CN111394427B - 一种含泥土检材中微量dna的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，包括如下步骤：(1)将含泥土检材放入离心管中，加入裂解液进行90‑100℃裂解处理，离心后得到上清液；(2)加入羧酸基阳离子树脂，混匀后60‑90℃金属浴加热处理，离心后吸取上清液；(3)加入吸附液、磁珠悬浊液，混匀，磁吸后吸弃所有液体；(4)向离心管中加入洗涤液Ⅰ，洗涤，磁吸，弃上清，之后使用洗涤液II重复上述操作，再使用洗涤液III重复上述操作；(5)离心管彻底干燥后，加入高纯水震荡混匀，65℃金属浴温浴10分钟，混匀，磁吸后得到DNA溶液。本方法可以有效地从含泥土检材中提取微量DNA，灵敏度高、抗杂质干扰能力强、检出率高，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于生物和医学检验技术领域，尤其涉及一种含泥土检材中微量DNA的提取方法。
背景技术
DNA检验技术是目前法医检验技术的重要组成，通过对案件现场采集的DNA样本进行测序分析，短串联重复序列(STR)分型是法医学个体识别和亲子鉴定的主要技术手段。目前，法医DNA检验包含DNA样本的采集、DNA提取和纯化、PCR扩增和分型检测等步骤，其中微量DNA的提取和纯化是后续检验的前提，对能否获得有效STR分型起到至关重要的作用。
目前各种常用的DNA纯化方法可分成两类：液相纯化和固相纯化。液相纯化法包括有机试剂提取法、Chelex-100法等，有机试剂提取法步骤繁琐、耗时、检材易污染。Chelex-100法不足的是提取的DNA纯化不高，易受检材泥土中的金属离子、深色燃料等PCR抑制物的干扰。近年来，DNA固相提取方法发展迅速，在DNA提取领域占有非常重要的地位。这类方法一般需要四个主要步骤：1、裂解细胞使细胞膜、核膜破裂以释放DNA；2、释放的DNA与固相载体结合；3、通过洗涤去除杂质；4、洗脱得到纯化的DNA。现已开发了多种固相载体，如二氧化硅微球、薄膜过滤器、金属氧化物、胶乳沉淀、硅藻土、玻璃粉等。当DNA存在于在高浓度离液盐以及低pH值溶液中，能够吸附到固相载体介质表面，并在低盐溶液中洗脱下来，进而达到纯化的目的。
含泥土检材中微量DNA提取纯化的一大难点就是DNA含量低，业内公认检材中微量DNA含量在0.1-0.25ng之间。泥土杂质表面具有可与DNA中磷酸基团相作用的位点，对DNA具有吸附性，可与DNA固相载体竞争吸附DNA，这使得含量本就很低的DNA更加难以提取纯化；同时由于案发现场环境的复杂性，从现场采集的含泥土检材中不可避免的会存在一些金属离子、腐植酸等抑制剂，如不能在提取环节进行有效纯化，则会对后续PCR扩增产生影响，这进一步增加了含泥土检材中微量DNA的提取纯化难度，而这些检材在案件侦破中往往是至关重要的证据来源。随着法医DNA技术的发展，对该类检材中DNA提取纯化的需求越来越多，无法有效对其进行DNA提取纯化会直接导致该类检材DNA检出率很低，无法满足日益增长的案件检验需求。
针对以上情况，有必要开发一种可以从含泥土检材中提取微量DNA的有效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，其能够更好地解决微量、疑难生物检材DNA的提取和富集，灵敏度高、抗杂质干扰能力强、检出率高，应用前景广阔。
为达到以上目的，本发明提供了一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)裂解：将20mg含泥土检材放入离心管中，加入200-400μL裂解液，90-100℃金属浴裂解5-15分钟，10000-12000rpm离心2-4分钟后吸取上清液至另一个离心管中，所述裂解液包括3.0-7.0mol/L异硫氰酸胍、10-40mmol/L Tris-HCl、5-15mmol/L吐温80、2-5mmol/LEDTA和0.05-0.5mmol/L氨基磷酸酯衍生物，所述裂解液用1mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5-8.5；
