CN111420037B

CN111420037B - 噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用

Info

Publication number: CN111420037B
Application number: CN202010225517.6A
Authority: CN
Inventors: 王建华; 闫伟; 滕达; 毛若雨; 杨娜; 王秀敏; 郝娅; 马炫炫
Original assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Feed Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-03-26
Filing date: 2020-03-26
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-03-26
Also published as: CN111420037A

Abstract

本发明提供噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用。本发明首次发现Lysep3对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果，同时在外膜渗透剂的联合作用下对多种细菌具有明显的抑制作用，且具有较低的对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。此外，本发明以天然噬菌体裂解酶Lysep3为模板，通过优化裂解酶Lysep3基因序列，构建特异表达载体，实现了裂解酶Lysep3在真核表达系统(毕赤酵母)中的表达，并建立完善了蛋白纯化体系，可实现噬菌体裂解酶Lysep3的规模化生产，用于抗菌药物、饲料添加剂等领域，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

Description

噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药及基因工程领域，具体地说，涉及噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用。

背景技术

中国是畜禽生产和产品消费大国，同时也是世界饲料生产和抗生素使用大国，2010年使用量约占全球消耗量的23％，到2030年有可能增长至30％(Van Boeckel et al.,2015)。畜牧业中抗生素的使用对促进养殖业发展发挥了重大作用，但是大量抗生素的使用，也导致畜牧养殖业中病原菌耐药性的泛滥。研究表明，尤其是在亚洲等不发达国家和地区，已经有三分之一的常用药物对鸡病原菌无效，四分之一的常用抗生素对猪无明显治疗效果(Thomas Van Boeckel et al.,2019)。人类、动物和环境之问的活动与联系，加强了耐药细菌及耐药基因的传播(Pranting et al.,2008；Pollard et al.,2012)。多重耐药，甚至“超级耐药”细菌的出现和流行，不仅影响到动物疾病的有效防治而且可能会危及食品和公共安全。

饲用抗生素的禁用已经在全球范围内成为行业和社会共识。欧盟、日本、韩国等国家已分别于2006年、2008年和2011年禁止在饲料中使用抗生素促生长剂。2017年6月，《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》明确提出推进兽用抗菌药物规范化、减量化使用，要实施“退出行动”，推动促生长用抗菌药物逐步退出，鼓励研制新型动物专用抗生素。2018年4月20日，农业农村部发布通知将开展兽用抗菌药使用减量化行动试点。以期应对动物源细菌耐药挑战，保障养殖业生产安全、食品安全、公共卫生安全和生态安全。禁止饲用抗生素是大势所趋，因此，开发新的抗生素替代品迫在眉睫。

噬菌体裂解酶(bacteriophage endolysins)是一种双链DNA噬菌体在侵染宿主菌后期编码合成的酶类物质，可以在穴蛋白(holin)的协助下从宿主菌内部杀灭细菌，释放子代噬菌体。噬菌体及裂解酶最早发现于上世纪初期，最近由于抗生素滥用所导致的细菌耐药性泛滥现象愈加严重，逐步受到研究者的关注(Fernando L et al.,2019)。目前研究普遍认为噬菌体裂解酶作用于细菌细胞壁的肽聚糖结构，根据其作用位点的不同可分为四类：葡糖苷酶、内肽酶、酰胺酶和转糖激酶(Michael J.Love et al.,2018)。由于裂解酶作用位点较为保守，所以相较于抗生素而言不易产生耐药性，同时噬菌体作为自然界中存在最为丰富的微生物之一，为裂解酶提供了充足的来源保障，因此，裂解酶被视作一种有潜力的抗生素替代品。但是目前已经分离鉴定出来的裂解酶仍然不足以满足畜牧业生产中的需求，同时天然裂解酶的生产成本较高、杀菌效果和机理不明确，因此对天然裂解酶的生产工艺加以优化改造以及对其应用领域的进一步研究也是目前裂解酶产品开发的难点和希望所在。

发明内容

本发明的目的是提供噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物或组合物中的应用。

本发明的另一目的是提供在重组毕赤酵母中高效表达噬菌体裂解酶Lysep3的方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物或组合物中的应用，其中，所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；

