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CN111406116A - 通过细菌宏基因组分析来诊断头颈癌的方法 - Google Patents

通过细菌宏基因组分析来诊断头颈癌的方法 Download PDF

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CN111406116A CN201880067793.5A CN201880067793A CN111406116A CN 111406116 A CN111406116 A CN 111406116A CN 201880067793 A CN201880067793 A CN 201880067793A CN 111406116 A CN111406116 A CN 111406116A
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Abstract

本发明涉及通过细菌宏基因组分析诊断头颈癌的方法，并且更具体地涉及通过使用来源于正常个人和受试者的样品执行细菌宏基因组分析经由分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断头颈癌的方法。从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡引起局部慢性炎症或吸收到人体中，因此可直接影响癌症的发生，且难以在其症状发作前及早诊断出头颈癌，因此难以有效治疗。因此，根据本发明，可通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析诊断头颈癌的风险，且因此使得能够及早诊断并预测头颈癌的风险群，从而通过适当治疗延迟头颈癌发作或预防头颈癌发作，并且甚至在头颈癌发作后能够实施对头颈癌的早期诊断，从而降低头颈癌的发生率并提高治疗效果。

Description

通过细菌宏基因组分析来诊断头颈癌的方法
技术领域
本发明涉及通过细菌宏基因组分析诊断头颈癌的方法，更具体地，涉及通过使用来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品进行细菌宏基因组分析以分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断头颈癌的方法等。
背景技术
头颈部是指从大脑到上胸部的部分，并且包括口腔、喉、咽、鼻腔等，并且在这些器官中发生的癌症称为头颈癌。其中，口腔癌是发生在口腔中的癌症，其主要起源于构成口腔周围粘膜的鳞状细胞。作为口腔癌的危险因素，吸烟、口腔清洁卫生、持续的慢性刺激等是已知的。咽癌是发生在咽粘膜中的恶性肿瘤，并且吸烟、饮酒、病毒感染等是已知的危险因素。根据韩国中央癌症登记处(Korea Central Cancer Registry)公布的数据，除甲状腺癌外，每年头颈癌患者的数量为3,000，其发生频率在癌症中排名第八。头颈癌的诊断是通过在怀疑患有癌症时从肿瘤中切除组织进行活检来确定的。另外，为了确定癌症的程度，进行了诸如计算机断层摄影、磁共振成像检查和正电子发射断层摄影之类的测试。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)是一种微生物群落，其包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共存于人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以与其他细胞交换关于基因、蛋白质、低分子量的化合物等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理阻隔膜，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或更小的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学(韩国专利公开No.2011-073049)。最近，使用基于16s核糖体RNA(16srRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。然而，关于头颈癌的发生，没有关于通过分析来源于细菌的囊泡中存在的基因组来从来源于人的材料(例如唾液)中鉴定出头颈癌的病因以及诊断头颈癌的方法的报道。
发明内容
[技术问题]
本发明人从作为来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品的唾液中存在的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，并在这方面进行了宏基因组分析，以便提前诊断出头颈癌的病因和风险，并且结果，鉴定出可用作头颈癌的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而基于此完成本发明。
因此，本发明的目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析提供用于诊断头颈癌的信息的方法，诊断头颈癌的方法，预测头颈癌发作的风险的方法等等。
然而，本发明的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目的，提供了一种提供用于头颈癌诊断的信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断头颈癌的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测头颈癌的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定所述来源于受试者的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一个实施方案中，所述样品可以是唾液。
在本发明的另一个实施方案中，在过程(c)中，头颈癌可以通过比较并确定来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，头颈癌可以通过比较并确定来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，头颈癌可以通过比较并确定来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，头颈癌可以通过比较并确定来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，头颈癌可以通过比较并确定来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断。
在本发明的一个实施方案中，过程(c)可以包括比较并确定：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为头颈癌：
来源于梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由假单胞菌科乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
在本发明的另一实施方案中，在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，可以将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为头颈癌：
来源于蓝细菌门(Cyanobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)和叶绿体纲(Chloroplast)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和水栖菌属(Enhydrobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
[有利效果]
由环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被人体吸收，因此可能直接影响癌症的发生，并且难以在症状发作之前及早诊断出头颈癌，因而难以对其进行有效治疗。因此，根据本发明，可以通过使用来源于人体的样品对来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析来诊断头颈癌的病因和风险，因此可以早期诊断头颈癌的风险人群，从而通过适当的管理来延迟头颈癌的发作或预防头颈癌的发作。另外，即使在发生头颈癌之后，也可以对头颈癌进行早期诊断，从而降低头颈癌的发生率并提高治疗效果，并且宏基因组分析使确诊为头颈癌的患者能避免暴露于由此预测的病因，从而可以改善癌症的进展，或者可以预防头颈癌的复发。
附图说明
图1A例示了示出在小鼠口服给药肠道细菌和来源于细菌的细胞外囊泡(EV)后，细菌和细胞外囊泡(EV)的随时间推移的分布模式的图像，并且图1B例示了示出在小鼠口服给药之后细菌和EV的分布模式的图像，并且在12小时，提取唾液和各种器官。
图2是通过从头颈癌患者和正常个体的唾液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在门级上的诊断性能方面是显著的。
图3是通过从头颈癌患者和正常个体的唾液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在纲级上的诊断性能方面是显著的。
图4是通过从头颈癌患者和正常个体的唾液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在目级上的诊断性能方面是显著的。
图5是通过从头颈癌患者和正常个体的唾液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在科级上的诊断性能方面是显著的。
图6是通过从头颈癌患者和正常个体的唾液中分离的来源于细菌的囊泡，然后进行宏基因组分析，而显示来源于细菌的细胞外囊泡(EV)分布的结果，其在属级上的诊断性能方面是显著的。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌的宏基因组分析来诊断头颈癌的方法。本发明的发明人使用正常个体的样品和来源于受试者的样品中从来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当头颈癌的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供用于诊断头颈癌的信息的方法，所述方法包括：
(a)从分离自正常个体样品和受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
如本文所用，术语“头颈癌”是指发生在诸如口腔、喉、咽、鼻腔等器官中的癌症，并且包括口腔癌、唾液腺癌、咽癌和鼻腔癌。
