CN111413447A

CN111413447A - 鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在胆管癌诊断方面的应用

Info

Publication number: CN111413447A
Application number: CN202010272688.4A
Authority: CN
Inventors: 阚全程; 田鑫; 张基; 张晓坚; 翟文龙; 杜智铖; 石丰源; 朱子家; 张晓芬; 史紫堉; 杨子尧
Original assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Zhengzhou University
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-07-14

Abstract

本发明公开了鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在胆管癌诊断方面的应用。本发明发现，鹅去氧胆酸(CDCA)、牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)单个或联合对胆管癌与良性胆管疾病具有较高的诊断效能，诊断准确率高，且显著优于现有技术，具有开发成早期诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景；CDCA、TCDCA单个或联合对胆管癌与健康人也具有较高的诊断效能，诊断准确率高，具有开发成早期诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景。

Description

鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在胆管癌诊断方面的应用

技术领域

本发明属于生物化学领域，涉及代谢标志物在疾病诊断中的应用，具体涉及鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在胆管癌诊断方面的应用。

背景技术

胆管癌起源于胆管上皮细胞，是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一。在全球范围内，胆管癌的发病率及病死率均呈上升趋势。胆管癌发病隐匿，大部分患者确诊时已是晚期。且由于缺乏早期特异性及检查费用昂贵，胆管癌的早期诊断仍然是一大难题。

目前胆管癌诊断的方法主要为影像学检查(如B超、CT、MRI、经内镜逆行胰胆管造影)，然后通过病理的方法进行确认。由于这些影像学方法都有一定的局限，所以需要综合多种影像学检测结果多维度分析，检测繁琐、成本高。另外，临床上还会利用实验室手段进行检查：胆管癌患者血生化检查常出现转氨酶、碱性磷酸酶、胆红素等异常升高；胆管癌患者血清肿瘤标志物异常，如CA19-9、CA125、白细胞介素-6(IL-6)、癌胚抗原(CEA)等，其中CA19-9是最具检测意义、应用最广泛的血清标志物。但是，这些实验室检查最大的缺陷就是其特异度和灵敏度很低，在胆管癌患者的诊断中都有相当大的局限性。

代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分，涉及生命科学、分析科学以及统计学等多方面的知识，目前已经在很多领域都有极为重要的作用，在新药研发、药物毒理研究和安全性评价、临床病理生理研究、疾病的早期诊断、个性化治疗等众多领域得到广泛应用并取得科研成果。

血浆分析是临床上常用的一种疾病诊断方法，因其简便、快速、经济且相对无创的优点而被广泛采用。近年来，针对胆管癌血浆代谢标志物的研究陆续报道，也筛选出了一些代谢标志物，但其中大多数代谢标志物仍缺少特异性以及灵敏度，而且由于验证的时间成本和经济成本非常高，很少会有研究对所筛选出的标志物进行验证，所以无法保证结果的准确性。另外，目前的胆管癌标志物研究主要集中在健康人罹患胆管癌的诊断，对胆管良性疾病患者罹患胆管癌的诊断筛查研究较少，而胆管良性疾病与健康人显然具有不同的代谢物谱，这就造成胆管良性疾病患者罹患胆管癌的诊断研究严重不足。

由此可见，为了提高胆管癌早期诊断率，迫切需要研究开发准确率更高、灵敏度和特异性更强的标志物，而血浆代谢标志物在诊断便捷性、经济性和微创性方面优势明显。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在胆管癌诊断方面的应用，具体地，一方面提供鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在制备早期诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用，另一方面提供鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸在制备早期诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用。

本发明上述目的通过如下技术方案实现：

一种血浆代谢标志物或其组合物在制备早期诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用，所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

优选地，所述诊断试剂盒中含有血浆代谢标志物或其组合物的标准品，所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

更优选地，还含有内标化合物的标准品。

一种血浆代谢标志物或其组合物在制备早期诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用，所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

