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CN111437896B - 一种微流控器件及其应用 - Google Patents

一种微流控器件及其应用

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CN111437896B
CN111437896B CN202010387466.7A CN202010387466A CN111437896B CN 111437896 B CN111437896 B CN 111437896B CN 202010387466 A CN202010387466 A CN 202010387466A CN 111437896 B CN111437896 B CN 111437896B
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CN
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microfluidic device
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protein
microfluidic
sample pretreatment
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田瑞军
陈文东
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Southern University of Science and Technology
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Abstract

本发明提供了一种微流控器件及其应用，所述微流控器件包括微流控芯片以及设置在微流控芯片的微通道中的反应器，所述反应器包括连接在一起的蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜；微流控装置以气压为驱动力集成了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级等操作，可用于少量细胞、组织或者体液(如血液、尿液)样品的蛋白质组学定性和定量分析；包含微流控器件的自动化蛋白质组学样品前处理平台可实现自动化操作，提高样品处理通量和定量分析准确性。

Description

一种微流控器件及其应用
技术领域
本发明属于蛋白质组学技术领域，涉及一种微流控器件及其应用，尤其涉及一种微流控器件、微流控装置、自动化蛋白质组学样品前处理平台及其应用。
背景技术
蛋白质组学研究中，通过将样品中的蛋白质酶解成多肽后，用于液相色谱-质谱分析以获得蛋白质信息，该分离鉴定方法是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段。
蛋白质组学分析前需要进行复杂的样品前处理，主要包括：细胞的裂解、蛋白质组分的富集、蛋白质的二硫键打开和保护、蛋白质的酶解和多肽组分的除盐等。在目前的蛋白质组学研究策略中，上述样品前处理步骤都是人工全手动完成的，这大大降低了样品处理的通量，同时增加了样品的损失并降低了相关反应的反应效率。因此需要一种高度集成化和自动化的蛋白质样品前处理技术，来最大程度地降低人工操作造成的样品损失，提高系统灵敏度、样品处理通量和定量分析准确性，同时还可以极大程度减少实验人员的工作量，避免人为原因造成的实验误差。为了发展自动化蛋白质组学分析平台，需要发展新的蛋白质组反应器。蛋白质组反应器是填充有强阳离子交换树脂的毛细管，实现了蛋白质的富集、还原、烷基化和酶解等过程，能够从300个细胞中鉴定到17个蛋白质(J.ProteomeRes.2006,5,2754-2759)。稀有细胞蛋白质组反应器基于强阳离子交换树脂毛细管整体柱，实现了蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解以及多肽的分级，从5000和50000个细胞中分别鉴定到409和2281个蛋白质(Mol.Cell.Proteomics 2011,10,M110.000679)。