噬菌体裂解酶Lysep3包含如下的氨基酸序列或由其组成：

i)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

ii)在i)的N端和/或C端连接标签(如6～8个组氨酸标签)得到的氨基酸序列；或

iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白质。

所述菌包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)的细菌。例如，猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Stphylococcus epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡白痢沙门菌(Salmonella pullorum)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)等。

第二方面，本发明提供一种广谱抗菌药物或组合物，活性成分为噬菌体裂解酶Lysep3，任选辅以外膜渗透剂。所述外膜渗透剂如EDTA、柠檬酸和苹果酸等。

第三方面，本发明提供一种聚核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

第四方面，本发明提供含有所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌或转基因细胞系。

第五方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含诱导型启动子以及位于启动子下游的SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为pPICZαA。

第六方面，本发明提供一种毕赤酵母转化子，所述毕赤酵母转化子是将上述重组表达载体进行线性化后转化到毕赤酵母X-33中构建而成。

第七方面，本发明提供所述毕赤酵母转化子在发酵生产噬菌体裂解酶Lysep3中的应用(在重组毕赤酵母中高效表达噬菌体裂解酶Lysep3的方法)。包括以下步骤：

1)种子液的制备：从YPD平板挑取毕赤酵母转化子单菌落，接种于含100μg/mlzeocin的10mL YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1％接种量接种于200mL YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养16-18h，至OD_600nm值为5-7，即得种子液；

2)发酵培养：25℃～29℃下，按10％的接种量将上述种子液加入1.8L基础盐培养基中，调pH值至4.0-6.0，加入9.6ml PMT1和200mL 45％葡萄糖溶液，通气量维持在8～9vvm，转速为800rpm，溶氧维持在10％以上；

3)饲喂碳源：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升至80％以上，开始流加50％葡萄糖溶液，流加速度为12～24mL/L/min，连续流加6～8h，转速上调至1000rpm；

4)甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时左右，开始补加100％甲醇，由第一小时的流速1mL/L/min逐渐增加到第六小时的6mL/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调至5.5，控制溶氧在20％以上，至发酵结束；

5)目的蛋白的纯化：包括对发酵液依次进行透析脱盐、冷冻干燥、复溶和离子交换层析等步骤。

其中，步骤2)中使用的基础盐培养基配方为：100g NH₄H2PO₄、40g K₂SO₄、30gMgSO₄·7H2O、12g KH₂PO₄、0.8g CaSO₄和3g KOH，加水充分溶解后定容至1.8L。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1、密码子优化：参考相关文献(Meng Lv et al.,2015)，从NCBI数据库检索噬菌体裂解酶Lysep3的氨基酸序列(YP_009100017.1，SEQ ID NO:1)，对所述裂解酶的基因序列按照毕赤酵母密码子偏好性进行优化(SEQ ID NO:2)，并在优化后的基因序列的3’端添加8个CAT组氨酸标签和2个TAA终止密码子(SEQ ID NO:3)，并通过特异性引物PCR扩增的方法在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加XbaI酶切位点，所设计引物序列如SEQ ID NO:4-5所示。

2、表达载体构建：将SEQ ID NO:3所示的DNA序列采用PCR扩增的方法分别在两端添加XhoI和XbaI酶切位点，然后和载体pPICZαA经XhoI和XbaI双酶切和连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态菌株中，验证重组质粒稳定性，测序正确得到的重组表达载体。

3、基因工程菌制备：重组表达载体线性化后转化到感受态毕赤酵母X-33中，诱导表达并筛选高表达基因工程菌。

本发明首次发现噬菌体裂解酶Lysep3对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果，同时在外膜渗透剂(如EDTA)的联合作用下对肠炎沙门氏菌CVCC 3377等多种细菌具有明显的抑制作用，且具有较低的对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。

本发明以天然噬菌体裂解酶Lysep3为模板，通过优化裂解酶Lysep3基因序列，构建特异表达载体，实现了裂解酶Lysep3在真核表达系统(毕赤酵母)中的表达，并建立完善了蛋白纯化体系，可实现噬菌体裂解酶Lysep3的规模化生产，用于抗菌药物、饲料添加剂等领域，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中PCR扩增Lysep3基因和提取空质粒pPICZαA的产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M:DNAMarker；1：Lysep3基因扩增产物；2：空质粒pPICZαA。

