者多为HPV整合感染所致，预防性疫苗对整合后的HPV感染 无明显效应。对于术后复发的宫颈疾病患者多为HPV整合感染所致，以上市的针 对L1的预防性疫苗对整合后的HPV感染无能为力。因此,一个可以兼顾HPV持续 感染、HPV整合前后感染状态的治疗措施亟为临床所需也正成为新的研究焦点。

HPV感染是子宫颈癌首要致癌因素和重要启动因子已被公认。迄今为止已发 现不同型别HPV一百余种,而不同型别的划分是基于在L1,E6,E7的编码基因 序列中有10％的序列与现存型别的相关序列不符。根据致病特点分为高危型和低 危型,99％的子宫颈癌都与高危型的HPV有关,其中近60％的子宫颈癌因感染 HPV16导致。HPV早期区(E区)基因编码的蛋白有E1,E2,E4,E5,E6,E7,其 中E1,E2与病毒的复制和转化有关；E4可能参与病毒从被感染的细胞中释放和 部分的病毒包装；E5蛋白是一种最小的转化蛋白，在促进细胞的恶性转化中发挥 作用,并且与HPV感染早期抑制DNA损伤的细胞凋亡有关。在HPV感染早期,在 CIN阶段E5有大量表达,且在整合之前，E5的表达与宫颈上皮病变的程度正相关。 另外，我们前期的研究结果提示：HPV16，18E5(1)可以明显促进细胞的恶性 增殖，并改变细胞周期；(2)通过下调P21而抑制细胞调亡；(3)通过与细胞 有丝分裂纺锤体检测点蛋白的相互作用而导致细胞分裂异常，异型核出现，是肿 瘤发生之初的关键因素之一；(4)我们的动物实验证实有HPV16E5表达的肿瘤生 长及恶性程度明显高于对照组。高危型HPV E6,E7是一直以来的研究热点，它们 主要参与病毒恶性转化,并经由相关机制分别与p53、Rb相互作用,使细胞周期失 控而发生永生化。有研究指出，在HPV感染之初，E5有效的增强了E6，E7的恶性 转化作用，并且这种转化辅助是必须的。

在HPV的8种蛋白中L2,E1,E4均不能使被感染者产生天然免疫,而L1在感染 后的数周或数年将有50％～100％的被感染者会产生保护性抗体,这也是HPV预防 性疫苗制备的基础之一；E5可通过抑制MHC-1的表达，而介导免疫耐受；E7与癌 前病变期的迟发型超敏反应有关。然而，针对E6，E7的疫苗仅能80％抑制HPV相关 疾病的发生，完全阻断这两个“经典”的靶点仍不能彻底根除HPV的恶性作用。 这迫使我们进行更深层次的思考，基于HPV的致病机制和天然的免疫原性,在HPV 的致病过程中除了E6，E7外是否还有其他的关键因素存在？而E5这个在HPV整合 前有着同样恶性潜能的靶点是否就是罪魁祸首？由此，我们设想：针对在HPV致 病机制中有恶性作用的一系列位点，多角度遏制HPV的致病作用，从源头上杜绝 宫颈癌的发生，靶向E5，E6，E7三者构建HPV疫苗，使机体对已知的HPV多个可能 的直接致病靶点产生有效免疫。HPV晚期区的主要衣壳蛋白L1在真核细胞内能 自我组装成病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)，其结构和抗原表位与 天然病毒相似，不含病毒核酸，与宿主细胞受体的结合能力与原病毒相似，并可 通过与病毒相同的途径呈递给宿主免疫细胞，有效地诱导机体免疫系统产生免疫 反应，且在L1羧基端加入含60个氨基酸的异源蛋白并不影响L1和异源蛋白 的免疫原性和空间构象，是预防HPV感染的可靠靶点。

三、发明内容

基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种多目标同时靶向 HPV16E5E6E7三个关键致病因素(治疗宫颈癌的靶点)和HPV16 L1(预防宫颈 癌靶点)兼具预防治疗双重效应的宫颈癌疫苗的筛选和验证及制备方法，我们希 望通过这种兼具预防和治疗功效的疫苗来有效解决目前HPV16阳性肿瘤治疗的 局限，同时为开辟中国人制备国人自己的宫颈癌疫苗奠定基础。

我们将L1(预防宫颈癌的靶点)与“E5E6E7长肽”相结合。利用生物信息学 平台分析针对人类主要组织相容性复合体MHC分子(HLA)的抗原表位筛选肽段。 同时，利用Bac toBac昆虫细胞-杆状病毒表达系统安全高效，可容载大片段外 源基因，表达产物的结构功能，抗原性和免疫原性等均与天然蛋白相似等优点， 合成“L1+E5E6E7”该研究内容在国内外尚无同类报道。

本发明采用以下技术方案：

一组免疫抗原肽编码核酸序列，由三个核酸片段组成，这三个核酸片段分别 编码E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，和E7：YMLDLQPET。

上述HPV16 E5、E6、E7三个肽片段的编码核酸序列在制备用于肿瘤及其在研 究HPV16相关疾病的预防和治疗的制剂中的用途。

本发明还进一步提供一种疫苗制剂，将SEQ ID NO：1编码的HPV16 L1蛋白与 上述的E5、E6、E7抗原肽组合制备得到的宫颈癌疫苗制剂。

本发明还进一步提供一种制备嵌合病毒样颗粒cVLPs的方法，将上述的三个 核酸片段以及SEQ ID NO：1所示的HPV16 L1利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进 行表达；分别通过构建、验证、扩增、纯化，最终获得HPV16 L1+“E5E6E7”嵌 合病毒样颗粒cVLPs，其中包装扩增HPV16L1VLP做对照研究。

其中制备权利要求上述的cVLPs的方法，其特征在于利用Bac to Bac杆状病 毒表达系统，用PCR方法克隆HPV16 L1+“E5E6E7”基因，测序鉴定后与线性化的 pFastHTb进行连接为pFastHTb一HPV16 L1+“E5E6E7”，使pFastHTb一HPV16 L1+ “E5E6E7”与DH10BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid 一HPV16 L1+“E5E6E7”克隆，提取Bacmid一HPV16 L1+“E5E6E7”转染昆虫细胞 Sf-9获得有感染力的病毒，利用病毒感染Sf-9细胞进行蛋白表达扩增，用RT-PCR 和Western blot进行鉴定，筛选出表达HPV16型L1+“E5E6E7”的cVLPs。

其中HPV 16 L1的上下游引物序列分别为：L1-P1：5'

CGGAATTCAAATGTGCCTGTATACACGGGTC 3'；L1-P2：5'

CGCGGATCCGCGCACACATATTACTTCCTGG 3'。

本发明还提供一种上述方法制备得到的嵌合病毒样颗粒cVLPs。

本发明还提供一种上述的嵌合病毒样颗粒cVLPs制备方法制备得到的cVLPs 在制备作为兼具预防和治疗双重作用的宫颈癌疫苗。

本发明还提供一种上述的嵌合病毒样颗粒cVLPs制备方法制备得到的cVLPs 在制备作为宫颈癌及免疫治疗的试剂中的用途。

本发明达到了以下效果：

1.成功筛选针对人HLA-A2的HPV16 E5，E6，E7 CTL表位多肽，并利用昆 虫细胞-杆状病毒表达系统制备构建HPV16 L1+“E5E6E7”宫颈癌疫苗制剂，为防 治宫颈癌注入新思路；

2.探讨HPV16感染过程中宿主免疫微环境变化，为全面阐述HPV16的致病 机制提供新的实验证据，为中国人开发自己的宫颈癌疫苗奠定坚实的基础。

四、附图说明

图1针对人HLA-A2的HPV16 E5多肽片段筛选。

图2针对人HLA-A2的HPV16 E6多肽片段筛选。

图3针对人HLA-A2的HPV16 E7多肽片段筛选。

图4 PCR扩增HPV16 L1-E5E6E7融合基因片段：1：在1.5kb左右处可见 L1-E5E6E7融合基因条带，与预测大小相符；2：阴性对照；M：1kb ladder DNA marker。

图5用EcoR Ⅰ和Hind III双酶切鉴定T-HPV16 L1-E5E6E7重组质粒。 2，3，5号重组质粒中含有T载体3.0kb和L1-E5E6E7融合基因片段 1.5kb，说明连接成功；1,4号质粒中没有L1-E5E6E7融合基因，说明未连接 上；M：1kb ladder DNA marker。

图6利用PCR技术鉴定重组bacmid-HPV16 L1-E5E6E7。1：阴性对照；2-3： 用L1-E5E6E7融合基因的两条引物扩增，在1.5kb左右有目的基因片段；4–5： bacmid-HPV16 L1-E5E6E7质粒DNA；M1:Marker Ⅵ.