如本文所用，术语“头颈癌诊断”是指确定患者是否有患头颈癌的风险，患头颈癌的风险是否相对较高，或者是否已经出现头颈癌。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟头颈癌发作(所述特定患者是具有高的患头颈癌的风险的患者)或防止头颈癌发作。此外，该方法还可以在临床上用于通过早期诊断头颈癌经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
如本文所用，术语“宏基因组”("metagenome")是指包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以鉴定一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从例如血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明中，正常个体的样品和受试者的样品可以是唾液，但本发明不受限于此。
在本发明的一个实施方案中，对来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当头颈癌发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在门级对存在于来源于受试者的唾液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在头颈癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在纲级对存在于来源于受试者的唾液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在头颈癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在目级对存在于来源于受试者的唾液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)的细菌的细胞外囊泡的含量在头颈癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在科级对存在于来源于受试者的唾液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在头颈癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一个实施方案中，通过在属级对存在于来源于受试者的唾液样品中的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析得出，来源于属于贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)的细菌的细胞外囊泡的含量在头颈癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
通过实施例的结果，证实了所鉴定的来源于细菌的细胞外囊泡的分布变量可用于预测头颈癌的发作。
[本发明的模式]
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不旨在限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
为了评估细菌和来源于细菌的囊泡是否通过黏膜系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在给药时不被系统吸收，而在给药后5分钟，来源于细菌的EV被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，由此确认EV经由泌尿系统排出，并且直至给药后12小时存在于身体中。
在细菌和来源于细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后侵入人体内的各种器官中的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上文所用相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，然而来源于细菌的EV分布在唾液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
实施例2.从唾液中进行囊泡分离和DNA提取
为了从唾液分离细胞外囊泡并且提取DNA，首先将唾液加入到10ml管中，以在3500×g和4℃下离心10分钟，沉淀出悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于离心过滤器(50kD)中，并在1500×g和4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的材料，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物在150,000×g和4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从唾液分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却5分钟。接下来，将所得的囊泡在10,000×g和4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，还使用下表1所示的16srDNA引物进行PCR。
[表1]
Figure BDA0002454957060000111
实施例3.使用从唾液中提取的DNA进行宏基因组分析
使用与实施例2中所用相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16S rDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图格式(SFF)文件输出，并使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在除去低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。具体地讲，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性，对于纲的80％的序列相似性，以及对于门的75％的序列相似性进行聚类，并且对每个OUT的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或更大的序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从唾液中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的头颈癌诊断 模型
从50例头颈癌患者和215例正常个体的唾液样品中分离EV，两组在年龄和性别上匹配，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，并且之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算作为诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、准确度、灵敏度和特异性。
通过在门级分析唾液中来源于细菌的EV得出，使用属于蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于头颈癌表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
Figure BDA0002454957060000121
通过在纲级分析唾液中来源于细菌的EV得出，使用属于盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于头颈癌表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
Figure BDA0002454957060000122
Figure BDA0002454957060000131
通过在目级分析唾液中来源于细菌的EV得出，使用属于嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于头颈癌表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
Figure BDA0002454957060000132
通过在科级分析唾液中来源于细菌的EV得出，使用属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于头颈癌表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
Figure BDA0002454957060000141
通过在属级分析唾液中来源于细菌的EV得出，使用属于贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于头颈癌表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
Figure BDA0002454957060000151
Figure BDA0002454957060000161
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特性。因此，本文描述的实施方案应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明的通过细菌宏基因组分析提供用于诊断头颈癌的信息的方法可用于通过使用来源于正常个体的样品和来源于受试者的样品进行细菌宏基因组分析以分析特定的来源于细菌的细胞外囊泡含量的增加或减少来预测头颈癌发作的风险，以及诊断头颈癌。
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<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断头颈癌的方法
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<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V3_F
<400> 1
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctacgg gnggcwgcag 50
<210> 2
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16S_V4_R
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (20)

