CN111398589A - 一种快速检测新型冠状病毒n蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用，所述免疫层析试剂盒包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其可进行鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液样本中新型冠状病毒N蛋白的检测，以用于新型冠状病毒肺炎的诊断。

Description

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于体外诊断领域，具体涉及一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的 免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新 毒株，人感染冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难 等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死 亡。1月26日，国家药品监督管理局应急审批通过华大基因等4家企业4个新 型冠状病毒检测产品，但目前已审批的新型冠状病毒核酸检测试剂均基于核酸检 测方式，单个样品采用核酸荧光PCR法需要3个小时给出检测结果，采用核酸 测序法需要6个小时给出检测结果，更重要的是由于基因扩增对实验室环境要求 极高导致检测通量称为最大制约因素，是极大制约了新型冠状病毒快速检测服务 的供给能力，不足以全面满足疫情防控需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种快速检测新型冠状病毒N蛋白 的免疫层析试剂盒及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，包括试纸条，所述 试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白 单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述试纸条还包括PVC板，所述PVC 板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次 设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记 物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物垫上包被有标记物标记的另一 株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG，所述标记物标记的 另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为 1:0.2～4。

在本发明的一个具体方案中，其中所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体 为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或羊抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体， 优选为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、 彩色乳胶或磁性微球。

在本发明的一个具体方案中，其中所述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免 疫层析试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。

在本发明的一个具体方案中，其中所述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加 样孔；

观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的制备方法，包括以 下步骤：

1)包被垫的制备：将一株抗新型冠状病毒N蛋白抗体和羊抗兔多克隆抗体 分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；

2)标记物垫的制备：将标记物标记的一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗 体和标记物标记的兔IgG混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；

3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的 一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样 品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。

在本发明的一个具体方案中，其中所述抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体 为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体或羊抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体， 优选为鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体。

在本发明的一个具体方案中，其中所述标记物标记的另一株鼠抗冠状病毒N 蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.5～4。

一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的使用方法，所述方 法所用的样本为选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液。

鼻咽拭子也可以叫作鼻拭子，鼻拭子为鼻腔内取样；口咽拭子也可以叫作咽 拭子，咽拭子为咽喉部位取样；口咽拭子为口腔内取样。

在本发明的一个具体方案中，其中所述使用方法，包括以下步骤：

包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取30～100μL处理好的 待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行 检测或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

在本发明的一个具体方案中，其中所述使用方法，包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测 样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置5～20min，然后插入荧光免疫分析仪进行检 测或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

在本发明的一个具体方案中，其中所述样本前处理的方式为：在塑料软管中 加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌； 用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞 出的液体即为待测样本。

试剂盒也可以叫做检测卡。

本发明的有益效果：

1、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其可 通过采用双抗夹心法检测新型冠状病毒核衣壳(N)蛋白，能够进行鼻咽拭子、 口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液等样本进行检测，检测速度快，15min 出检测结果，配合荧光免疫层析仪使用，操作简单，适用于基层医疗机构。

2、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其能 够改善PCR对仪器操作、人员、环境等的专业性要求限制，以及检测抗体无法 在早期进行筛查的缺陷，能够加速疫情一线疑似病例筛查，快速进行确诊人员隔 离，有效降低社会恐慌情绪。

3、本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其可 进行鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液标本、口腔拭子或唾液样本中冠状病毒核 衣壳(N)蛋白的检测，以用于新型冠状病毒肺炎的诊断。

附图说明

图1为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试纸条示 意图；

图2A为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析检测卡中 一种上盖的内部结构示意图；

图2B为本发明所提供的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析检测卡中 一种底槽的内部结构示意图；

其中，1-PVC板，2-包被垫，3-标记物垫，4-吸水垫，5-检测线，6-质控线， 7-标记物结合处，8-样本，9-样品垫，11-上盖，12-底槽，13-加样孔，14-观察窗， 15-试纸条放置区域，16-定位柱，17-定位孔，18-第一限定部，19-第二限定部， 20-第三限定部。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明进行进一步说明。

以下材料或试剂，除非特别说明，均为市售。

实施例1：

1.新型冠状病毒N蛋白免疫层析检测试剂盒的制备

1)采用荧光微球标记另一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体

取0.5mL荧光微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mg N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL另一株鼠抗 新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入 10mg BSA封闭液，继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照12000 r/min的转速离心20min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4) 将离心后获得的固体沉淀物复溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下 保存待用。