更优选地，还含有内标化合物的标准品。

有益效果：

本发明发现，CDCA、TCDCA单个或联合对胆管癌与良性胆管疾病具有较高的诊断效能，诊断准确率高，且显著优于现有技术，具有开发成诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景；CDCA、TCDCA单个或联合对胆管癌与健康人具有较高的诊断效能，诊断准确率高，具有开发成诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景。

附图说明

图1为训练集中CDCA单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线(AUC＝0.929，灵敏度＝0.905，特异性＝0.933)；

图2为训练集中TCDCA单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线(AUC＝0.960，灵敏度＝0.905，特异性＝0.983)；

图3为训练集中CDCA和TCDCA联合诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线(AUC＝0.983，灵敏度＝0.952，特异性＝0.950)；

图4为训练集中CDCA单独诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线(AUC＝0.970，灵敏度＝0.905，特异性＝0.967)；

图5为训练集中TCDCA单独诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线(AUC＝0.986，灵敏度＝0.952，特异性＝0.983)；

图6为训练集中CDCA和TCDCA联合诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线(AUC＝0.990，灵敏度＝0.952，特异性＝1.000)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：目标代谢物诊断区分胆管癌患者与良性胆管疾病患者或健康人的诊断效能

一、实验样本

在取得患者知情同意后，收集2017年9月至2019年9月在郑州大学第一附属医院住院的胆管癌患者42例，良性胆管疾病患者120例。排除糖尿病、肝硬化、急性肝损伤和多器官衰竭患者。此外，从体检科入组健康志愿者120例作为健康对照组。从以上282例样本中随机选取141例样本(包括60例健康对照样本、60例良性胆管疾病患者和21例胆管癌患者样本)组成训练集；剩余141例样本(包括60例健康对照样本、60例良性胆管疾病患者和21例胆管癌患者样本)组成验证集。

二、实验方法

1、血浆采集及储存

所有血样采集于患者早晨空腹状态下，每个研究对象采集静脉血3mL置于EDTA抗凝采血管中，采集后于4℃条件下3000r/min离心10min，吸取上清(血浆)，分装后立即于-80℃冰箱内冷冻保存。

2、LC-MS测定血浆中目标代谢物的含量

(1)溶液制备

血浆样本的处理方法：血浆样品取出后放置于冰上解冻，涡旋混匀后吸取50μL血浆样品于1.5mL离心管中，加入10μL CDCA-d4(0.5μM，内标)和140μL甲醇溶液，涡旋2min混匀，14000g离心10min(4℃)，两次离心后吸取上清于进样小瓶等待进样。

不含胆汁酸的空白血浆样本的制备方法：将空白血浆与0.1g/mL活性炭混合，混合物在室温下连续震荡孵育16小时，随后在4℃、4000转/分，离心20分钟，将上清液转移到新的1.5mL离心管中，19500rpm再次离心40分钟(4℃)。离心两个循环后，上清液用于配制校准曲线和质控样本。

储备液配制：以甲醇为溶剂，配制浓度为1mM的胆汁酸鹅去氧胆酸(CDCA)和牛磺酸鹅去氧胆酸(TCDCA)标准品储存液，将CDCA和TCDCA储存液混合，并用50％甲醇水溶液连续稀释，得到校准标准品及质控样品的工作液。内标CDCA-d4以甲醇为溶剂制备1mM的储存液，并用50％甲醇溶液稀释到0.5μM得到内标工作液。

标准曲线和质控样本制备：将5μL的工作液加入45μL不含胆汁酸的空白血浆基质中制备校准标准品及质控样品，混匀后按照血浆样本处理方法进行处理。CDCA标准曲线终浓度为：0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5μM，质控样品终浓度为：0.001、0.003、0.5、3.75μM；TCDCA标准曲线终浓度为：0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2和5μM，TCDCA质控样品终浓度为：0.005、0.015、0.5、3.75μM。