这两种蛋白质组反应器都是在毛细管柱内进行蛋白质的处理过程，在同一个装置中集成了蛋白质样品前处理的部分过程，有效的减少了样品损失。但是受毛细管柱内径影响，填充填料有限，因此只适用于少量蛋白质样品的处理，且处理过程不包含多肽的除盐等过程。Anal.Chem.2016,88,4864-4871中公开了一种集成化的蛋白质组学技术，通过在移液枪头中填充的C18膜和SCX填料，实现蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级的全过程，能够在1.4h的质谱时间里从2000个细胞中鉴定到1270个蛋白质，在22h的质谱时间里从100000个细胞中鉴定到7826个蛋白质。虽然此蛋白质组反应器具有很好的效果，但是却需要借助离心机操作，不适用于气压驱动的自动化蛋白质组学样品前处理平台。
因此，开发一种全新的、以气压为驱动力的、应用于蛋白质组学样品前处理的微流控器件已成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种微流控器件及其应用，该样品处理过程通过气压来驱动，能够实现蛋白质样品前处理，包括蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级的全过程，可用于少量细胞、组织或者体液(如血液、尿液)样品的蛋白质组学定性和定量分析；此外，本发明的微流控器件可实现自动化操作，提高样品处理通量和定量分析准确性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的目的之一在于提供一种微流控器件，所述微流控器件包括微流控芯片以及设置在微流控芯片的微通道中的反应器，所述反应器包括连接在一起的蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜。
在本发明中，所述微流控芯片的材质为耐有机溶剂的材料，优选聚苯乙烯。
在本发明中，所述微流控芯片的形状为梯形四方体、长方体或圆柱体中的任意一种或至少两种的组合，优选梯形四方体。
在本发明中，所述微通道的个数为1-100个，当微通道的个数为2-100个，多个微通道各自相互独立，可以包括反应器，也可以不包括反应器，且反应器的具体选择可以相同，也可以不同，本领域技术人员可根据实际需要进行调整。
在本发明中，所述微通道的形状包括正圆台体、圆柱体或长方体中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，所述微通道包括连接设置的正圆台体段和圆柱体段，所述正圆台体段包括截面端和底面端，所述圆台体段的截面端与圆柱体段相连接。
在本发明中，所述反应器设置在微流道的圆台体段。
在本发明中，沿底面端至截面端方向，所述正圆台体段中依次设置有蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜。
在本发明中，所述蛋白质样品前处理填料包括强阳离子交换树脂填料和/或强阴离子交换树脂填料。
在本发明中，所述强阳离子交换树脂填料为磺酸基强阳离子交换树脂填料。
在本发明中，所述强阴离子交换树脂填料为季胺基强阴离子交换树脂填料。
在本发明中，所述固相萃取膜为C18膜。
本发明的目的之二在于提供一种微流控装置，所述微流控装置包括目的之一所述的微流控器件。
在本发明中，所述微流控装置包括：
固定器，包括壳体以及位于壳体内部的容置腔室；
设置在固定器容置腔室中的微流控器件；
嵌设在固定器壳体两端的连接件；
贯穿所述连接件的毛细管，所述毛细管与微流控器件的微通道相连通。
本发明的微流控装置可实现自动化操作：例如，可以在安捷伦毛细管电泳仪上使用所述微流控器件自动化、高通量地处理样品。
在本发明中，所述壳体是由第一壳体和第二壳体对接形成，即第一壳体和第二壳体是可拆卸连接。
在本发明中，所述连接件的外表面设置有限位件，所述限位件用于限制固定器在轴向上的相对移动。
在本发明中，所述限位件为凸台，所述固定器两端与连接件的接触面上开设有与凸台相啮合的凹槽，通过所述凸台和凹槽的啮合作用限制固定器在轴向上的相对移动。
本发明的目的之三在于提供一种微流控装置在待测生物样品的蛋白质组学定性和定量分析中的应用。
在本发明中，所述待测生物样品包括细胞、组织或体液中的任意一种或至少两种的组合，所述体液包括血液或尿液。