图7 Bacmid-HPV16 L1+“E5E6E7”DNA转染昆虫细胞Sf-9(倒置显微镜)： A–C：正常Sf-9昆虫细胞；D-F：bacmid-HPV16 L1+“E5E6E7”重组杆状病毒 感染Sf-9昆虫细胞后，细胞体积逐渐增大，胞内出现许多颗粒，容易脱落。

图8利用PCR技术鉴定重组bacmid-HPV16 L1-E5E6E7：1:在4kb左右 可见目的条带，说明转位成功。2–4：用L1-E5E6E7融合基因的两条引物扩增， 在1.5kb左右有目的基因片段，说明bacmid-HPV16 L1-E5E6E7重组质粒中含 有L1-E5E6E7；5：阴性对照。M：1kbladder DNA marker。

图9 SDS-PAGE检测纯化的HPV16 L1-EE5E6E7融合蛋白：HPV16 L1-E5E6E7融合蛋白：1：Sf-9细胞；2：非变性条件下纯化的HPV16 L1-E5E6E7 融合蛋白；3：经结合缓冲液处理的融合蛋白；4：未纯化的融合蛋白。

图10 Western blotting分析HPV16 L1+“E5E6E7”蛋白在Sf-9细胞中的 表达及10％SDS-PAGE分析HPV16 L1+“E5E6E7”蛋白纯化

图11电镜观察纯化前转染重组Bacmid DNA的Sf-9细胞及纯化后的病毒颗粒

图12小鼠血球凝集试验结果图.采用Image-Pro+v6.0(Media Cybernetics, Inc)和SPSS 13.0进行半定量分析。通过体外不同浓度(25～400ng)的纯HPV16-L1 +E5E6E7cVLP蛋白成功的血球凝集，获得了(P＝0.000)。每个条表示三次实验 结果)的均值。

图13用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建重组杆状病毒并表达目的基因

图14 pFastBac-Htb表达载体的限制性内切酶切位点和多克隆位点

图15 pFastBac-Htb表达载体的多克隆位点序列

图16 PCR鉴定重组bacmid-HPV16 L1+E5E6E7 DNA和转位原理图

图17预防组：不同宫颈癌疫苗制剂干预后各组小鼠未成瘤情况

图18预防组：不同宫颈癌疫苗制剂干预后各组小鼠成瘤情况

图19治疗组：不同宫颈癌疫苗制剂干预后各组小鼠成瘤情况

图20 ELISA结果显示在cVLP组，VLP组较各对照组IL-2,IFNγ表达明显增 强

五、具体实施方式

实施例1：筛选针对人HLA-A2的HPV16 E5、E6、E7抗原表位片段

将HPV16 E5、E6和E7全长序列通过生物信息及分子结构分析系统，得到相 应片段我们选择评分较高，亲和力强，免疫源性及抗原性较好的靶位片段作为侯 选片段进行下一步的实验室筛选。结果见图1-3所示，最终筛选获得了效果最好 的抗原表位片段为E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，E7：YMLDLQPET。 (Epitope-Prediction(http://www.Syfpeithi.de/)(Rammensee et al.,1999)； ProPred-I(http://www.imtech.res.in/raghava/propred1/index.html) (Singh and Raghava,2003).附图1-3

实施例2：利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备构建HPV16 L1+“E5E6E7” 短效宫颈癌疫苗制剂

按照附图11所述的操作步骤用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建重组杆 状病毒并表达目的基因。具体的操作步骤如下：

1)HPV 16 L1+“E5E6E7”目的片段的扩增

利用Oligo 6.0引物设计软件分析HPV16型全基因组序列，设计扩增HPV16 L1全长的一对引物(primer,P)及经生物信息学预测分析及体内外效应实验筛 选的E5.E6.E7抗原表位片段，其具体序列如下(引物由上海英俊生物技术有限 公司合成)。

HPV 16 L1的上下游引物序列

为了便于克隆，在两引物的5’端分别加入了EcoR I或Hind Ш酶切位 点及保护性碱基。

E5.E6.E7抗原表位片段

反应试剂如下:

1、引物:用去离子水配成10-50umol/L，扩增时用量为1-2ul/100ul反应体系。

2、Taq聚合酶:5U/ul，扩增时用量为2-5U/100ul.

3.PCR反应缓冲液:随Taq酶提供，

4、dNTPs:中胜混合液(ZM，10x):dATP、dGTP、dCTP、dTTP钠盐各10mg，加 去离子水2ml溶解，用O.1M的Na0H调pH7.0-7.5，分装后-20℃保存(浓度为5mM)。

5.以德国海德堡大学EthelMieheledeVillierS教授惠赠质粒为模板。(模 板中HPV16全序列如下：

我们已用该质粒进行相关研究并发表文章Shujie Liao，Dongrui Deng,WeinaZhang,Xiaoji Hu,Wei Wang,Hui Wang,Yunping Lu,Shixuan Wang,Li Meng,Ding Ma*.Human papillomavirus 16/18E5 promotes cervical cancer cell proliferation,migration and invasion in vitro and accelerates tumor growth in vivo.Oncologyreports,29(1)，95-102,2013.(SCI)

表1反应体系(冰上混合50μl)

轻混，离心,置于PCR仪上，开始以下反应,

表2扩增条件

1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定HPV16L1序列

(l)制胶:在三角烧瓶中装入1XTAE电泳缓冲液20ml和0.2g琼脂糖粉。微波 炉中加热使琼脂糖溶解，使溶液冷却至60℃。在距离底板0.5-1.0mm的位置上放 置梳子，将温热琼脂糖溶液倒入胶模中，凝胶厚度在3-5mm之间，并检查梳子的 齿下或齿间是否有气泡。在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45min)，小心移去梳 子，将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面约lmm深的足量电泳缓冲液。

(2)电泳:PCR产物与10x加样缓冲液混合后，用一次性微量移液器，慢慢将混 合物加至样品槽中，其中一泳道加入1KB DNA ladder。盖上电泳槽通电，正极为 红色，样品向正极泳动。电压100mV恒压电泳。电泳至溟酚蓝和二甲苯青FF在凝 胶中迁移出适当的距离。切断电源，取出凝胶，再放入溴化乙锭(用双蒸水配制 成10mg/ml的贮存液)至终浓度为0.5μg/m1的溶液中浸泡20-30分钟，紫外灯下观 察结果。

(3)紫外光照相系统照相。

从图4的结果可以看出，在1.5kb左右处可见L1-E5E6E7融合基因条带， 与预测大小相符；阴性对照无条带。

2)HPV16 L1+E5E6E7目的片段的鉴定和测序

①纯化PCR扩增产物(HPV16 L1+E5E6E7目的片段)