(2)检测方法

色谱条件：色谱分离采用ExionLC超高效液相色谱(AB Sciex，Foster City，CA，USA)，色谱柱为Phenomennex

C18

LC Column(2.1mm×75mm，2.6μm)，柱温40℃。流动相组成是A相为水(含5mM乙酸铵和0.012％甲酸)，B相为甲醇。梯度洗脱条件：0～4min，60-70％B；4～7.5min，70％～80％B；7.5～8.0min，80％～92％B；8.0～10.0min，92％B；10.0～10.2min，92％～60％B；10.2～11.0min，60％B；流速0.3mL/min，柱后流出液不分流直接入质谱进行检测。进样量5μL，进样器温度4℃。

质谱条件：质谱分析采用QTrap 4500三重四极杆-线性离子阱复合质谱仪，离子源为电喷雾离子源(Turbo ion Spray)，负离子模式下运行多重反应监测(MRM)。离子喷雾电压-4.5KV，源温度550℃。其它参数详见表1。Analyst1.6.2软件(Applied Biosystems，USA)用于数据收集和处理。

以CDCA、TCDCA的峰面积与内标的峰面积的比值作为目标代谢物的相对含量。

表1胆汁酸质谱检测参数

3、数据处理和分析

按照本领域常规的数据处理和分析方法进行处理、分析。具体地：训练集中，建立单个目标代谢物的ROC曲线，计算曲线下面积(AUC)及95％可信区间；对于多个目标代谢物，运用Logistic回归建立回归方程，产生一组新变量logit[p]，对该新变量进行ROC曲线分析；根据ROC曲线得到最佳cut-off值。验证集中，以前述得到的最佳cut-off值为阈值计算单个目标代谢物或其联合对胆管癌的诊断准确率。

ROC曲线评价法的原理：

诊断试验的基本评价指标有敏感度、特异性等，综合评价指标有Youden指数、ROC、AUC等。对于诊断试验的评价，首先需要通过金标准知道待测样本的真实组别。对于按金标准确定的疾病组和健康组，采用诊断试验检测的结果可以分为如下情况：

阳性(True Positive,TP)；诊断试验检测为阳性(与金标准结果一致)；

阴性(True Negative,TN)；诊断试验检测为阴性(与金标准结果一致)；

假阳性(False Positive,FP)：诊断试验检测为阳性(与金标准结果不一致)；

假阴性(False Negative,FN)：诊断试验检测为阴性(与金标准结果不一致)。

可以用下表表示：

诊断试验的敏感度＝A/(A+C)；诊断试验的特异性＝D/(B+D)。通过敏感度和特异性可以得出诊断试验相对于金标准的诊断灵敏程度和特异程度。敏感度高代表将疾病例诊断为阴性的个数少，漏诊率低；特异性高代表将健康例诊断为阳性的个数少，误诊率低。

ROC曲线正是基于上述敏感度和特异性绘制出的曲线。以诊断试验中可能的诊断界值作为诊断点，根据上述表格计算出相应的敏感度和特异性。然后，以敏感度为纵坐标，1-特异性为横坐标，将各诊断点时各点的敏感度和特异性点在坐标图中标出，连接坐标点得到平滑曲线，该曲线即为ROC曲线。诊断点设置的越多越密，得到的ROC曲线就越平滑。

ROC曲线是以每一个检测结果作为可能的诊断界值，其曲线下面积AUC的大小表明了诊断试验准确度的大小。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC＞0.9时，表示诊断有较高的准确性。