2)采用荧光微球标记兔IgG多克隆抗体

取0.5mL荧光微球加入1mg碳化二亚胺(EDC)，1mg N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)，于室温，120r/min的转速下搅拌3h，然后加入100μL mg羊兔IgG 多克隆抗体，于室温，120r/min的转速下搅拌1h，再加入10mg BSA封闭液， 继续以120r/min的转速搅拌1h。在2～8℃下，按照11000r/min的转速离心30 min，除去上清液。最后，用0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将固体沉淀物复 溶至1mL，再加入1μL的Proclin300在4℃下保存待用。

3)包被垫的制备

将一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和羊抗兔多克隆抗体分别用 0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)稀释成1mg/mL，用划膜喷金仪在硝酸纤维素 膜(NC膜)上进行划膜。含有一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的作为 检测线(T线)5，含有羊抗兔多克隆抗体的作为质控线(C线)6，然后在37℃， 湿度<30％的环境下干燥4h制成包被垫2。

4)标记物垫的制备

①将玻璃纤维素膜在0.2M的磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中浸泡6h，然后在 35℃下干燥8h，备用。

②将摩尔比为1:1的荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗 体和荧光微球标记的兔IgG标记的荧光微球混合均匀后，按照10μL/cm的速度 喷涂在玻璃纤维素膜上，然后放置在45℃下干燥2h制成标记物垫3。标记物垫 3上包被有荧光微球标记的一株鼠抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和荧光微球 标记的兔IgG的地方叫做标记物结合处7。

5)免疫层析检测试剂盒的组装

首先在PVC板1上粘接硝酸纤维膜2，然后在靠近硝酸纤维膜2上的质控 线6的一端搭接吸水垫4，在靠近硝酸纤维膜2的检测线5的一端搭接标记物垫 3及其连接的样品垫9，用切条机切成4mm±0.1mm的试纸条(见图1)，将试 纸条放入卡壳中制备成新型冠状病毒N蛋白免疫层析检测试剂盒。

试剂盒也可以叫做检测卡。

所述卡壳选自现有技术，例如，所述卡壳(如图2所示)可以包括：底槽 12，其连接于所述PVC板1；上盖11，其连接于所述底槽12，所述上盖11上 设置有用于向所述样品垫9上加样的加样孔13；观察窗14，其设置于上盖11上， 用于检测线5和质控线6的数据采集。

如图2B所示，所述底槽12包括：位于其内表面的对称分布的多个定位孔 17，多个所述定位孔17之间设有多个用于限定试纸条横向移动的第一限定部18 以及用于限定试纸条纵向移动的第二限定部19；对称设置的所述第一限定部18 与所述第二限定部19围设成纸条放置区域15(虚线区域)，用于放置试纸条；

如图2A所示，所述上盖11包括：与多个所述定位孔17相配合的多个定位 柱16，这样配合使用以将上盖11和底槽12固定在一起；所述上盖11还包括用 于限定试纸条的上下移动的第三限定部20。

所述包被垫2的上方设有用于数据采集的观察窗14，以露出全部所述检测 线5和质控线6，用于收集其检测结果；且所述观察窗14开设于所述上盖11上 与试纸条放置区域15的中部相对应的位置。所述上盖11在与所述样品垫9相对 应的位置处开设有加样孔，以用于样品垫9上滴加样本8。所述检测线距离加样 孔15-25mm。

2.检测

取60μL的待测样本，通过加样孔向标记物垫上标准品或待测样本，室温 静置15min，抗原就会与标记物混合反应并沿着硝酸纤维素膜层析，分别与测试 线和质控线反应，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本 T/C值，通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光 条带时，即为阳性。

紫外光也可以叫作紫外线，可以具体使用紫外线灯。

3.性能评价

1)精密度

用3个不同批号的试剂盒分别检测配置浓度为(300±75)ng/mL和(100 ±25)ng/mL两个样本，每个批号重复检测10次，计算30次测量浓度值结果的 平均值M和标准差SD，计算变异系数CV。检测结果如下表1所示。

表1

从表1的数据可以看出，批间变异系数均小于10.92％，说明本发明的快速 检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的精密度较高。

