CN1114443C - 诱导分化治疗的药物及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种黄芪等诱导分化治疗的药物，通过诱导肿瘤细胞中β-珠蛋白基因从不表达到表达，促进β-globin mRNA翻译成珠蛋白和合成血红蛋白，诱导肿瘤细胞趋向终末分化，成为正常或接近正常的细胞，从而达到抗肿瘤的目的。本发明药物显著优于目前国际上公认的诱导分化药物羟基脲，而且无毒副作用。可用于治疗造血系统肿瘤、β-地中海贫血及镰刀性贫血等疾病，展示了广阔的应用前景。
Description
本发明涉及治疗肿瘤的药物，尤其是关于一种诱导分化治疗造血系统肿瘤的药物。
近年来，造血系统肿瘤(如白血病等)的发病率逐年上升，目前在年青人和儿童中已占肿瘤发病率首位，而且其死亡率亦逐渐上升为该年龄组的前几位。但是，围绕造血系统肿瘤的治疗还有大量尚待解决的问题，缺乏令人满意的治疗手段(艾辉胜等，《现代白血病学》，人民军医出版社，北京，1997年，P.171～178)。目前对于白血病的治疗，主要有三种形式：化疗是治疗白血病的最基本形式，尤其是对于急性白血病，但是，由于耐药性的存在，可能导致化疗的失败，同时，伴随化疗的严重毒副作用也使得患者难以完成化疗。免疫治疗在近二十年来亦逐渐应用于临床，但由于其副作用较突出，也很少获得成功。骨髓移植、手术治疗和放射治疗等迄今在白血病治疗中应用极为有限，如骨髓移植仅适用于少数患者；手术治疗仅限于在治疗前或治疗中出现的急症外科；放射治疗适用于中枢神经系统白血病出现症状之前的防治。近年来国外兴起的基因治疗虽已取得某些令人鼓舞的结果，但是尚处于初始阶段，并主要用于治疗单基因遗传病，距离治疗白血病的实际应用还有很长的一段路，存在着很多困难(陆道培，《白血病治疗学》，科学出版社，北京，1992年，P.23～39；Evans WE，et al.Leuk.Res.，1997，21：435～437；Balis FM，et al.J.Clin.Oncol.，1985，3：485～489)。
白血病的诱导分化治疗近来正在被证明是一条行之有效的治疗途径，并已在急性早幼粒细胞白血病(M3)的诱导治疗中得到证实(Chen GQ，etal.Leukemia，1996，10：825～828)。如目前国际上公认的诱导白血病细胞分化的药物羟基脲(Hydroxyurea)等，但羟基脲毒副作用较大。由于诱导分化治疗的关键在于新的分化诱导剂的发现及其作用机理的阐明，因此，国内外的药物学家和药理学家正致力于建立模型，并筛选大量化合物。虽然已有多种化合物被筛选出来，如仅中国科学院上海药物研究所即已筛选了近1000种化合物，并发现若干化合物具有较强的分化诱导作用，但是，这些化合物对机体也具有突出的毒副作用，如强烈的组织刺激性、骨髓抑制、免疫机能损害，胃肠道反应、心脏肾脏毒性、皮肤毒性和神经毒性等等(艾辉胜等，《现代白血病学》，人民军医出版社，北京，1997年，P.171～178；Gunz FW，et al.《Leukemia》，Grune & Stratton，Inc.1983，P.137～213)。
中草药是祖国传统医药学宝库中一颗璀灿的明珠。临床上运用中医中药方法治疗肺癌、胃癌、肝癌等肿瘤已取得良好疗效，中药具有增强机体免疫功能、缓解临床症状、改善生存质量、减轻化疗放疗毒副作用等特点(程晓东等。中国中西医结合杂志，1997，17(2)：88～90；Cheng XD，et al.Chinese Journal of Immunology，1995，11(Suppl.)：218～220)。虽然传统医学中早有用中药治疗肺癌、肝癌等晚期恶性肿瘤的临床案例，但是，用中药诱导肿瘤细胞趋向终末分化以治疗造血系统肿瘤，至今从无报道和论述。因此，诱导分化治疗的药物及其应用的研究，是一项很有意义的工作。
本发明的目的是提供一种黄芪等诱导分化治疗的药物，用于治疗造血系统肿瘤，疗效显著而无毒副作用。
