CN111437381A - 一种水凝胶微粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水凝胶微粒及其制备方法。制备方法包括步骤：1)制备羧甲基‑β‑环糊精溶液；2)制备羧甲基壳聚糖溶液；3)制备羧甲基‑β‑环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒。通过羧甲基‑β‑环糊精和羧甲基壳聚糖进行接枝交联得到的水凝胶微粒，主要使用到羧甲基‑β‑环糊精、羧甲基壳聚糖两种原材料，且两种原材料便宜易得，避免了高成本原料的使用；其制备步骤简洁，制备过程安全、易操作；水凝胶微粒几乎无细胞毒性，生物相容性良好，能够口服灌胃，无任何毒副作用，且负载胰岛素后缓释效果良好，能避免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，可控制药物的释放和延长药物疗效及保持药物活性不变，提高口服胰岛素类蛋白药物的生物利用度。

Description

一种水凝胶微粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种羧甲基-β-环糊精 接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒，以及制备该水凝胶微粒的方法。

背景技术

糖尿病是现代人们生活中最常见的慢性疾病之一且很难根治，一 直以来胰岛素为主要的治疗方式。但长期针剂注射容易引起过敏、低 血糖、感染及皮下脂肪萎缩等副作用，这给需要终生用药的糖尿病患 者带来很多困扰及不便。口服给药方便合理、易于被患者接受，因此 口服胰岛素无疑是较理想且最好的治疗方式。目前，口服胰岛素类蛋 白给药需要克服生理障碍、酶障碍及物理化学稳定性等问题，因此需 要借助生物相容性好、无细胞毒性的载体材料将胰岛素制成缓控释制 剂，这样不仅可避免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，提高胰岛 素的生物利用度，还可以延缓胰岛素在体内的作用时间，减少给药次 数。

多糖具有高度的稳定性、安全性、无毒性、亲水性、生物可降解 性等优点，而且来源广泛、成本低。多糖水凝胶是多糖利用的一个重 要方面，可用作缓释载体，显示出十分广阔的应用前景。

羧甲基壳聚糖是壳聚糖的水溶性衍生物，具有良好的生物相容 性、成膜性、吸附性、亲水性、可修饰性以及低生理毒性，储存丰富、 价格低廉，壳聚糖对胰岛素的包裹以及优良靶向性，可使壳聚糖胰岛 素材料在一定程度上避免消化道蛋白酶对胰岛素的分解。羧甲基-β- 环糊精具有疏水空腔生成包络物的能力，在pH较低的溶液中溶解度 低，但在中、碱性溶液中，由于羧基解离，可以任意浓度溶解，而且 其结构疏松，自流动性明显改善。故在人体肠道pH6-7的环境中具有 很好的溶解性，可提高药物的稳定性和生物利用度，用于药物的缓释 和改善剂型。

发明内容

本发明公开了一种用作口服胰岛素的载体的水凝胶微粒，其具有 多孔结构和非晶型结构，热稳定性能良好，缓释性能良好；且有较好 的生物相容性，能有效包载胰岛素药物和抵抗胃酸的破坏作用并保护 胃粘膜不受药物的刺激，从而控制药物的释放和延长药物疗效及保持 药物活性。

一种水凝胶微粒的制备方法，主要包括以下步骤：

1)制备羧甲基-β-环糊精溶液：取羧甲基-β-环糊精溶解于去离子 水中，制得羧甲基环糊精溶液；

2)制备羧甲基壳聚糖溶液：取羧甲基壳聚糖溶解于去离子水中， 制得羧甲基壳聚糖溶液；

3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒：将羧甲 基-β-环糊精溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合，再加适量的1-乙基-(3-二 甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺进行接枝交联， 在25℃下充分搅拌24小时，得到接枝产物溶液；接枝产物溶液用甲 醇沉淀，过滤得沉淀物；用蒸馏水溶胀沉淀物，再用去离子水透析， 最后用甲醇沉淀，冷冻干燥，过20目筛，收集获得固体颗粒状水凝 胶。