在本发明中，所述微流控装置用于待测生物样品的蛋白质样品前处理和多肽的高pH值反相分级。
在本发明中，将所述蛋白质样品在蛋白质样品前处理填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，而后再进行高pH值反相分级。
在本发明中，所述高pH值反相分级的pH值高于8。
在本发明中，所述应用包括如下步骤：
(1)将待测生物样品沿毛细管加入到微流控器件中，使蛋白质富集到蛋白质样品前处理填料上，得到富集有蛋白质的蛋白质样品前处理填料；
(2)使用含有机溶剂的溶液或者纯有机溶剂清洗掉残留在微流控器件中的表面活性剂和其它杂质，将步骤(1)得到的富集有蛋白质的蛋白质样品前处理填料在还原剂、烷基化试剂和酶的作用下，依次完成蛋白质的还原反应、烷基化反应和酶解反应，得到多肽；
(3)通过盐溶液将步骤(2)得到的多肽从蛋白质样品前处理填料转移到固相萃取膜上；
(4)除盐后，使用含高比例有机溶剂的溶液将多肽洗脱下来或者使用高pH值的含有不同比例有机溶剂的溶液按从低到高的比例依次将多肽洗脱下来，进行高pH值反相分级。
在本发明中，所述反相分级时使用溶液的pH值高于8。
在本发明中，所述待测生物样品为细胞或组织，所述步骤(1)还包括将细胞或组织样品预先依次进行裂解和酸化。
在本发明中，所述裂解是在裂解液的作用下进行裂解的。
在本发明中，所述裂解液包括表面活性剂。
在本发明中，所述表面活性剂包括正十二烷基-β-D-麦芽糖苷和/或胆固醇琥珀酸单酯三羟甲基氨基甲烷盐。
在本发明中，步骤(2)所述有机溶剂为乙腈和/或甲醇。
在本发明中，步骤(2)所述含有机溶剂的水溶液为含有乙腈的柠檬酸钾水溶液和/或含有甲醇的柠檬酸钾水溶液。
在本发明中，所述乙腈体积为含有乙腈的柠檬酸钾水溶液体积的10-30％，例如10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、27％、30％等。
在本发明中，所述甲醇体积为含有甲醇的柠檬酸钾水溶液体积的10-30％，例如10％、12％、15％、18％、20％、22％、25％、27％、30％等。
在本发明中，所述柠檬酸钾在含有乙腈的柠檬酸钾水溶液或含有甲醇的柠檬酸钾水溶液中的浓度为5-10mmol/L，例如5mmol/L、6mmol/L、7mmol/L、8mmol/L、9mmol/L、10mmol/L等。
在本发明中，所述待测生物样品为体液，所述步骤(1)还包括将体液预先加入稀释液进行稀释。
在本发明中，所述稀释液为N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸水溶液。
在本发明中，所述稀释液的pH为6-7。
在本发明中，所述稀释液的浓度为10-30mmol/L，例如10mmol/L、12mmol/L、15mmol/L、18mmol/L、20mmol/L、22mmol/L、25mmol/L、28mmol/L、30mmol/L等。
在本发明中，步骤(1)所述的微流控器件中的反应器在加入蛋白质样品前预先进行活化。
在本发明中，步骤(1)所述蛋白质富集到蛋白质样品前处理填料上是通过气体加压实现的。
在本发明中，步骤(2)所述还原剂包括二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯或β-巯基乙醇中的任意一种或至少两种的组合。
在本发明中，步骤(2)所述烷基化试剂包括碘代乙酸和/或碘乙酰胺。
在本发明中，步骤(2)所述酶为碱性蛋白酶。
在本发明中，步骤(2)所述酶包括胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或弹性蛋白酶。
在本发明中，步骤(3)所述盐溶液为甲酸铵和/或碳酸氢铵。
本发明的目的之四在于提供一种自动化蛋白质组学样品前处理平台，所述自动化蛋白质组学样品前处理平台包括密闭系统、目的之二所述的微流控装置以及收集系统，所述密闭系统和收集系统均与微流控装置两端的毛细管相连。
在本发明中，所述微流控装置的个数为1-100个，所述微流控装置的个数为2-100个，不同微流控装置之间并联设置。
在本发明中，所述密闭系统包括设置有气体通道的密闭容器和位于密闭容器中的样品放置装置，所述样品放置装置用于放置样品。
在本发明中，所述收集系统包括收集器件，用于收集反应系统后的样品。