用PCR产物纯化试剂盒(U-gene)纯化PCR扩增产物，具体操作如下：

A.取PCR扩增产物80μl+400μl PB，混匀；

B.置离心柱中，离心30-60sec；

C.弃取废物收集管中的废液，在将离心柱放入管中；

D.+750μl PE，离心10min；

E.弃去废物收集管中的废液，再离心10min；

F.将离心柱放入1.5ml Eppendorf(Ep)管中；

G.+ddH₂O 30μl入柱中央，离心1min；

H.测OD值。

②酶切纯化产物

表3

混匀，37℃，过夜

③1％琼脂糖凝胶电泳后胶纯化 用凝胶纯化试剂盒(U-gene)纯化酶切产物，具体操作如下：

A.紫外灯下切下目的条带，放入1.5ml EP管中，称重；

B.加入1ml GS buffer，50℃，10min；

C.将融化后的凝胶放入离心柱管中，10 000rpm离心30sec,弃 取废液；

D.+500μl wash buffer，10 000rpm离心30sec,重复一次；

E.最高速离心1min，以弃净wash buffer；

F.将离心柱放入一无菌的1.5ml Ep管中；

G.+ddH₂O 30μl入柱中央，室温静置2-10min后，最高速离心1 min；

取出离心柱，将1.5ml Ep管于-20℃保存。

④加尾反应(加上粘性A末端)：

表4

混匀，72℃，20min

⑤连至

–T Easy载体

表5

混匀，22℃，2h，电泳分析鉴定。

⑥转化DH 5α细菌，并进行蓝白斑筛选

A感受态DH5α细菌的制备:

1)试剂及材料:

LB液体培养基:不含抗菌素.0.lmol/LCaCl₂:溶液:配制方法见附录 E coil DH5α单菌落或冻存菌种(如JM109)。

2)流程:

a.菌种复苏:取菌种100μl接种至含3m1 LB的玻璃试管中；

b.200rpm-250rpm x37℃振摇过夜，12h-16h；

C.次日取菌液100μl至含10ml LB的试管中；

d.37℃剧烈振摇2-3h；

e.待OD600值达到0.3-0.4时，取出，立即置冰浴10-15min；

自本步起需无菌操作；

f.将细菌移到预冷的10ml塑料离心管中；

g.离心:4℃4,000g x 10min；

h.弃培养液，将管倒置于滤纸上lmin//可用无菌枪头吸去残留培养液；

i.加预冷的0.lmol/LCaCl₂ 2ml重悬菌体；

j.置冰浴30min；

k.离心:4℃ 4,000g X 10min；

1.弃上清液，倒置于滤纸上lmin//可用无菌枪头吸去残留培养液；

m.再加400μl预冷的0.lmol/LCaC1₂重悬菌体(操作要轻)，分装为 200ul/管或者50μl/管；

n.置4℃冰箱12-24小时，即可用于转化，或者加甘油冻存于-70℃备用。

.o.感受态细胞的冻存:将感受态细胞分装成200μ1/管；每份加30％体 积(80μ1)的甘油保存液。置一70℃，可保存3个月之久。

B转化：

1)试剂及材料:

1.感受态DH5α细菌，Amp抗性平板(固体培养基配制及制板见附录)；

水浴42℃；

2.I PTG stock solution(0.1M):

2g IPTG(Promega)

50ml双蒸去离子水

过滤除菌，4℃保存。

3.X-Gal:100mg X-Gal(Promega)溶解于2ml二甲酚胺(N N-dimethyl -formamide)中，铝箔纸封口，-20℃避光保存。

4.LB培养基:

5.含有ampicillin/IPTG/X-gel的LB培养板:按附录方法制作LB培养 板，加入ampicillin，加入至0.5mMIPTG和80ug/m1X-Gal后倒板。或者加 入100ul100mMIPTG和20ul5Omg/ml X-Gal至平板表面，37℃x30min 可完全吸收后使用。

2)流程(根据pGEM-Teasy说明书):

a)从-80℃冰箱中迅速取出DH 5α细菌感受态(50μl 分装)；

b)加入5μl的上述连接产物T-HPV 18 L1+E5E6E7；

c)轻轻混匀后静置冰上30min；

d)42℃水浴中热休克90sec；

e)加200μl LB，37℃，150rpm,振摇1h；

f)取80μl铺板(含ampicillin/IPTG/X-gel的LB培 养板)；

g)37℃，过夜；

h)观察有蓝白斑生长后，将培养板置4℃保存(蓝白斑更 清楚)。

C挑取数个独立圆形白色菌斑作小量培养。

操作程序:

1.取灭菌的5ml的培养管，加入3m1LB培养基。

2.再加入5Omg/ml氨节青霉素3-5ul，(如培养宿主菌则不加抗生 素)，也可将抗生素先加入LB培养基中。

3.用无菌牙签(或枪头)调取单菌落，送入培养液，(或取菌液100ul， 加入培养液中)，用无菌棉球封好管口。

4.37℃，摇床培养，100-200r/min，至生长饱和，约6-12h，可过夜培养。

5.菌种的保存:取1.5ml离心管，加入0.3ml保存液(100％甘油)。加 入0.7ml菌液，混匀后，贮存于-70℃。

D质粒的小量提取:(应用博大泰克质粒小量提取试剂盒)

取1.5ml菌液置于Ep管中，10000rpm，离心30秒。弃上清，控尽。

加溶液Ⅰ 100UL，重悬菌体，剧烈振荡。

加溶液Ⅱ 150ul，上下颠倒5次混匀。

加入溶液Ⅲ 150ul，混匀。

室温放置5min，12000rpm，离心10分钟。

在离心吸附柱中加入420ul结合缓冲液，转移上清至离心吸附柱中，混 匀，12000rpm，离心30sec。倒掉收集管中的废液。

在离心吸附柱中加入750ul漂洗缓冲液，静置1min，12000rpm，离心 30sec。倒掉收集管中的废液。

重复一次，倒掉收集管中的废液后，12000rpm，离心2分钟。

将离心吸附柱取出，套入另一个1.5mlEp管中，加入50ul无菌去离 子水，室温放置5分钟后，12000rpm，离心2分钟。

收集质粒。质粒贮存在4℃或-20℃。以TAE为缓冲液，15OV、60mA 电泳30分钟，观察有所提质粒的情况。

⑦双酶切(EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ)鉴定T-HPV16 L1+E5E6E7

表6

混匀，37℃，2-6h后，电泳分析鉴定。

⑧HPV16Ll+E5E6E7的测序鉴定:观察电泳结果，挑选连接有目的条带的克 隆，小量扩增后送悬浮菌液至Invitrogen公司测序。

3)构建pFastBacHTb-HPV16 L1+E5E6E7重组穿梭质粒

该质粒的具体结构如附图13所示，质粒的多克隆位点如附图14所示。具体操 作步骤如下：

①小量提取T-easy-HPV16L1+E5E6E7质粒和pFastBac-Htb质粒,双酶 切。

酶切体系如下:50ul体积中含1-2ugDNA。以EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切 T-HPV16 L1+E5E6E7质粒和pFastBac-Htb穿梭载体.

