CN111398598A - 胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胰岛素样生长因子结合蛋白‑3化学发光检测试剂盒及其制备方法，属于免疫医学检测技术领域，试剂盒包括：R1试剂：包被链霉亲和素的磁珠溶液；R2试剂：吖啶酯标记的IGFBP‑3抗体溶液；R3试剂：生物素标记的IGFBP‑3抗体溶液。本试剂盒采用一步法夹心法的反应模式，采用吖啶酯化学发光免疫分析法，与碱性磷酸酶比较吖啶酯的发光效率高，且发光体系简单，不需要加入催化剂，本底低，标记简单等优势，同时采用链霉亲和素‑生物素体系比较磁珠包被体系，与现有磁珠体系相比，反应体系信号进一步放大，提高试剂灵敏度，可特异性检测人体内IGFBP‑3，为临床诊断提供更为精确、灵敏、更具针对性的体外诊断试剂。

Description

胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒及其制备 方法

技术领域

本发明涉及免疫医学检测技术领域，尤其涉及一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

胰岛素样生长因子结合蛋白-3(insμlin-like growth factor bindingprotein3，IGFBP-3)，是一种主要由肝脏合成和分泌，包含264个氨基酸，相对分子质量约为28.7KDa，存在于血清中的含量丰富的IGF结合蛋白。

IGFBP-3在血液循环中主要以两种复合体形式存在：一种为大分子量(150KDa)三聚体，由分子量为39-42KDa的IGFBP-3，GH依赖的不耐酸的亚单位(ALS)及IGF-I/II构成。它携带约80％的IGFs，主要存在于血液循环中。另一种为小分子量(40KDa)二聚体，由IGFBP-3和IGF-I/II组成，能通过毛细血管屏障，转运至IGFs的靶细胞。因此IGFBP-3在转运IGFs、延长其半衰期，调节IGFs与其受体间的相互作用等方面发挥了重要的生理作用。

血清IGFBP-3的水平主要受GH和IGF-I的调节。同样的，血清IGF-I和IGFBP-3水平反映了健康儿童内源性的生长激素分泌。在生长激素缺乏症患者血清IGF-I、IGFBP-3显著低于正常儿童,可作为筛选由GH-IGF轴异常引起生长发育迟缓的潜在指标。在矮小儿童中，如果IGFBP-3低下，则GH激发试验的反应同样低下；但IGFBP-3正常也不能完全排除生长激素缺乏症(GHD),因此IGFBP-3的测定，加上临床分析，生长发育测量和GH的测定，能够大大提高GHD诊断的准确性。因此检测患者血清和血浆中胰岛素样生长因子结合蛋白-3水平对于生长激素缺乏症(GHD)的诊断非常重要。

目前用于检测IGFBP-3的常用分析方法主要为免疫层析法，与免疫层析法相比，化学发光免疫分析法具有灵敏度高、检测线性范围宽、操作简便，自动化程度高等优势。市面上IGFBP-3化学发光定量检测试剂盒仅西门子公司生产的Immulite2000胰岛素样生长因子结合蛋白-3试剂盒，该试剂盒采用鼠单克隆抗IGFBP-3抗体包被磁珠及碱性磷酸酶标记的鼠单克隆抗IGFBP-3抗体的夹心法检测人体内IGFBP-3的含量，然而，碱性磷酸酶发光体系，需要加入催化剂，本底较高，灵敏度达不到要求，并且IGFBP-3在辅助诊断生长紊乱的地位愈发重要。因此，研制一种新型的IGFBP-3化学发光检测试剂盒十分必要。

发明内容

本发明针对上述技术问题，提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒及其制备方法，提高试剂的灵敏度及精确性。

本发明的目的是提供一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒。

本发明的另一目的是提供上述胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒的制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，包括：R1试剂：包被链霉亲和素的磁珠溶液；R2试剂：吖啶酯标记的IGFBP-3抗体溶液；R3试剂：生物素标记的IGFBP-3抗体溶液。

其中：

所述的R1试剂中，磁珠为粒径大小1.5-3μm的Fe3O4纳米粒子，包被链霉亲和素的磁珠浓度为0.05％-0.15％。

所述的R2试剂，pH为5.0-8.0，吖啶酯标记的IGFBP-3浓度为0.3μg/mL-1.5μg/mL，抗体与吖啶酯按摩尔体积比为1:2.5-1:15。

优选地，所述的吖啶酯采用DMAE类吖啶酯或酰胺类吖啶酯。

更优选地，DMAE类吖啶酯采用DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS或NSP-DMAE-HEG-Glu-NHS。酰胺类吖啶酯采用NSP-SA-NHS。