本发明的目的之五在于提供一种如目的之四所述的自动化蛋白质组学样品前处理平台在待测生物样品的蛋白质组学定性和定量分析中的应用。
在本发明中，所述应用包括：将设置有气体通道的密闭容器中通入气体加压，使样品放置装置中的样品在压力作用下通过毛细管，到达微流控器件中反应，反应结束后通过毛细管到达收集器件，收集器件对反应后的样品进行收集。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的应用于蛋白质组学样品前处理的微流控器件能够通过气压驱动完成蛋白质的预富集、还原、烷基化、酶解、多肽的除盐、洗脱和高pH值反相分级等操作，实现少量细胞、组织或者体液(如血液、尿液)样品的蛋白质组学定性和定量分析；此外，本发明的微流控器件可实现自动化操作，提高样品处理通量和定量分析准确性。
(2)本发明的微流控器件能够实现批量化生产，成本低廉。
(3)本发明的应用于蛋白质组学样品前处理的微流控器件可以通过并联形成二通道、四通道或者八通道等多通道反应器，或者是在一个微流控芯片内并联设置多个微通道和反应器，同时处理多个蛋白样品，提高样品处理通量。
附图说明
图1是本发明实施方式中微流控器件的结构示意图；
图2为本发明实施方式中微流控装置的结构示意图；
图3为本发明实施方式中自动化蛋白质组学样品前处理平台的结构示意图；
其中，100为蛋白质样品前处理填料，101为固相萃取膜，102为微流控芯片，10为固定器，11为微流控器件，12为连接件，13为毛细管，14为限位件，1为微流控装置，2为密闭系统，3为收集系统，21为气体通道，22为密闭容器，23为样品放置装置；
图4为实施例1中微流控装置在水通过蛋白质的自动化反应系统在不同压力下流速的曲线图；
图5为实施例1中微流控装置在不同溶剂流过蛋白质的自动化反应系统在压力为3bar时的流速图；
图6为实施例1中微流控装置处理HEK 293T细胞样品的色谱图；
图7为实施例1中微流控装置在连续三次处理蛋白样品的酶解效率和烷基化效率图；
图8为实施例1中微流控装置在不分级和高pH值分级处理血浆样品所鉴定的蛋白和多肽数量统计图。
图9为实施例2中对微流控芯片材料进行甲醇和乙腈耐受性测试图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本实施方式提供一种微流控器件，如图1所示，从图1可以看出，微流控器件包括微流控芯片102以及设置在微流控芯片102的微流道中的反应器，反应器包括连接在一起的蛋白质样品前处理填料100和固相萃取膜101；微流道包括自左而右连接设置的正圆台体段和圆柱体段，正圆台体段包括截面端和底面端，圆台体段的截面端与圆柱体段相连接，蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜位于微流道的正圆台体段。
本实施方式提供一种微流控装置，如图2所示，
包括固定器10(包括壳体和容置腔室)、设置在固定器内部容置腔室中的微流控器件11(其中微流控器件11为上述提供的微流控器件)、嵌设在固定器两端的连接件12以及贯穿连接件12的毛细管13，毛细管13和微流控器件11的微通道相连通，壳体由第一壳体和第二壳体对接形成，连接件12的外表面设置有限位件14，用于限制固定器10在轴向上的相对移动，其中限位件为凸台，固定器10两端与连接件的接触面上开设有与凸台相啮合的凹槽，通过凸台和凹槽的啮合作用限制固定器10在轴向上的相对移动。
本实施方式还提供一种自动化蛋白质组学样品前处理平台，如图3所示，包括密闭系统2、微流控装置1(其中，微流控装置为上述提供的微流控装置)和收集系统3，密闭系统2和收集系统3均与微流控装置1两端的毛细管相连；密闭系统2包括设置有气体通道21的密闭容器22，以及位于密闭容器22中的样品放置装置23。
实施例1
本实施例中对微流控装置的参数进行设置：微流控芯片是梯形四方体，高为8.57mm，宽为7.00mm，上底面边长5.35mm，下底面边长6.32mm；正圆台体段的底面直径为1.46mm，截面直径为0.8mm，高为7.27mm；圆柱体段的底面直径为1.46mm，高为1.3mm；本实施例中蛋白质样品前处理填料为磺酸基强阳离子交换树脂填料和季胺基强阴离子交换树脂填料的组合，用量为1mg；固相萃取膜为C18膜，层数为5层；毛细管的内径200μm，外径为360μm，长度15cm。