表7

稍离心，混合。37℃水浴或温箱，过夜混匀,电泳分析鉴定。

②胶纯化回收：(U-gene试剂盒，具体操作见2)③)

③测定回收产物浓度:吸取5μl DNA溶液溶于200μl ddH₂O中，利用紫 外光分光光度计测其0D值，读取OD260(DNA浓度)，DNA浓度(μg/μl)＝ OD260X5

④连接回收的HPVI6L1+E5E6E7序列和pFastHTb序列

连接体系为 表8

混匀，RT，3h后,电泳分析鉴定。

⑤转化：DH 5α细菌,挑选抗Gen和抗Amp的克隆。

⑥酶切鉴定：摇菌，小提质粒DNA后(博大泰克的质粒小量提取试 剂盒，操作严格按说明书进行)，EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定.根据电泳 结果确认能够酶切获得1.5KB的目的片段，证明连接成功。命名为 pFastHTb-HPV16Ll E5E6E7，保存阳性克隆的菌种。从图5的结果可以看出，2， 3，5号重组质粒中含有T载体3.0kb和L1-E5E6E7融合基因片段1.5kb，说明连接成功；1,4号质粒中没有L1-E5E6E7融合基因，说明未连接上。

4)转位：重组杆状病毒bacmid-HPV16 L1+E5E6E7构建和鉴定

经酶切鉴定pFastHTb-HPV16L1+E5E6E7连接正确后，将其转入感受态 DH10Bac大肠杆菌中与杆状病毒DNA(bacmid)发生同源重组形成bacmid- HPV16 L1+E5E6E7，用PCR技术鉴定与筛选。

①提取pFastHTb-HPV16L1+E5E6E7质粒。

②制备DH10Bac感受态细胞:

a.菌种复苏:取菌种100ul接种至含3mlSOC培养基的玻璃试管中；

b.200rpm-250rpm 37℃振摇过夜，12h-16h；

C.次日取菌液100ul至含10mlSOC的试管中；

d.剧烈振摇2-3h；

e.待OD600值达到0.3-0.4时，取出，立即置冰浴10-15min；

自本步起需无菌操作；

f.菌移到预冷的10ml塑料离心管中；

g.离心4℃ X 4,000g X 10min；

h.弃培养液，将管倒置于滤纸上lmin//可用无菌枪头吸去残留培养液；

i.加预冷的0.lmol/LCaCl₂:2ml重悬菌体；

j.置冰浴30min；

k.离心:4℃ X 4,000g X 10min；

l.弃上清液，倒置于滤纸上lmin//可用无菌枪头吸去残留培养液；

m.再加400ul预冷的0.lmol/LCaCI₂:重悬菌体(操作要轻)，分装为 200ul/管或者50ul/管；

n.置4℃冰箱12-24小时，即可用于转化，或者加甘油冻存于-70℃备用。

o.感受态细胞的冻存:将感受态细胞分装成200ul/管；每份加30％体积(80ul) 的甘油保存液。置-70℃，可保存3个月之久。

SOC培养基配制方法见附录

③制板:制备含有kanamycin(50μg/ml)+gentamycin(7μg/ml)+ tetracycline(10μg/ml)+IPTG(40μg/ml)+X-gel(100μg/ml)的培养 板；

④转化

A.从-80℃冰箱中迅速取出DH10Bac细菌感受态50μl；

B.加入5μl的上述连接产物pFB-HPV16 L1+E5E6E7-E7 (50-72aa/4-12aa)；

C.轻轻混匀后静置冰上30min；

D.42℃水浴中热休克90sec，然后冰上静置2min；

E.加200μl LB，37℃，150rpm,振摇4h；

F.取80μl铺板；

G.37℃，24～48h；

H.观察有蓝白斑生长后，将培养板置4℃保存(蓝白斑更 清楚)；

I.挑取白色克隆，摇菌后小提质粒，转化涂板，再次进行 蓝白斑选。

在DN10Bac宿主菌辅助质粒的辅助下，pFastHTb一HPV16LI可以和宿主菌 的Bacmid发生转座，质粒里含有的HPV16L1+E5E6E7基因及庆大霉素抗性基因 的表达盒，通过转座作用与含有杆状病毒基因组Bacmid发生转座重组，在LB 平板上通过卡那霉素(kan)、四环素(tet)和庆大霉素(Gm)抗生素筛选，及 IPTG和X-gal蓝白斑筛选，挑取数个独立圆形白色菌斑作小量培养。(重组杆 状病毒命名为Bacmid-HPVI6L1+E5E6E7)

⑤鉴定

再次挑取白色克隆，摇菌后提取质粒DNA。由于Bacmid-HPVI8Ll DNA>135 kb，因此不能用限制性内切酶酶切鉴定。而应该用PCR鉴定目的片段已转位至 bacmid。在bacmid的lacZα区域两边的attTn7位设计两条引物PUC/M13 (见图14)，其引物序列为M13(Forward):5′GTT TTC CCA GTC ACG AC 3′， M13(Reserve):5′CAG GAA ACA GCT ATG AC 3′，由invitrogen公司合成。 如果转位成功，PCR产物大小应该是引物大小(2300bp)+插入片段的大小， 即为4000bp左右。图15显示了PCR鉴定重组bacmid-HPV16 L1+E5E6E7 DNA和 转位原理图。

表9反应体系(50μl)

表10扩增条件

1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

从图6的结果可以看出，2-3：用L1-E5E6E7融合基因的两条引物扩增， 在1.5kb左右有目的基因片段，成功。

5)获得具感染力的重组杆状病毒Bacmid一HPV16L1+E5E6E7

(1)大量制备Bacmid-HPV16L1+E5E6E7质粒用于转染

1)大量培养含Baemid-HPV16L1+E5E6E7质粒的DH10Bac:

操作程序:

1.在培养瓶中加入LB液体培养基100-200ml，高压灭菌。

2.每ml LB加kanamycin(50μg/ml)+gentamycin(7μg/ml)+ tetracycline(10μg/ml)

3.每ml培养基加菌液5-10μl(终浓度0.5-1％)。

100-200r/min37℃摇床培养至OD值0.6-0.8。

2)质粒的大量提取(步骤严格参照博大泰克大提试剂盒说明书)

(2)Sf-9昆虫细胞的培养:使用含10％胎牛血清的Grace’S培养液，补加 体积分数为10％(V/v)的硫酸庆大霉素(500mg/ml)和10％两性霉素 (25μg/ml)，培养温度为27℃.

(3)细胞转染:取处于对数生长期、状态良好的Sf-9细胞，制成单细胞悬液， 将9×10⁵/孔细胞均匀种植于六孔培养板，27℃培养1h以上使完 全贴壁，密度达5x10⁶时开始转染。细胞转染严格按照Invitrogen公司 产品

的说明书进行，具体操作如下：

①用Grace培养基(不含抗生素和FBS)吹打细胞，把大约9×10⁵个细胞放置于六孔板，Grace培养基体积约2ml，此时使用的细胞应该 是培养了3～4天处于对数生长期，成活率大于97％。

②允许细胞贴壁至少1h。

③在1.5ml灭菌Ep管准备下列溶液：

a)溶液A：1-2μg重组bacmid-HPV16 L1+E5E6E7 DNA+100μl的 无血清Grace培养基，混匀。

b)溶液B：6μl

+100μl的无血清Grace培养基， 混匀。

④溶液A和溶液B混合，在室温孵育15～45min。

⑤吸去六孔板中Grace培养基，加入200μl溶液A和溶液B混合 物，然后加入无血清Grace培养基800μl，混匀。

⑥27℃孵育5h。

⑦去掉转染混合物，加入昆虫细胞培养基，密切注意细胞的形态变化 如下：

表11

⑧转染72h后收集病毒，经3000r/min离心5min留上清，获 取病毒液(P1)用第一代毒种以1:3感染Sf-9细胞，72h后收获细胞上清， 即得到第2代感染性Bacnlid一HPV16L1+E5E6E7病毒液(P2)，此病毒液可 直接感染细胞进行表达或保存。

6)转染Sf-9昆虫细胞中bacmid-HPV16 L1+E5E6E7 DNA的提取 和PCR鉴定

用病毒液P1再次感染Sf-9细胞，27℃孵育3天。细胞和培养液 的混合物经3000rpm离心5min后，留上清，获取病毒液(P2)，避光 4℃保存。同时收集沉淀的细胞，附图7。

①抽提bacmid–HPV16 L1+E5E6E7 DNA(用基因组DNA小量提取试剂 盒)

A.沉淀细胞经PBS缓冲液洗涤,800rpm，离心5min,重复1次 后，移入1.5ml Ep管内，高速离心10sec后，加入100μl，振荡 后再加入100μl裂解液和20μl RNaseA/蛋白酶K液，迅速充分 振荡混匀，置55℃温浴15min,其间来回颠倒Ep管数次；