本发明提供一种黄芪等诱导分化治疗的药物。黄芪等中药诱导K562细胞后，可以使K562细胞内β-珠蛋白从不表达到表达，促进β-globin mRNA翻译成珠蛋白和合成血红蛋白，诱导K562细胞趋向终末分化，使其恶性程度减小，使之“改邪归正”，成为正常或接近正常的细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。
本发明诱导分化治疗的药物可以各别采用下列四种配方：
配方A是黄芪；
配方B包括黄芪和当归，两者药料重量比例黄芪为0.1-99.9％：当归99.9-0.1％；
配方C包括黄芪和大枣，两者药料重量比例为黄芪0.1-99.9％：大枣99.9-0.1％；或
配方D包括当归、川芎、熟地和白芍，其药料重量比例为当归0.1-99.7％，川芎99.7-0.1，熟地99.7-0.1％，白芍99.7-0.1％。
本发明诱导分化治疗药物的制备方法：先将各配方的药料分别用水漂洗，于玻璃瓶中加三蒸水煎煮后，去渣、过滤、浓缩，按常规操作(杜克礼等，《简明药剂学》人民卫生出版社，北京1994年)制成各种剂型如煎剂、丸剂、冲剂、片剂、胶囊、口服液、或注射液等。本发明诱导分化治疗的药物均为中草药，是天然植物，对人体无任何毒性。
本发明采用人类红白血病细胞株(K562细胞)作为体外模型，进行黄芪等中药对造血系统肿瘤细胞诱导分化作用的体外试验。
1)细胞的体外传代培养和诱导培养：
K562细胞用RPMI-1640(Gibco产品)培养液在37℃、CO2孵育箱内培养，对于诱导的K562细胞，在细胞培液中分别加入中药各配方(A、B、C、D)药液，实验中以诱导分化药物羟基脲(Hydroxyurea，Hu)作为对照，于诱导后7天收集K562细胞，用于细胞总RNA的抽提。
2)细胞内总RNA的抽提：
抽提细胞内总RNA，用异硫氰酸胍一步法抽提。
3)RT-PCR检测细胞内α-、β-和γ-珠蛋白基因表达：
取细胞总RNA进行PCR扩增试验，PCR反应中各种成分的浓度同常规PCR反应一样。
4)细胞的苯肼染色：
收集适量的细胞，加入新配制的苯肼染色液染色后，计数蓝染细胞，以蓝染细胞数占总细胞数的百分比表示阳性率。
本发明中药各配方(A、B、C、D)对K562细胞诱导分化作用的体外试验结果如下：
1)中药各配方(A、B、C、D)对K562细胞内β-珠蛋白基因表达的影响
实验中用不经诱导的K562细胞作为阴性对照，用羟基脲诱导的K562细胞作为阳性对照。结果显示：K562细胞不经诱导时，不能表达成年型β-珠蛋白基因，细胞不能达到终末分化；用200μmol/L羟基脲诱导K562细胞后，可检测到β-珠蛋白基因的转录产物，促进K562细胞向终末分化；用中药配方A、B、C、D药液分别诱导K562细胞7天后，也同样可检测到β-珠蛋白基因的转录产物，如图1所示。该结果表明中药配方A、B、C、D可以诱导K562细胞内β-珠蛋白基因从不表达到表达，促进K562细胞趋向终末分化。
2)中药各配方(A、B、C、D)对K562细胞内α-珠蛋白基因表达的影响
K562细胞不经诱导时，能表达α-珠蛋白基因；用羟基脲和中药配方A、B、C、D药液分别诱导K562细胞7天后，仍可检测到α-珠蛋白基因的转录产物，未见明显变化，如图2所示。该结果表明中药配方A、B、C、D对K562细胞内α-珠蛋白基因的表达未有明显影响。
3)中药各配方(A、B、C、D)对K562细胞内γ-珠蛋白基因表达的影响
K562细胞不经诱导时，能表达胎儿型γ-珠蛋白基因；用羟基脲和中药配方A、B、C、D药液分别诱导K562细胞7天后，仍可检测到胎儿型γ-珠蛋白基因的转录产物，未见明显变化，如图3所示。该结果表明中药配方A、B、C、D对K562细胞内胎儿型γ-珠蛋白基因的表达未有明显影响。
4)中药各配方(A、B、C、D)对K562细胞内血红蛋白合成的影响