本实施方式利用该微流控装置测试相同时间(2min)不同压力(2bar、4bar、6bar、8bar、10bar)下流过蛋白质反应器的水的体积，图4为本实施方式中压力和通过蛋白质反应器时水的流速曲线图，从图4可知，本发明的微流控装置的压力和流速具有很好的线性关系。
本实施方式利用该微流控装置测试压力为3bar时不同溶剂在蛋白质组反应器中的流速，从图5可知，甲醇、乙腈以及乙腈含量高的溶液中流速相对较快，水的流速较慢。
结合图4和图5可知，本实施方式中可以通过压力来控制溶剂在微流控装置中的流速。
本实施方式还对微流控装置处理蛋白样品(HEK 293T细胞样品)的酶解效率进行测试，图6为微流控装置处理HEK 293T细胞样品的色谱峰图，从图6可知，色谱峰峰宽窄且分布均匀，表明样品的酶解效率高。
本实施方式还对微流控装置处理HEK 293T细胞样品的酶解效率和烷基化效率进行连续三次测试，通过图7可知，三次重复实验的烷基化效率都接近于1，酶解效率都超过97％。
结合图6和图7可知，本实施方式中的微流控装置处理蛋白质样品不会对酶解效果造成影响，均有很好的样品处理效果。
将本实施方式的微流控装置和现有的SISPROT蛋白质组反应器对同样的10μg血浆样品进行处理，而后通过液质联用进行检测，检测结果见表1：
表1
从表1可知，同样处理10μg血浆样品(不包括多肽的高pH值反相分级)，本实施方式的微流控装置可以鉴定到2550条多肽和215个蛋白质，与SISPROT蛋白质组反应器具有相当的效果，说明本实施方式的微流控装置具有较好的灵敏度。
通过本实施方式的微流控装置对微量的牛血清蛋白进行处理，通过液质联用检测，检测结果如下：
表2
BSA量 覆盖率(％) 多肽数量 PSMs
2ng 7.58 5 5
20ng 8.50 6 6
200ng 29.41 17 20
2μg 80.81 85 170
从表2可知，本实施方式的微流控装置处理牛血清蛋白，在蛋白量少至2ng的情况下仍能鉴定到5条多肽以及7.58％的覆盖率，在蛋白量达到2μg时能够达到80.81％的覆盖率；结果表明，本实施方式的微流控装置对于处理微量蛋白质样品同样具有很好的效果。
本实施方式中的微流控装置还集成了多肽的高pH值反相分级操作，从而增加了多肽和蛋白质的鉴定量，如图3所示：
表3
如表3所示，用本实施方式的蛋白质组反应器处理20μg血浆样品，使用pH值为10的分别含有3％、6％、9％、15％、80％乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，进行5个分级，最后总共鉴定到4154条多肽和317个蛋白质。
如图8所示，本实施方式中微流控装置高pH值反相分级鉴定到的多肽数量和蛋白数量分别是不分级时的1.7倍和1.5倍。
实施例2
考虑到蛋白质样品前处理过程中，会用到甲醇和乙腈两种常见的有机溶剂，所以应用于蛋白质组学样品前处理的微流控器件内部的微流控芯片的材料需要能够耐受一般有机溶剂，具有一定的机械强度等特点。根据需要挑选了四种材料作为测试对象，分别是聚苯乙烯(Polystyrene，缩写PS)，聚丙烯(Polypropylene，缩写PP)，聚碳酸酯(Polycarbonate，缩写PC)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)。
对上述四种材料颗粒进行甲醇和乙腈耐受性测试，测试结果如图9所示：分别对4种材料依次用甲醇和乙腈浸泡，短时间浸泡均无明显变化；超过30min后，甲醇浸泡后4种材料还是无明显变化，再用乙腈浸泡后，PC材料会由透明变为白色，透明性降低；PMMA材料也会由透明变为白色，透明性降低同时会变软；PP和PS材料都无明显变化。但因为PS材料的透明性要比PP材料好，所以最后选择PS作为此微流控芯片的材料。
实施例3
本实施例提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台，自动化蛋白质组学样品前处理平台中的微流控装置选用与实施例1相同的微流控装置。
本实施例还提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台在蛋白质样品定性和定量分析中的应用包括如下步骤：