B.加入10μl 3M NaAc(pH 4.8),随后加入1250μl结合缓冲 液，充分振荡混匀，离心后将上清直接加入到离心吸附柱去，放置1min， 12000rpm离心30sec；

C.到掉收集管中的废液，再加入600μl洗涤清洗液，12000rpm 离心30sec；

D.重复步骤C1-2次。最后一次洗涤应于12000rpm离心3min 以充分除去洗涤缓冲液；

E.小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5ml Ep管中，并 加入50μl洗脱缓冲液。放置1min后，于12000rpm离心3min。取 出Ep管，其中即是所提取的基因组DNA。

②PCR鉴定

分别以HPV16 L1+E5E6E7基因的P1和P2引物扩增重组杆状 病毒中所携带的HPV16L1+E5E6E7 DNA片段。

表12反应体系：(总体积100μl)

表13扩增条件：

取5μl经1％琼脂糖凝胶电泳。从图8的结果可以看出，1:在4kb左右可 见目的条带，说明转位成功。2–4：用L1-E5E6E7融合基因的两条引物扩增， 在1.5kb左右有目的基因片段，说明bacmid-HPV16 L1-E5E6E7重组质粒中含 有L1-E5E6E7。

7)重组病毒培养条件:

将生长状态良好的Sf-9细胞按2x 10⁶个/ml加入六孔板中，每孔细胞融合率 达到70％，贴壁6h倒掉培养液，重组病毒液按:10^-3-10^-7倍稀释后分别取500ul感 染六孔板中的细胞27℃培养lh，弃去含病毒的培养液，铺1％的低熔点琼脂糖每孔 2ml。27℃培养7d，铺含有0.33％的酚红上层琼脂糖，12h后，计算病毒滴度。

100ml培养瓶内接种7x10⁶个Sf-9细胞，分别按病毒感染复数MOI＝0.05、 0.1、0.2或0.4加入病毒液，在24、48、72、84、96或120h收获上清，离心去除 细胞残渣后检测上清病毒滴度。扩增病毒时按照MOI＝0.2感染细胞，并于72h收获 病毒液，离心弃沉淀后分装置于4℃备用。

100ml培养瓶内接种7X10⁶个Sf-9细胞，将病毒按MOI＝3、5、10、15、20或 30感染Sf-9细胞，分别在24、48、72、96或120h收获细胞，进行SDS-PAGE，考马 斯亮蓝G-250染色后经薄层扫描仪检测目的蛋白的表达情况。

感染所需病毒液量(ml)＝「预计的MOI值(Pfu/cell)x细胞总数」÷病毒液滴 度(Pfu/ml)。

我们的实验中得出MOI为20时，感染效率最高且细胞的凋亡率较其他各组无 统计学差异。

从图9的SDS-PAGE检测纯化的HPV16 L1-EE5E6E7融合蛋白情况来看，融合 蛋白表达成功。

8)SDS-PAGE检测及考马斯亮蓝G-250染色

(1)培养细胞的蛋白质提取:

A.取培养板中感染病毒Bacmid-HPV 16L1+E5E6E7 6d后的细胞,5x10⁵个细 胞，用预冷的PBS液在冰浴中温和洗细胞2次。

B.加入细胞裂解液混合置冰上20min，在冰上用细胞刮板仔细刮取细胞。转 移至1mlEp管中。

C.低温离心(4℃)12000rcf x2Omin，吸取上清，转移至另一lmlEp管中。

(2)考马斯亮兰染色，紫外分光光度计测量蛋白浓度。

A.取3ul蛋白样本加入57ul ddH²O中，于试管中，充分混合，另以60ulddH²O 设为空白管。

B.各管内加入3ml考马斯亮兰溶液，混匀后置室温1smin。紫外分光光度计 测各管吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。

C.聚丙烯酸胺凝胶蛋白电泳(SDS一PAGE凝胶):

a.配制分离胶10ml，方法如下:

b.安装玻璃板，迅速在间隙中灌注分离胶，留出成层胶空间(齿长再加1cm)， 用巴氏吸管小心的在分离胶溶液上覆盖一层水，将凝胶垂直放于室温，30min。 倾出覆盖层水，用去离子水洗涤凝胶数次以取出未聚合的分离胶，用纸巾吸出残 留液体。

c.配制积层胶4ml，方法如下:

加入积层胶，安装梳子。将凝胶垂直放于室温，30min后小心移出梳子。

d.将所需蛋白样品与等体积2×SDS加样缓冲液混合后，置于Ep管，煮沸10min，使蛋白变性。

e.用微量加样器按顺序加样，每样加蛋白30ug，加至底部，每加完一个 应在下槽缓冲液中洗涤加样器。样品后一孔加入蛋白分子量标准(Marker)。

未加样的孔内加入l义SDS加样缓冲液，防止蛋白移出。

f.电泳装置安装:正极接下槽，电压130mV，开始电泳。约1小时后，观察 澳酚兰达到分离胶底部，关闭电源。

D.进行考马斯亮蓝染色30min及脱色。

a.电泳结束后，用至少5倍体积的染液浸泡，放摇床室温缓慢旋转3-4h。

b.换掉并回收染液，用甲醇/醋酸溶液浸泡凝胶，缓慢摇动4-5h脱色，其 间换液3-4次。

c.继续脱色24h，直到满意为止。

d.将脱色后的凝胶照相或干燥，也可无限期的用塑料袋封闭在含20％甘油 的水中保存，附图10。

9)Bacmid-HPV16 L1+E5E6E7蛋白的纯化，附图10。

利用Ni-NTA His·

Resins纯化系统对HPV16 L1+E5E6E7蛋白进行纯 化。其纯化的具体步骤如下：

①纯化主要试剂

1 x Ni-NTA结合缓冲液(50mM/L NaH₂PO₄,PH8.0；300mM/L NaCl；10mM/L 咪唑)

1 x Ni-NTA漂洗缓冲液(50mM/L NaH₂PO₄,PH8.0；300mM/L NaCl；20mM/L 咪唑)

1 x Ni-NTA洗脱缓冲液(50mM/L NaH₂PO₄,PH8.0；300mM/L NaCl；250mM/L 咪唑)

②具体步骤

A：取0.5ml 50％Ni-NTA His

Resins+2ml 1 x Ni-NTA结合缓 冲液，轻柔混匀，300rpm x 3min,弃上清，重复一次；

B：取1.8ml 1 x Ni-NTA结合缓冲液+200μl制备好的细胞蛋白，轻柔 摇动混匀，4℃结合60min，300rpm x 1min；

C：取上清至1.5ml Ep管中保存；

D：+3ml 1 x Ni-NTA漂洗缓冲液漂洗一次，300rpm x 1min，收集上 清保留，重复一次；

E：+0.5ml 1 x Ni-NTA洗脱缓冲液，振荡混匀，300rpm x 1min，收 集上清保留，重复三次，依次保留上清；

F：取各次保留的上清15μl+2×SDS–PAGE上样缓冲液，100℃煮 沸3min，10％SDS-PAG电泳，考马氏亮蓝染色。

10)透视电镜和扫描电镜分别观察纯化前后HPV16 L1+E5E6E7VLP

收集感染第二代重组病毒4d的sf-9细胞中用戊二醛固定3h后，经巴比妥缓冲 液浸洗lh(期间换液3次)用巴比妥固定缓冲液再固定lh，再经巴比妥缓冲液浸洗 lh(期间换液3次)，后用梯度酒精(70％、90％、100％)脱水，树脂包埋，高温聚合， 用超薄切片机切片，再经乙酸铀和构栋酸铅染色，通过透射电镜，以不同放大倍 数观察细胞中的病毒样颗粒。