所述的R3试剂，pH为5.0-8.0，生物素标记的IGFBP-3抗体浓度为0.4μg/mL-2.5μg/mL，抗体与生物素按摩尔体积比为1:3.5-1:20。

上述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，还包括以缓冲液为基质的IGFBP-3蛋白配制校准品及质控品。

校准品的制备步骤为：用含有0.5-1.0％BSA、2-3％海藻糖、0.1-0.5％PEG6000、0.05-0.1％吐温-20及0.1-0.5％的酪蛋白酸钠、pH7.0-8.0的100-400mM MES缓冲液并添加0.1％叠氮钠防腐剂，将IGFBP-3蛋白稀释成校准品，分装成0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL；

质控品的制备步骤为：用含有0.5-1.0％BSA、0.1-0.5％PEG6000、0.05-0.1％吐温-20及0.1-0.5％的酪蛋白酸钠，pH7.0-8.0的100-400mM MES缓冲液将IGFBP-3蛋白配制成浓度为1μg/mL和8μg/mL的质控品。

本发明还提供了上述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

R1试剂的制备：使用100-400mM Tris-HCl缓冲液配制包被链霉亲和素的磁珠浓度为0.05％-0.15％；

R2试剂的制备：使用30KDa孔径超滤离心管将IGFBP-3抗体缓冲液置换为100mM-200mM PB缓冲液，将抗体与吖啶酯按摩尔体积比1:2.5-1:15混合，充分混匀，室温放置1-3h后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗体，将收集到的吖啶酯标记抗体选用pH5.0-8.0的100-400mM Tris-HCl缓冲液稀释至0.3μg/mL-1.5μg/mL；

R3试剂的制备：使用30KDa孔径超滤离心管将IGFBP-3抗体缓冲液置换为100mM-200mM PB缓冲液，将抗体与生物素按摩尔体积比1:3.5-1:20混合，充分混匀，室温放置2-4小时后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗体，将收集到的生物素标记抗体选用pH5.0-8.0的100-400mM Tris-HCl缓冲液稀释至0.4μg/mL-2.5μg/mL。

此外，本发明还提供了上述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

将样本与吖啶酯标记抗体溶液试剂R2、生物素标记抗体溶液试剂R3共同孵育5min，样本与吖啶酯标记抗体及生物素标记抗体形成免疫复合物，再加入包被有链霉亲和素磁珠溶液试剂R1共同孵育5min，通过生物素与链霉亲和素结合到磁珠。再通过酸碱激发液激发吖啶酯发光，记录相对发光强度(RLU)，在线性范围内，样本中IGFBP-3的含量与相对发光强度成正比。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的试剂盒，采用一步法夹心法的反应模式，采用吖啶酯化学发光免疫分析法，与碱性磷酸酶体系相比，吖啶酯的发光效率高，且发光体系简单，不需要加入催化剂，本底低，灵敏度更高，标记简单；同时采用链霉亲和素-生物素体系比较磁珠包被体系，与现有磁珠体系相比，1:4的结合使得反应体系信号放大，进一步提高试剂灵敏度。此外，通过改变标记抗体及抗原，与原有检测技术相比，增强检测的特异性。因此，本试剂盒能特异性检测人体内IGFBP-3，为临床诊断提供更为精确、灵敏、更具针对性的体外诊断试剂。经对比试验，本发明的试剂盒各项检测指标均优于同类试剂盒的分析水平。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1使用的吖啶酯NSP-SA-NHS的结构式。

图2为本发明实施例3使用的吖啶酯DMAE-NHS的结构式。

图3为本发明实施例4使用的吖啶酯NSP-DMAE-NHS的结构式。

图4为本发明实施例5使用的吖啶酯NSP-DMAE-HEG-Glu-NHS的结构式。

图5为本发明实施例6使用的吖啶酯NSP-2,7-(OMHEG)₂-DMAE-AC-NHS的结构式。

图6为本发明实施例7使用的吖啶酯NSP-DMAE-Z-NHS的结构式。

图7为本发明IGFBP-3化学发光检测试剂盒的血清检测结果与西门子公司试剂盒检测结果的相关性，横坐标x为西门子公司试剂盒样本浓度测值，浓度为μg/mL，纵坐标y为实施例1制备的的试剂盒样本浓度测值，浓度单位为μg/mL。