2)灵敏度

以新型冠状病毒N蛋白合成的多肽片段配置，浓度为50ng/mL、100ng/mL、 200ng/mL。检测结果如下表2所示。

表2

从表2的检测结果中可以看出，本发明的快速检测新型冠状病毒N蛋白的 免疫层析试剂盒符合灵敏度的要求。

实施例2：

鼻/口咽拭子样本检测

所采取的样本类型包括鼻咽拭子、口咽拭子。

鼻/口咽拭子样本采集后经样本保存液(组成见表3)进行样本前处理，处理 方式：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样 本保存液中并搅拌。用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒， 然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到样本保存液中)的液体即为 待测样本。随后取60μL处理好的待测样本滴加到检测卡的加样孔处，静置 15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值， 通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时， 即为阳性。临床检测结果如下表4所示。

表3样本保存液的组成

表4

从表4的临床检测数据可以看出，30例阴性样本全部检测为阴性，与临床 诊断一致；9例阳性口咽拭子中8例检测为阳性，21例阳性鼻咽拭子中19例检 测为阳性，阳性总符合率为90％。

实施例3：

口腔拭子/唾液检测

所采取的样本类型包括口腔拭子、唾液。

口腔拭子/唾液样本采集后经样本保存液(组成见表5)进行样本前处理，处 理方式：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在 样本保存液中并搅拌。用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉 棒，然后拔出棉棒，绞出(即将棉棒上采集的样本混合到样本保存液中)的液体 即为待测样本。随后取60μL处理好的待测样本滴加到检测卡的加样孔处，静 置15min，然后插入荧光免疫层析分析仪进行检测，仪器自动计算出样本T/C值， 通过与正常值范围判断阴阳性。另外当在紫外光照射下呈现出两条荧光条带时， 即为阳性。临床检测结果如下表6所示。

表5样本保存液(P.B缓冲液)

表6

从表6的临床检测数据可以看出，口腔拭子样本检测结果，8例阳性样本4 例检测为阳性，阳性检出率为50％，12例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊 断一致；唾液样本检测结果，9例阳性样本4例检测为阳性，阳性检出率为44.4％， 11例阴性样本全部检测为阴性，与临床诊断结果一致。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的实施例，本发明的保护范围 不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在 本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (12)

1.一种快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，包括试纸条，所述试纸条包括检测线及质控线，所述检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，所述质控线上包被有羊抗兔多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试纸条还包括PVC板，所述PVC板上固定有依次连接的样品垫、标记物垫、包被垫及吸水垫，所述包被垫上依次设有检测线及质控线，所述样品垫和标记物垫连接为一体。

3.如权利要求2所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述包被垫靠近检测线的一端连接有标记物垫，靠近质控线的一端连接有吸水垫。

4.如权利要求3所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG，所述标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG的摩尔比为1:0.2～4。

5.如权利要求4所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。

6.如权利要求5所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒还包括用于卡设试纸条的卡壳。

7.如权利要求6所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，其特征在于，所述卡壳包括：

底槽，其连接于所述PVC板；

上盖，其连接于所述底槽，所述上盖上设置有用于向所述样品垫上加样的加样孔；

观察窗，其设置于上盖上并用于检测线和质控线的数据采集。

8.一种权利要求1-7任一项所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)包被垫的制备：将一株抗新型冠状病毒N蛋白抗体和羊抗兔多克隆抗体分别包被到硝酸纤维素膜上，干燥备用；

2)标记物垫的制备：将标记物标记的一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体和标记物标记的兔IgG混合后，喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥备用；

3)组装试纸条：在PVC板上粘接包被垫，并在靠近该包被垫上的质控线的一端搭接吸水垫，在靠近该包被垫上的检测线的一端搭接标记物垫及其连接的样品垫；然后将其切成所需宽度的试纸条，之后将该试剂条放入卡壳。

9.一种权利要求1-7任一项所述的快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法所用的样本为选自鼻咽拭子、口咽拭子、肺泡灌洗液、口腔拭子或唾液。

10.如权利要求9所述的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取30～100μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置15min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

11.如权利要求10所述的使用方法，其特征在于，

将所采取的样本经样本保存液进行样本前处理，随后取60μL处理好的待测样本滴加到试剂盒的加样孔处，静置5～20min，然后插入荧光免疫分析仪进行检测，或者在紫外光下观察，即时可获得检测结果。

12.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述样本前处理的方式为：在塑料软管中加入0.5mL样本保存液，随后将采集样本后的棉棒浸在样本保存液中并搅拌；用手指挤压塑料软管外侧数次，使样本保存液充分浸透棉棒，然后拔出棉棒，绞出的液体即为待测样本。

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