取10μL非变性条件下纯化的蛋白滴至碳膜包被的铜网上，经磷钨酸复染 后扫描电镜观察。说明书附图11，电镜结果提示：HPV16 L1+E5E6E7VLP可在体外 自行包装为病毒样颗粒(E5E6E7片段的插入并不影响其包装效能)，且这些颗粒 定位在细胞核中。

11)HPV16-L1+E5E6E7 VLP的体外相关免疫效应验证

(1)小鼠红细胞凝集试验

①取C57BL/6小鼠眼球后取血，4℃，1000g x 5min离心,留取红细 胞；

②用PBS洗涤红细胞两次(1000g x 5min),然后用1％(v/v)PBS+BSA (1mg/ml)重悬红细胞；

③用PBS+BSA(1mg/ml)倍比稀释纯化的VLP，与等体积红细胞悬液 混匀；

④将100μl混合物(VLP和红细胞各50μl)加入96孔板，每种种两孔， 同时设两孔阴性对照(不加VLP，仅加100μl红细胞悬液)；

⑤4℃，放置2-3小时后观察结果。

⑥结果显示HPV16-L1+E5E6E7 VLP在体外可以使红细胞明显凝集，有 很强的免疫原性与对照组相比有明显差异。

12)HPV16-L1+E5E6E7 VLP的体内相关免疫效应验证

人源免疫重建鼠接种(利用人外周血细胞(hPBMC)获得人免疫系统重 建的NCG小鼠)：

选择4-6周龄的人源免疫重建鼠，根据实验目的分为预防和治疗两大组， 前个大组又分为HPV16-L1+E5E6E7 VLP组(cVLP组)，HPV16-L1组(VLP组)， 三肽组，二肽组，单肽(E5、E6、E7三组)，错构肽组(irrelevant control peptide,IR-P)，生理盐水组九组

1)预防组：先于鼠左侧大腿根部给予相应的制剂，按不同的配伍将鼠随机分为cVLP组，VLP组，三肽组，二肽组，E5组，E6组、E7组，错构肽组和生理盐水 组九组，一周后按取对数生长期的Siha细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每 只鼠左侧大腿根部接种200μl，同时再给一次相应的制剂,其后,每1-2天一次，观 察瘤块生成情况。各组成瘤情况如图17，18：在cVLP组，VLP组较各对照组有很 好的肿瘤预防效应，几乎无瘤生成。

2)治疗组:各取对数生长期的Siha细胞制备单细胞悬液(1×10⁶/100μl)，于每只鼠 左侧大腿根部接种200μl，一周后于鼠左侧大腿根部给予相应的制剂，将鼠随 机分为八组，按不同的配伍将鼠随机分为cVLP组，VLP组，三肽组，二肽组， E5组，E6组，E7组，错构肽组和生理盐水组九组，其后,每周给一次相应的制 剂,每1-2天一次，观察瘤块生成情况。有瘤体长出后,每周观察并测量肿瘤大 小2-3次(垂直测量肿瘤最长径a、b)直至成瘤或治疗后3-4周，以公式1/2*a*b 计算肿瘤体积。各组成瘤情况如图19：在cVLP组，VLP组较各对照组有很好 的肿瘤治疗效应，肿瘤体积较对照组有明显减少。

13)ELISA

A.标本的采集及保存

小鼠眼球后取血：标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000x g离心 20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。

B.试剂的准备和保存

A).标准品的稀释和使用。

试剂盒提供2管标准品，每管10ng，每次使用1管。

1.配制10,000pg/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置 10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。

2.配制1000pg/ml标准品：取0.1ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品 稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。

3.配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml 样品稀释液，分别标记上500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml， 15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中，混匀后同 样取出0.3ml,加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。

溶解后的标准品应在12小时内使用。

B)生物素标记的抗体工作液。

1.根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。

2.按1μι生物素标记抗人VEGF加抗体稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混 匀。

C).亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备：在使用前1小时内准备。

1.根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。

2.按1μι亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μι的比例配制工 作液。轻轻混匀。

C.操作程序

所有试剂用前需在室温平衡。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次 测都应该做标准曲线。如果估计样品VEGF浓度＞2000pg/ml时，应在试管中将 样品用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。

1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB 空白显色孔。总数＝样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。

2.将1000pg/ml，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml， 15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的 作为零孔。对于人血清、体液、组织匀浆或细胞培养上清，每孔先加50μι 样品稀释液，再加50μι样品。

3.酶标板加上盖，37℃反应120分钟。

4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体(将自动洗板机的洗涤次数设 为零再开始即可)；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。不洗。

5.将准备好的生物素抗人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB 空白显色孔除外)。37℃反应60分钟。

6.0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。吸去或甩去 多余液体。

7.将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。 37℃反应30分钟。

8.0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。吸去或甩 去多余液体。

9.按每孔0.1ml依次加入TMB显色液，37℃避光反应20-25分钟(此时肉 眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显)。

10.按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。

11.用酶标仪在450nm测定O.D.值，将TMB空白显色孔设为对照。

12.所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出 曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。

13.根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应 用软件来计算(下载)。应记住由于样品稀释了1倍，其实际浓度应该×2。

如图20ELISA证实了在cVLP组，VLP组较各对照组IL-2,IFNγ等TH-1类细胞 因子表达明显增强，可引起很好的CTL效应，杀伤肿瘤细胞。

序列表

<110> 武汉凯德维斯生物技术有限公司

<120> 同时靶向HPV16 L1及HPV16 E5E6E7的宫颈癌疫苗及其制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtctcttt ggctgcctag tgaggccact gtctacttgc ctcctgtccc agtatctaag 60

gttgtaagca cggatgaata tgttgcacgc acaaacatat attatcatgc aggaacatcc 120

agactacttg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata 180

ttagttccta aagtatcagg attacaatac agggtattta gaatacattt acctgacccc 240

aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg 300

gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat tagtggccat 360

cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420

gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg tttaattggt 480

tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta 540

aatccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatatg 600

gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt 660

ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgtcagaa 720

ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780

tttaataggg ctggtactgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840

gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta cacctagtgg ttctatggtt 900

acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat 960

aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca 1020

aatatgtcat tatgtgctgc catatctact tcagaaacta catataaaaa tactaacttt 1080

aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa 1140

ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac atacattcta tgaattccac tattttggag 1200

gactggaatt ttggtctaca acctccccca ggaggcacac tagaagatac ttataggttt 1260

gtaacatccc aggcaattgc ttgtcaaaaa catacacctc cagcacctaa agaagatccc 1320

cttaaaaaat acactttttg ggaagtaaat ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat 1380

cagtttcctt taggacgcaa atttttacta caagcaggat tgaaggccaa accaaaattt 1440

acattaggaa aacgaaacgc tacacccacc acctcatcta cctctacaac tgctaaacgc 1500

aaaaaacgta agctgtaa 1518

<210> 2

<211> 7906

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actacaataa ttcatgtata aaactaaggg cgtaaccgaa atcggttgaa ccgaaaccgg 60

ttagtataaa agcagacatt ttatgcacca aaagagaact gcaatgtttc aggacccaca 120

ggagcgaccc agaaagttac cacatttatg cacagagctg caaacaacta tacatgatat 180

aatattagaa tgtgtgtact gcaagcaaca gttactgcga cgtgaggtat atgactttgc 240

ttttcgggat ttatgcatag tatatagaga tgggaatcca tatgcagtgt gtgataaatg 300

tttaaagttt tattctaaaa ttagtgagta tagatattat tgttatagtg tgtatggaac 360

aacattagaa cagcaataca acaaaccgtt gtgtgatttg ttaattaggt gtattaactg 420

tcaaaagcca ctatgtcctg aagaaaagca aagacatctg gacaaaaagc aaagattcca 480

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tagagaaacc cagctgtaat catgcatgga gatacaccta cattgcatga atatatgtta 600