具体实施方式

本发明的试剂盒测定原理是夹心法。样本与吖啶酯标记抗体R2溶液、生物素标记抗体R3溶液共同孵育5min，样本与吖啶酯标记抗体及生物素标记抗体形成免疫复合物，再加入包被有链霉亲和素磁珠共同孵育5min，通过生物素与链霉亲和素结合到磁珠。通过磁分离器分离免疫复合物，清洗液洗去未结合抗体。通过酸碱激发液激发吖啶酯发光，记录相对发光强度(RLU)，在线性范围内，样本中IGFBP-3的含量与相对发光强度成正比。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。

实施例1制备本发明的IGFBP-3化学发光检测试剂盒

一、校准品的制备

用含有0.5％BSA、2％海藻糖、0.1％PEG6000、0.05％吐温-20及0.1％的酪蛋白酸钠、pH7.0的100mM MES缓冲液并添加0.1％叠氮钠防腐剂将IGFBP-3蛋白稀释成校准品，分装成0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。

二、质控品的制备

用含有0.5％BSA、0.1％PEG6000、0.05％吐温-20及0.1％的酪蛋白酸钠，pH7.0的100mM MES缓冲液将IGFBP-3蛋白配制成浓度为1μg/mL和8μg/mL的质控品。

三、包被链霉亲和素磁珠的R1溶液配制

用磁珠稀释缓冲液将亲和素磁珠稀释至0.05％，4℃保存。

四、吖啶酯标记的IGFBP-3R2溶液的制备

将IGFBP-3鼠单克隆抗体500μg加入50KDa超滤离心管内，加入500μL的100mM PB缓冲液，10000rpm离心10min，重复3次，将抗体内缓冲液置换为吖啶酯标记缓冲液。收取置换后溶液，按抗体：吖啶酯＝1:2.5摩尔比加入吖啶酯，静置2h。选用GE公司AKTA全自动蛋白纯化仪对吖啶酯标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有0.5％BSA，pH为5.0，浓度为100mM Tris-HCl缓冲液将纯化后抗体配制为0.3μg/mL的R2溶液，4℃保存。

具体的是，使用的吖啶酯为酰胺类吖啶酯：3-[9-(((3-(N-琥珀酰亚胺氧基羧丙基)[4-甲基苯基]磺酰基)胺基)羧基]-10-吖啶基)-1-丙烷磺酸内盐(英文名称：NSP-SA-NHS)，其结构如图2所示。

在基本的吖啶酯结构上引入NSP基团，增加吖啶酯试剂的亲水性，降低试剂反应的非特异性反应，能有效增加试剂特异性。

五、生物素标记的IGFBP-3抗体R3溶液的制备

将IGFBP-3鼠单克隆抗体抗体500μg加入50KDa超滤离心管内，加入500μL的100mMPB缓冲液，10000rpm离心10min，重复3次，将抗体内缓冲液置换为生物素标记缓冲液。收取置换后溶液，按抗体：生物素＝1:3.5摩尔比加入生物素，静置2h。选用GE公司AKTA全自动蛋白纯化仪对生物素标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有0.5％BSA、0.1％明胶，pH 5.0的100mM Tris-HCl缓冲液将纯化后抗体配制为0.4μg/mL的R3溶液，4℃保存。

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品，组装成为IGFBP-3化学发光试剂盒。

七、试剂盒性能测定

1.试剂盒线性范围检测范围测定

将实施例1中制备的试剂盒其中1批，测定检测范围样本0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，得出检测范围最高可达为20μg/mL，相关系数R＝0.9997。

表1试剂盒检测范围测定

2.试剂盒灵敏度的测定

将实施例1中制备的试剂盒其中1批，测定20次零浓度样本，计算平均值(M)及标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU带入方程，得出相应浓度值即为试剂盒灵敏度0.001μg/mL。

表2灵敏度第1点发光值

第一点发光均值M＝259，SD＝26.5，M+2SD＝312。

表3灵敏度第2点发光值

3.试剂盒准确度的测定

使用实施例1中制备的试剂盒检测WHO NIBSC试剂93/560标准物质配制成的准确度样本1浓度1μg/mL，准确度样本2浓度8μg/mL，每个样本测定3次，计算准确度，得出准确度均＜5％。