(1)用20mmol/L的pH为7.4的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-2磺酸水溶液(HEPES)将浓度约为60μg/μL血浆样品蛋白浓度稀释至1μg/μL；
(2)将各种所需试剂移入试剂管并放入密闭容器中，打开二通阀，通入氮气，通过氮气加压使试剂管中的样品或试剂流过微流控器件，微流控器件首先分别通过80μL的甲醇、40μL的10mmol/L HEPES(pH 7.4)的水溶液活化；活化后将浓度为1μg/μL的蛋白样品放入试剂管中，氮气加压使蛋白样品流过微流控器件，使蛋白样品富集到SCX/SAX混合填料上；
(3)用含有20％乙腈的10mmol/L HEPES水溶液和纯乙腈清洗微流控器件，加入50mmol/L二硫苏糖醇(DTT)的20mmol/L HEPES(pH 8.0)水溶液，在室温下反应30分钟，完成蛋白质的还原。接着，加入20μL的20mmol/L HEPES(pH 8.0)洗去DTT，再加入含有胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解；
(4)使用60μL的500mmol/L甲酸铵水溶液及60μL的500mmol/L氯化钠水溶液将生成的多肽从SCX/SAX混合填料转移到C18膜上；
(5)加入60μL的1％甲酸水溶液进行除盐，而后使用含有80％乙腈的0.5％醋酸水溶液将多肽从C18膜上洗脱下来，洗脱下来的多肽收集在收集管中，而后放置在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行检测。
使用液相色谱-质谱检测10μg血浆样品中多肽和蛋白质数量如表4所示：
表4
实验次数 鉴定多肽数量 鉴定蛋白数量
实验1 2442 214
实验2 2657 215
从表4可知，两次重复实验都能鉴定到大于2400条多肽和210个蛋白，表明本实施例的应用于蛋白质组学样品前处理的微流控器件通过气压驱动进行的蛋白质样品前处理具有很好的稳定性。
实施例4
本实施例提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台，自动化蛋白质组学样品前处理平台中的微流控装置选用与实施例1相同的微流控装置。
本实施例还提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台在蛋白质样品定性和定量分析中的应用包括如下步骤：
(1)将HEK 293T细胞样品使用兼容性裂解液进行裂解(裂解液成分包括10mmol/LHEPES，pH 7.4，600mmol/L盐酸胍，1％DDM，1mmol/L Na3VO4和蛋白酶抑制剂)，裂解完成后加入0.1％甲酸将样品溶液酸化至pH为2；
(2)将各种所需试剂移入试剂管并放入密闭容器中，打开二通阀，通入氮气，通过氮气加压使试剂管中的样品或试剂流过微流控器件。微流控器件首先分别通过80μL的甲醇、20μL的100mmol/L柠檬酸钾水溶液和20μL的10mmol/L柠檬酸钾水溶液活化；活化后，将蛋白样品放入试剂管，氮气加压让样品缓慢流过微流控器件，使蛋白质富集到SCX/SAX混合填料上；
(3)用含有20％乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液清洗掉结合到C18膜上的表面活性剂DDM；接着，加入10mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶液，在室温下反应15分钟，完成蛋白质的还原；接着，加入20μL的20mmol/L HEPES，pH 8.0洗去TCEP，再加入含有胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解；
(4)加入60μL的500mmol/L甲酸铵水溶液及60μL的500mmol/L氯化钠水溶液将生成的多肽从SCX/SAX混合填料转移到C18膜上；
(5)加入60μL的1％甲酸水溶液进行除盐。最后，使用含有80％乙腈的0.5％醋酸水溶液将多肽从C18膜3上洗脱下来；洗脱下来的多肽收集在收集管中，而后放置在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行检测。
通过液质联用检测到的多肽和蛋白质数量见表5：
表5
实验次数 鉴定多肽数量 鉴定蛋白数量
实验1 31244 4553