gatttgcaac cagagacaac tgatctctac tgttatgagc aattaaatga cagctcagag 660

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acgggatgta atggatggtt ctatgtagag gctgtagtgg aaaaaaaaac aggggatgcc 960

atatcagatg acgagaacga aaatgacagt gatacaggtg aagatttggt agattttata 1020

gtaaatgata atgattattt gacacaggca gaaacagaga cagcacatgc gttgtttact 1080

gcacaggaag caaaagaaca tagagatgca gtacaggttc taaaacgaaa gtatttgggt 1140

agtccactta gtgatattag tgaatgtgta gacaataata ttagtcctag attaaaagcc 1200

atatgtatag aaaaacaaag tagagctgca aaaaggagat tatttgaaag cgaagacagc 1260

gggtatggca atactgaagt ggaaactcag cagatgttac aggtagaagg gcgccatgag 1320

actgaaacac catgtagtca gtatagtggt ggaagtgggg gtggtagcag tcagtatagt 1380

agtggaagtg ggggagaggg tgttagtgaa agacacacta tatgcgaaac accacttaca 1440

aatattttaa atgtactaaa aactagtaat gcaaaggcag caatgctagc aaaatttaaa 1500

gagttatacg gggtgagttt tacagaatta gtaagaccat ttaaaagtaa taaatcaacg 1560

tgttgcgatt ggtgtattgc tgcattcgga cttacaccca gtatagctga cagtataaaa 1620

acattattac aacaatattg tttatattta cacattcaaa gtttagcgtg ttcatgggga 1680

atggttgtgt tactattagt aagatataaa tgtggaaaaa atagagaaac aattgaaaaa 1740

ttgatgtcta aactattatg tgtgtctcca atgtgtatga tgatagagcc tccaaaattg 1800

cgtagtacag cagcagcatt atattggtat aaaacaggta tgtcaaatat tagtgcagtg 1860

tatggagaca cgccagaatg gatacaaaga caaacagtat tacaacatag ttttaatgat 1920

tgtacatttg aattatcaca gatggtacaa tgggcctacg ataatgacat agtagacgat 1980

agtgaaattg catataaata tgcacaattg gcagacacta atagtaatgc aagtgccttt 2040

ttaaaaggta attcacaggc aaaaattgta aaggattgtg caacaatgtg tagacattat 2100

aaacgagcag aaaaaaaaca aatgagtatg agtcaatgga taaaatatag atgtgatagg 2160

gtagatgatg gaggtgattg gaagcaaatt gttatgtttt taaggtatca aggtgtagac 2220

tttatgtcat ttttaagtgc attaaaaaaa tttctgcaag gtatacctaa aaaaaattgc 2280

atattattat atggtgcagc taacacaggt aaatcattat ttggtatgag tttaatgaaa 2340

ttcttgcaag ggtctgtaat atgttttgta aattctaaaa gccatttttg gttacaacca 2400

ttagcagatg ccaaaatagg tatgttagat gatgctacag tgccctgttg gaactacata 2460

gatgacaatt taagaaatgc attggatgga aatttagttt ctatggatgt aaagcataga 2520

ccattggtac aactaaaatg ccctccatta ttaattacat ctaacattaa tgctggtaca 2580

gattccaggt ggccttattt acataatcga ttggtggtgt ttacatttcc aaatgagttt 2640

ccatttgaca aaaacggaaa tccagtgtat gagcttaatg ataagaactg gaaatccttt 2700

ttctcaagga cgtggtccag attaagtttg cacgaggacg aggacaagga aaacgatgga 2760

gactctttgc caacgtttaa atgtgtgtca ggacaaaata ctaacacatt atgaaaatga 2820

tagtacagac ctacgtgacc atatagacta ttggaaacaa atgcgcctag aatgtgctat 2880

ttattacaag gccagagaaa tgggatttaa acatattaac caccaggtgg tgccaacact 2940

ggctgtatca aagaataaag cattacaagc aattgaactg caactaacgt tagaaacaat 3000

atataactca caatatagta atgaaaagtg gacattacaa gacgttagcc ttgaagtgta 3060

tttaactgca ccaacaggat gtataaaaaa acatggatat acagtggaag tgcagtttga 3120

tggagacata tgcaatacaa tgcattatac aaactggaag catatatata tttgtgaaga 3180

cacatcagta actgtggtag agggtcaagt tgactattat ggtatatatt atgttcatga 3240

aggaatacaa acatattttg tgcagtttaa agatgatgca gaaaaatata gtaaaaataa 3300

agtatgggaa gttcatgcgg gtggtcaggt aatattatgt cctacatctg tgtttagcag 3360

cgacgaagta tcctctgctg aaattactag gcagcacttg gccaaccact ccgccgcgac 3420

ccataccaaa gccgtcgcct tgggcaccaa agaaacacag acgactatcc agcgaccaag 3480

atcagagcca gacaccggaa acccctgcca caccaacaag ttgttgcaca gagactccgt 3540

ggacagtgct ccaatcctca ctgcagttaa cagctcacac aaaggacgga ttaactgtaa 3600

tagtaacact acacccatag tacatttaaa aggtgatgct aatactttaa aatgtttaag 3660

atacagattt aaaaagcatt gtaaattgta tacagcagtg tcgtccacat ggcattggac 3720

aggacataat gtaaaacata aaagtgcaat tgttacactt acatatgata gtgaatgtca 3780

acgtgaacaa tttttgtctc aagtgaaaat accaaaaact attacagtgt ctactggatt 3840

tatgtctata tgacaaacct tgatactgca tccacaacat tactggcgtg ctttttgctt 3900

tgcttttgtg tgcttttgtg tgtctgccta ttaatacgtc cgctgctttt gtctgtgtct 3960

acatacacat cattaatact attggtatta gtattgtgga taacagcagc ctctgcattt 4020

aggtgtttta ttgtatatat tgtatttgtt tatataccat tatttttaat acatacacat 4080

gcacgcttct taattacata atgtatatgt acataatgta attgttacat ataattgttg 4140

tataccataa attactgatt ttttttttta tttttatttt atatatagtt ttttttctta 4200

tttgtgtgtt ttttaataaa ctgttattac ttaacaatgc gacacaaacg ttctgcaaaa 4260

cgcacaaaac gtgcatcggc cacccaactt tataaaacat gcaaacaggc aggtacatgt 4320

ccacctgaca ttatacctaa ggttgaaggc aaaactattg ctgatcaaat attacaatat 4380

ggaagtatgg gtgtattttt tggtgggtta ggaattggaa cagggtctgg tacaggcgga 4440

cgcactgggt acattccatt aggaacaagg cctcccacag ctacggatac acttgctcct 4500

gtaagacccc ctttaacagt agatcctgtg ggcccttctg atccttctat agtttcttta 4560

gtggaagaaa ctagttttat tgatgctggt gcaccaaccc ctgtaccttc cattccccca 4620

gatgtatcag gatttagtat tacaacttca actgatacca cacctgctat attagatatt 4680

aataatactg ttactactgt tactacacat aataatccca cttttactga cccatctgta 4740

ttgcagcctc caacacctgc agaaactgga gggcatttta cactttcatc atccactatt 4800

agtacacata attatgaaga aattcctatg gatacattta ttgttagcac aaaccctaac 4860

acagtaacta gtagcacacc cataccgggg tctcgcccag tggcacgcct aggattatat 4920

agtcgcacaa cacaacaagt taaggttgtg gaccctgctt ttgtaaccgc tcccactaaa 4980

cttattacat atgataatcc tgcatatgaa ggtatagatg tggataatac attttatttt 5040