准确度＝(测定值-标准物质浓度)/标准物质浓度×100％

表4准确度测定

4.试剂盒精密度的测定

(1)分析内精密度

将实施例1中制备的试剂盒其中1批，分别测定本公司质控品C1、C2，10孔平行测试，得出批内变异系数为2.98％、2.34％。

表5批内精密度

测试样本	C1(1μg/mL)	C2(8μg/mL)
			测试1	1.05	8.38
测试2	1.02	8.18
			测试3	1.03	8.32
测试4	0.98	8.26
			测试5	1.05	7.84
测试6	1.04	8.29
			测试7	0.99	7.88
测试8	1.01	8.16
			测试9	1.02	8.05
测试10	0.96	7.96
			批内精密度	2.98％	2.34％

(2)分析间精密度

将实施例1中制备的试剂盒其中3批，分别测定本公司质控品C1、C2，10孔平行测试，得出批内变异系数为3.47％、2.77％。

表6批间精密度

5.试剂盒抗干扰特异性实验

在缓冲液样本中添加下列浓度的特异性物质，使用实施例1中试剂盒进行检测，记录IGFBP-3的测定浓度。

干扰率＝(测定浓度-交叉反应物浓度)×100％

表7抗干扰特异性

ND：未检测到。

经过大量重复性实验，本发明的试剂盒指标如下：

检测范围：最高可达20μg/mL；

灵敏度：最低检测限不高于0.001μg/mL；

准确度：测定值与标准物质偏差＜5％；

分析内精密度C1：2.98％，C2：2.34％；分析间精密度C1：3.47％，C2：2.77％。

特异性：与IGF-II、IGFBP-1(磷酸化)、IGFBP-1(去磷酸化)、IGFBP-1(复合体)、IGFBP-2、转铁蛋白、胆红素、人血清白蛋白、血红蛋白、人IgG无交叉反应。

实施例2制备本发明的IGFBP-3化学发光检测试剂盒

一、校准品的制备

用含有1.0％BSA、3％海藻糖、0.5％PEG6000、0.1％吐温-20及0.5％的酪蛋白酸钠、pH8.0的400mM MES缓冲液并添加0.1％叠氮钠防腐剂将IGFBP-3蛋白稀释成校准品，分装成0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。

二、质控品的制备

用含有1.0％BSA、0.5％PEG6000、0.1％吐温-20及0.5％的酪蛋白酸钠，pH8.0的400mM MES缓冲液将IGFBP-3蛋白配制成浓度为1μg/mL和8μg/mL的质控品。

三、包被链霉亲和素磁珠的R1溶液配制

用磁珠稀释缓冲液将亲和素磁珠稀释至0.15％，4℃保存。

四、吖啶酯标记的IGFBP-3R2溶液的制备

将IGFBP-3抗体500μg加入50KDa超滤离心管内，加入500μL的200mM PB缓冲液，10000rpm离心10min，重复3次，将抗体内缓冲液置换为吖啶酯标记缓冲液。收取置换后溶液，按抗体：吖啶酯＝1:15摩尔比加入吖啶酯，静置2h。选用GE公司AKTA全自动蛋白纯化仪对吖啶酯标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有3％BSA，pH为8.0，浓度为400mMTris-HCl缓冲液将纯化后抗体配制为1.5μg/mL的R2溶液，4℃保存。

使用的吖啶酯同实施例1。

五、生物素标记的IGFBP-3抗体R3溶液的制备

将IGFBP-3抗体500μg加入50KDa超滤离心管内，加入500μL的200mM PB缓冲液，10000rpm离心10min，重复3次，将抗体内缓冲液置换为生物素标记缓冲液。收取置换后溶液，按抗体：生物素＝1:20摩尔比加入生物素，静置2h。选用GE公司AKTA全自动蛋白纯化仪对生物素标记抗体溶液进行纯化，收取纯化后溶液，用含有3％BSA、0.1％明胶，pH为8.0的400mM Tris-HCl缓冲液将纯化后抗体配制为2.5μg/mL的R3溶液，4℃保存。

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品，组装成为IGFBP-3化学发光试剂盒。

七、试剂盒性能测定

1.试剂盒线性范围测定

将实施例2中制备的试剂盒其中1批，测测定检测范围样本0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，得出检测范围最高可达为20μg/mL，相关系数R＝0.9997。