其中，羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基 丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为 3.3:17:19.2:19.2。

进一步，每克羧甲基-β-环糊精溶解于20mL去离子水。每克羧 甲基壳聚糖溶解于25mL去离子水。优选地，所述羧甲基-β-环糊精 纯度≥99.3％，所述羧甲基壳聚糖的羧化度≥80％。

进一步，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量 为3.68g。所述N-N-羟基琥珀酰亚胺的质量为2.21g。

上述制备所得羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒可 用于胰岛素的包埋及口服递送。羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖 水凝胶微粒具有多孔结构，属于非晶型结构。多孔结构有利于水分子 的渗透和药物分子的贮存保留。结构特征表明其溶胀性能良好，热稳 定性能良好；羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒包埋胰 岛素后，经模拟人体胃肠道环境，载胰岛素水凝胶微粒可避免胃酸及 胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，且保持胰岛素的生物活性不变。不同 浓度的水凝胶溶液(12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL) 培养的细胞存活率均达96％以上，无细胞毒性作用；糖尿病小鼠经口 服载胰岛素凝胶微粒(50、75、100IU/kg)，可维持6-10h的低血糖 水平，载胰岛素水凝胶微粒对2型糖尿病小鼠模型具有良好且较持久 的降血糖活性效果。

与现有技术相比，本发明通过羧甲基-β-环糊精和羧甲基壳聚糖进 行接枝交联得到的水凝胶微粒，主要具有以下优势：

(a)本发明主要使用到羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖两种原 材料，且两种原材料便宜易得，避免了高成本原料的使用，具有经济 合理性，节约成本。

(b)本发明的水凝胶微粒，制备步骤简洁，制备过程安全、易 操作。

(c)本发明的水凝胶微粒几乎无细胞毒性，生物相容性良好， 能够口服灌胃，无任何毒副作用，可广泛用于口服递送药物。

(d)本发明的水凝胶微粒，负载胰岛素后缓释效果良好，能避 免胃酸及胃蛋白酶对胰岛素的破坏降解，可控制药物的释放和延长药 物疗效及保持药物活性不变，提高口服胰岛素类蛋白药物的生物利用 度。

附图说明

图1是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒制备工艺流 程图；

图2是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的傅里叶红 外分析图；

图3是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的X射线单 晶衍射图；

图4是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的扫描电镜 图；

图5是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的热重分析 图；

图6是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的溶胀率 图；

图7是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒负载胰岛素 后的累积释药曲线图；

图8是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒释放胰岛素 后的荧光光谱图；

图9是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒释放胰岛素 后的圆二色谱图；

图10是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的细胞毒 性图；

图11是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒负载胰岛 素后的降血糖活性效果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图 对本发明作进一步地详细描述。

实施例1，制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒。

工艺流程如图1所示，主要包括以下步骤：

(1)制备羧甲基-β-环糊精溶液：称取4.0g羧甲基-β-环糊精溶解 于80mL去离子水中，制得羧甲基-β-环糊精溶液；

(2)制备羧甲基壳聚糖溶液：称取4.0g羧甲基壳聚糖溶解于100 mL去离子水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；

(3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒：将羧 甲基壳聚糖溶液和羧甲基-β-环糊精溶液混合，再加3.68g的1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和2.21g的N-N-羟基琥珀酰亚胺进 行接枝交联，在25℃下充分搅拌24小时，得到接枝产物溶液；接枝 产物溶液用甲醇沉淀，过滤得沉淀物；用蒸馏水溶胀沉淀物，再用去 离子水透析，最后用甲醇沉淀，冷冻干燥，过20目筛，收集获得固体 颗粒状水凝胶。

实施例2，结构表征测定。

傅里叶红外光谱检测：分别将羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖与 少量KBr混合研磨均匀，压成薄片。冷冻干燥后的凝胶样品借助ATR 附件，通过傅里叶红外光谱在波长500～4000cm^-1范围进行扫描。

羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的表征如下图所 示，其中，如图2所示，三者在3400cm^-1位置的峰均归属为OH基团振 动。羧甲基-β-环糊精在2930、1601、1420cm^-1处的吸收峰分别归属 为羧甲基脂肪族CH₂基团的不对称伸缩振动、羧酸盐基团C＝O的不对 称伸缩振动和对称伸缩振动。在羧甲基壳聚糖谱图中，在1597、1414 cm^-1处有与羧甲基-β-环糊精共同的吸收峰，为羧酸盐基团C＝O的不对 称伸缩振动和对称伸缩振动，而在2875cm^-1波段处的吸收峰归属为乙 酰氨基团的对称CH₃振动。在羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝 胶微粒谱图中显示出强度高达1634cm^-1的典型酰胺I带，该迹象表明 在羧甲基壳聚糖和羧甲基-β-环糊精之间发生了成功的酰胺化交联。 此外，由于α(1→4)吡喃葡萄糖环的振动，羧甲基-β-环糊精显示在 946cm^-1波段处有吸收峰，且在水凝胶制备过程中通过羧甲基-β-环糊 精的加入，水凝胶微粒在894cm^-1处有更强的吸收峰，表明羧甲基-β-环糊精通过羧甲基壳聚糖的氨基和羧甲基-β-环糊精的羧甲基之间的 酰胺键作用，促使羧甲基-β-环糊精接枝到了羧甲基壳聚糖上，因此 接枝成功。

X射线单晶衍射仪检测：将冷冻干燥的凝胶样品研碎；分别将凝 胶粉末，羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖置于样品池中，通过X射线 单晶衍射仪检测；参数如下：放射源Cu-Kα(λ＝0.154nm)，工作电压、 工作电流分别为40KV和40mA，衍射角度10°到45°。

如图3所示，羧甲基-β-环糊精的晶面特征衍射吸收峰，其峰强度 较强、峰形较好，说明其结构规整，晶型较好。羧甲基壳聚糖的X射 线单晶衍射光谱显示出，在反射角2θ值为20°处，由于羟基分子氢键 造成的晶体特点的结晶形态。而羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖 水凝胶微粒的X射线单晶衍射图，反射角2θ值为20°处表现出宽的单峰 模式，与羧甲基壳聚糖相比，表现为结晶度降低，吸收峰有所减弱， 显示为更多的是无定形态。因此，接枝完成，X射线单晶衍射结果也 与红外谱图的结果相一致。

扫描电镜检测：将羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒 进行冷冻干燥，冻干后的凝胶样品贴在导电胶上，真空环境下喷金20 min。通过10KV电压下的扫描电镜观察其截面微观结构。

图4是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的扫描电镜 图，不同倍数下观察到凝胶截面均有较多的孔隙，具有不规则疏松多 孔结构。

热重分析检测：将冻干后的水凝胶微粒进行热重分析仪检测；样 品置于密封的铝质样品篮中，在氮气中以10℃/min的升温速率从 25℃加热至600℃。

图5是羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的热重分析 图，水凝胶在100℃前主要为水分的流失，200-600℃为官能团的化 学降解，羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒分解时间相 比羧甲基-β-环糊精和羧甲基壳聚糖发生更早，表明凝胶微粒的热稳 定性能更好。

实施例3，理化性能测定指标评定。

溶胀实验：取一定质量(W₀)的冷冻水凝胶放置在5mL的pH＝1.2 的0.1M HCl溶液和pH＝6.8、pH＝7.4的0.1％(w/v)PBS磷酸盐溶液中， 并在37℃、100rpm下震荡2h。分别在30、60、90、120min时轻轻 用滤纸吸收去除多余的液体的表面,并且称重(W_t)。溶胀率用以下公 式计算，绘制溶胀率随时间的变化曲线。

溶胀率：SR＝(W_t-W₀)/W₀×100％

结果阐明了羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒的理 化性质，其中，图6表明在不同的pH条件下水凝胶微粒的溶胀率均较 高，具备优良的溶胀性能。水凝胶微粒既可吸收大量的水分子，也利 于药物的大量贮存。