(2)向步骤(1)得到的上清液中加入10-20mg羧酸基阳离子树脂，混匀后，60-90℃金属浴10-20分钟，7000-10000rpm离心2-4分钟，吸取上清液转到另一个离心管中；
(3)DNA吸附：向步骤(2)得到的上清液中加入300-600μL吸附液和10-20μL磁珠悬浊液，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，所述吸附液包括2.0-5.0mol/L盐酸胍、10-40mmol/LTris-HCl和1.5-2.5mol/L乙二醇，并且所述吸附液通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将pH值调至3-4之间，所述磁珠悬浊液包含分散在高纯水中质量百分比浓度为9％的、尺寸为100-2000nm的二氧化硅磁性复合微粒，所述二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，并且微粒表面具有多个纳米级尺寸的突起；
(4)洗涤：向离心管中加入200-400μL洗涤液I，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，之后使用800-1000μL洗涤液II重复上述操作，然后再使用600-800μL洗涤液III重复上述操作，
所述洗涤液I包括2.0-5.0mol/L异硫氰酸胍、10-30mmol/L Tris-HCl和1.5-2.5mol/L乙二醇；
所述洗涤液II包括终浓度为2.0mol/L的氯化钠、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水；
所述洗涤液III包括体积百分比为50％的无水乙醇和体积百分比为50％的异丙醇；
(5)洗脱：离心管开盖置于65℃金属浴5-10分钟，内容物彻底干燥后，加入10-100μL的高纯水，混匀，65℃金属浴闭盖10分钟，混匀，磁吸1分钟，吸取DNA溶液保存至另一个离心管中。
在本发明的一个实施方案中，所述氨基磷酸酯衍生物为α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯的一种或多种，其中，所述氨基为无取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基为脂肪族基团，所述氨基磷酸酯为长度小于5个碳的脂肪醇磷酸酯。
在本发明的另一个实施方案中，所述的铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子，其内核是具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，其外壳是二氧化硅。
本发明的有益效果主要在于：
1、本发明提供的从含泥土检材中提取微量DNA的方法，首先需对含泥土DNA检材进行裂解处理。泥土吸附DNA主要是由于泥土杂质中含有可与磷酸基团相作用的位点，通过这些位点与DNA中的磷酸基团作用将其吸附到泥土表面。本发明在体系中加入小分子氨基磷酸酯衍生物，使其优先与泥土表面的磷酸基团固定位点作用，极大地减小泥土对DNA的吸附，能够最大限度地获得裂解产物。随后通过离心将泥土除去，确保对后续磁珠吸附DNA无不良影响。通过羧酸基阳离子树脂吸附反应体系中过量的氨基磷酸酯衍生物，然后离心去除。因此，本发明方法能够实现对含泥土检材DNA的充分提取，操作步骤简单，有利于对样本DNA的后续PCR和和STR检测。
2、本发明采用的二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，同时微粒表面具有小尺寸的纳米级突起。与其他同尺寸的表面光滑的二氧化硅磁性复合粒子相比，本发明采用的二氧化硅磁性复合微粒比表面积更大，当微粒的尺寸处于较大的微米级时，微粒除了具有与其他微米级磁性粒子相同的强磁场相应能力外，还具有较大的比表面积，弥补了其他微米级磁性粒子比表面积小的不足，实现了更强的吸附活性、更大的吸附容量。此外，所述二氧化硅磁性复合微粒同时具有二氧化硅磁性复合粒子生物相容性好、化学稳定性高和表面易功能化的优点，因而非常适用于各种生物材料和医药制品的分离、纯化、标记和检测非常适用于微量DNA的提取。