1.一种提供用于诊断头颈癌的信息的方法，该方法包括：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
3.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
4.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
5.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
6.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述正常个体的样品和受试者的样品是唾液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
9.根据权利要求8所述的方法，其中在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为头颈癌：
来源于梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由假单胞菌科乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
10.根据权利要求8所述的方法，其中在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为头颈癌：
来源于蓝细菌门(Cyanobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)和叶绿体纲(Chloroplast)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)和水栖菌属(Enhydrobacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
11.一种诊断头颈癌的方法，该方法包括：
(a)从分离自正常个体的样品和受试者的样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所述提取的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，与来源于正常个体的样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量比较并确定来源于所述受试者样品的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
12.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
13.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
14.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
15.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
16.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
17.根据权利要求11所述的方法，其中，所述正常个体的样品和受试者的样品是唾液。
18.根据权利要求11所述的方法，其中过程(c)包括比较并确定：
来源于选自由蓝细菌门(Cyanobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)、叶绿体纲(Chloroplast)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、草酸杆菌科(Oxalobacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由贪铜菌属(Cupriavidus)、色盐杆菌属(Chromohalobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、水栖菌属(Enhydrobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，将下述的细胞外囊泡的含量增加诊断为头颈癌：
来源于梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌纲(Fusobacteriia)和ε-变形菌纲(Epsilonproteobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由梭杆菌目(Fusobacteriales)和弯曲菌目(Campylobacterale)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由假单胞菌科乳杆菌科(Lactobacillaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、梭杆菌科(Fusobacteriaceae)和弯曲菌科(Campylobacteraceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；或者
来源于选自由乳酸杆菌属(Lactobacillus)、韦荣氏球菌属(Veillonella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、放线菌属(Actinomyces)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、巨球形菌属(Megasphaera)、弯曲杆菌属(Campylobacter)和奥里杆菌属(Oribacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡。
20.根据权利要求18所述的方法，其中在过程(c)中，与来源于正常个体的样品相比，将下述的细胞外囊泡的含量减少诊断为头颈癌：
来源于蓝细菌门(Cyanobacteria)的细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由盐细菌纲(Halobacteria)和叶绿体纲(Chloroplast)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
来源于选自由嗜盐杆菌目(Halobacteriales)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)、木霉菌目(Streptophyta)、假单胞菌目(Pseudomonadales)和海洋螺菌目(Oceanospirillales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡；
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