cctagtaatg ataatagtat taatatagct ccagatcctg actttttgga tatagttgct 5100

ttacataggc cagcattaac ctctaggcgt actggcatta gatacagtag aattggtaat 5160

aaacaaacac tacgtactcg tagtggaaaa tctataggtg ctaaggtaca ttattattat 5220

gatttaagta ctattaatcc tgcagaagaa atagaattac aaactataac accttctaca 5280

tatacaacca cttcccatgc agcctcacca acttctatta ataatggatt atatgatatt 5340

tatgcagatg actttattac agatactgtt acaaccccag taccagctat accctctaca 5400

tccttatcag gttatattcc tgcaaataca acaattcctt ttggtggtgc atacaatatt 5460

cctttagtat caggacctga tatacctatt aatacaactg accaaactcc ttcattaatt 5520

cctatagttc cagggtctcc acaatataca attattgctg atggaggtga cttttattta 5580

catcctagtt attacatgtt acgaaaacga cgtaaacgtt taccatattt tttttcagat 5640

gtctctttgg ctgcctagtg aggccactgt ctacttgcct cctgtcccag tatctaaagt 5700

tgtaagcacg gatgaatatg ttgcacgcac aaacatatat tatcatgcag gaacatccag 5760

actacttgca gttggacatc cctattttcc tattaaaaaa cctaacaata acaaaatatt 5820

agttcctaaa gtatcaggat tacaatacag ggtatttaga atatatttac ctgaccccaa 5880

taagtttggt tttcctgaca cctcatttta caatccagat acacagcggc tggtttgggc 5940

ctgtgtaggt gttgaggtag gtcgtggtca gccattaggt gtgggcatta gtggccatcc 6000

tttattaaat aaattggatg acacagaaaa tgctagtgct tatgcagcaa atgcaggtgt 6060

ggataataga gaatgtatat ctatggatta caaacaaaca caattgtgtt taattggttg 6120

caaaccacct ataggggaac actggggcaa aggatcccca tgtaacaatg ttgcagtaac 6180

tccaggtgat tgtccaccat tagagttaat aaacacagtt attcaggatg gtgatatggt 6240

tgataccggc tttggtgcta tggactttac tacattacag gctaacaaaa gtgaagttcc 6300

actggatatt tgtacatcta tttgcaaata tccagattat attaaaatgg tgtcagaacc 6360

atatggcgac agcctatttt tttatttacg aagggaacaa atgtttgtta gacatttatt 6420

taatagggct ggtgctgttg gtgaaaatgt accagacgat ttatacatta aaggctctgg 6480

gtctactgca aatttagcca gttcaaatta ttttcctaca cctagtggtt ctatggttac 6540

ctctgatgcc caaatattta ataaacctta ttggttacaa cgagcacagg gccacaataa 6600

tggcatttgt tggggtaacc aactatttgt tactgttgtt gatactacac gcagtacaaa 6660

tatgtcatta tgtgctgcca tatctacttc agaacctaca tataaaaata ctaactttaa 6720

agagtaccta cgacatgggg aggaatatga tttacagttt atttttcaac tgtgcaaaat 6780

aaccttaact gcagacgtta tgtcatacat acattctatg aattccacta ttttggagga 6840

ctggaatttt ggtttacaac ctcctccagg aggcacacta gaagatactt ataggtttgt 6900

aacatcccag gcaattgctt gtcaaaaaca tacacctcca gcacctaaag aagatcccct 6960

taaaaaatat actttttggg aagtaaattt aaaagaaaag ttttctgcag acctagatca 7020

gtttccttta ggacgcaaat ttttactaca agcaggattt aaggccaaac caaaatttac 7080

attaggaaaa cgaaaagcta cacccaccac ctcatctacc tctacaactg ctaaacgcaa 7140

aaaacgtaag ctgtaagtat tgtatgtatg ttgaattagt gttgtttgtt gtttatatgt 7200

ttgtatgtgc ttgtatgtgc ttgtaaatat tacgttgtat gtgtgtttgt atgtatggta 7260

taataaacac gtgtgtatgt gtttttaaat gcttgtgtaa ctattgtgtc atgcaacata 7320

aataaactta ttgtttcatc acctactaat tgtgttgtgg ttattcattg tatataaact 7380

atatttgcta cattttgttt ttgttttata tatactatat tttgtagcgc cagcggccat 7440

tttgtagctt caaccgaatt cggttgcatg ctttttggca caaactgtat ttttttaaat 7500

agttctatgt cagcaactat agtttaaact tgtacgtttc ctgcttgcca tgcgtgccaa 7560

atccctgttt tcctgacctg cactgcttgc caaccattcc attgtttttt acactgcact 7620

atgtgcaact actgaatcac tatgtacatt gtgtcatata aaataaatta ctatgcgcca 7680

acgccttaaa taccgctgtt aggcacatat ttttggcttg ttttaactca cctaattgca 7740

tagttggcat aaggtttaaa cttttaaggc caactaaatg tcaccttagt tcatacatga 7800

actgtgtaaa ggttagtcat acattgttca tttgtaaaac tgcacatggg tgtgtgcaaa 7860

ccgttttggg ttacacattt acaagaaact tatataataa tactaa 7906

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cggaattcaa atgtgcctgt atacacgggt c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatccg cgcacacata ttacttcctg g 31

<210> 5

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctttgctttt gtgtgctttt gtgtgtccca catttatgca cagagctgca aacattagat 60

ttgcaaccag agacaactga t 81

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Phe Leu Leu Cys Phe Cys Val Leu Leu

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr

1 5

Claims (9)

1.一组免疫抗原肽编码核酸序列，其特征在于由三个核酸片段组成，这三个核酸片段分别编码E5：FLLCFCVLL，E6：KLPQLCTEL，和E7：YMLDLQPET。

2.权利要求1中所述的HPV16 E5、E6、E7三个肽片段的编码核酸序列在制备用于肿瘤及其在研究HPV16相关疾病的预防和治疗的制剂中的用途。

3.SEQ ID NO：1编码的HPV16 L1蛋白与权利要求1所述的E5、E6、E7抗原肽组合制备得到的宫颈癌疫苗制剂。

4.一种制备嵌合病毒样颗粒cVLPs的方法，其特征在于将权利要求1中所述的三个核酸片段以及SEQ ID NO：1所示的HPV16 L1利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统进行表达；分别通过构建、验证、扩增、纯化，最终获得HPV16 L1+“E5E6E7”嵌合病毒样颗粒cVLPs，其中包装扩增HPV16L1VLP做对照研究。

5.制备权利要求4所述的cVLPs的方法，其特征在于利用Bac to Bac杆状病毒表达系统，用PCR方法克隆HPV16 L1+“E5E6E7”基因，测序鉴定后与线性化的pFastHTb进行连接为pFastHTb一HPV16 L1+“E5E6E7”，使pFastHTb一HPV16 L1+“E5E6E7”与DH10BAC感受菌进行转座重组，利用抗性及蓝白斑筛选重组Bacmid一HPV16 L1+“E5E6E7”克隆，提取Bacmid一HPV16 L1+“E5E6E7”转染昆虫细胞Sf-9获得有感染力的病毒，利用病毒感染Sf-9细胞进行蛋白表达扩增，用RT-PCR和Western blot进行鉴定，筛选出表达HPV16型L1+“E5E6E7”的cVLPs。

6.如权利要求5所述的方法，其中HPV 16L1的上下游引物序列分别为：L1-P1：5'CGGAATTCAAATGTGCCTGTATACACGGGTC 3'；L1-P2：5'CGCGGATCCGCGCACACATATTACTTCCTGG3'。

7.根据权利要求4或5所述方法制备得到的嵌合病毒样颗粒cVLPs。

8.根据权利要求4或5所述的嵌合病毒样颗粒cVLPs制备方法制备得到的cVLPs在制备作为兼具预防和治疗双重作用的宫颈癌疫苗。

9.根据权利要求4或5所述的嵌合病毒样颗粒cVLPs制备方法制备得到的cVLPs在制备作为宫颈癌肿瘤发病机制及免疫治疗的试剂中的用途。

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