实验2 31837 4426
实验3 31855 4489
从表5可知，3次重复实验都能鉴定到了30000多条多肽和4500个蛋白质，表明本实施例的自动化蛋白质组学样品前处理平台处理蛋白样品具有很好的重现性。
实施例5
本实施例提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台，自动化蛋白质组学样品前处理平台中的微流控装置选用与实施例1相同的微流控装置。
本实施例还提供了自动化蛋白质组学样品前处理平台在蛋白质样品定性和定量分析中的应用包括如下步骤：
(1)将HEK 293T细胞样品使用兼容性裂解液进行裂解(裂解液成分为10mmol/LHEPES，pH 7.4，600mmol/L盐酸胍，1％DDM，1mmol/L Na3VO4和蛋白酶抑制剂)，裂解完成后加入0.1％甲酸将样品溶液酸化至pH为2；
(2)将各种所需试剂移入试剂管并放入密闭容器中，打开二通阀，通入氮气，通过氮气加压使样品或试剂流过微流控器件。微流控器件首先分别通过80μL的甲醇、20μL的100mmol/L柠檬酸钾水溶液和20μL的10mmol/L柠檬酸钾水溶液活化；活化后，将蛋白样品放入试剂管，氮气加压让样品缓慢流过微流控器件，使蛋白质富集到强阳离子/强阴离子交换树脂混合填料上；
(3)用含有20％乙腈的8mmol/L柠檬酸钾水溶液清洗掉结合到C18膜3上的表面活性剂DDM；接着，加入10mmol/L三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)溶液，在室温下反应15分钟，完成蛋白质的还原；接着，加入20μL的20mmol/L HEPES，pH 8.0洗去TCEP，再加入含有胰蛋白酶的10mmol/L碘乙酰铵溶液，在室温和黑暗的环境下反应60分钟，完成蛋白质的烷基化和酶解；
(4)加入60μL的500mmol/L甲酸铵水溶液及60μL的500mmol/L氯化钠水溶液将生成的多肽从SCX/SAX混合填料转移到C18膜上；
(5)加入60μL的5mmol/L甲酸铵水溶液进行除盐。最后，使用pH值为10的分别含有3％、6％、9％、15％、80％乙腈的5mmol/L甲酸铵溶液依次将多肽洗脱下来，即进行高pH值反相分级；洗脱下来的多肽收集在收集管中，而后放置在冻干机冻干后复溶于0.1％甲酸水溶液，即可用液相色谱-质谱进行检测。
使用本实施例所述的过程处理20μg HEK 293T细胞蛋白样品并进行高pH值反相分级，鉴定的多肽和蛋白质数量见表6：
表6
分级 鉴定多肽数量 鉴定蛋白数量
3％ACN 15501 4869
6％ACN 24283 5694
9％ACN 23068 5511
15％ACN 30923 5860
80％ACN 33707 5797
合并结果 92412 8010
通过表6可知，每个分级鉴定到的多肽和蛋白数量都比较平均，最后合并结果鉴定到了92412条多肽和8010个蛋白质，表明本实施例的蛋白质自动化反应系统处理蛋白样品具有很好的灵敏性。
对比例1
本对比例的方案为CN106770814A，通过本对比例和实施例1的方案进行对比，对比例1中是通过离心的方式在离心力的作用下使样品进入蛋白质组反应器，但是该方式不能及时的控制反应的开始与结束，且离心力的作用是将样品甩向移液枪头的内壁面，不容易进入交换树脂填料中，不利于反应的连续进行；而实施例1中微流控器件在气压推动下能够保证反应的连续进行，此外通过控制气压，可随时调整反应的发生与中断。另外，对比例1只用了强阳离子交换树脂填料，该填料不能有效结合等电点低于2的蛋白，造成样品损失；而实施例1使用的是强阳离子/强阴离子交换树脂混合填料，两种填料有互补作用，能够有效结合蛋白，几乎不会造成样品损失。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (15)

1.一种微流控装置，其特征在于，所述微流控装置包括：
固定器，包括壳体以及位于壳体内部的容置腔室；
设置在固定器容置腔室中的微流控器件；所述微流控器件通过气压驱动进行蛋白质样品前处理；
嵌设在固定器壳体两端的连接件；
贯穿所述连接件的毛细管，所述毛细管与微流控器件的微通道相连通；