载药实验：取一定质量的冷冻水凝胶浸入到5mg/mL的胰岛素盐 酸溶液中，于37℃、100r/min条件下恒温振荡进行吸附载药，中间 每隔一段时间取样测定溶液的吸光度，直至溶液的吸光度不变为止， 使水凝胶达到溶胀和吸附平衡，然后取出水凝胶常温真空干燥即可， 并用紫外分光光度计测定吸附前后溶液的吸光度值，由标准曲线法算 出其中的浓度，计算水凝胶的载药量。载药率按如下公式计算：

载药率：Q＝[V×(C₀-C_e)]/W×100％

体外释药性能测定：将达到吸附和溶胀平衡的水凝胶室温晾干至 恒重后，称重并置于锥形瓶中，模拟胃肠道pH值的变化，先将载胰 岛素水凝胶微粒放入pH1.2的HCl溶液中，在37℃恒温培养振荡器中 100r/min条件下恒温连续振荡释放药物2h，然后放入释放介质为pH 值为6.8的PBS中，继续在37℃条件下释放药物2h，最后放入释放介 质为pH值为7.4的PBS中，继续在37℃条件下释放药物3h，每隔0.5 小时用移液管移取2mL缓释液，，并补充新鲜的2mL相应体积的模拟 胃肠道缓释介质，通过紫外分光光度计分别以各自的空白作参比，测 定药物的吸光度值，得到药物的含量，绘制累积药物释放曲线。累计 释药率按如下公式计算得到，绘制释药曲线。

释药率：

图7表明在前两小时模拟胃液环境内凝胶微粒没有明显的突释现 象，释放率仅8％，而在模拟肠道环境释放率显著增加至55％至70％， 并实现可持续释放。因此，水凝胶对胰岛素有良好的控释和缓释性能， 可避免胰岛素受胃液的分解，而在肠道pH环境下释放时间更长、更 稳定，有利于胰岛素被人体肠道吸收。

胰岛素生物活性测定：将胰岛素标准溶液和载胰岛素水凝胶经模 拟人体环境释放出的胰岛素进行荧光光谱仪测定及对比分析，将激发 光单色器固定在所选择的激发光波长处，将荧光单色器调节至所选择 的荧光波长处，由记录仪得出的信号是样品溶液的荧光强度。设定激 发波长为276nm，激发和发射的狭缝宽度为2.5nm，发射波长扫描范 围280-450nm。将胰岛素标准溶液和载胰岛素水凝胶经模拟人体环境 释放出的胰岛素进行圆二色谱仪测定及对比分析，用1cm光程差的圆 柱形石英比色皿，设定参数为精密度0.2nm，带宽1.0nm，扫描速率200nm/min，扫描范围200-300nm，恒温4℃下扫描测定。

图8表明经模拟人体环境释放出的胰岛素荧光光谱图在308nm附 近均出现了特征峰，与胰岛素标准溶液的荧光光谱图一致，说明胰岛 素在经过凝胶微粒的包埋与释放此过程中其二级结构没有发生任何 改变，该凝胶微粒可保持胰岛素原有的生物活性不变。图9表明经模 拟人体环境释放出的胰岛素圆二色谱图中，在波长208nm和222nm 附近出现的两个负峰分别对应胰岛素的α螺旋和反平行β折叠的特征 峰。由此表明包埋的胰岛素在释放前后的结构未发生明显变化，进而 测其生物活性也保持不变，也与荧光光谱图的结果相一致。

实施例4，生物相容性测定指标评定。

细胞毒性实验：将Caco-2细胞接种于96孔板中，接种密度1×10⁵细胞/孔，用100μL含20％优质胎牛血清、1％双抗和1％非必需氨基酸 的MEM培养基在5％CO₂，37℃条件下培养24h。将凝胶微粒加入 MEM培养基，制成12.5、25、50、100、200、400、800、1600μg/mL 的凝胶混悬液。24h后去除96孔板中的培养基，加入100μL不同浓度 凝胶混悬液，继续培养24h，然后每孔加入10μL CCK-8溶液。用加 了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对 照。在细胞培养箱内继续孵育0.5小时，在450nm测定吸光度。用不含 凝胶的MEM培养基做对照组。每组设8个复孔平行实验，取其平均值。