表8试剂盒线性范围测定

测定校准品浓度(μg/mL)	相对光强度(RLU)
		0	3625
0.75	857414
		1.25	1685475
2.50	3352418
		5.00	6895417
10.00	15248541
		20.00	31524812

2.试剂盒灵敏度的测定

将实施例1中制备的试剂盒其中1批，测定20次零浓度样本，计算平均值(M)及标准差(SD)，得出M+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-RLU进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD的RLU带入方程，得出相应浓度值即为试剂盒的灵敏度0.002μg/mL。

表9灵敏度第1点发光值

第一点发光均值M＝12021，SD＝1199，M+2SD＝14419。

表10灵敏度第2点发光值

第一点与第二点连线拟合曲线，计算的灵敏度＝0.002μg/mL。

3.试剂盒准确度的测定

使用实施例1中制备的试剂盒检测WHO NIBSC试剂93/560标准物质配制成的准确度样本1浓度1μg/mL，准确度样本2浓度8μg/mL，每个样本测定3次，计算准确度，得出准确度均＜5％。

准确度＝(测定值-标准物质浓度)/标准物质浓度×100％

表11准确度测定

4.试剂盒精密度的测定

(1)分析内精密度

将实施例2中制备的试剂盒其中1批，分别测定本公司质控品C1、C2，10孔平行测试，得出批内变异系数分别为2.88％、2.21％。

表12批内精密度

测试样本	C1(浓度：1μg/mL)	C2(浓度：8μg/mL)
			测试1	0.97	8.15
测试2	1.05	8.32
			测试3	1.01	8.41
测试4	0.98	8.03
			测试5	1.02	8.22
测试6	1.02	7.79
			测试7	0.99	8.26
测试8	0.98	8.13
			测试9	1.05	8.22
测试10	1.03	8.37
			批内精密度	2.88％	2.21％

(2)分析间精密度

将实施例2中制备的试剂盒其中3批，分别测定本公司质控品C1、C2，10孔平行测试，得出批内变异系数分别为3.28％、2.93％。

表13批间精密度

5.试剂盒抗干扰特异性实验

在缓冲液样本中添加下列浓度的特异性物质，使用实施例1中试剂盒进行检测，记录IGFBP-3的测定浓度。

干扰率＝(测定浓度-交叉反应物浓度)×100％

表14抗干扰特异性

ND:未检测到。

经过大量重复性实验，本发明的试剂盒指标如下：

检测范围：最高可达20μg/mL；

灵敏度：最低检测限不高于0.002μg/mL；

准确度：测定值与标准物质偏差＜5％；

分析内精密度C1：2.88％，C2：2.21％；分析间精密度C1：3.28％，C2：2.93％。

特异性：与IGF-II、IGFBP-1(磷酸化)、IGFBP-1(去磷酸化)、IGFBP-1(复合体)、IGFBP-2、转铁蛋白、胆红素、人血清白蛋白、血红蛋白、人IgG无交叉反应。

实施例3IGFBP-3化学发光检测试剂盒的制备

与实施例1中方法基本相同，不同之处在于：R2试剂中用于标记抗体的吖啶酯为DMAE-NHS，其结构如图2所示。

使用上述吖啶酯标记抗体制备试剂盒，检测其灵敏度为0.05μg/mL，准确度≤±10％，重复性C1：6.99％，C2：6.71％。

实施例4IGFBP-3化学发光检测试剂盒的制备

与实施例1中方法基本相同，不同之处在于：R2试剂中用于标记抗体的吖啶酯为NSP-DMAE-NHS，其结构如图3所示。

使用上述吖啶酯标记抗体制备试剂盒，检测其灵敏度为0.01μg/mL，准确度≤±10％，重复性C1：5.83％，C2：6.28％。

实施例5IGFBP-3化学发光检测试剂盒的制备

与实施例1中方法基本相同，不同之处在于：R2试剂中用于标记抗体的吖啶酯为NSP-DMAE-HEG-Glμ-NHS，其结构如图4所示。

使用上述吖啶酯标记抗体制备试剂盒，检测其灵敏度为0.1μg/mL，准确度≤±10％，重复性C1：8.76％，C2：6.96％。

实施例6IGFBP-3化学发光检测试剂盒的制备

与实施例1中方法基本相同，不同之处在于：R2试剂中用于标记抗体的吖啶酯为NSP-2,7-(OMHEG)2-DMAE-AC-NHS，其结构如图5所示。

使用上述吖啶酯标记抗体制备试剂盒，检测其灵敏度为0.1μg/mL，准确度≤±10％，重复性C1：8.22％，C2：7.33％。

实施例7一种IGFBP-3化学发光检测试剂盒的制备，与实施例1中方法基本相同，不同之处在于：R2试剂中用于标记抗体的吖啶酯为NSP-DMAE-Z-NHS，其结构如图6所示。