细胞经苯肼染色后，显示常规培养的K562细胞在诱导前，含有血红蛋白的蓝染细胞数仅占细胞总数的1％；用羟基脲诱导后，苯肼蓝染细胞数明显增加，达到13％；用中药配方A、B、C、D分别诱导后，苯肼蓝染细胞数的增加更为显著，分别达到30％、31％、33％、28％，如图4所示。该结果表明：中药配方A、B、C、D不仅可诱导K562细胞使β-珠蛋白基因表达，而且可促进β-globin mRNA翻译成珠蛋白和合成血红蛋白，其作用显著优于化学诱导剂羟基脲。
上述体外试验结果表明：中药各配方A、B、C、D诱导K562细胞7天后，可使成年型β-珠蛋白基因从不表达到表达，而对α-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因的表达没有明显影响，类似于诱导分化剂羟基脲的作用，表明中药各配方A、B、C、D激活了K562细胞β-珠蛋白基因的转录机制。同时，K562细胞在常规培养下，含有血红蛋白的蓝染细胞数极少(＜1％)，说明K562细胞虽具有转录ε-、γ-、和α-珠蛋白基因对应的mRNA能力，但是不能翻译成珠蛋白和合成血红蛋白。经中药各配方A、B、C、D诱导后，含有血红蛋白的蓝染细胞数显著增加，说明K562细胞经诱导后，能有效地合成血红蛋白，而且其作用明显优于羟基脲。表明K562细胞内可能存在着抑制珠蛋白基因翻译的机制，中药各配方A、B、C、D诱导后，这种抑制机制被逆转。实验结果证明中药各配方A、B、C、D不仅可诱导人红白血病细胞株(K562细胞)β-珠蛋白基因的表达，而且对β-globin mRNA翻译成珠蛋白和合成血红蛋白具有促进作用，促进肿瘤细胞趋向终末分化。
根据祖国医学理论“正气存内，邪不可干，邪之所凑，其气必虚”，正气不足与肿瘤的发生发展密切相关，是肿瘤机体的主要病理机制，扶正疗法是中医辨证治疗肿瘤的常用方法，通过扶助正气达到驱除病邪、治疗疾病的目的。但直至目前为止，本发明是首次用中药诱导肿瘤细胞分化的方法治疗造血系统肿瘤，以及从基因水平上研究中药抗肿瘤的作用。祖国医学理论认为：“气能生血”、“有形之血，不能自生，生于无形之气”，中药配方A、B、C、D均根据补气、养血理论组方，大补脾肺之气，以资生血之源，可使阳生阴长，气旺血生，达到扶正祛邪、治疗疾病的目的。本发明不但为中医“补气生血”学说和扶正祛邪治疗肿瘤的理论提供了实验依据，而且为临床治疗造血系统肿瘤和β-地中海贫血、镰刀型贫血等重症贫血提供了一个疗效显著而无毒副作用的药物，也可用作对造血系统肿瘤、β-地中海贫血和镰刀型贫血等患者的康复保健营养保健品，展示了广阔的应用前景，具有巨大的社会和经济效益。
本发明临床试验正在顺利进行中。
本发明优点：本发明在国内外首次提出用黄芪等中药诱导造血系统肿瘤细胞趋向终末分化，使肿瘤细胞恶性程度减小，使之“改邪归正”，成为正常或接近正常的细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。本发明提供的药物与普通的抗肿瘤化疗药物不同，普通的化疗药物可杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤细胞的分裂和增殖，但对机体正常细胞也有明显的损伤，存在严重的毒副作用，诸如强烈的组织刺激性、骨髓抑制、免疫机能损害，胃肠道反应、心脏肾脏毒性、皮肤毒性和神经毒性等等。而本发明提供的药物优点在于既可有效地诱导肿瘤细胞趋向终末分化，同时又对机体正常细胞无任何损伤作用，而且可通过调整机体各系统生理机能的平衡，如调节神经内分泌免疫网络、调节心肺肝肾功能、调补气血等，以改善临床症状，提高生存质量。
附图说明：
图1是中药配方A、B、C、D诱导K562细胞内β-珠蛋白基因表达的结果图
其中 1：分子量标志；2：未诱导的K562细胞；3：羟基脲诱导的K562细胞；4：中药配方A诱导的K562细胞；5：中药配方B诱导的K562细胞；6：中药配方C诱导的K562细胞；7：中药配方D诱导的K562细胞。
图2是中药配方A、B、C、D诱导K562细胞内α-珠蛋白基因表达的结果图
其中 1：分子量标志；2：未诱导的K562细胞；3：羟基脲诱导的K562细胞；4：中药配方A诱导的K562细胞；5：中药配方B诱导的K562细胞；6：中药配方C诱导的K562细胞；7：中药配方D诱导的K562细胞。