细胞存活率(％)＝OD_490(样品)-OD_490(空白)/OD_490(对照)-OD_490(空白)×100％

羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒有良好的生物相 容性，其中，如图10所示，凝胶混悬液(12.5、25、50、100、200、 400、800、1600μg/mL)培养24h后Caco-2细胞细胞存活率均到达96％ 以上，表明凝胶微粒无毒性，生物相容性良好。

实施例5，药理活性测定指标评定。

小鼠降血糖水平检测：取60只2～3周的雄性昆明小鼠，使用链脲 佐菌素(STZ)诱导法建立2型糖尿病小鼠模型。模型构建成功(血糖水 平≥16.7mmol/L)后，作为糖尿病小鼠模型用于进一步实验。将糖尿 病小鼠分为六组，每组10只，分别为模型组(口服0.9％生理盐水)、阳 性组(皮下注射5IU/kg)、阴性组(口服100IU/kg胰岛素溶液)、高剂量 给药组(口服100IU/kg载胰岛素凝胶微粒)、中剂量给药组(口服75 IU/kg载胰岛素凝胶微粒)、低剂量给药组(口服载50IU/kg胰岛素凝胶 微粒)。按照预先设计的不同方式给药后，通过收集尾巴末端的血样 (每小时一次)来获得血糖值，并检测不同给药方式下血糖随时间的变化规律。

图11所示，载胰岛素凝胶微粒有良好的降血糖活性作用。模型组 和阴性组对小鼠的血糖水平并没有起到任何的作用；阳性组可确保注 射后2小时血清胰岛素浓度达到峰值，但是作用时间短、急剧且很快 血糖值有所回升；相比之下,口服灌胃载胰岛素水凝胶微粒(50、75、 100IU/kg)均表现出血清胰岛素浓度峰值在6h左右,且可控制小鼠长 时间保持低血糖水平，缓释出的胰岛素持续了大约近10h。这表明, 水凝胶微粒包埋胰岛素后可实现缓释作用并对2型糖尿病小鼠模型具 有更持久的降血糖活性效果。

Claims (9)

1.一种水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：

1)制备羧甲基-β-环糊精溶液：取羧甲基-β-环糊精溶解于去离子水中，制得羧甲基环糊精溶液；

2)制备羧甲基壳聚糖溶液：取羧甲基壳聚糖溶解于去离子水中，制得羧甲基壳聚糖溶液；

3)制备羧甲基-β-环糊精接枝羧甲基壳聚糖水凝胶微粒：将羧甲基-β-环糊精溶液和羧甲基壳聚糖溶液混合，再加适量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺进行接枝交联，在25℃下充分搅拌24小时，得到接枝产物溶液；接枝产物溶液用甲醇沉淀，过滤得沉淀物；用蒸馏水溶胀沉淀物，再用去离子水透析，最后用甲醇沉淀，冷冻干燥，过20目筛，收集获得固体颗粒状水凝胶。

2.根据权利要求1所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，所述羧甲基-β-环糊精、羧甲基壳聚糖、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为3.3:17:19.2:19.2。

3.根据权利要求2所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，步骤1)中每1.0g羧甲基-β-环糊精溶解于20mL去离子水。

4.根据权利要求2所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，步骤2)中每1.0g羧甲基壳聚糖溶解于25mL去离子水中。

5.根据权利要求4所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，所述羧甲基壳聚糖的羧化度≥80％。

6.根据权利要求2所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的质量为3.68g。

7.根据权利要求2所述水凝胶微粒的制备方法，其特征在于，N-羟基丁二酰亚胺的质量为2.21g。

8.一种水凝胶微粒，其特征在于，由权利要求1至7任一项所述制备方法所制成。

9.如权利要求8所述水凝胶微粒在胰岛素的包埋及口服递送中的应用。

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