3、含泥土检材中微量DNA提取的的另一大难点是杂质多，这些杂质会对DNA扩增产生抑制作用，增加检验的难度。除了从现场引入的外源性杂质外，还有DNA降解产生的无效短片段DNA，都会严重影响PCR扩增和STR检测过程，因此片段选择性吸附是实现微量DNA提取的另一关键。本发明据此特点，设计了全新的洗涤体系和洗涤方法，采用极性和离子强度递减的洗涤液，通过顺序洗涤的方法，将吸附在磁珠上的无效短片段DNA、蛋白、金属离子和其他杂质洗脱，保留包含STR信息的长片段DNA，确保在后续的PCR扩增反应中，可以使STR有效片段充分扩增，提高有效片段的扩增数量，极大地增强毛细管电泳的有效信号，从而使高难接触性检材DNA检出率得到有效提升。
综上所述，本发明提供了一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，其能够实现含泥土检材的DNA提取，灵敏度高(100-250pg)、抗杂质干扰能力强、检出率高，能够有效提高含泥土检材微量DNA的STR分型成功率。
附图说明
图1是采用本发明方法提取的DNA样本的STR谱图。
图2是采用一般固相DNA提取方法提取的DNA样本的STR谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和技术效果更加清楚，结合以下实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明说明书中所提及的相关成分的含量不仅仅可指代各组分的具体含量，也可以表示各组分之间含量的比例关系，因此只要按本发明说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本发明实施例说明书公开的范围。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。但是以下实施例是示范性的，而不是限制性的，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。
本发明实施例
1、试剂材料：
(1)裂解液包括5.0mol/L异硫氰酸胍、30mmol/L Tris-HCl、8mmol/L吐温80、2mmol/L EDTA和0.1mmol/L氨基磷酸酯衍生物，裂解液用1mol/L NaOH溶液将pH值调至8.0。
(2)吸附液包括5.0mol/L盐酸胍、10mmol/L Tris-HCl、2.0mol/L乙二醇，并且吸附液通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将pH值调至4.0。
(3)磁珠悬浊液包含分散在高纯水中质量百分比为9％的、尺寸为600nm的Fe3O4-二氧化硅磁性复合微粒。利用专利CN2008100509410公开的方法制备Fe3O4-二氧化硅磁性复合微粒，具体步骤如下：
利用文献(Albert P.Philipse,Magnetic Silica Dispersons:Preparation andStability of Surface-Modified Silica Particles with a Magnetic Core,Langmuir1994,10,92-99)公开的方法合成30nm Fe3O4-二氧化硅核壳纳米粒子。取500ml水和500ml丙醇混合后，加入50.0g氯化铝和2.0g四乙烯五胺，搅拌溶解后，加入5.0g 30nm Fe3O4-二氧化硅核壳纳米粒子，在搅拌速度为50rpm的条件下反应15分钟。然后在溶液中加入30ml质量百分比浓度为25-28％的浓氨水，并在搅拌速度为300rpm下，滴加正硅酸乙酯0.2ml，反应12小时。用永磁铁从反应溶液中分离出固体，用高纯水清洗所得固体3次，即得到Fe3O4-二氧化硅磁性复合微粒，其平均尺寸为600nm。
(4)洗涤液Ⅰ包括4.0mol/L异硫氰酸胍、15mmol/L Tris-HCl和2.0mol/L乙二醇，pH为7.0。
(5)洗涤液Ⅱ包括终浓度为2.0mol/L的氯化钠、体积百分比为50％的无水乙醇、体积百分比为20％的异丙醇和体积百分比为30％的水。
(6)洗涤液Ⅲ包括体积百分比为50％的无水乙醇和体积百分比为50％的异丙醇。
2、方法步骤：