使用上述吖啶酯标记抗体制备试剂盒，检测其灵敏度为0.1μg/mL，准确度≤±10％，重复性C1：9.26％，C2：7.17％。

临床试验

用实施例1中制备的试剂盒与西门子公司试剂盒同时检测100份临床血清。其检测结果见图7以西门子试剂盒测得的结果作为横坐标x，浓度为μg/mL，以本发明测定的结果作为纵坐标y，浓度单位为μg/mL，作回归方程，相关方程为：y＝1.0476x+0.072，相关系数r为0.9935。经统计学处理结果表明，本方法与市面在售试剂盒临床相关性良好。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (10)

1.一种胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：R1试剂：包被链霉亲和素的磁珠溶液；R2试剂：吖啶酯标记的IGFBP-3抗体溶液；R3试剂：生物素标记的IGFBP-3抗体溶液。

2.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的R1试剂中，磁珠为粒径大小1.5-3μm的Fe3O4纳米粒子，包被链霉亲和素的磁珠浓度为0.05％-0.15％。

3.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的R2试剂，pH为5.0-8.0，吖啶酯标记的IGFBP-3浓度为0.3μg/mL-1.5μg/mL，抗体与吖啶酯按摩尔体积比为1:2.5-1:15。

4.根据权利要求1或3所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的吖啶酯采用DMAE类吖啶酯或酰胺类吖啶酯。

5.根据权利要求4所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，DMAE类吖啶酯采用DMAE-NHS、NSP-DMAE-NHS或NSP-DMAE-HEG-Glu-NHS。

6.根据权利要求4所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，酰胺类吖啶酯采用NSP-SA-NHS。

7.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的R3试剂，pH为5.0-8.0，生物素标记的IGFBP-3抗体浓度为0.4μg/mL-2.5μg/mL，抗体与生物素按摩尔体积比为1:3.5-1:20。

8.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒，其特征在于，还包括以缓冲液为基质的IGFBP-3蛋白配制校准品及质控品。

9.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

R1试剂的制备：使用100-400mM Tris-HCl缓冲液配制包被链霉亲和素的磁珠浓度为0.05％-0.15％；

R2试剂的制备：使用30KDa孔径超滤离心管将IGFBP-3抗体缓冲液置换为100mM-200mMPB缓冲液，将抗体与吖啶酯按摩尔体积比1:2.5-1:15混合，充分混匀，室温放置1-3h后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗体，将收集到的吖啶酯标记抗体选用pH5.0-8.0的100-400mMTris-HCl缓冲液稀释至0.3μg/mL-1.5μg/mL；

R3试剂的制备：使用30KDa孔径超滤离心管将IGFBP-3抗体缓冲液置换为100mM-200mMPB缓冲液，将抗体与生物素按摩尔体积比1:3.5-1:20混合，充分混匀，室温放置2-4小时后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗体，将收集到的生物素标记抗体选用pH5.0-8.0、100-400mMTris-HCl缓冲液稀释至0.4μg/mL-2.5μg/mL。

10.根据权利要求1所述的胰岛素样生长因子结合蛋白-3化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，还包括制备校准品及质控品的步骤，校准品的制备步骤为：用含有0.5-1.0％BSA、2-3％海藻糖、0.1-0.5％PEG6000、0.05-0.1％吐温-20及0.1-0.5％的酪蛋白酸钠、pH7.0-8.0的100-400mM MES缓冲液并添加0.1％叠氮钠防腐剂，将IGFBP-3蛋白稀释成校准品，分装成0μg/mL、0.75μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL；质控品的制备步骤为：用含有0.5-1.0％BSA、0.1-0.5％PEG6000、0.05-0.1％吐温-20及0.1-0.5％的酪蛋白酸钠，pH7.0-8.0的100-400mM MES缓冲液将IGFBP-3蛋白配制成浓度为1μg/mL和8μg/mL的质控品。

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