图2为本发明实施例3中重组酵母基因组特异性PCR验证结果；其中，M：DNAMarker；1-10：含有Lysep3编码序列的毕赤酵母X-33重组子的PCR扩增结果。

图3为本发明实施例4中重组酵母菌株诱导发酵120h后不同诱导时间的发酵Tricine-SDS-PAGE电泳检测结果；其中，M:蛋白分子量Marker；1-6：分别诱导0h、24h、48h、72h、96h和120h的发酵液上清电泳条带。

图4为本发明实施例4中重组酵母菌株发酵上清总蛋白浓度与菌体湿重时间曲线。

图5为本发明实施例5中发酵液上清纯化电泳检测结果；其中，M:蛋白分子量Marker；1-6：分别是发酵上清液、穿透峰、25％B液洗脱峰、35％B液洗脱峰和45％B液洗脱峰。

图6为本发明实施例5中重组蛋白质谱鉴定结果。

图7为本发明实施例7中裂解酶Lysep3对金黄色葡萄球菌ATCC43300浊度试验结果；其中，A：不同浓度裂解酶Lysep3对金黄色葡萄球菌ATCC43300抑制作用；B、C、D：分别为裂解酶分别与EDTA、柠檬酸和苹果酸联合作用对金黄色葡萄球菌ATCC43300的抑制作用。

图8为本发明实施例8中裂解酶Lysep3溶血性实验结果。

图9为本发明实施例9中裂解酶Lysep3细胞毒性实验结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中涉及的培养基和缓冲液配方：

LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 10g/L；固体LB培养基则加入2％的琼脂糖。

低盐LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸提取物5g/L，NaCl 5g/L；固体低盐LB培养基则加入2％的琼脂粉。

MH培养基：酪蛋白水解物17.5g/L，牛肉浸粉5g/L，淀粉1.5g/L。

MHA培养基：固体MH培养基则加入2％的琼脂粉。

YPD培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，葡萄糖20g/L；固体YPD培养基则加入2％琼脂粉。

YPDS培养基：蛋白胨20g/L，酵母浸提取物10g/L，山梨醇182.2g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。

BMGY培养基(1L)：酵母浸提取物10g，蛋白胨20g，甘油10m L，13.4％无氨基酸酵母氮源(YNB)100m L，0.02％生物素2m L，1mol/L磷酸缓冲液，pH6.0，100m L。

有关LB培养基、低盐LB、MH、YPD、YPDS等培养基的使用参照Invitrogen毕赤酵母操作手册。

结合缓冲液(A液)：7.6024g Na₃PO₄·12H₂O，29.22g NaCl，0.3404g咪唑，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 7.4，定容至1000mL。

洗脱缓冲液(B液)：7.6024g Na₃PO₄·12H₂O，29.22g NaCl，34.04g咪唑，加去离子水至950mL，置于磁力搅拌器至完全溶解后调pH 7.4，定容至1000mL。

关于纯化液配制及操作步骤参见GE公司纯化仪说明书。

以下实施例中涉及的基因扩增及转化子鉴定方法为PCR法及DNA测序法。

以下实施例中涉及的蛋白检测方法为Tricine-SDS-PAGE，参照(

H.,etal,2006)。

以下实施例中涉及的蛋白质浓度测定方法为Bradford法。

以下实施例中涉及的蛋白分子量的确定方法为MALDI-TOF MS法。

以下实施例中涉及的蛋白纯化的方法为基于镍柱亲和层析法。

以下实施例中涉及的发酵方法为高密度发酵法。

以下实施例中涉及的菌种和质粒见表1：

表1供试菌种和质粒

实施例1裂解酶Lysep3基因片段的获得

裂解酶Lysep3基因表达序列的优化与设计：

对裂解酶Lysep3的编码基因根据酵母密码子偏好性进行优化(SEQ ID NO:2)，在优化后的基因序列的3’端添加8个CAT组氨酸标签以及2个TAA终止子序列(SEQ ID NO:3)，并通过特异性引物PCR扩增的方法在优化后的基因序列的5’端添加XhoI酶切位点和Kex2切割位点，在3’端添加XbaI酶切位点，即完成基因表达框的构建。以上序列由上海生工生物工程股份有限公司完成。