(1)在亚克力基底上撒20mg泥土，用棉签拭子将泥土擦拭彻底后，向沾有泥土的棉头上滴加2.5μL标准DNA溶液9947A(0.1ng/μL)，室温放置1小时晾干后，将棉头剥离置于离心中，加入裂解液400μL，放置到金属浴上，95℃高温快速裂解10分钟，以达到细胞裂解、DNA与蛋白质分离的目的。然后将离心管放入离心机中，12000rpm离心3分钟，吸取上清液转到另一个离心管中。
(2)向上清液中加入20mg羧酸基阳离子树脂，涡旋震荡混匀后，金属浴80℃加热20分钟，然后10000rpm离心3分钟，吸取上清液转到另一个离心管中。
(3)向上清液中加入400μL吸附液，再加入20μL磁珠悬浊液，涡旋震荡混匀后，将离心管放置在自动翻转混匀仪上，翻转混匀15分钟，混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，然后吸弃所有液体。
(4)向离心管中加入300μL洗涤液Ⅰ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；再加入900μL洗涤液Ⅱ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；最后加入600μL洗涤液Ⅲ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；
(5)将离心管放入65℃金属浴中，开盖加热干燥5分钟，再加入20μL高纯水，将所有磁珠均分散到溶液中，65℃闭盖温浴10分钟，涡旋震荡混匀后立即放到磁架上，磁吸1分钟，吸出DNA溶液置于另一离心管中保存。
对本发明方法提取纯化后的DNA溶液使用VeriFilerTM Plus扩增试剂盒进行PCR扩增，在ABI 3130XL仪器中进行电泳，获得的STR分型谱图如附图1所示，STR位点完整，分型准确，25个基因座等位基因完整，峰高均在1000以上，表明该纯化方法纯化效率高，得到的DNA纯度高，完整性好，符合法医案件检测数据要求，非常适用于含泥土检材的分离、纯化、标记和检测，非常适用于微量DNA的提取。
对比方法实施例
1、试剂材料：
(1)裂解液包括5.0mol/L异硫氰酸胍、30mmol/L Tris-HCl、8mmol/L吐温80和2mmol/L EDTA，裂解液用1mol/L NaOH溶液将pH值调至8.0。
(2)吸附液包括5.0mol/L盐酸胍、10mmol/L Tris-HCl、2.0mol/L乙二醇，并且吸附液通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将pH值调至4.0。
(3)磁珠悬浊液包含分散在高纯水中质量百分比为9％的、尺寸为600nm可商业途径购买的磁性复合微粒。
(4)洗涤液Ⅰ包括体积百分比为80％的无水乙醇和体积百分比为20％的水。
(5)洗涤液Ⅱ包括体积百分比为80％的无水乙醇和体积百分比为20％的水。
(6)洗涤液Ⅲ包括体积百分比为80％的无水乙醇和体积百分比为20％的水。
对比方法与本发明方法所使用的试剂材料对比：
2、方法步骤：
(1)在亚克力基底上撒20mg泥土，用棉签拭子将泥土擦拭彻底后，向沾有泥土的棉头上滴加2.5μL标准DNA溶液9947A(0.1ng/μL)，室温放置1小时晾干后，将棉头剥离置于离心中，加入裂解液400μL，放置到金属浴上，95℃高温快速裂解10分钟，然后将离心管放入离心机中，12000rpm离心3分钟，吸取上清液转到另一个离心管中；
(2)向上清液中加入400μL吸附液，再加入20μL磁珠悬浊液，涡旋震荡混匀后，将离心管放置在自动翻转混匀仪上，翻转混匀15分钟，混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，然后吸弃所有液体。
(3)向离心管中加入300μL洗涤液Ⅰ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；再加入900μL洗涤液Ⅱ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；最后加入600μL洗涤液Ⅲ，涡旋震荡混匀后立即放回磁架，磁吸1分钟，吸弃所有液体；