所述微流控器件包括微流控芯片以及设置在微流控芯片的微通道中的反应器，所述反应器包括连接在一起的蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜；所述微通道的个数为1-100个，当微通道的个数为2-100个，多个微通道各自相互独立；所述微流控芯片的材质为聚苯乙烯；
所述微通道包括连接设置的正圆台体段和圆柱体段，所述正圆台体段包括截面端和底面端，所述正圆台体段的截面端与圆柱体段相连接；所述反应器设置在微通道的正圆台体段；
沿底面端至截面端方向，所述正圆台体段中依次设置有蛋白质样品前处理填料和固相萃取膜；
所述蛋白质样品前处理填料为磺酸基强阳离子交换树脂填料和季胺基强阴离子交换树脂填料的组合；所述固相萃取膜为C18膜。
2.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片的形状为梯形四方体、长方体或圆柱体中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求2所述的微流控装置，其特征在于，所述微流控芯片的形状为梯形四方体。
4.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述壳体是由第一壳体和第二壳体对接形成。
5.根据权利要求1所述的微流控装置，其特征在于，所述连接件的外表面设置有限位件，所述限位件用于限制固定器在轴向上的相对移动。
6.根据权利要求5所述的微流控装置，其特征在于，所述限位件为凸台，所述固定器两端与连接件的接触面上开设有与凸台相啮合的凹槽，通过所述凸台和凹槽的啮合作用限制固定器在轴向上的相对移动。
7.一种根据权利要求1-6中任一项所述的微流控装置在待测生物样品的蛋白质组学定性和定量分析中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述待测生物样品包括细胞、组织或体液中的任意一种或至少两种的组合，所述体液包括血液或尿液。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述微流控装置用于待测生物样品中的蛋白质样品前处理和多肽的高pH值反相分级。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述蛋白质样品在蛋白质样品前处理填料上进行酶解，酶解完成后将生成的多肽转移到固相萃取膜上，而后再进行高pH值反相分级。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述高pH值反相分级的pH值高于8。
12.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：
（1）将待测生物样品沿毛细管加入到微流控器件中，使蛋白质富集到蛋白质样品前处理填料上，得到富集有蛋白质的蛋白质样品前处理填料；
（2）将步骤（1）得到的富集有蛋白质的蛋白质样品前处理填料在还原剂、烷基化试剂和酶的作用下，依次完成蛋白质的还原反应、烷基化反应和酶解反应，得到多肽；
（3）通过盐溶液将步骤（2）得到的多肽从蛋白质样品前处理填料转移到固相萃取膜上；
（4）除盐后，将不同浓度的有机溶剂溶液对固相萃取膜上的多肽依次洗脱下来，进行高pH值反相分级，所述反相分级时使用溶液的pH值高于8。
13.一种自动化蛋白质组学样品前处理平台，其特征在于，所述自动化蛋白质组学样品前处理平台包括密闭系统、权利要求1-6中任一项所述的微流控装置以及收集系统，所述密闭系统和收集系统均与微流控装置两端的毛细管相连；
所述密闭系统包括设置有气体通道的密闭容器和位于密闭容器中的样品放置装置，所述样品放置装置用于放置样品；
所述收集系统包括收集器件，用于收集反应系统后的样品；
所述微流控装置的个数为1-100个，不同微流控装置之间并联设置。
14.一种根据权利要求13所述的自动化蛋白质组学样品前处理平台在待测生物样品的蛋白质组学定性和定量分析中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述应用包括：将设置有气体通道的密闭容器中通入气体加压，使样品放置装置中的样品在压力作用下通过毛细管，到达微流控器件中反应，反应结束后通过毛细管到达收集器件，收集器件对反应后的样品进行收集。
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