三、实验结果

1、目标代谢物在胆管癌组与良性胆管疾病组或健康对照组样本中的水平差异

训练集中，与良性胆管疾病组或健康对照组相比，胆管癌组血浆样本中CDCA显著下调，TCDCA显著上调，差异具有统计学意义。

2、目标代谢物单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的诊断效能和诊断准确率

训练集中，CDCA、TCDCA单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线如图1、2所示，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.929、0.960，具有较高的诊断效能。根据ROC曲线，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的最佳cut-off值分别为0.603、0.221。验证集中，以该最佳cut-off值为阈值计算单个目标代谢物对胆管癌的诊断准确率，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的准确率分别为79.0％(64/81)、91.4％(74/81)。为了与现有技术比较，研究中将CDCA、TCDCA单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的诊断效能和诊断准确率与现有技术中的标志物CA199进行了比较，CA199单独诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线如图1、2所示，CA199单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线下面积(AUC)为0.883，灵敏度＝0.784，特异性＝0.905，CA199单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的最佳cut-off值为37.0；验证集中，以该最佳cut-off值为阈值计算单个目标代谢物对胆管癌的诊断准确率，CA199单个诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的准确率为80.2％(65/81)。

3、目标代谢物联合诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的ROC曲线

训练集中，以CDCA、TCDCA的相对含量为自变量，以组别(即胆管癌组与良性胆管疾病组)为应变量，对CDCA、TCDCA在胆管癌组与良性胆管疾病组样本中的相对含量进行二元逻辑回归，产生一组新变量logit[p]，对该新变量进行ROC曲线分析，ROC曲线如图3所示，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组样本的AUC为0.983。根据ROC曲线，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的最佳cut-off值为0.18。验证集中，以该最佳cut-off值为阈值计算目标代谢物联合对胆管癌的诊断准确率，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与良性胆管疾病组的准确率为91.4％(74/81)。

4、目标代谢物单独诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线

训练集中，CDCA、TCDCA单独诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线如图4、5所示，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.970和0.986，具有较高的诊断效能。根据ROC曲线，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与健康对照组的最佳cut-off值分别为0.639、0.053。验证集中，以该最佳cut-off值为阈值计算单个目标代谢物对胆管癌的诊断准确率，CDCA、TCDCA单个诊断区分胆管癌组与健康对照组的准确率分别为82.7％(67/81)、96.3％(78/81)。

5、目标代谢物联合诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的ROC曲线

训练集中，以CDCA、TCDCA的相对含量为自变量，以组别(即胆管癌组与健康对照组)为应变量，对CDCA、TCDCA在胆管癌组与健康对照组样本中的相对含量进行二元逻辑回归，产生一组新变量logit[p]，对该新变量进行ROC曲线分析，ROC曲线如图6所示，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与健康对照组样本的AUC为0.990。根据ROC曲线，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与健康对照组的最佳cut-off值为0.146。验证集中，以最佳cut-off值为阈值计算目标代谢物联合对胆管癌的诊断准确率，CDCA、TCDCA联合诊断区分胆管癌组与健康对照组的准确率为97.5％(79/81)。

上述实验结果表明，CDCA、TCDCA单个或联合对胆管癌与良性胆管疾病具有较高的诊断效能，诊断准确率高，且显著优于现有技术，具有开发成诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景；CDCA、TCDCA单个或联合对胆管癌与健康人具有较高的诊断效能，诊断准确率高，具有开发成诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒的前景。

实施例2：诊断区分健康人、良性胆管疾病患者或胆管癌患者的诊断试剂盒

一种用于早期检测良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒，其中含有诊断标志物的标准品，该诊断标志物为鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸。

一种用于早期检测健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒，其中含有诊断标志物的标准品，该诊断标志物为鹅去氧胆酸或/和牛磺酸鹅去氧胆酸。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims

1.一种血浆代谢标志物或其组合物在制备早期诊断良性胆管疾病患者罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用，其特征在于：所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒中含有血浆代谢标志物或其组合物的标准品，所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：还含有内标化合物的标准品。

4.一种血浆代谢标志物或其组合物在制备早期诊断健康人罹患胆管癌的诊断试剂盒方面的应用，其特征在于：所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述诊断试剂盒中含有血浆代谢标志物或其组合物的标准品，所述血浆代谢标志物为鹅去氧胆酸或牛磺酸鹅去氧胆酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：还含有内标化合物的标准品。