(4)将离心管放入65℃金属浴中，开盖加热干燥5分钟，再加入20μL高纯水，将所有磁珠均分散到溶液中，65℃闭盖温浴10分钟，涡旋震荡混匀后立即放到磁架上，磁吸1分钟，吸出DNA溶液置于另一离心管中保存。
对比方法获得的DNA溶液，使用VeriFilerTM Plus扩增试剂盒进行PCR扩增，在ABI3130XL仪器中进行电泳，获得的STR分型谱图如附图2所示，STR位点不完整，25个基因座只有4个等位基因完整，分型不准确，且峰高基本在400以下，表明该纯化方法纯化效率低，无法得到纯度符合要求的DNA，完整性差，不适用于针对含泥土检材中的微量DNA进行提取。
通过以上实验对比发现，本发明方法具有更好提取效果。采用本发明方法的DNA提取灵敏度高、抗杂质干扰能力强、检出率高，可以有效地从含泥土检材中提取纯化微量DNA(100-250pg)，充分表明本发明方法的适用性和显效性，可以为案件侦破和法庭审判提供更为有效的依据。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种含泥土检材中微量DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）裂解：将20mg含泥土检材放入离心管中，加入200-400 μL裂解液，90-100℃金属浴裂解5-15分钟，10000-12000rpm离心2-4分钟后吸取上清液至另一个离心管中，所述裂解液包括3.0-7.0 mol/L异硫氰酸胍、10-40 mmol/L Tris-HCl、5-15 mmol/L 吐温80、2-5mmol/L EDTA和0.05-0.5 mmol/L氨基磷酸酯衍生物，所述裂解液用1 mol/L NaOH溶液将pH值调至7.5-8.5；
（2）向步骤（1）得到的上清液中加入10-20 mg羧酸基阳离子树脂，混匀后，60-90℃金属浴10-20分钟，7000-10000rpm离心2-4分钟，吸取上清液转到另一个离心管中；
（3）DNA吸附：向步骤（2）得到的上清液中加入300-600 μL吸附液和10-20 μL磁珠悬浊液，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，所述吸附液包括2.0-5.0 mol/L盐酸胍、10-40 mmol/LTris-HCl和1.5-2.5 mol/L乙二醇，并且所述吸附液通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将pH值调至3-4之间，所述磁珠悬浊液包含分散在高纯水中质量百分比浓度为9%的、尺寸为100-2000nm的二氧化硅磁性复合微粒，所述二氧化硅磁性复合微粒是由两个或更多个铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子交联而成的交联体，并且微粒表面具有多个纳米级尺寸的突起；
（4）洗涤：向离心管中加入200-400 μL洗涤液I，混匀，磁吸1分钟，吸弃所有液体，之后使用800-1000 μL洗涤液II重复上述操作，然后再使用600-800 μL洗涤液III重复上述操作，
所述洗涤液I包括2.0-5.0 mol/L异硫氰酸胍、10-30 mmol/L Tris-HCl和1.5-2.5mol/L乙二醇；
所述洗涤液II包括终浓度为2.0 mol/L的氯化钠、体积百分比为50%的无水乙醇、体积百分比为20%的异丙醇和体积百分比为30%的水；
所述洗涤液III包括体积百分比为50%的无水乙醇和体积百分比为50%的异丙醇；
（5）洗脱：离心管开盖置于65℃金属浴5-10分钟，内容物彻底干燥后，加入10-100 μL的高纯水，混匀，65℃金属浴闭盖10分钟，混匀，磁吸1分钟，吸取DNA溶液保存至另一个离心管中，
所述氨基磷酸酯衍生物为α-氨基磷酸酯、β-氨基磷酸酯和γ-氨基磷酸酯的一种或多种，其中，所述氨基为无取代氨基、一取代氨基或二取代氨基，所述氨基的取代基为脂肪族基团，所述氨基磷酸酯为长度小于5个碳的脂肪醇磷酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铁氧体-二氧化硅核壳纳米粒子，其内核是具有超顺磁性的铁氧体纳米粒子，其外壳是二氧化硅。
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