实施例2酵母重组表达载体的构建

1、将实施例1获得的裂解酶Lysep3基因片段含有XhoI和XbaI酶切位点序列的特异性引物进行扩增后进行双酶切回收纯化片段。同时，用XhoI和XbaI双酶切pPICZαA载体(购自Invitrogen)，并对产物进行Tricine-SDS-PAGE电泳验证(图1)。

双酶切体系如下：

以上酶切体系加样完毕后置于PCR仪37℃反应4h，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。酶切产物用DNA产物回收试剂盒回收。裂解酶Lysep3基因和pPICZαA载体经过XbaI和XhoI双酶切消化后，用T4 DNA连接酶将裂解酶Lysep3基因与线性化的pPICZαA载体进行连接。连接体系如下：

连接条件:以上连接体系加样完毕后于PCR仪16℃过夜连接。

2、将获得的重组载体转化到大肠杆菌DH5α中，转化步骤如下：

1)10μL连接产物加入50μL E.coli DH5α感受态细胞，冰浴30min；

2)42℃热激45s，立即冰浴2～3min；

3)加入450μL 37℃预热的LB低盐培养基，37℃，100rpm恢复培养1h；

4)重悬菌体后取100-200μL涂布于含有25μg/mL Zeocin的固体低盐LB培养基上；

5)37℃倒置培养12-16h。

2.3大肠杆菌DH5α阳性转化子鉴定

挑取在低盐LB平板上长出的单菌落接种于10mL LB液体培养基中(含25μg/mLzeocin)，37℃，250rpm过夜培养，通过菌落PCR鉴定阳性转化子。挑取经特异引物验证的阳性转化子接种于10mL低盐LB液体培养基中(含25μg/mL zeocin)，37℃，250rpm过夜培养，取500μL测序验证。

挑取阳性转化子，进行菌液PCR验证转化子正确性，PCR体系、反应条件如下：

PCR体系(引物F、R的序列如SEQ ID NO:4-5所示)：

PCR反应条件：

PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带。30％甘油管保存含有重组表达载体的E.coli并提取质粒(pPICZαA-Lysep3)，用于后续电转毕赤酵母。

实施例3含裂解酶Lysep3基因重组酵母菌株的构建

1、重组载体pPICZαA-Lysep3的线性化

利用PmeI对组成型重组表达载体pPICZαA-Lysep3进行酶切，酶切体系和反应条件如下：

以上酶切体系加样完毕后置于PCR仪37℃反应4h，2％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件：120V，30min。电泳结果显示：pPICZαA-Lysep3重组载体完全线性化。

2、毕赤酵母X-33感受态的制备

1)挑取YPD平板上的X-33单菌落，接种至10mL YPD液体培养基，29℃，250rpm，过夜培养；

2)取毕赤酵母X-33过夜培养液以1％接种量，接种至100mL YPD液体培养基，29℃，250rpm，培养至OD₆₀₀吸光值为1.1-1.3；

3)50mL培养物，4℃，4000rpm，5min离心后加入50mL无菌水重悬；

4)4℃，4000rpm，5min离心后，去上清，加入25mL无菌水重悬；

5)4℃，4000rpm，5min离心后，去上清，加入2mL 1M山梨醇重悬；

6)4℃，4000rpm，5min离心后，去上清，加入100μL 1M山梨醇重悬后即为X-33感受态细胞；

3、电转化

取100μL酵母感受态细胞加入线性化重组质粒冻干粉，轻轻混匀，转至冰预冷的电转杯中，冰上放置5min，电转，参数为1200V，25μF，400Ω。电转后立即加入1ml冰预冷的1M山梨醇溶液，混匀转入2mL离心管中，29℃，复苏2h,取100μL复苏后的菌液涂布在含有100μg/mL zeocin抗生素的YPDS平板上，29℃倒置培养，直至长出单菌落。

4、50mL三角瓶诱导筛选阳性转化子

在50mL三角瓶中每瓶加入10mL BMGY培养基，分别挑取实例3.3中长出的单菌落放入三角瓶中，并取活化后的菌液进行基因组特异性PCR验证(图2)。分别设置不加转化子的空白对照孔，pPICZαA空质粒阴性对照孔和确定可诱导出来的阳性对照孔。29℃，250rpm振荡培养24h后，每孔加入2.5μL甲醇(甲醇的终浓度为0.5％)，记为0h，每隔24h加一次甲醇，分别记为0h，24h，48h，72h，诱导72h后，分别收集三角瓶中的发酵液于1.5mL离心管中，离心取上清，进行诱导表达情况检测。