图3是中药配方A、B、C、D诱导K562细胞内γ-珠蛋白基因表达的结果图
其中 1：分子量标志；2：未诱导的K562细胞；3：羟基脲诱导的K562细胞；4：中药配方A诱导的K562细胞；5：中药配方B诱导的K562细胞；6：中药配方C诱导的K562细胞；7：中药配方D诱导的K562细胞。
图4是中药配方A、B、C、D诱导K562细胞合成血红蛋白的结果图
其中 1：未诱导的K562细胞；2：羟基脲诱导的K562细胞；3：中药配方A诱导的K562细胞；4：中药配方B诱导的K562细胞；5：中药配方C诱导的K562细胞；6：中药配方D诱导的K562细胞。
通过以下实施例对本发明作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1 黄芪60克，大枣30克，加水400ml煎煮2次，每次1小时，煎液合并过滤，去渣，浓缩至200毫升左右，即得煎剂。
实施例2 黄芪60克，加工洗净，磨成细粉，过100目筛，即得冲剂。
实施例3 黄芪60克，当归12克，加工洗净，磨成细粉，过100目筛，炼蜜为丸，每丸重9克，每丸含生药8克，即得丸剂。
实施例4 黄芪60克，大枣30克，加水400ml煎煮2次，每次1小时，煎液合并过滤，浓缩成膏，干燥，整粒，压片，每片含生药20克，即得片剂。
实施例5 采用人类红白血病细胞株(K562细胞)作体外模型试验
1)细胞的体外传代培养和诱导培养
K562细胞用RPMI-1640(Gibco产品)培养液在37℃、CO2孵育箱内培养，培养液中含10％新生小牛血清、100μg/ml链霉素、100u/ml青霉素。对于诱导的K562细胞，在细胞培液中分别加入中药各配方(A、B、C、D)药液，药物终浓度为7mg/ml；实验中以诱导分化药物羟基脲(Hydroxyurea，Hu)作为对照，羟基脲终浓度为200μmol/L。于诱导后7天收集K562细胞，用于细胞总RNA的抽提。
2)细胞内总RNA的抽提
抽提细胞内总RNA用异硫氰酸胍一步法抽提。
3)RT-PCR检测细胞内α-、β-和γ-珠蛋白基因表达
取1-1.5μg细胞总RNA，PCR反应中各种成分的浓度同标准PCR反应一样。反应总体积为50μl。
4)细胞的苯肼染色
收集适量的细胞，按细胞体积的1/5，加入新配制的苯肼染色液(1.25ml苯肼溶液，0.1ml H2O2)，染色5min后，计数蓝染细胞，以蓝染细胞数占总细胞数的百分比表示阳性率。
实验结果
如图1所示。表明：中药配方A、B、C、D可以诱导K562细胞内β-珠蛋白基因从不表达到表达，促进K562细胞趋向终末分化。
如图2所示。表明：中药配方A、B、C、D对K562细胞内α-珠蛋白基因的表达未有明显影响。
如图3所示。表明：中药配方A、B、C、D对K562细胞内胎儿型γ-珠蛋白基因的表达未有明显影响。
细胞经苯肼染色后显示：常规培养的K562细胞在诱导前，含有血红蛋白的蓝染细胞数仅占细胞总数的1％；用羟基脲诱导后，苯肼蓝染细胞数明显增加，达到13％；用中药配方A、B、C、D分别诱导后，苯肼蓝染细胞数的增加更为显著，分别达到30％、31％、33％、28％，如图4所示。该实验结果表明中药配方A、B、C、D不仅可诱导K562细胞使β-珠蛋白基因表达，而且可促进β-globin mRNA翻译成珠蛋白和合成血红蛋白，其作用显著优于化学诱导剂羟基脲。
Claims (3)
1.一种治疗造血系统肿瘤、β-地中海贫血和镰刀性贫血的药物组合物，其由重量比为5∶1的黄芪和当归组成。
2.一种治疗造血系统肿瘤、β-地中海贫血和镰刀性贫血的药物组合物，其由重量比为2∶1的黄芪和大枣组成。
3.按权利要求1或2所述的药物组合物，其特征在于所述药物的剂型可以是煎剂、丸剂、冲剂、片剂、胶囊、口服液或注射液。
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