实施例4重组酵母菌株的高密度发酵

从YPD平板挑取转化子单菌落，接种于装液量为10ml YPD液体培养基(含100μg/mLzeocin)的50mL摇瓶中，29℃，250rmp，18-24h，以1％接种量接种于装液量为200ml YPD种子液培养基的1L摇瓶中，在29℃，250rmp条件下培养16-18h，直至OD_600nm约为6，作为高密度发酵种子液备用。

采用5L发酵罐进行高密度发酵，发酵过程分为三个阶段：(1)菌体生长阶段：加入1.8L基础盐培养基，121℃灭菌20min，冷却至29℃，加入9.6mL PMT1与200mL45％葡萄糖溶液，接入200mL菌液(1:10体积比)，通气量维持在8～9vvm，转速为800rpm，溶氧维持在10％以上；(2)流加葡萄糖生长阶段：观测溶氧值开始缓慢下降后突然上升，开始流加50％葡萄糖溶液，流加速度为12～24mL/L/min，连续流加6h，转速上调至1000rpm，其它发酵条件不变；(3)甲醇过渡诱导阶段：发酵条件变化，流加葡萄糖6h后，饥饿半小时左右，开始补加100％甲醇，由第一小时的流速1mL/L/min逐渐增加到第六小时的6mL/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调为5.5，控制溶氧在20％以上，其他发酵条件不变，直至发酵结束。

从过渡诱导开始，每隔24h取样，用于蛋白表达情况分析。图3为重组酵母菌株高密度发酵上清蛋白电泳图，图4为重组酵母菌株发酵上清总蛋白浓度与菌体湿重时间曲线。

实施例5裂解酶Lysep3的纯化

1、镍柱亲和层析纯化

将HisTrap^TMHP-5mL(GE Healthcare)利用A液平衡3-5个柱体积后上样。进样完毕后，先用pH7.4的结合缓冲液(A液)进行洗脱，待穿透峰洗脱完后，用含有0.5M咪唑的洗脱缓冲液(B液)进行洗脱，收集洗脱峰，UV280nm监测洗脱情况。图5为纯化Lysep3 Tricine-SDS-PAGE电泳验证图，图6为裂解酶Lysep3质谱检测结果。

2、8kDa透析袋除盐

收集到的洗脱峰，经8kD截留分子量透析袋4℃透析，每2h换水一次，换水6次。收集透析后的透析液，低温真空冷冻干燥机(-54℃，0.016MPa)冻干，获得裂解酶Lysep3冻干粉产品。

实施例6裂解酶Lysep3抗菌谱检测

将实施例5中获得裂解酶Lysep3冻干粉用无菌PBS溶液溶解。将生长至对数生长期的菌液稀释后，加入到含有琼脂的未凝固的MHA固体培养基中，使终浓度为1×10⁵CFU/mL，混匀后倒平板晾干凝固。另取纯化后冻干的裂解酶冻干粉溶于无菌PBS缓冲液中，将浓度为1.024mg/mL的30μL裂解酶溶液均匀滴在培养基平板上，自然晾干后置于37℃培养箱，16h后观察抑菌圈，测定抑菌圈直径。以PBS和3.125μg/mL万古霉素(或2.5μg/mL环丙沙星)分别作为阴性和阳性对照。受试病原菌包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌、猪葡萄球菌、肠炎沙门氏菌和大肠杆菌。结果如表2所示。

表2 Lysep3对革兰氏阳性菌的抗菌活性

注：+，抑菌圈直径18-22mm；++，抑菌圈直径26-30mm；-，无抑菌圈。

实施例7对金黄色葡萄球菌浊度试验测定

将实施例5获得的裂解酶Lysep3冻干粉溶于无菌PBS溶液中，分别取10、40、160、640和2560μg/mL浓度的裂解酶溶液各10μL加于96孔板内，再加90μL 1×10⁵CFU/mL金黄色葡萄球菌混匀后于37℃恒温震荡培养，每隔不同时间测吸光度OD_600nm值。

为了检测裂解酶Lysep3与不同外膜渗透剂是否存在联合杀菌作用，选择EDTA、柠檬酸和苹果酸分别与裂解酶Lysep3联合作用，实验设置4个处理：(1)空白组:细菌在BHI培养基培养；(2)细菌在BHI培养基中培养30min后，加入外膜渗透剂至终浓度1mmol/L，孵育15min后加入Lysep3至终浓度0.5mg/mL；(3)细菌在BHI培养基中培养30min后，加入外膜渗透剂至终浓度1mmol/L；(4)细菌在BHI培养基中培养30min后，加入Lysep3至终浓度0.5mg/mL。4个实验组分别在培养0min、30min、45min、75min和195min时取培养液稀释后涂布于BHI固体培养基平板上计菌落数。每个处理做三个平行，计算平均值，结果如图7所示。

实施例8裂解酶Lysep3的溶血性实验

将实施例5中获得的裂解酶Lysep3冻干粉溶解于无菌PBS溶液中，配置成浓度为1024μg/mL的母液，2倍倍比稀释终浓度为1μg/mL。取6周龄SPF级的ICR雌鼠，眼球取血，使用肝素钠抗凝管收集。采集的血液于4℃，1500rpm，离心10min，用10mM PBS(pH7.3)重复洗涤红细胞三次，至上清无色透明制成8％的红细胞悬浮液。各取100μL红细胞悬浮液和裂解酶Lysep3溶液，加入96孔板，37℃孵育1h，1500rpm离心5min，吸取上清至ELISA酶标板检测540nm下紫外吸光值。生理盐水和0.1％Triton X-100分别为0％和100％溶血对照实验。溶血程度计算公式如下(Jung H J et al，2007)：

溶血度(％)＝[(Abs540nm裂解酶Lysep3－Abs540nm生理盐水)/(Abs540nm 0.1％Triton X-100－Abs540nm生理盐水)]×100％

结果如图8所示。

实施例9裂解酶Lysep3的细胞毒性实验

在37℃，5％CO₂及饱和湿度条件下，RAW264.7细胞培养于DMEM完全培养基中。用移液枪吹打细胞，使DMEM完全培养基重悬细胞，以2.5×l0⁵cells/mL密度接种于96孔板中，每孔100μL，设置3个重复。培养24h后移除培养基，每孔按浓度梯度加入100μL浓度为1、2、4、8、16、32、64、128、256、512和1024μg/mL裂解酶溶液，对照孔加等量的PBS溶液。继续孵育24h后，移除培养基，PBS洗两次，每孔中加入100μL浓度为5mg/mL的MTT(避光操作)。将96孔板移至培养箱继续培养4h。弃MTT液后每孔加入150μL DMSO，振荡器振荡10min，待孔底结晶完全溶解，570nm波长测各孔吸光度。根据以下公式计算细胞存活率：

存活率(％)＝处理组OD值/对照组OD值×100％(Jiao J et al,2015)

结果如图9所示。

本发明成功优化了编码裂解酶Lysep3基因，并构建了pPICZαA-Lysep3重组表达载体，经PmeI线性化后成功转化到毕赤酵母X-33中获得重组酵母菌株。对纯化后的裂解酶Lysep3进行了抗菌活性检测，结果显示，Lysep3对革兰氏阳性菌具有直接裂解效果，同时对金黄色葡萄球菌在外膜渗透剂的联合作用下有明显的抑制效果。安全性实验结果表明，Lysep3具有较低溶血性，Lysep3的细胞毒性实验结果表明，Lysep3在浓度512μg/mL时，细胞存活率为85.78％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用

<130> KHP201110791.2

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 159

<212> PRT

<213> 噬菌体(bacteriophage)

<400> 1

Met Lys Ile Ser Ser Asn Gly Leu Ala Val Leu Lys Tyr Phe Glu Asn

1 5 10 15

Cys His Leu Lys Ala Tyr Pro Asp Pro Ala Thr Gly Gly Ala Pro Trp

20 25 30

Thr Ile Gly Trp Gly His Thr Gly Pro Glu Val Lys Arg Gly Leu Val

35 40 45

Trp Thr Gln Lys Gln Ala Asp Asp Ala Leu Val Ala Asp Leu Ala Arg

50 55 60

Phe Glu Arg Ala Val Ser Ala Ala Val Arg Val Pro Leu Asn Gln Gly

65 70 75 80

Gln Phe Asp Ala Leu Val Ser Phe Thr Tyr Asn Leu Gly Glu Gly Asn

85 90 95

Leu Lys Ser Ser Thr Leu Leu Lys Met Val Asn Ala Gly Asn Phe Ala

100 105 110

Gly Ala Ala Glu Gln Phe Lys Arg Trp Asn Lys Ala Asn Gly Lys Thr

115 120 125

Met Arg Gly Leu Thr Arg Arg Arg Ala Ala Glu Gln Cys Leu Phe Leu

130 135 140

Gly Met Gly Gly Ala Ser Ala Ile Glu Arg Gly Val Ala Ala Ala

145 150 155

<210> 2

<211> 477

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagattt cttctaacgg tttggctgtt ttgaagtact ttgaaaactg tcatttgaag 60

gcttacccag atccagctac tggtggtgct ccatggacta ttggttgggg tcatactggt 120

ccagaagtta agagaggttt ggtttggact caaaagcaag ctgatgatgc tttggttgct 180

gatttggcta gatttgaaag agctgtttct gctgctgtta gagttccatt gaaccaaggt 240

caatttgatg ctttggtttc ttttacttac aacttgggtg aaggtaactt gaagtcttct 300

actttgttga agatggttaa cgctggtaac tttgctggtg ctgctgaaca atttaagaga 360

tggaacaagg ctaacggtaa gactatgaga ggtttgacta gaagaagagc tgctgaacaa 420

tgtttgtttt tgggtatggg tggtgcttct gctattgaaa gaggtgttgc tgctgct 477

<210> 3

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaagattt cttctaacgg tttggctgtt ttgaagtact ttgaaaactg tcatttgaag 60

gcttacccag atccagctac tggtggtgct ccatggacta ttggttgggg tcatactggt 120

ccagaagtta agagaggttt ggtttggact caaaagcaag ctgatgatgc tttggttgct 180

gatttggcta gatttgaaag agctgtttct gctgctgtta gagttccatt gaaccaaggt 240

caatttgatg ctttggtttc ttttacttac aacttgggtg aaggtaactt gaagtcttct 300

actttgttga agatggttaa cgctggtaac tttgctggtg ctgctgaaca atttaagaga 360

tggaacaagg ctaacggtaa gactatgaga ggtttgacta gaagaagagc tgctgaacaa 420

tgtttgtttt tgggtatggg tggtgcttct gctattgaaa gaggtgttgc tgctgctcat 480

catcatcatc atcatcatca ttaataa 507

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcgaga aaagaatgaa gatttcttct aacggtttgg ctgttttga 49

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctctagatt attaatgatg atgatgatga tgatgatgag cagcagca 48

Claims

1.聚核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

2.含有权利要求1所述聚核苷酸的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌或转基因细胞系。

3.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含诱导型启动子以及位于启动子下游的SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端具有酵母Kex2基因表达产物切割识别序列AAGAGA。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体为pPICZαA。

5.毕赤酵母转化子，其特征在于，所述毕赤酵母转化子是将权利要求4所述的重组表达载体进行线性化后转化到毕赤酵母X-33中构建而成。

6.权利要求5所述毕赤酵母转化子在发酵生产噬菌体裂解酶Lysep3中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)种子液的制备：从YPD平板挑取毕赤酵母转化子单菌落，接种于含100μg/ml zeocin的10mL YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养18-24h，以1％接种量接种于200mL YPD液体培养基中，29℃，250rmp，摇床培养16-18h，至OD_600nm值为5-7，即得种子液；

4)甲醇诱导：流加葡萄糖后，饥饿半小时，开始补加100％甲醇，由第一小时的流速1mL/L/min逐渐增加到第六小时的6mL/L/min，转速上调至1100rpm，pH上调至5.5，控制溶氧在20％以上，至发酵结束；

5)目的蛋白的纯化：包括对发酵液依次进行透析脱盐、冷冻干燥、复溶和离子交换层析的步骤；

其中，步骤2)中使用的基础盐培养基配方为：100g NH₄H₂PO₄、40g K₂SO₄、30gMgSO₄·7H₂O、12g KH₂PO₄、0.8g CaSO₄和3g KOH，加水充分溶解后定容至1.8L。